CN105734009A - 体外重组人体皮肤表皮模型及其制备方法和应用 - Google Patents

体外重组人体皮肤表皮模型及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种体外重组人体皮肤表皮模型，在基底细胞层下表面有一层半桥粒蛋白，基底细胞层上表面覆盖有6～8层短凸起棘细胞的棘层细胞层，棘层细胞层上表面覆盖有由3～4层含有透明颗粒细胞的颗粒细胞层，颗粒细胞层上表面覆盖有角质细胞层，各细胞层之间分层明显，脂质组成整体屏障功能接近于人体皮肤。制备方法由制备基质胶微粒、筛选扩增表皮干细胞、制备基底细胞层、制备棘细胞层、制备颗粒细胞层、体外重组表皮模型的成熟与角化步骤组成。该模型在具有人体皮肤屏障修复功效的化妆品评价中的用途，在具有人体皮肤屏障修复功效的植物提取物筛选中的用途，在评价医疗器械材质对人体皮肤刺激性检测中的用途，在化学品皮肤刺激性检测中的用途。

Description

体外重组人体皮肤表皮模型及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及人体表皮模型。
背景技术
在生物医学研究领域中，针对皮肤洗护、接触物、护肤用品等的安全性评价一直采用动物实验为主要研究、验证模型。由于种间差异，实验动物无法精确复制人类皮肤表现出的复杂生物学、生理学特征，使实验结果存在偏差和片面性，甚至得出错误结论。随着欧盟动物保护福利和3R(减少、优化和替代)原则的推行，体外替代方法已经作为现代毒理学研究系统的主要模式和生物医学发展的新方向之一，被欧洲政府及国际法规所接受并推行。动物实验甚至成为国际贸易关系中的技术壁垒，因此，动物实验体外替代方法的开发和研究也逐渐受到了中国的重视。例如，以人源性细胞体外培养技术为基础构建的皮肤替代模型，被广泛应用于皮肤安全性评价以及化妆品功效性测试，为护肤相关产品的检测提供了精准工具。
皮肤是人体最大的器官，表皮是皮肤的最外层结构，由上到下主要分为：1.角质层，由多层扁平的角化细胞组成，是皮肤屏障的重要结构；2.颗粒层，位于角质层下方，典型特征是细胞质内含有许多透明角质颗粒；3.棘层，位于颗粒层下方，细胞较大，成多边形，向四周伸出许多细短的突起；4.基底层，位于基底膜上，由一层柱状基底细胞组成，具有活跃的增殖能力。
目前，国际上已有可用于体外皮肤安全性测试的重组皮肤模型，包括只由表皮结构和真皮脱细胞基质形成的皮肤模型；具有成纤维细胞真皮层和表皮层的全层皮肤模型以及含有成纤维细胞、表皮细胞和黑色素细胞的皮肤模型等。随着重组皮肤模型的研发与应用，促进了皮肤生物学研究领域中非临床研究工作的开展，如皮肤屏障渗透、创伤愈合、色素控制、皮肤力学性质、皮肤衰老以及皮肤疾病研究等。
含有表皮层和真皮层的全层皮肤，真皮层是通过对成纤维细胞体外诱导，使其发生细胞分化和胞外基质的形成等一系列变化，最终形成类似于真皮的结构。或者采用生物聚糖等材料或胶原作为支架，填充成纤维细胞，进行体外培养交联形成类真皮结构。然后在已构建的真皮表层，覆盖一定密度的表皮细胞，进行共培养，利用真表皮之间的相互作用及体外诱导因素，支持表皮细胞的生发和分化，最终形成结构类似于完整皮肤的模型。虽然表皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用更类似与天然皮肤的状态，但该模型在应用方面的优势特点报道很少，在化工产品的安全性评价应用方面的报道更少，主要用于皮肤生理的基础学研究。并且，模型构建工艺繁琐，制备周期长，结构复杂。此外，在应用中该类模型的制备也存在着一定的弊端，如在模型制备过程中，下层成纤维细胞的来源，数量以及状态的差异性对于表皮细胞的增殖及分化有较大影响，造成模型稳定性差，影响模型对化学物质评判的准确性。另外由于成纤维细胞在体外分化的过程中，会自身分泌的胶原，对外界的胶原支架或者其他生物材料支架进行塑形，易导致真皮部分乃至模型收缩，引起测试物从模型边缘的渗漏，干扰测试结果的评判；最后，成纤维细胞的存在也要求构建体系的培养液必须含有血清，引进了不可预估的安全风险。
为了排除成纤维体系的不稳定性，目前不含有成纤维细胞的体外重组皮肤模型被认为是用于评估、研究物质刺激性的优秀模型，其结构简单，不含真皮部分，但功能完善，应用广泛。
重组表皮模型的构建主要利用不含细胞的类真皮胞外基质作为支架材料或者是含有成纤维细胞的真皮结构支持表皮生发，体外诱导其分化形成典型的基底层，棘层，颗粒层以及角质层结构。模型在分化过程中，角质形成细胞经过分化和细胞外基质共同构成角质层，使得重组表皮模型具有类似天然皮肤同样的屏障功能，从而形成体外安全性检测的结构基础。
但其依然存在其他缺陷，所形成的表皮模型的屏障功能也和天然皮肤存在较大差异。在结构方面：颗粒层特征不显著，脂质板层及脂质组成异常，细胞间连接结构不完整。体外构建过程中模型容易出现收缩等现象，表皮模型和真皮基质之间的链接结构存在缺陷，易导致模型脱落等。这些方面的缺陷导致现有的重组表皮模型屏障功能不完善，对受试物的通透性偏高或者发生渗漏，从而对体外安全性测试结果的准确性造成影响，例如，Epiderm和Episkin是OECD批准通过的两款体外皮肤刺激性预测的动物替代模型，但其对刺激性标准品的判定均存在一定的误判。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种各细胞层之间分层明显、排列紧凑、皮肤屏障功能完整、类似于天然人体皮肤的体外重组皮肤模型。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种工艺简单、方法稳定、无须制备真皮类似物支架、得率高的体外重组人体皮肤表皮模型的制备方法。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于为体外重组人体皮肤表皮模型提供一种新用途。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：在基底细胞层的上表面覆盖有棘层细胞层、棘层细胞层的上表面覆盖有颗粒细胞层、颗粒细胞层的上表面覆盖有角质细胞层构成体外重组人体皮肤表皮模型。本发明的基底细胞层的下表面具有一层半桥粒蛋白；棘层细胞层由6～8层具有短凸起的棘细胞构成。本发明的颗粒细胞层由3～4层含有透明颗粒的细胞构成。
本发明的体外重组人体皮肤表皮模型的厚度为100～150μm。
上述的体外重组人体皮肤表皮模型的制备方法由下述步骤组成：
1、制备基质胶微粒
将基质胶用无血清表皮细胞培养液稀释至50～150μg/mL，置于36～37℃、5％CO2细胞培养箱，孵育2～4小时，基质胶溶液可形成胶颗粒逐渐沉降，弃去未凝固的基质胶，重复该步骤3次，得到基质胶颗粒。将基质胶颗粒置于真空干燥箱中进行冷冻干燥，得到粉末状具有三维结构的基质胶微粒。
基质胶是一种含有基底膜的主要成分的材料，包括层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白等。此外，还包含生长因子如转化生长因子，表皮生长因子，胰岛素样生长因子，成纤维细胞生长因子，组织纤溶酶原激活物等。将基质胶制备成微粒，可增加其表面积，
2、筛选扩增表皮干细胞
将离体的人皮肤组织浸没于1.2U/mL的质量分数为1％的Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶消化液中，37℃消化8～10分钟，无菌条件下用200目筛网过滤，离心，收集细胞，并制备成3×103个/ml～5×103个/ml的细胞悬液，细胞悬液与基质胶微粒按质量体积比为5：1混合，置于10ml的旋转培养系统进行微重力旋转培养，转速为22转/分，旋转培养20分钟，弃去培养液，完成表皮干细胞的筛选，得表皮干细胞。将新鲜的基质胶微粒与无血清表皮细胞培养液按质量体积比为5:1混合，制备成表皮干细胞扩增液。表皮干细胞在表皮干细胞扩增液中培养5～7天，隔天换液，完成表皮干细胞的扩增。
上述100mL的胰酶消化液中含0.025g胰酶、0.01g的乙二胺四乙酸。
由于本发明将基质胶制备成微粒，可增加其表面积，提高了表皮干细胞的筛选率。同时采用基质胶在体外模拟表皮干细胞的微环境，借助细胞外基质对表皮干细胞增殖的调控作用，实现种子细胞的优化，同时结合旋转培养系统实现干细胞体外的大量扩增；
3、制备基底细胞层
将表皮干细胞从基质胶微粒表面用胰酶消化液消化，用培养液TU1进行重悬，接种于细胞小室中，细胞接种密度为0.2×105～0.5×105个/cm2，在细胞小室内液下培养，在5％CO2、36～37℃的细胞培养箱中孵育24～48小时，制备成下表面具有一层半桥粒蛋白的基底细胞层。
该步骤中的表皮干细胞也可替换成表皮细胞与表皮干细胞按1:1～3数量比的混合物，其余步骤相同。
上述培养液TU1为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制。
4、制备棘细胞层
将步骤3中的培养液TU1替换为培养液TU2,在含有基底细胞层的细胞小室内添加150～200μl培养液TU2，在36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中孵育24～48小时，制备成6～8层具有短凸起的棘细胞层。
上述培养液TU2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素1-10mg、L-肉碱0.001～0.1mM、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙0.03～0.2mM，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制，基础液F12由美国Gibco公司生产。
5、制备颗粒细胞层
替换步骤4中的培养液TU2为培养液TA1，弃去步骤4中细胞小室内的TU2液体，进行气液面培养，36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中孵育72～96小时，48小时更换新鲜的培养液TA1，制备成由3～4层含有透明颗粒的细胞构成的颗粒细胞层。
上述培养液TA1为：500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、胰岛素1～10mg、氢化可的松10～100μg、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙0.03～0.2mM、L-丝氨酸0.01～0.1mM、棕榈酸0.01～0.05mM、油酸0.01～0.05mM、精氨琥珀酸0.05～0.1mM、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙1.0～1.5mM、维生素C15～25μg，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制。
6、体外重组表皮模型的成熟与角化
将步骤5中的培养液TA1更换为培养液TA2，进行气液面培养，置于33～35℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中培养4～5天，48小时更换新鲜的培养液TA2,制备成厚度为100～150μm的体外重组人体皮肤表皮模型。
上述培养液TA2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、胰岛素1～10mg、氢化可的松10～100μg、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙1.0～1.5mM、维生素C10～15μg、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子5～10μg，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合制成。
体外重组人体皮肤表皮模型在具有人体皮肤屏障修复功效的化妆品评价中的用途。其使用方法如下：
1、准备模型
每3个体外重组人体皮肤表皮模型准备1个无菌6孔板，被功效评价的化妆品准备9个体外重组人体皮肤表皮模型为实验组，另外9个体外重组人体皮肤表皮模型为对照组。
2、给药
将被功效评价的化妆品用无血清表皮细胞培养液稀释成质量分数为0.1％～1％的溶液，对体外重组人体皮肤表皮模型给药：每个实验组添加0.9ml化妆品溶液，对照组添加0.9ml无血清表皮细胞培养液，实验组和对照组置于37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱内孵育23～25小时。
3、评价化妆品的功效
用移液器吸取80μl体积浓度为1％的聚乙二醇辛基苯基醚分别滴加于对照组和实验组，分别进行不孵育和置于36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中孵育3和6小时，用杜氏磷酸盐缓冲液对体外重组人体皮肤表皮模型表面清洗，用棉签拭干实验组和对照组表面，转移至含有1mg/mL噻唑蓝溶液0.2mL的24孔培养板中，进行细胞活力检测。将24孔板转移到36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中，孵育3小时，从孔板中吸去噻唑蓝溶液，用杜氏磷酸盐缓冲溶液冲洗，弃去，重复此过程3次，转移到另一个24孔培养板中，在实验组和对照组表面添加2ml异丙醇，用石蜡封口密封24孔板，4℃静置12～14小时浸提，采用200μl移液器枪尖刺穿培养小室底部，使浸提物流到培养孔中。丢弃被刺穿的体外重组人体皮肤表皮模型，培养孔中溶液吹打3次，吸取200μl的浸提物到96孔板中；用分光光度计在550～570nm波长处读取吸光度OD值。
以步骤3中对照组不孵育条件下体外重组人体皮肤表皮模型的吸光度值所对应的活力为100％，按下式计算实验组和对照组孵育3小时、孵育6小时的相对细胞活力，细胞相对活力计算公式为：
相对细胞活力％＝实验组OD值/对照组OD值。
绘制实验组和对照组不同时间的细胞活力曲线，孵育时间为横坐标，体外重组人体皮肤表皮模型的细胞活力为纵坐标，实验组孵育3小时、6小时的细胞活力高于对照组，该试验化妆品具有皮肤屏障修复功效。
体外重组人体皮肤表皮模型在具有人体皮肤屏障修复功效的植物提取物筛选中的用途。其使用方法如下：
1、准备模型
每3个体外重组人体皮肤表皮模型准备1个无菌6孔板，被评价功效的每种活性物准备9个体外重组人体皮肤表皮模型为实验组，另外9个体外重组人体皮肤表皮模型作为对照组。
2、给药
将被功效评价植物提取物用无血清表皮细胞培养液稀释成质量分数为0.01％～0.1％的溶液，制备成活性物溶液，对体外重组人体皮肤表皮模型给药：每个实验组给药0.9ml活性物溶液，对照组添加0.9ml表皮细胞培养液，实验组和对照组置于37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱内孵育23～25小时。
3、评价植物提取物的人体皮肤屏障修复功效
用移液器吸取80μl体积浓度为1％的聚乙二醇辛基苯基醚分别滴加于对照组和实验组，分别进行不孵育和置于36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中孵育3和6小时，用杜氏磷酸盐缓冲液对体外重组人体皮肤表皮模型表面清洗，用棉签拭干实验组和对照组表面，转移至含有1mg/mL噻唑蓝溶液0.2mL的24孔培养板中，进行细胞活力检测；将24孔板转移到36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中，孵育3小时，从孔板中吸去噻唑蓝溶液，用杜氏磷酸盐缓冲溶液冲洗，弃去，重复此过程3次，转移到另一个24孔培养板中，在实验组和对照组表面添加2ml异丙醇，用石蜡封口密封24孔板，4℃静置12～14小时浸提，采用200μl移液器枪尖刺穿培养小室底部，使浸提物流到培养孔中；丢弃被刺穿的体外重组人体皮肤表皮模型，培养孔中溶液吹打3次，吸取200μl的浸提物到96孔板中；用分光光度计在550～570nm波长处读取吸光度OD值。
以步骤3中对照组不孵育条件下体外重组人体皮肤表皮模型的吸光度值所对应的活力为100％，按下式计算实验组和对照组孵育3小时、孵育6小时的相对细胞活力，细胞相对活力计算公式为：
相对细胞活力％＝实验组OD值/对照组OD值。
绘制实验组和对照组不同时间的细胞活力曲线，孵育时间为横坐标，体外重组人体皮肤表皮模型的细胞活力为纵坐标，实验组孵育3小时、6小时的细胞活力高于对照组，该试验制备化妆品的材料具有皮肤屏障修复功效。
体外重组人体皮肤表皮模型在评价医疗器械材质对人体皮肤刺激性检测中的用途。其使用方法如下：
1、准备样品
将试验的医疗器械材质分别在3～5倍的生理盐水和棉籽油中于36～37℃、浸提70～74小时作为实验组，体积浓度为1％的十二烷基磺酸钠作为阳性对照组，杜氏磷酸盐缓冲溶液为阴性对照组，棉籽油为溶剂对照组。
2、测试安全性
(1)准备5个6孔板，每孔放置一个表面积为0.5cm2的体外重组人体皮肤表皮模型，将100μL的医疗器械材质两种浸提液、阳性对照、阴性对照、棉籽油分别加在体外重组人体皮肤表皮模型表面，置于36～37℃、5％CO2、95％湿度的细胞培养箱中孵育24小时。
(2)取出体外重组人体皮肤表皮模型，准备3个无菌24孔板，用于细胞活力检测。
(3)用杜氏酸盐缓冲溶液洗体外重组人体皮肤表皮模型15次，用无菌纱布或无菌棉棒擦拭。
(4)将表面干燥的体外重组人体皮肤表皮模型转移到含有1mg/mL噻唑蓝溶液的24孔板中，每孔0.3mL，在36～37℃、5％CO2、95％湿度的细胞培养箱中避光孵育3小时。
(5)用移液器吸除噻唑蓝溶液，将体外重组人体皮肤表皮模型完全浸没至每孔含2mL异丙醇的24孔板，用封口膜密封，在4℃静置提取12～16小时，得到异丙醇的浸提物。
(6)采用200μl移液器枪尖刺穿培养小室底部，使体外重组人体皮肤表皮模型的异丙醇浸提物流到培养孔中。吸取200μl的到异丙醇浸提物到96孔板中。
(7)测量吸光度：用96孔板分光光度计检测在波长为550～570nm的吸光度OD值。
(8)判定刺激性：以阴性对照组的吸光度值为分母，医疗器械材质浸提组的吸光度OD值为分子，比值的百分数作为实验组的相对细胞活力，计算医疗器械材质的相对细胞活力，相对细胞活力高于50％，被检测医疗器械材质无刺激性，相对细胞活力低于50％，被检测医疗器械材质有刺激性。
体外重组人体皮肤表皮模型在评价化学物质对人体皮肤刺激性检测中的用途，其使用方法如下：
1、准备模型
每3个体外重组人体皮肤表皮模型准备1个无菌6孔板，在第一排孔中添加0.9ml的无血清表皮细胞培养液。被评价的化学品为实验组，杜氏酸盐缓冲溶液作为阴性对照组，5％十二烷基硫酸钠作为阳性对照组。实验组，阴性对照组和阳性对照组各准备3个体外重组人体皮肤模型。
2、给药
实验组为液体化学物质：在每个体外重组人体皮肤表皮模型表面滴25μl液体测试物，不可按压表皮模型表面。
实验组为半固体化学物质：采用容积式吸管吸取25μl测试物滴加于体外重组人体皮肤表皮模型表面。
实验组为固体化学物质：给药前，在体外重组人体皮肤表皮模型表面滴加25μl杜氏酸盐缓冲溶液湿润表皮模型表面，加入25mg受试物，轻摇体外重组人体皮肤表皮模型。
实验组为蜡样粘稠化学物质：把受试物压制成直径为8mm的圆形的扁平薄片，将受试物置于体外重组人体皮肤模型表面。
给药后，将所有的6孔板转移到细胞培养箱，37±1℃、5±1％CO2、95％相对湿度，培养30分钟。
3、清洗
用杜氏磷酸缓冲液冲洗体外重组人体皮肤表皮模型表面的化学物质，将体外重组人体皮肤表皮模型浸没杜氏磷酸盐缓冲溶液中并振摇，除去残余的化学品，重复浸洗3次。抖掉体外重组人体皮肤表皮模型表面残留的杜氏磷酸盐缓冲液，用无菌吸水纸吸去残留的液体，将体外重组人体皮肤表皮模型转移到6孔板的第二排里(已加过培养液)。
阴性对照组和阳性对照组操作同上。
4、给药孵育
将所有的6孔板转移到细胞培养箱中，37±1℃、5±1％CO2、95％相对湿度培养24小时，从细胞培养箱中取出，转移到无菌工作台上，更换无血清表皮细胞培养液，每孔0.9ml。继续在细胞培养箱中37±1℃、5±1％CO2、95％相对湿度培养培养18小时，取出。
5、判定化学品的刺激性
(1)将体外重组人体皮肤表皮模型转移到含有1mg/mL的噻唑蓝溶液的24孔板中，每孔0.3mL，在36～37℃、5％CO2、95％湿度的细胞培养箱中避光孵育3小时。
(2)用移液器吸除噻唑蓝溶液，将体外重组人体皮肤表皮模型浸没至每孔含2mL异丙醇的24孔板，用封口膜密封，4℃静置提取12～16小时，得异丙醇浸提物。
(3)用200μl移液器枪尖刺穿培养小室底部，使体外重组人体皮肤表皮模型的异丙醇浸提物流到培养孔中，吸取200μl异丙醇浸提物到96孔板内。
(4)用96孔板分光光度计检测在波长为550～570nm的吸光度OD值。
(5)以阴性对照组的吸光度值为分母，实验组的吸光度OD值为分子，比值的百分数为实验组的相对细胞活力，计算化学品的相对细胞活力，相对细胞活力高于50％，被检测化学品无皮肤刺激性，相对细胞活力低于50％，被检测化学品具有皮肤刺激性。
由于本发明采用了表皮干细胞作为种子细胞进行构建，细胞活力旺盛，状态良好，体外构建可诱导潜能大。通过表皮干细胞自身对基底膜组分的粘附性的特性进行筛选，获得大量的表皮干细胞，发现干细胞表面标志物整合蛋白β1，角蛋白19高表达，分化相关的标志物角蛋白10处于阴性状态，表明该方法可以稳定地实现干细胞性强的种子细胞制备。所筛选的细胞性强，体外构建不依赖于底面支架材料以及滋养细胞的支持，可独立生发形成完整的表皮结构；在构建培养基中加入角质层脂质合成的前体和原料，保证了体外条件下角质层脂质板层的正常发育和角质层脂质组分的正确表达，使角质层微观结构及屏障性能更接近于天然状态，与天然皮肤具有一致性。此外，本发明制备方法稳定，无须制备真皮类似物支架，避免了动物血清使用以及表皮细胞状态差异对模型最终质量的影响。
采用本发明方法制备的体外重组人体皮肤表皮模型与同类产品相比，具有清晰完整的基底细胞层、棘层细胞层、颗粒细胞层、角质细胞层，各细胞层之间分层明显，角质细胞层呈编花篮状紧凑排列，颗粒细胞层内含颗粒清晰。对经合组织测试指南439文件中规定的20种皮肤刺激性判定标准品的测试误判率(15％)低于市场上同类产品，例如美国Mattek的Epiderm(20％)和欧盟推荐的皮肤替代模型Episkin(20％)，说明模型屏障功能成熟，细胞间连接结构完整，脂质组成整体屏障功能接近于人体皮肤。可用于替换化学物品的刺激性、安全性动物实验，还可用于化妆品皮肤屏障修护的功效评价。
附图说明
图1是体外重组人体皮肤表皮模型与天然皮肤结构的组织学染色对比结果照片。
图2是体外重组人体皮肤表皮模型用透射电镜观测脂质板层结构照片。
图3是图2中矩形框内放大4000倍的结构照片。
图4是体外重组人体皮肤表皮模型的丝聚蛋白的免疫组织化学染色结果照片。
图5是体外重组人体皮肤表皮模型兜甲蛋白的免疫组织化学染色结果照片。
图6是体外重组人体皮肤表皮模型与人体皮肤角质层脂质屏障组分的薄层色谱照片。
图7体外重组人体皮肤表皮模型的化妆品屏障功效曲线。
图8是植物提取物神经酰胺及化妆品皮肤屏障修复精华乳皮肤屏障修复功效评价结果曲线。
图9是体外重组人体皮肤表皮模型的两种医疗器械材料细胞活力结果图。
图10是体外重组人体皮肤表皮模型基底细胞层下方形成的半桥粒蛋白结构在显微镜下放大4000倍的照片。
图11是体外重组人体皮肤表皮模型对经合组织测试文件439中20种关于皮肤刺激性标准品的判定结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施的体外重组人体皮肤表皮模型由基底细胞层、棘层细胞层、颗粒细胞层、角质细胞层构成。基底细胞层的下表面具有一层半桥粒蛋白，在基底细胞层的上表面覆盖有棘层细胞层，棘层细胞层由7层具有短凸起的棘细胞构成，棘层细胞层的上表面覆盖有颗粒细胞层，颗粒细胞层由3层含有透明颗粒的细胞构成，颗粒细胞层的上表面覆盖有角质细胞层。本实施例的体外重组人体皮肤表皮模型的厚度120μm。
上述的体外重组人体皮肤表皮模型的制备方法由下述步骤组成：
1、制备基质胶微粒
将基质胶用无血清表皮细胞培养基稀释至50～150μg/mL，置于36～37℃、5％CO2培养箱，孵育2～4小时，基质胶溶液形成胶颗粒逐渐沉降，弃去未凝固的基质胶，重复该步骤3次，得基质胶颗粒，将基质胶颗粒置于真空干燥箱中进行冷冻干燥，制备成基质胶微粒。
2、筛选扩增表皮干细胞
将离体的3块1cm2人皮肤组织浸没于1.2U/mL的质量分数为1％的Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶消化液中，37℃消化8～10分钟，无菌条件下用200目筛网过滤，离心，收集细胞，制备成4×103个/ml的细胞悬液，细胞悬液与基质胶微粒按质量体积比为5：1混合，置于10ml的旋转培养系统进行微重力旋转培养，转速为22转/分，旋转培养20分钟，弃去培养液，得表皮干细胞，将新鲜的基质胶微粒与无血清表皮细胞培养液按质量体积比为5:1混合，制备成表皮干细胞扩增液。表皮干细胞在表皮干细胞扩增液中培养5～7天，隔天换液，完成表皮干细胞的扩增。
上述100mL的胰酶消化液中含0.025g胰酶、0.01g的乙二胺四乙酸。
3、制备基底细胞层
将表皮干细胞从基质胶表面用胰酶消化液消化，用培养液TU1进行重悬，接种于细胞小室中，细胞接种密度为0.3×105个/cm2，在细胞小室内液下培养，置于5％CO2、36～37℃的细胞培养箱中孵育36小时，制备成下表面具有一层半桥粒蛋白的基底细胞层。
该步骤中的表皮干细胞也可替换成表皮细胞与表皮干细胞按1:2数量比的混合物，表皮细胞与表皮干细胞的数量比在1:1～3范围内任意混合，其余步骤相同。
上述培养液TU1为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子3μg、腺嘌呤15mg、转铁蛋白2.5～64μg、角质形成细胞生长因子3μg，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制。
4、制备棘细胞层
将步骤3中的培养液TU1替换为培养液TU2,在含有基底细胞层的细胞小室内添加150～200μl培养液TU2，在36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中孵育36小时，制备成7层具有短凸起的棘细胞层；
上述培养液TU2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子3μg、腺嘌呤15mg、转铁蛋白4μg、角质形成细胞生长因子3μg、胰岛素4.5mg、L-肉碱0.05mM、牛血清白蛋白0.03mM、氯化钙0.1mM，该基础液用F12(由美国Gibico公司生产)与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制；
5、制备颗粒细胞层
替换步骤4中的培养液TU2为培养液TA1，弃去步骤4中细胞小室内的TU2液体，进行气液面培养，36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中孵育72小时，48小时更换新鲜的培养液TA1，制备成由3层含有透明颗粒的细胞构成的颗粒细胞层。
上述培养液TA1为：500mLFAD基础液中添加表皮生长因子3μg、腺嘌呤15mg、转铁蛋白4.5μg、胰岛素6mg、氢化可的松55μg、牛血清白蛋白0.03mM、氯化钙0.1mM、L-丝氨酸0.05mM、棕榈酸0.03mM、油酸0.03mM、精氨琥珀酸0.08mM、牛血清白蛋白0.03mM、氯化钙1.25mM、维生素C20μg，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制。
6、体外重组表皮模型的成熟与角化
将步骤5中的培养液TA1更换为培养液TA2，进行气液面培养，置于33～35℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中培养4～5天，48小时更换新鲜的培养液TA2。
制备成厚度为120μm的体外重组人体皮肤表皮模型。
上述培养液TA2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子3μg、胰岛素5mg、氢化可的松55μg、牛血清白蛋白0.03mM、氯化钙1.25mM、维生素C12,5μg、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子7.5μg，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合制成。
实施例2
本实施的体外重组人体皮肤表皮模型由基底细胞层、棘层细胞层、颗粒细胞层、角质细胞层构成。基底细胞层的下表面具有一层半桥粒蛋白，在基底细胞层的上表面覆盖有棘层细胞层，棘层细胞层由6层具有短凸起的棘细胞构成，棘层细胞层的上表面覆盖有颗粒细胞层，颗粒细胞层由3层含有透明颗粒的细胞构成，颗粒细胞层的上表面覆盖有角质细胞层。本实施例的体外重组人体皮肤表皮模型的厚度120μm。
其制备方法如下：
1、制备基质胶微粒
该步骤与实施例1相同。
2、筛选扩增表皮干细胞
将离体的人皮肤组织浸没于1.2U/mL的质量分数为1％的Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶消化液中，37℃消化8～10分钟，无菌条件下用200目筛网过滤，离心，收集细胞，并制备成3×103个/ml的细胞悬液，细胞悬液与基质胶微粒按质量体积比为5：1混合，置于10ml的旋转培养系统进行微重力旋转培养，转速为22转/分，旋转培养20分钟，弃去培养液，完成表皮干细胞的筛选，得表皮干细胞。
该步骤的其它步骤与实施例1相同。
3、制备基底细胞层
将表皮干细胞从基质胶表面用胰酶消化液消化，用培养液TU1进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的细胞小室中，细胞接种密度为0.2×105，在细胞小室内液下培养，置于5％CO2、36～37℃的细胞培养箱中培养24小时，制备成下表面具有一层半桥粒蛋白的基底细胞层，基底细胞层呈柱状排列。
上述培养液TU1与实施例1相同。
4、制备棘细胞层
将步骤3中的培养液TU1替换为培养液TU2,在含有基底细胞层的细胞小室内添加150～200μl培养液TU2，置于5％CO2、36～37℃的细胞培养箱中孵育24小时，制备成6层具有短凸起的棘细胞层。
上述培养液TU2与实施例1相同。
5、制备颗粒细胞层
将步骤4中的培养液TU2替换为培养液TA1，进行气液面培养，将步骤3中细胞小室内的液体弃掉，5％CO2、36～37℃的孵箱中培养72小时，48小时更换新鲜的培养液TA1，制备成由3层含有透明颗粒的细胞构成的颗粒细胞层。
上述培养液TA1与实施例1相同。
其它步骤与实施例1相同，制备成体外重组人体皮肤表皮模型，该模型的厚度为100μm。
实施例3
本实施的体外重组人体皮肤表皮模型由基底细胞层、棘层细胞层、颗粒细胞层、角质细胞层构成。基底细胞层的下表面具有一层半桥粒蛋白，在基底细胞层的上表面覆盖有棘层细胞层，棘层细胞层由8层具有短凸起的棘细胞构成，棘层细胞层的上表面覆盖有颗粒细胞层，颗粒细胞层由4层含有透明颗粒的细胞构成，颗粒细胞层的上表面覆盖有角质细胞层。本实施例的体外重组人体皮肤表皮模型的厚度150μm。
其制备方法如下：
1、制备基质胶微粒
该步骤与实施例1相同。
2、筛选扩增表皮干细胞
将离体的人皮肤组织浸没于1.2U/mL的质量分数为1％的Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶消化液中，37℃消化8～10分钟，无菌条件下用200目筛网过滤，离心，收集细胞，并制备成5×103个/ml的细胞悬液，细胞悬液与基质胶微粒按质量体积比为5：1混合，置于10ml的旋转培养系统进行微重力旋转培养，转速为22转/分，旋转培养20分钟，弃去培养液，完成表皮干细胞的筛选，得表皮干细胞。
该步骤的其它步骤与实施例1相同。
3、制备基底细胞层
将表皮干细胞从基质胶表面用胰酶消化液消化，用培养液TU1进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的细胞小室中，接种密度为0.5×105个/cm2，在细胞小室内液下培养，置于5％CO2、36～37℃的细胞培养箱中培养48小时，制备成下表面具有一层半桥粒蛋白的基底细胞层，基底细胞层呈柱状排列。
上述培养液TU1与实施例1相同。
4、制备棘细胞层
将步骤3中的培养液TU1替换为培养液TU2,在含有基底细胞层的细胞小室内添加150～200μl培养液TU2，置于5％CO2、36～37℃的细胞培养箱中孵育48小时，制备成8层具有短凸起的棘细胞层。
上述培养液TU2与实施例1相同。
5、制备颗粒细胞层
将步骤4中的培养液TU2替换为培养液TA1，进行气液面培养，将步骤3中细胞小室内的液体弃掉，5％CO2、36～37℃的孵箱中培养96小时，48小时更换新鲜的培养液TA1，制备成由4层含有透明颗粒的细胞构成的颗粒细胞层。
上述培养液TA1与实施例1相同。
其它步骤与实施例1相同，制备成体外重组人体皮肤表皮模型，该模型的厚度为150μm。
实施例4
在以上的实施例1～3中，体外重组人体皮肤表皮模型的结构与相应的实施例相同。
其制备方法如下：
制备基质胶微粒步骤1和筛选扩增表皮干细胞步骤2与相应的实施例相同。
在制备基底细胞层步骤3中，所用的培养液TU1为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5μg、腺嘌呤5mg、转铁蛋白2.5μg、角质形成细胞生长因子0.5μg，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制，该步骤中的其它步骤与实施例1相同。
在制备棘细胞层步骤4中，所用的培养液TU2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5μg、腺嘌呤5mg、转铁蛋白2.5μg、角质形成细胞生长因子0.5μg、胰岛素1mg、L-肉碱0.001mM、牛血清白蛋白0.01mM、氯化钙0.03mM，该基础液用F12(由美国invitrogen公司生产)与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制。该步骤中的其它步骤与实施例1相同。
在制备颗粒层步骤5中，所用的培养液TA1为：500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5μg、腺嘌呤5mg、转铁蛋白2.5μg、胰岛素1mg、氢化可的松10μg、牛血清白蛋白0.01mM、氯化钙0.03mM、L-丝氨酸0.01mM、棕榈酸0.01mM、油酸0.01mM、精氨琥珀酸0.05mM、牛血清白蛋白0.01mM、氯化钙1.0mM、维生素C15μg，基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制。该步骤中的其它步骤与实施例1相同。
在体外重组表皮模型的成熟与角化步骤6中，所用的培养液TA2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5μg、胰岛素1mg、氢化可的松10μg、牛血清白蛋白0.01mM、氯化钙1.0mM、维生素C10μg、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子5μg，基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合制成。该步骤中的其它步骤与实施例1相同。
其它步骤与实施例1相同。制备成体外重组人体皮肤表皮模型。
实施例5
在以上的实施例1～3中，体外重组人体皮肤表皮模型的结构与相应的实施例相同。
其制备方法如下：
制备基质胶微粒步骤1和筛选扩增表皮干细胞步骤2与相应的实施例相同。
在制备基底细胞层步骤3中，所用的培养液TU1为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子5μg、腺嘌呤25mg、转铁蛋白6μg、角质形成细胞生长因子5μg，基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制，该步骤中的其它步骤与实施例1相同。
在制备棘细胞层步骤4中，所用的培养液TU2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子5μg、腺嘌呤25mg、转铁蛋白6μg、角质形成细胞生长因子5μg、胰岛素10mg、L-肉碱0.01mM、牛血清白蛋白0.06mM、氯化钙0.2mM，基础液用F12(由美国invitrogen公司生产)与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制。该步骤中的其它步骤与实施例1相同。
在制备颗粒层步骤5中，所用的培养液TA1为：500mLFAD基础液中添加表皮生长因子5μg、腺嘌呤25mg、转铁蛋白6μg、胰岛素10mg、氢化可的松100μg、牛血清白蛋白0.05mM、氯化钙0.2mM、L-丝氨酸0.1mM、棕榈酸0.05mM、油酸0.05mM、精氨琥珀酸0.1mM、牛血清白蛋白0.05mM、氯化钙1.5mM、维生素C215μg，基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制。该步骤中的其它步骤与实施例1相同。
在体外重组表皮模型的成熟与角化步骤6中，所用的培养液TA2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子5μg、胰岛素10mg、氢化可的松100μg、牛血清白蛋白0.05mM、氯化钙1.5mM、维生素C15μg、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子10μg，基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合制成。该步骤中的其它步骤与实施例1相同。
其它步骤与实施例1相同。制备成体外重组人体皮肤表皮模型。
实施例6
以实施例1制备的体外重组人体皮肤表皮模型在具有人体皮肤屏障修复功效的精华乳化妆品评价中的用途为例，其使用方法如下：
1、准备模型
本实施例的每个体外重组人体皮肤表皮模型的表面积为0.5cm2，每3个体外重组人体皮肤表皮模型准备1个无菌6孔板，被功效评价的精华乳化妆品准备9个体外重组人体皮肤表皮模型为实验组，另外9个体外重组人体皮肤表皮模型作为对照组。
2、给药
将被功效评价的精华乳化妆品用无血清表皮细胞培养液稀释成质量分数为0.1％～1％的溶液，对体外重组人体皮肤表皮模型给药：每个实验组添加0.9ml精华乳化妆品溶液，对照组添加0.9ml无血清表皮细胞，实验组和对照组置于37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱内孵育24小时，也可在23～25小时范围内任意选取时间。
3、评价化妆品的功效
用移液器吸取80μl体积浓度为1％的聚乙二醇辛基苯基醚分别滴加于对照组和实验组，分别进行不孵育和置于36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中孵育3和6小时，用杜氏磷酸盐缓冲液对体外重组人体皮肤表皮模型表面清洗，用棉签拭干实验组和对照组表面，转移至含有1mg/mL噻唑蓝溶液0.2mL的24孔培养板中，进行细胞活力检测。将24孔板转移到36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中，孵育3小时，从孔板中吸去噻唑蓝溶液，用杜氏磷酸盐缓冲溶液冲洗，弃去，重复此过程3次，转移到另一个24孔培养板中，在实验组和对照组表面添加2ml异丙醇，用石蜡封口密封24孔板，4℃静置12小时浸提，也可在12～14小时范围内任意选取浸提时间，采用200μl移液器枪尖刺穿培养小室底部，使浸提物流到培养孔中。丢弃被刺穿的体外重组人体皮肤表皮模型，培养孔中溶液吹打3次，吸取200μl的浸提物到96孔板中；用分光光度计在570nm波长处读取吸光度OD值，也可在波长为550～570nm的范围内检测吸光度OD值。
以步骤3中对照组不孵育条件下体外重组人体皮肤表皮模型的吸光度值所对应的活力为100％，按下式计算实验组和对照组孵育3小时、孵育6小时的相对细胞活力，细胞相对活力计算公式为：
相对细胞活力％＝实验组OD值/对照组OD值。
绘制实验组和对照组不同时间的细胞活力曲线见图8。在图8中，孵育时间为横坐标，体外重组人体皮肤表皮模型的细胞活力为纵坐标，曲线a为对照组不同时间的细胞活力曲线的细胞活力曲线，曲线c为皮肤屏障修复精华乳不同时间的细胞活力曲线的细胞活力曲线。由图8可见，实验组孵育3小时、6小时的细胞活力高于对照组，说明该试验化妆品具有皮肤屏障修复功效。
实施例7
以实施例1制备的体外重组人体皮肤表皮模型在具有人体皮肤屏障修复功效的植物提取物神经酰胺筛选中的用途为例，其使用方法如下：
1、准备模型
植物神经酰胺是化妆品中添加的一种具有皮肤屏障修复作用的活性物原料，本实施例的每个体外重组人体皮肤表皮模型的表面积为0.5cm2，每3个体外重组人体皮肤表皮模型准备1个无菌6孔板，被功效评价的植物神经酰胺准备9个体外重组人体皮肤表皮模型为实验组，另外9个体外重组人体皮肤表皮模型作为对照组。
2、给药
在该步骤中，将精华乳化妆品替换为植物神经酰胺，该步骤的其它步骤与实施例6的给药步骤相同。
3、评价植物提取物的人体皮肤屏障修复功效
该步骤与实施例6的评价化妆品的功效步骤3相同。绘制实验组不同时间的细胞活力曲线见图8。在图8中，曲线b为神经酰胺的不同时间的细胞活力曲线。由图8可见，实验组孵育3小时、6小时的细胞活力高于对照组，说明该试验化妆品具有皮肤屏障修复功效。
实施例8
以实施例1制备的体外重组人体皮肤表皮模型在评价高压注射器材质为聚碳酸酯对人体皮肤刺激性检测中的用途为例，其使用方法如下：
1、准备样品
将试验的高压注射器材质为聚碳酸酯分别在3～5倍的生理盐水和棉籽油中于37℃浸提72小时作为实验组，也可在36～37℃、70～74小时范围内任意选取浸提温度和浸提时间，体积浓度为1％的十二烷基磺酸钠作为阳性对照组，杜氏磷酸盐缓冲溶液为阴性对照组，棉籽油为溶剂对照组。
2、测试安全性
(1)在5个预标记的6孔板每孔放置一个表面积为0.5cm2的体外重组人体皮肤表皮模型，将100μL的聚碳酸酯两种浸提液、阳性对照、阴性对照、棉籽油分别加在体外重组人体皮肤表皮模型表面，置于36～37℃、5％CO2、95％湿度的细胞培养箱中孵育24小时。
(2)取出体外重组人体皮肤表皮模型，准备3个无菌24孔板，用于细胞活力检测。
(3)用杜氏酸盐缓冲溶液洗体外重组人体皮肤表皮模型15次，用无菌纱布或无菌棉棒擦拭。
(4)将表面干燥的体外重组人体皮肤表皮模型转移到含有1mg/mL噻唑蓝溶液的24孔板中，每孔0.3mL，在37℃、5％CO2、95％湿度的细胞培养箱中避光孵育3小时，也可在36～37℃范围内，任意选取孵育温度。
(5)用移液器吸除噻唑蓝溶液，将体外重组人体皮肤表皮模型完全浸没至每孔含2mL异丙醇的24孔板，用封口膜密封，在4℃静置提取14小时，也可在12～16小时范围内任意选取静置提取时间，得到异丙醇的浸提物。
(6)采用200μl移液器枪尖刺穿培养小室底部，使体外重组人体皮肤表皮模型的异丙醇浸提物流到培养孔中。吸取200μl的到异丙醇浸提物到96孔板中。
(7)测量吸光度：用96孔板分光光度计检测在波长为570nm的吸光度OD值，也可在波长为550～570nm的范围内检测吸光度OD值。
(8)判定刺激性：以阴性对照组的吸光度值为分母，高压注射器浸提组的吸光度值为分子，比值的百分数作为实验组的相对细胞活力。实验结果见图9，图9表明，高压注射器生理盐水浸提的相对细胞活力为57.6％，高压注射器棉籽油浸提的相对细胞活力为93.4％，说明试验的高压注射器的材质聚碳酸酯无人体皮肤刺激性。(相对细胞活力高于50％，被检测的医疗器械无刺激性，相对细胞活力低于50％，被检测的医疗器械有刺激性。)
实施例9
以实施例1制备的体外重组人体皮肤表皮模型在评价种植牙愈合帽材质聚二醚酮对人体皮肤刺激性检测中的用途为例，其使用方法如下：
1、准备样品
将试验的种植牙愈合帽的材质聚二醚酮分别在3～5倍的生理盐水和棉籽油中于37℃浸提72小时作为实验组，也可在36～37℃、70～74小时范围内任意选取浸提温度和浸提时间，体积浓度为1％的十二烷基磺酸钠作为阳性对照组，杜氏磷酸盐缓冲溶液为阴性对照组，棉籽油为溶剂对照组。
2、测试安全性
将该步骤中的高压注射器替换为种植牙愈合帽，该步骤中的步骤(1)～(6)与实施例8相同。
在判定刺激性步骤(7)中，以阴性对照组的吸光度值为分母，种植牙愈合帽浸提组的吸光度值为分子，比值的百分数作为实验组的相对细胞活力。实验结果见图9，在图9中，种植牙愈合帽生理盐水浸提的相对细胞活力为93.3％，种植牙愈合帽生理盐水浸提的相对细胞活力为96％，表明被检测的种植牙愈合帽的材质聚二醚酮无人体皮肤刺激性。(相对细胞活力高于50％，被检测的医疗器械无刺激性，相对细胞活力低于50％，被检测的医疗器械有刺激性。)
实施例10
以实施例1制备的体外重组人体皮肤表皮模型在评价化学物质对人体皮肤刺激性检测中的用途，其使用方法如下：
1.准备样品
以经合组织测试指南439皮肤刺激性文件中规定的20种皮肤刺激性判定标准品作为不同实验组。以杜氏磷酸盐缓冲液作为阴性对照组，以0.5％的十二黄基硫酸钠作为阳性对照。每个实验组和对照组分别准备3个体外重组人体表皮模型，每3个体外重组人体表皮模型准备1个无菌6孔板，并在第一排空中添加0.9ml的培养液。其中20种皮肤刺激性标准品具体名称及临床皮肤刺激性参见表1。
表1经合组织测试文件439中20种皮肤刺激性标准品名称及属性
编号 名称 联合国全球化学品统一分类和标签系统标准
1 1-溴-4-氯丁烷 非刺激性
2 邻苯二甲酸二乙酯 非刺激性
3 1-萘乙酸 非刺激性
4 苯氧乙酸烯丙酯 非刺激性
5 异丙醇 非刺激性
6 1-癸醇 刺激性
7 兔耳草醛 刺激性
8 溴己烷 刺激性
9 2-氯甲基-3,5-二甲基-4-甲氧基吡啶盐酸盐 刺激性
10 二丙基二硫醚 刺激性
11 4-甲基硫代苯甲醛 非刺激性
12 硬脂酸甲酯 非刺激性
13 丁酸庚酯 非刺激性
14 水杨酸己酯 非刺激性
15 肉桂醛 非刺激性
16 6647氢氧化钾 刺激性
17 2-甲基-5-叔丁基噻吩 刺激性
18 1-甲基-3-苯基哌嗪 刺激性
19 庚醛 刺激性
20 四氯乙烯 刺激性
2、给药
实验组为液体化学物质：在每个体外重组人体皮肤表皮模型表面滴25μl液体测试物，不可按压表皮模型表面。
实验组为半固体化学物质：采用容积式吸管吸取25μl测试物滴加于体外重组人体皮肤表皮模型表面。
实验组为固体化学物质：给药前，在体外重组人体皮肤表皮模型表面滴加25μl杜氏酸盐缓冲溶液湿润表皮模型表面，加入25mg受试物，轻摇体外重组人体皮肤表皮模型。
实验组为蜡样粘稠化学物质：把受试物压制成直径为8mm的圆形的扁平薄片，将受试物置于体外重组人体皮肤模型表面。
给药后，将所有的6孔板转移到细胞培养箱，37±1℃、5±1％CO2、95％相对湿度，培养30分钟。
3、清洗
用杜氏磷酸缓冲液冲洗体外重组人体皮肤表皮模型表面的化学物质，将体外重组人体皮肤表皮模型浸没杜氏磷酸盐缓冲溶液中并振摇，除去残余的化学品，重复浸洗3次。抖掉体外重组人体皮肤表皮模型表面残留的杜氏磷酸盐缓冲液，用无菌吸水纸吸去残留的液体，将体外重组人体皮肤表皮模型转移到6孔板的第二排里(已加过培养液)
阴性对照组和阳性对照组操作同上。
4、给药后孵育
将所有的6孔板转移到细胞培养箱中，37±1℃、5±1％CO2、95％相对湿度培养24小时，从细胞培养箱中取出，转移到无菌工作台上，更换无血清表皮细胞培养液，每孔0.9ml。继续在细胞培养箱中37±1℃、5±1％CO2、95％相对湿度培养培养18小时，取出。
5、判定化学品的刺激性
(1)将体外重组人体皮肤表皮模型转移到含有1mg/mL的噻唑蓝溶液的24孔板中，每孔0.3mL，在36～37℃、5％CO2、95％湿度的细胞培养箱中避光孵育3小时。
(2)用移液器吸除噻唑蓝溶液，将体外重组人体皮肤表皮模型浸没至每孔含2mL异丙醇的24孔板，用封口膜密封，4℃静置提取12～16小时，得异丙醇浸提物。
(3)用200μl移液器枪尖刺穿培养小室底部，使体外重组人体皮肤表皮模型的异丙醇浸提物流到培养孔中，吸取200μl异丙醇浸提物到96孔板内。
(4)用96孔板分光光度计检测在波长为550～570nm的吸光度OD值。
(5)以阴性对照组的吸光度值为分母，实验组的吸光度OD值为分子，比值的百分数为实验组的相对细胞活力，计算化学品的相对细胞活力，相对细胞活力高于50％，被检测化学品无皮肤刺激性，相对细胞活力低于50％，被检测化学品具有皮肤刺激性。实验结果见图11，结合图11的测试结果，实施例1制备的体外重组人体皮肤表皮模型对经合组织测试指南439皮肤刺激性文件中规定的20种皮肤刺激性判定标准品的刺激性判定结果整理如下表2，根据表2中对各标准品的判定正确与否可以计算出本发明对标准品的误判率为15％。
表2.本发明对经合组织测试文件439中20种皮肤刺激性标准品的判断结果
为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的体外重组人体皮肤表皮模型进行了实验，各种实验情况如下：
1、对实施例1构建的体外重组人体皮肤表皮模型，采用苏木精-伊红染色，透射电镜和免疫组织化学分析法检测体外重组人体皮肤表皮模型的结构分层以及分化状态，实验结果见图1。在图1中，左侧照片为天然皮肤的苏木精-伊红染色照片，右侧照片为体外重组人体皮肤表皮模型的苏木精-伊红染色照片。由图1可见，体外重组人体皮肤表皮模型的结构完整，表皮各层分化明显，具有显著的基底细胞层、棘层细胞层、颗粒细胞层的区分，角质细胞层分化完全，细胞排列紧密，成紧凑的编花篮状交叉分布，与天然皮肤结构类似。透射电镜观察显示了体外重组人体皮肤表皮模型角质细胞层的脂质板层结构，如图2和图3所示，由图2和图3可以清晰地看到角质细胞层中的脂质明暗条带，其结构的完整性和连续性是体外重组人体皮肤表皮模型屏障功能的重要体现。
采用免疫组织化学法对体外重组人体皮肤表皮模型中的丝聚蛋白进行表征，结果见图4，在图4中，着色深的部位为丝聚蛋白的分布部位。对体外重组人体皮肤表皮模型中的兜甲蛋白进行表征，结果见图5，在图5中，着色深的部位为兜甲蛋白的分布部位。实验结果显示，这两种蛋白在体外重组人体皮肤表皮模型中均有表达，表达部位均与天然皮肤一致，其中丝聚蛋白和兜甲蛋白均表达于颗粒细胞层。
采用薄层色谱分析法，对体外重组人体皮肤表皮模型的角质细胞层进行脂质组份成分分析，结果见图6，在图6中，1为天然皮肤角质细胞层的脂质条带，2为体外重组人体皮肤表皮模型的角质细胞层的脂质条带，3为脂质标准品条带。图6结果说明体外重组人体皮肤表皮模型的角质细胞层的脂质成分与人体皮肤角质细胞层的脂质成分非常接近。
采用本实施例1中构建的体外重组人体皮肤表皮模型对经合组织测试指南439皮肤刺激性文件中规定的20种皮肤刺激性判定标准品进行刺激性判定，测试误判率(15％)低于市场上同类产品，例如美国Mattek的Epiderm(20％)和欧盟推荐的皮肤替代模型Episkin(20％)，说明模型屏障功能成熟，细胞间连接结构完整，脂质组成整体屏障功能接近于人体皮肤。可用于替换化学物品的刺激性、安全性动物实验，还可用于化妆品皮肤屏障修护的功效评价。

Claims (8)

1.一种体外重组人体皮肤表皮模型，在基底细胞层的上表面覆盖有棘层细胞层、棘层细胞层的上表面覆盖有颗粒细胞层、颗粒细胞层的上表面覆盖有角质细胞层构成体外重组人体皮肤表皮模型，其特征在于：所述的基底细胞层的下表面具有一层半桥粒蛋白；棘层细胞层由6～8层具有短凸起的棘细胞构成；所述的颗粒细胞层由3～4层含有透明颗粒的细胞构成。
2.根据权利要求1所述的体外重组人体皮肤表皮模型，其特征在于：所述的体外重组人体皮肤表皮模型的厚度为100～150μm。
3.一种权利要求1所述的体外重组人体皮肤表皮模型的制备方法由下述步骤组成：
(1)制备基质胶微粒
将基质胶用无血清表皮细胞培养基稀释至50～150μg/mL，置于36～37℃、5％CO2培养箱，孵育2～4小时，基质胶溶液形成胶颗粒逐渐沉降，弃去未凝固的基质胶，重复该步骤3次，得基质胶颗粒，将基质胶颗粒置于真空干燥箱中进行冷冻干燥，制备成基质胶微粒；
(2)筛选扩增表皮干细胞
将离体的人皮肤组织浸没于1.2U/mL的质量分数为1％的Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶消化液中，37℃消化8～10分钟，无菌条件下用200目筛网过滤，离心，收集细胞，制备成3×103个/ml～5×103个/ml的细胞悬液，细胞悬液与基质胶微粒按质量体积比为5：1混合，置于10ml的旋转培养系统进行微重力旋转培养，转速为22转/分，旋转培养20分钟，弃去培养液，得表皮干细胞，将新鲜的基质胶微粒与无血清表皮细胞培养液按质量体积比为5:1混合，制备成表皮干细胞扩增液，表皮干细胞在表皮干细胞扩增液中培养5～7天，隔天换液，完成表皮干细胞的扩增；
上述100mL的胰酶消化液中含0.025g胰酶、0.01g的乙二胺四乙酸；
(3)制备基底细胞层
将表皮干细胞从基质胶表面用胰酶消化液消化，用培养液TU1进行重悬，接种于细胞小室中，接种密度为0.2×105～0.5×105个/cm2，在细胞小室内液下培养，置于5％CO2、36～37℃的细胞培养箱中孵育24～48小时，制备成下表面具有一层半桥粒蛋白的基底细胞层；
上述培养液TU1为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制；
(4)制备棘细胞层
将步骤(3)中的培养液TU1替换为培养液TU2,在含有基底细胞层的细胞小室内添加150～200μl培养液TU2，在36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中孵育24～48小时，制备成6～8层具有短凸起的棘细胞层；
上述培养液TU2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素1-10mg、L-肉碱0.001～0.1mM、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙0.03～0.2mM，基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制；
(5)制备颗粒细胞层
替换步骤4中的培养液TU2为培养液TA1，弃去步骤4中细胞小室内的TU2液体，进行气液面培养，36～37℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中孵育72～96小时，48小时更换新鲜的培养液TA1，制备成由3～4层含有透明颗粒的细胞构成的颗粒细胞层；
上述培养液TA1为：500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、胰岛素1～10mg、氢化可的松10～100μg、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙0.03～0.2mM、L-丝氨酸0.01～0.1mM、棕榈酸0.01～0.05mM、油酸0.01～0.05mM、精氨琥珀酸0.05～0.1mM、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙1.0～1.5mM、维生素C15～25μg，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制；
(6)体外重组表皮模型的成熟与角化
将步骤(5)中的培养液TA1更换为培养液TA2，进行气液面培养，置于33～35℃、5％CO2、95％相对湿度的细胞培养箱中培养4～5天，48小时更换新鲜的培养液TA2；制备成厚度为100～150μm的体外重组人体皮肤表皮模型；
上述培养液TA2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、胰岛素1～10mg、氢化可的松10～100μg、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙1.0～1.5mM、维生素C10～15μg、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子5～10μg，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合制成。
4.根据权利要求3所述的体外重组人体皮肤表皮模型的制备方法，其特征在于：在制备基底细胞层步骤3中的表皮干细胞替换成表皮细胞与表皮干细胞按1:1～3数量比的混合物。
5.体外重组人体皮肤表皮模型在具有人体皮肤屏障修复功效的化妆品评价中的用途。
6.体外重组人体皮肤表皮模型在具有人体皮肤屏障修复功效的植物提取物筛选中的用途。
7.体外重组人体皮肤表皮模型在评价医疗器械材质对人体皮肤刺激性检测中的用途。
8.体外重组人体皮肤表皮模型在评价化学物质对人体皮肤刺激性检测中的用途。
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