CN108567996A - 一种3d复层结构细胞膜片的制备及其应用 - Google Patents

一种3d复层结构细胞膜片的制备及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种3D复层结构细胞膜片的制备及其应用，包含如下步骤：两步分离法，分离人皮肤干细胞、基底角质细胞和黑色素细胞；3D复层结构表皮细胞膜片的培养方法：三种细胞无血清混合培养扩增及细胞的诱导分化培养出表皮细胞的3D复层结构细胞膜片；3D复层结构细胞膜片的剥离备用；3D复层结构细胞膜片的移植：用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将复层结构表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎。两步分离法同时分离三种不同细胞，分离细胞表面的膜受体和膜蛋白保持完整；3D复层结构细胞膜片中黑色素细胞和表皮细胞比例接近正常人表皮结构；可用于皮肤色素脱失性皮肤病的治疗及各种创伤的治疗。

Description

一种3D复层结构细胞膜片的制备及其应用
技术领域
本发明涉及一种3D复层结构细胞膜片的制备及其应用，尤其是一种利用人自体黑色素干细胞、短暂扩充细胞、毛囊干细胞、滤泡间表皮干细胞(Interfollicle EpidermalStem Cell，(IFESCs)皮脂腺干细胞、基底层角质细胞为种子细胞，培养具有3D复层结构表皮细胞膜片的技术及其在临床中的应用。
背景技术
皮肤由表皮真皮和皮下组织组成，是人体最大最复杂的器官，具有保护、分泌、感知和代谢功能。皮肤缺损和烧伤等是临床上的常见疾病，其最主要治疗的方法是自体皮肤移植或采用临时皮肤替代物覆盖；此外，白癜风也是一种皮肤色素脱失性疾病，发病机制目前还不清楚，治疗方法有激光照射等物理治疗法、药物治疗法和自体表皮移植法等方法。表皮移植法均需要自体皮肤，然而，由于人体皮肤有限，因此，人们一直在寻找一种永久性皮肤替代物，而永久性皮肤替代物仍依赖于有活性的自体多种种子细胞，主要包括各种表皮干细胞。
表皮干细胞(祖细胞)是一类异质性细胞，具有不同的亚类，其分子特征、分化能力及细胞巢(resident sites)都不相同。表皮干细胞主要包括：毛囊干细胞(HFSCs)、毛囊外根鞘干细胞、表达keratin-15的毛囊多潜能干细胞(follicle pluripotent stem cells，fPSCs)、皮脂腺干细胞(SGSCs)、汗腺干细胞(sweat stem cell)和黑色素干细胞(melancyte stem cell，EPI-NCSCs)和滤泡表皮干细胞(IFESCs)。
表皮干细胞具有终身、无限的自我更新能力。它是一种具有产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞。从发生机制来看，干细胞并不直接分化产生终末分化细胞，而是先分化成短暂扩充细胞，短暂扩充细胞有产生定向分化成某种终末分化细胞的能力，因而是定向祖细胞。短暂扩充细胞再经过几次到十几次不等的分裂后定向分化，进一步可分化为有丝分裂后细胞及终末分化细胞。
短暂扩充细胞的存在说明组织靠较少量的干细胞分裂为很多的子代分化细胞。干细胞自我更新和分化的方式通常有两种，一种是不对称方式分裂，即1个干细胞分裂成1个干细胞和一个定向祖细胞，常见于单细胞生物和无脊椎动物；另一种是具有高度调控机制的分裂方式，干细胞按一定的概率分裂成干细胞或定向祖细胞，即干细胞按一定的概率分裂为两个干细胞或两个定向祖细胞，或按不对称方式分裂，一般认为哺乳类动物即以此种方式进行自我组织更新。细胞的更新具有准确无误性，干细胞在整个增殖过程中处于相对静止状态，而由短暂扩充细胞完成DNA合成和细胞扩充的任务，干细胞在分裂后仍保留其原有的遗传信息，短暂扩充细胞拥有新复制DNA序列，以保证差错仅停留在短暂扩充细胞水平。通常干细胞等数分裂干细胞和定向祖细胞，当受到损伤等情况时，干细胞的分裂方式会发生改变以适应机体的需要。
皮肤上皮层是一层保护机体免受外界环境损伤的重要屏障。该层主要为角质细胞类型，包含了大约85％活的表皮细胞。角质层是复扁平上皮细胞。在表皮基底层，角质细胞分化、增殖，随着角质细胞产生角蛋白并上移至表皮表面后，发生程序性死亡。
角蛋白细胞增殖、分化及凋亡是复杂且严格控制的过程。角蛋白细胞可产生很多细胞因子和生长因子，包括IL-1，IL-3，IL-6，IL-8，集落刺激因子，TNF-alpha，TGF-alphaand beta，成纤维细胞生长因子，双调蛋白和PDGF。
除了保护功能之外，角蛋白细胞在组织稳态、伤口恢复、癌症以及皮肤基因治疗上有着重要的作用。人角蛋白细胞能表达粘附分子和细胞因子，能参与皮肤免疫和动态平衡。
黑色素细胞起源于外胚层的神经嵴，位于表皮的基底层，与表皮细胞共同组成表皮黑色素单位，其主要功能是产生黑色素小体保护皮肤免受损害。1960年Cruickshank首次报道体外培养黑色素细胞以来，由于培养技术未突破，一直未得到大量纯化的黑色素细胞。1982年，美国Eisinger和Marco用一种含有致癌因子TPA的培养基培养出大量人黑色素细胞，但仅能存活几个月。
近年来，对表皮细胞、表皮干细胞和黑色素细胞等单独培养方法的报导很多，但目前还未见到将三种细胞共培养成具有三维复层结构的表皮报道。
因此，建立一种表皮角质细胞、黑色素细胞和表皮干细胞三维结构表皮复层的制备方法与移植新技术具有重要的经济和社会意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种将三种细胞共培养成具有三维复层结构的表皮的3D复层结构细胞膜片的制备及其应用。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：一种3D复层结构细胞膜片的制备及其应用，其制备方法为：
1)、两步分离法，分离人皮肤干细胞、基底角质细胞和黑色素细胞等；
2)、3D复层结构表皮细胞膜片的培养方法，三种细胞无血清混合培养扩增及细胞的诱导分化培养出表皮细胞的3D复层结构细胞膜片；
3)、3D复层结构细胞膜片的剥离备用。
本发明中，上述3D复层结构细胞膜片的应用方法为：3D复层结构细胞膜片的移植：用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将复层结构表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎。
采用上述技术方案后，本发明具有以下有益效果：
1、两步分离法同时分离三种不同细胞，其第一步分离有效时间窗口为15-18小时，第二步分离有效时间窗口为8min，比传统的胰蛋白酶直接分离有效时间窗口2分钟安全150-300倍，分离细胞表面的膜受体和膜蛋白保持完整，细胞活性大于90％；细胞总收率大于3-8×106/cm2皮肤；
2、3D复层结构细胞膜片的共培养方法；Defined K-SFM培养基可同时扩增三种细胞，扩增倍数在100-120倍之间，是传统方法的5倍；该制备技术制备的3D复层结构细胞膜片中黑色素细胞和表皮细胞比例接近正常人表皮结构；
3、该3D复层结构表皮细胞膜片可用于白癜风、烧伤后色素减退等皮肤色素脱失性皮肤病的治疗及各种创伤的治疗，移植后皮肤复色效果接近或与本人肤色一致。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本具体实施方式采用以下技术方案：一种3D复层结构细胞膜片的制备及其应用，它的具体实施步骤如下：
(a)、人表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞的共分离：
在无菌条件下将无菌2×2cm2正常全层皮置于无菌的100mm培养皿中，用手术剪和手术镊将皮肤制备成直径为2mm×2mm组织颗粒，第一步皮肤样本一次消化，将组织颗粒置于2.4U/ml的Dispase中酶解，2-8℃酶解15-18小时。第二步皮肤样本二次消化，PBS(1X)冲洗第一步的Dispase，冲洗三次。将组织颗粒置于0.05％胰蛋白酶中二次酶解，37℃酶解8min，PBS(1X)稀释酶，过滤，离心分离，得到三种高活性种子细胞，包括短暂扩充细胞、毛囊干细胞、滤泡间表皮干细胞(Interfollicle Epidermal Stem Cell，(IFESCs)皮脂腺干细胞等，三种细胞活性分别达到90％以上，细胞总收率大于3-8×106/cm2皮肤。
(b)、三种细胞无血清混合扩增培养：
将三种种子细胞接种到培养皿上，细胞密度为1-2×106个细胞/直径60mm培养皿，加5ml Defined K-SFM培养基，37℃，5％CO2培养，三天后第一次换液，以后每48小时更换一次培养基，7-10天细胞达到90％的融合，每24小时更换一次培养基。经10-18天培养，细胞分化向3D复层结构生长，厚度为3-10层，形成具有三维结构的表皮细胞膜片。
(c)、3D复层结构细胞膜片的剥离方法：
配制0.6u/ml的Dispase，吸出培养皿中的Life培养基，另加入5ml新配制的0.6u/ml的Dispase，37℃培养箱中孵育40min-60min，用眼用镊慢慢将3D复层结构细胞膜片从培养皿底部轻轻剥离，置于无菌尼龙网上，用无菌PBS清洗3遍，置于密封瓶保存备用。
3D复层结构细胞膜片的应用：用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将复层结构表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎，3-6个月后皮损处可完全复色，无任何瘢痕。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.一种3D复层结构细胞膜片的制备，其制备方法为：
1)、两步分离法，分离人皮肤干细胞、基底角质细胞和黑色素细胞；
2)、3D复层结构表皮细胞膜片的培养方法：三种细胞无血清混合培养扩增及细胞的诱导分化培养出表皮细胞的3D复层结构细胞膜片；
3)、3D复层结构细胞膜片的剥离备用。
2.根据权利要求1所述的一种3D复层结构细胞膜片的制备，其特征在于，它的具体实施步骤如下：
(a)、人表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞的共分离：
在无菌条件下将无菌2×2cm2正常全层皮置于无菌的100mm培养皿中，用手术剪和手术镊将皮肤制备成直径为2mm×2mm组织颗粒，第一步皮肤样本一次消化，将组织颗粒置于2.4U/ml的Dispase中酶解，2-8℃酶解15-18小时；第二步皮肤样本二次消化，PBS 1X冲洗第一步的Dispase，冲洗三次；将组织颗粒置于0.05％胰蛋白酶中二次酶解，37℃酶解8min，PBS 1X稀释酶，过滤，离心分离，得到三种高活性种子细胞，包括短暂扩充细胞、毛囊干细胞、滤泡间表皮干细胞皮脂腺干细胞，三种细胞活性分别达到90％以上，细胞总收率大于3-8×106/cm2皮肤；
(b)、三种细胞无血清混合扩增培养：
将三种种子细胞接种到培养皿上，细胞密度为1-2×106个细胞/直径60mm培养皿，加5mlDefined K-SFM培养基，37℃，5％CO2培养，三天后第一次换液，以后每48小时更换一次培养基，7-10天细胞达到90％的融合，每24小时更换一次培养基；经10-18天培养，细胞分化向3D复层结构生长，厚度为3-10层，形成具有三维结构的表皮细胞膜片；
(c)、3D复层结构细胞膜片的剥离方法：
配制0.6u/ml的Dispase，吸出培养皿中的Life培养基，另加入5ml新配制的0.6u/ml的Dispase，37℃培养箱中孵育40min-60min，用眼用镊慢慢将3D复层结构细胞膜片从培养皿底部轻轻剥离，置于无菌尼龙网上，用无菌PBS清洗3遍，置于密封瓶保存备用。
3.一种3D复层结构细胞膜片的应用，其特征在于，3D复层结构细胞膜片的移植：用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将复层结构表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎。
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