CN105326863A

CN105326863A - 一种利用自体毛囊黑色素细胞制备用于治疗白癜风复合膜的方法

Info

Publication number: CN105326863A
Application number: CN201510852467.3A
Authority: CN
Inventors: 任力; 李卫昌; 王迎军
Original assignee: Guangzhou Pudaolianxin Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Pudaolianxin Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2015-11-27
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2035-11-27
Also published as: CN105326863B

Abstract

本发明公开了一种利用自体毛囊黑色素细胞制备用于治疗白癜风复合膜的方法，在患者毛囊里面分离到足够多的自体黑色素细胞，利用培养扩增后其性能和功能不变的特征，把细胞转移到生物膜上继续生长，有效提高细胞可控性，这将极大方便临床医生使用。避免了传统手术治疗白癜风损伤大、治疗时间长、治疗皮损面不大、不适合幼儿及儿童的治疗以及疤痕的形成等缺陷。本发明操作方便、重复性好，适应临床治疗白癜风大规模推广。

Description

一种利用自体毛囊黑色素细胞制备用于治疗白癜风复合膜的方法

技术领域

本发明涉及一种利用自体毛囊黑色素细胞制备用于治疗白癜风复合膜的方法。

背景技术

白癜风是一种严重影响患者美貌的常见皮肤疾病，全世界约1％至2％的人口正受到白癜风的困扰，在中国保守的估计至少有2000万白癜风患者，该病约30％的患者对药物或紫外线照射不敏感，此类患者希望给予快速有效的治疗方法，因此，至少大约600万名患者将面临手术相关的细胞治疗。

目前供白癜风治疗的手段主要有中西药物治疗、各种光辐照治疗以及外科手术治疗。这几种治疗方法各有优缺点和适应症，中西药治疗分为口服和外用药物，口服皮质激素和/（或）外用皮质激素是主要的治疗药物，并起到了积极作用，但是其疗效长，用药也有可能引起局部和系统副作用，仅有少部分患者可能达到康复，所以导致患者的依从性差。各种光辐照治疗，由于某些患者对光线照射不敏感，不适应此种疗法；另外该疗法也可能因长期光疗而诱导皮肤肿瘤、老化等系列副作用。手术治疗是最有希望治愈白癜风的手段，传统的手术治疗主要是吸疱表皮移植、打孔移植等，但有一定缺陷：损伤大、治疗时间长、治疗皮损面有限，不适合幼儿及儿童的治疗以及疤痕的形成等。

目前比较有效的疗法是自体黑色素细胞移植治疗，由于所获得的黑色素细胞来源于自体，不会引起排斥；也可针对治疗较大范围的皮损患者，有望彻底改变白癜风的治疗难点，但是由于自体黑色素细胞取自皮肤，面临着数量有限且分离困难、培养工艺复杂、不容易推广等缺陷。虽然市面上的确有一些快速分离细胞的方法，但由于其细胞来源需要大量的皮肤，所移植的细胞也不易固定，分布也不均匀，疗效尚不确切，治疗费用较高，所以该方法尚存在一定的弊端。

发明内容

针对现有技术中所存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种利用自体毛囊黑色素细胞制备用于治疗白癜风复合膜的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种利用自体毛囊黑色素细胞制备用于治疗白癜风复合膜的方法，包括如下步骤：

1）使用皮肤打孔器从患者头部取少量含有毛囊的头皮，分离毛囊中黑色素细胞并进行体外培养；

2）将培养的自体黑色素细胞转移至胶原膜或PVA/胶原复合膜表面，即得用于治疗白癜风的复合膜。

步骤1）毛囊中黑色素细胞的分离方法为：使用皮肤打孔器取少量含有毛囊的头皮，用酒精浸泡后，PBS液冲洗，无菌生理盐水冲洗直至表面清洁，立即用添加青霉素、链霉素和Tylosin的PBS液浸洗，然后浸入无菌0.25%中性蛋白酶中，消化处理后放入新的PBS液中，显微镜下取出毛囊至于培养基中，缓慢滴加0.25%胰蛋白酶，37℃孵育后除去多余胰蛋白酶，更换新的培养基，37℃，5%CO₂饱和湿度环境下进行培养，即可观察到细胞分离。

步骤1）黑色素细胞的培养方法为：配制含IGF-I、EGF、氢化可的松和FBS的DMEM/F12培养基，将细胞置入培养基中培养，培养条件为36-38℃，4-6%CO₂饱和湿度环境培养箱，每2-4天换一次培养基。

所述胶原膜的制备方法为：用弱酸溶液配制浓度为0.5～5wt%的胶原溶液，充分搅拌后平铺并干燥成膜即得到纯胶原膜。

所述PVA/胶原复合膜的制备方法为：

（1）取PVA加入水中，在65～95℃下搅拌至完全溶解，得到PVA溶液，备用，PVA溶液的浓度优选为5～15wt%；

（2）用弱酸溶液配制浓度为0.5～5wt%的胶原溶液，备用；

（3）将步骤1）制备得到的PVA溶液倒入模具中，干燥成膜得到PVA膜，再将步骤2）制备得到的胶原溶液均匀平铺于PVA膜表面，静置、干燥，得到PVA增强胶原复合膜；或者先将胶原溶液倒入模具中，干燥得到胶原膜，再将PVA溶液均匀平铺于胶原膜表面，静置、干燥，得到PVA增强胶原复合膜；或者取PVA溶液与胶原溶液共混制备胶原/PVA混合溶液，然后将混合液倒入模具中，成型干燥后即制得PVA/胶原复合膜，PVA溶液与胶原溶液的混合体积比例为（1～10）：10。

作为优选的，所述弱酸包括：乙酸、盐酸、次氯酸、氢硫酸中的任一种，浓度为0.3～1wt%。

由以上任一项所述的方法制备得到的用于治疗白癜风的复合膜。

本发明的有益效果是：

（1）传统常规疗法均是通过把液体的黑色素细胞悬液敷在创面上，这样细胞容易流动，分布不均匀，复色效果欠佳。本发明将培养的黑色素细胞转移至PVA/胶原复合膜表面上生长，极容易转化到需要治疗的区域，极大方便了临床医生使用。而且本发明的PVA/胶原复合膜能够有效地促进细胞的粘附和增殖，具有良好的细胞相容性，极大地提高了治疗的效果。

（2）本发明通过获取自体头皮毛囊中黑色素细胞，体外培养扩增获得大量自体黑色素细胞，而这种黑色素细胞具有皮肤正常的黑色素细胞功能并且可以正常的产生皮肤黑色素（图1），移植到治疗区域后，可有效弥补皮损处缺失的黑色素细胞，从而达到治疗白癜风的目的。此种治疗方法区别于传统治疗方法，自体细胞不会出现排斥反应，更不需要用药物治疗，无潜在风险。

附图说明

图1是细胞自体头皮毛囊中黑色素细胞，通过体外培养扩增获得大量自体黑色素细胞。

图2是细胞在生物膜上生长（A）及在一定时间后可转移至培养板上（B）。

图3是小鼠黑色毛发重建效果，重建前无黑色素细胞（A）重建后有明显的黑色素细胞（B）。

图4是纯胶原膜（A）和胶原/PVA复合膜（B）微观形貌图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

（1）胶原膜的制备：用浓度为1wt%的乙酸溶液配制浓度为5wt%的胶原溶液，充分搅拌后平铺并干燥成膜即得到纯胶原膜（图4中A）。

（2）自体毛囊黑色素细胞的制备：使用2mm皮肤打孔器取2个含有毛囊的头皮，用70%酒精浸泡后，PBS液冲洗，无菌生理盐水冲洗直至表面清洁，立即用添加青霉素(400U/mL)、链霉素(400mg/mL)和Tylosin(250mg/mL)的PBS液浸洗3次，然后浸入无菌0.25%中性蛋白酶中，4℃消化处理5h放入新的PBS液中，显微镜下取出毛囊至于培养基中，缓慢滴加0.25%胰蛋白酶，37℃孵育10min后除去多余胰蛋白酶，更换新的培养基，37℃，5%CO₂饱和湿度环境下进行培养，即可观察到细胞分离。配制含IGF-I、EGF、氢化可的松和2%FBS的DMEM/F12培养基，将细胞置入培养基中培养，培养条件为37℃，5%CO₂饱和湿度环境培养箱，每3天换一次培养基。针对修复面积为小于20cm²的患处，体外扩增的细胞在1周完成供临床使用。

（3）将培养的自体黑色素细胞转移至胶原膜表面，即可给予白癜风患者使用。使用时只需对治疗部位进行简单的磨削，然后将带有自体的黑色素细胞黏贴在治疗区域，完成治疗；经过2周就可以看到明显的复色。

实施例2

（1）胶原膜的制备：用浓度为1wt%的乙酸溶液配制浓度为5wt%的胶原溶液，充分搅拌后平铺并干燥成膜即得到纯胶原膜。

（2）自体毛囊黑色素细胞的制备：同实施例1。针对修复面积为大于20cm²的患处，体外扩增的细胞在2周完成供临床使用。

（3）将培养的自体黑色素细胞转移至胶原膜表面，即可给予白癜风患者使用。使用时只需对治疗部位进行简单的磨削，然后将带有自体的黑色素细胞黏贴在治疗区域，完成治疗；经过4周就可以看到明显的复色。

实施例3

（1）胶原/PVA复合膜的制备：用浓度为0.3wt%的乙酸溶液配制浓度为0.5wt%的胶原溶液，备用；称取PVA，加入到去离子水中，配置浓度为5wt%的PVA溶液，在65℃恒温油浴中搅拌6h，溶解完成后加入胶原溶液，制备PVA和胶原体积比为1:10的混合溶液，充分搅拌后平铺并干燥成膜即得到胶原/PVA复合膜（图4中B）。

（2）自体毛囊黑色素细胞的制备：同实施例1。针对修复面积小于20cm²的患处，体外扩增的细胞在1周完成供临床使用。

（3）将培养的自体黑色素细胞转移至胶原/PVA复合膜表面，即可给予白癜风患者使用。使用时只需对治疗部位进行简单的磨削，然后将带有自体的黑色素细胞黏贴在治疗区域，完成治疗；经过2周就可以看到明显的复色。

实施例4

（1）胶原/PVA复合膜的制备：用浓度为0.3wt%的乙酸溶液配制浓度为0.5wt%的胶原溶液，备用；称取PVA，加入到去离子水中，配置浓度为15wt%的PVA溶液，在95℃恒温油浴中搅拌2h，溶解完成后加入胶原溶液；制备PVA和胶原体积比为1:1的混合溶液，充分搅拌后平铺并干燥成膜即得到胶原/PVA复合膜。

实施例5

（1）将1g分子量为13000-23000的PVA加入10ml的去离子水中，在85℃的恒温油浴中搅拌2小时得到PVA溶液，静置至室温，倒入PMMA材质的模具中，室温条件下自然干燥成膜；使用浓度为0.5wt%的乙酸溶液配制10ml浓度为3.0wt%的胶原溶液；充分搅拌后，然后将胶原溶液均匀平铺于PVA膜表面，干燥成型后即得到胶原/PVA复合膜。

以上实施例表明，将培养的黑色素细胞转移至PVA/胶原复合膜表面上生长，极容易转化到需要治疗的区域，极大方便了临床医生使用。而且本发明的PVA/胶原复合膜能够有效地促进细胞的粘附和增殖，具有良好的细胞相容性，极大地提高了治疗的效果。

Claims

1.一种利用自体毛囊黑色素细胞制备用于治疗白癜风复合膜的方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶原膜的制备方法为：用弱酸溶液配制浓度为0.5～5wt%的胶原溶液，充分搅拌后平铺并干燥成膜即得到纯胶原膜。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PVA/胶原复合膜的制备方法为：

（1）取PVA加入水中，搅拌至完全溶解，得到PVA溶液，备用；

（2）用弱酸溶液配制浓度为0.5～5wt%的胶原溶液，备用；

（3）将步骤1）制备得到的PVA溶液倒入模具中，干燥成膜得到PVA膜，再将步骤2）制备得到的胶原溶液均匀平铺于PVA膜表面，静置、干燥，得到PVA增强胶原复合膜；或者先将胶原溶液倒入模具中，干燥得到胶原膜，再将PVA溶液均匀平铺于胶原膜表面，静置、干燥，得到PVA增强胶原复合膜；或者取PVA溶液与胶原溶液共混制备胶原/PVA混合溶液，然后将混合液倒入模具中，成型干燥后即制得PVA/胶原复合膜。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述弱酸包括：乙酸、盐酸、次氯酸、氢硫酸中的任一种，浓度为0.3～1wt%。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）制备的PVA溶液的浓度为5～15wt%。

6.根据权利要求3所述的双层结构角膜修复材料的制备方法，其特征在于，步骤（1）的PVA在65～95℃下搅拌至完全溶解。

7.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，PVA溶液与胶原溶液的混合体积比例为（1～10）：10。

8.根据权利要求1所说的方法，其特征在于，步骤1）毛囊中黑色素细胞的分离方法为：使用皮肤打孔器取少量含有毛囊的头皮，用酒精浸泡后，PBS液冲洗，无菌生理盐水冲洗直至表面清洁，立即用添加青霉素、链霉素和Tylosin的PBS液浸洗，然后浸入无菌0.25%中性蛋白酶中，消化处理后放入新的PBS液中，显微镜下取出毛囊至于培养基中，缓慢滴加0.25%胰蛋白酶，37℃孵育后除去多余胰蛋白酶，更换新的培养基，37℃，5%CO₂饱和湿度环境下进行培养，即可观察到细胞分离。

9.根据权利要求1所说的方法，其特征在于，步骤1）黑色素细胞的培养方法为：配制含IGF-I、EGF、氢化可的松和FBS的DMEM/F12培养基，将细胞置入培养基中培养，培养条件为36-38℃，4-6%CO₂饱和湿度环境培养箱，每2-4天换一次培养基。

10.由权利要求1-9任一项所述的方法制备得到的用于治疗白癜风的复合膜。