CN114686420B - 一种3d表皮模型的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种3D表皮模型的制备方法及应用。本发明首先用Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白处理transwell小室的聚碳酸酯膜，弃掉Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白后将表皮细胞接种在小室的聚碳酸酯膜上，再经过浸没和气液培养得到成熟的3D表皮模型，且在角质细胞培养和表皮模型培养的初始阶段中都使用ROCK inhibitor Y‑27632维持角质细胞的干性，在气液培养中加入脂肪酸、胆固醇和葡萄糖神经酰胺使构建的角质层更加完整。本发明的3D表皮模型制备方法简单，相比常规方法，无需加基质层，无需加滋养层细胞，不会出现收缩的问题，屏障功能良好，可用于化妆品、药品、生物制品等的安全性和功效性评价，也可用于皮肤科学的基础研究。

Description

一种3D表皮模型的制备方法及应用
技术领域
本发明属于组织工程领域，涉及一种3D表皮模型的制备方法及应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，是人体天然的保护屏障，可以抵御外界的刺激并保持人体内环境的稳定。皮肤由真皮层和表皮层组成，两者之间由基底膜连接。其中真皮层由真皮成纤维细胞和胶原蛋白组成。表皮层包含由位于基底层的角质细胞不断分化形成的4个层次，包括基底层、颗粒层、棘层和角质层。皮肤的屏障功能主要由表皮层的角质层在起作用，角质层是由角质细胞和脂质成分组成。
以往的化妆品刺激和腐蚀性实验都是在动物身上实施的，对动物造成极大的痛苦甚至死亡；另外动物和人之间存在着种属差异，动物实验不能真实反映化妆品的安全性及有效性。随着动物福利和3R原则的建立，同时欧盟制定了相关的法律法规禁止销售使用动物实验的化妆品和原料。2004年欧盟禁止销售使用动物实验的化妆品成品，2009年欧盟禁止使用动物做化妆品毒理实验，2013年欧盟禁止使用动物做化妆品原料的安全性评价，并禁止进口和销售使用动物实验的化妆品和原料。所以，动物实验替代方法的研究成为一种热点和趋势。越来越多的学者和商家开始开发3D体外检测模型，可用于化妆品原料和成品的安全性和有效性检测。
目前建立3D皮肤模型的方法很多，但建立的模型仍存在各种各样的问题，如模型易收缩、制备工艺繁琐、屏障功能较弱。比如，常见的表皮模型制备方法，包括加胶原基质层、加滋养层细胞，然后再接种表皮细胞，但这些方法步骤繁琐、增加了表皮模型的制备周期，同时因缺少基底膜表皮层很容易脱落、模型容易收缩。
发明内容
针对现有方法的不足，本发明提供了一种新的3D表皮模型的制备方法，本发明首先用Ⅳ型胶原蛋白(0.5M醋酸溶解)和层粘连蛋白(磷酸盐缓冲液溶解)处理transwell小室(面积0.47cm2)的聚碳酸酯膜，弃掉Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白后将表皮细胞接种在小室的聚碳酸酯膜上，再经过浸没和气液培养得到成熟的3D表皮模型。且在角质细胞培养和表皮模型初始阶段中培养基中加入ROCK inhibitor Y-27632维持角质细胞的干性，在气液培养中加入脂肪酸、胆固醇和葡萄糖神经酰胺使构建的角质层更加完整，同时表皮模型培养各个阶段的培养基中还可以加入了我们浓缩的平常实验室养真皮成纤维细胞时收集的真皮细胞培养基。因已经培养过真皮成纤维细胞的真皮细胞培养基中含有大量的真皮成纤维细胞分泌的真皮生长因子，可以为构建的表皮模型提供滋养。相比见的表皮模型制备方法(包括加胶原基质层、加滋养层细胞，然后再接种表皮细胞)，本发明的3D皮肤模型制备工艺简单，无需加基质层，也无需加滋养层细胞，不会出现收缩的问题，屏障功能良好，可用于化妆品、药品、生物制品等的安全性和功效性评价，也可用于皮肤科学的基础研究。
本发明的技术方案是：一种3D表皮模型的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)从包皮组织中分离出原代的角质细胞或复苏原代的角质细胞，并用含有ROCKinhibitor Y-27632的角质细胞培养基培养角质细胞至P2/P3代；待细胞生长融合度达到80±5％时收集细胞，并用培养基a重悬角质细胞使其密度达到200±50万/ml；
(2)取5～15μg/ml的IV型胶原蛋白(0.5M醋酸溶解)和10～20μg/ml层粘连蛋白(pH7.0-7.2的磷酸盐缓冲液溶解)各25-35μl包被transwell小室(面积0.47cm2)的聚碳酸酯膜；24±2h吸去IV型胶原蛋白和层粘连蛋白；
(3)每个transwell小室(面积0.47cm2)中接种100μl～400μl重悬的角质细胞，小室外加入培养基a，使小室内外界面相平；
(4)用培养基a浸没培养1～2天；
(5)用培养基b浸没培养1～2天；
(6)用培养基b气液培养11～13天，得到3D表皮模型。
含有ROCK inhibitor Y-27632的角质细胞培养基，配方为：角质细胞培养基500mL、ROCK inhibitor Y-27632 10～20μM、庆大霉素1-1.5％(体积比)。
培养基a的配方为：角质细胞培养基500mL、胎牛血清(FBS)5％～10％(质量体积比)、表皮生长因子(EGF)0.1～0.3ng/ml、胰岛素4～6μg/ml、谷氨酰胺0.5～2mM、ROCKinhibitor Y-27632 10～20μM、庆大霉素1-1.5％(体积比)。在上述配方的基础上还可以加入2μg/ml的浓缩的真皮生长因子(AFGF)125μl～500μl，其中真皮生长因子为实验室中已经培养过真皮成纤维细胞的真皮细胞培养基上清液，浓缩后使用。本发明实施例中的真皮细胞培养基(专利号为201610473348.1)包含如下组分：以500ml计，250ml DMEM高糖培养基、250ml F12营养培养基混合，5-20ml B27添加剂、5-20ml PC-1添加剂、10-100μl基因重组人表皮生长因子、5ml青链霉素。
培养基b的配方为：角质细胞培养基500mL、胎牛血清(FBS)5％～10％、表皮生长因子(EGF)0.1～0.3ng/ml、胰岛素4～6μg/ml、谷氨酰胺0.5～2mM、CaCl2 0.8～2.4mM、维生素C 45～60μg/ml、软脂酸0.02～0.03mM、葡萄糖神经酰胺0.03～0.05mM、胆固醇0.02～0.04mM、亚油酸0.01～0.02mM、BSA 0.02～0.028mM、庆大霉素1-1.5％(体积比)。在上述配方的基础上还可以加入2μg/ml的浓缩的真皮生长因子125μl～500μl。
模型成熟后，可用于化妆品、药品的刺激性实验和和腐蚀性实验等安全性评价；也可用于皮肤相关的基础研究。
皮肤的结构包括真皮层和表皮层，真皮层和表皮层之间由基底膜连接，真皮层包括胶原蛋白和真皮成纤维细胞。胶原蛋白为表皮生长和分化提供支架；真皮成纤维细胞分泌的因子为表皮细胞生长和分化提供营养；基底膜的主要成分包括Ⅳ型和Ⅶ型胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、串珠素等，是表皮层与真皮层之间重要的承接结构。表皮层有基底层、颗粒层、棘层和角质层，角质层是表皮层的最外层，可以抵抗外界微生物入侵和化学物质的刺激，同时保持体内环境的稳定。角质层通过角质细胞和细胞间的脂质成分构成表皮层的屏障，脂质成分包括脂肪酸、神经酰胺和胆固醇。
常见的表皮模型制备方法，包括加胶原基质层、加滋养层细胞，然后再接种表皮细胞，但这些方法步骤繁琐、增加了表皮模型的制备周期，同时因缺少基底膜表皮层很容易脱落、模型容易收缩。
相比上述常用表皮模型制备方法，本发明的优势是：
1、本发明的表皮模型的制备无需加基质层，也无需加滋养层细胞，是将表皮细胞(角质细胞)直接接种于transwell小室的聚碳酸酯膜上。首先用Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白处理小室的聚碳酸酯膜24h，弃掉Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白后将表皮细胞接种在小室的聚碳酸酯膜上，再经过浸没和气液培养得到成熟的3D表皮模型。Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白起到基质膜的作用，使角质细胞牢牢结合在聚碳酸酯上，形成的3D表皮模型不会出现脱落的现象。
2、本发明角质细胞培养和表皮模型初始阶段培养时，都使用了ROCK inhibitorY-27632(抑制剂)，它可以维持角质细胞的干性，使其不分化。
3、本发明最重要的创新点还在于，我们浓缩了平常实验室养真皮成纤维细胞时收集的真皮细胞培养基，加入到表皮模型培养各个阶段的培养基中。因已经培养过真皮成纤维细胞的真皮细胞培养基中含有大量的真皮成纤维细胞分泌的真皮生长因子，可以为构建的表皮模型提供滋养。
4、本发明的表皮模型在气液培养阶段，培养基中加入了脂质成分。虽然有文献报道，其表皮模型在气液阶段的培养阶段也有脂质成分的参与，但脂质成分只有脂肪酸，构建的表皮模型的角质层不够完整。本发明的气液培养中不仅加入了脂肪酸，还有胆固醇和葡萄糖神经酰胺，这样表皮模型角质层的脂质结构更完整，与角质细胞间的结合更紧密，形成的角质层的屏障功能更强。
与加胶原蛋白基质层构建的表皮模型相比，本发明的3D表皮模型无需加胶原蛋白基质层的繁琐步骤，同时也避免了因胶原蛋白引起的皮肤模型的收缩；与加滋养层构建的表皮模型相对，本发明的3D表皮模型缩短了模型构建周期。
本法发明制备的3D表皮模型可用于化妆品、药品的安全性评价，如刺激性实验和和腐蚀性实验等；也可用于化妆品功效性评价，如化妆品保湿功效评价、化妆品屏障功效评价等；也可用于皮肤相关的基础研究。
附图说明
图1：实施例1制备的皮肤模型的组织学结构；
图2：实施例2制备的皮肤模型的组织学结构；
图3：不同浓度SDS下，实施例1制备的皮肤模型的细胞活性；
图4：不同浓度SDS下，实施例2制备的皮肤模型的细胞活性；
图5：化妆品屏障功效皮肤模型的细胞活性；
图6：SDS损伤后皮肤模型的组织学结构；
图7：透明质酸钠组(损伤修复组)皮肤模型的的组织学结构；
图8：牛I型胶原蛋白组(损伤修复组)皮肤模型的组织学结构；
图9：未损伤皮肤模型(正常皮肤模型)的组织学结构。
具体实施方式
以下结合实施例和附图来说明其效果。实施例使用的角质细胞培养基为gibcoDefined K-SFM(货号为10785-012)
实施例1：3D表皮模型的制备——传统制备
培养基a的配方为：角质细胞培养基500mL、胎牛血清(FBS)10％、表皮生长因子(EGF)0.1ng/ml、胰岛素5μg/ml、谷氨酰胺0.5mM、庆大霉素5ml。
培养基b的配方为：角质细胞培养基500mL、胎牛血清(FBS)10％、表皮生长因子(EGF)0.1ng/ml、胰岛素5μg/ml、谷氨酰胺0.5mM、庆大霉素5ml、CaCl2 1.2mM、维生素C 45μg/ml、庆大霉素5ml。
制备步骤：
(1)复苏P1角质细胞，并用角质细胞培养基培养角质细胞至P2代。待细胞生长融合度达到80％左右时收集细胞，并用培养基a重悬角质细胞使其密度达到200万/ml。
(2)coating matrix包被transwell小室30min，吸去coating matrix。
(3)每个小室中接种200μl重悬的角质细胞，小室外加入一定量的培养基a，使小室内外界面相平。
(4)用培养基a浸没培养1天；
(5)用培养基b浸没培养1天；
(6)用培养基b气液培养12天，得到3D皮肤模型。经实施例1传统制备方法制备的皮肤模型的组织学结构如图1所示。
实施例2：3D表皮模型的制备—本发明的制备方法
培养基a的配方为：角质细胞培养基500mL、胎牛血清(FBS)10％、表皮生长因子(EGF)0.1ng/ml、胰岛素5μg/ml、谷氨酰胺0.5mM、ROCK inhibitor Y-27632 10μM、庆大霉素5ml。
培养基b的配方为：角质细胞培养基500mL、胎牛血清(FBS)10％、表皮生长因子(EGF)0.1ng/ml、胰岛素5μg/ml、谷氨酰胺0.5mM、CaCl2 1.2mM、维生素C 45μg/ml、软脂酸0.02mM、葡萄糖神经酰胺0.045mM、胆固醇0.03mM、亚油酸0.01mM、BSA 0.02mM、庆大霉素5ml。
含有ROCK inhibitor Y-27632的角质细胞培养基，配方为：角质细胞培养基500mL、ROCK inhibitor Y-27632 15μM、庆大霉素5ml。
制备步骤：
(1)复苏P1角质细胞，并用含有ROCK inhibitor Y-27632的角质细胞培养基培养角质细胞至P2代。待细胞生长融合度达到80％左右时收集细胞，并用培养基a重悬角质细胞使其密度达到200万/ml；
(2)取10μg/ml的IV型胶原蛋白(0.5M醋酸溶解)和15μg/ml层粘连蛋白(pH7.0-7.2的磷酸盐缓冲液溶解)各30μl包被transwell小室(面积0.47cm2)24h，吸去IV型胶原和层粘连蛋白；
(3)每个transwell小室中接种200μl重悬的角质细胞，小室外加入一定量的培养基a，使小室内外界面相平；
(4)用培养基a浸没培养1天；
(5)用培养基b浸没培养1天；
(6)用培养基b气液培养12天，得到3D皮肤模型。
经实施例2(本发明制备方法)制备的皮肤模型的组织学结构如图2所示，相比图1(实施例1方法制备)，其表皮模型角质层更厚，基底层的细胞更多。
进一步的，培养基a和b的配方中还可以加入2μg/ml的浓缩的真皮生长因子250μl，其中真皮生长因子为实验室中已经培养过真皮成纤维细胞的真皮细胞培养基上清液，浓缩后使用。真皮细胞培养基(专利号为201610473348.1)配方为：250ml DMEM高糖培养基、250ml F12营养培养基混合，5-20ml B27添加剂、5-20ml PC-1添加剂、10-100μl基因重组人表皮生长因子、5ml青链霉素。因已经培养过真皮成纤维细胞的真皮细胞培养基中含有大量的真皮成纤维细胞分泌的真皮生长因子，可以为构建的表皮模型提供滋养，其制备的表皮模型的性能更佳。
实施例3：验证效果——MTT法检测不同浓度SDS下皮肤模型的细胞活性
(1)配制1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml的SDS；
(2)将刚成熟或者刚复苏好的实施例2(或实施例1)皮肤模型转移到无菌六孔板中(提前添加0.9mL培养基b)，在六孔板上标注测试物的编号和给药孵育浓度；
(3)在超净工作台中进行所有的给药操作：每隔1min进行给药，确保给药后，留有充分的浸洗时间间隔。用移液器吸取80μL测试物(不同浓度的SDS溶液)缓慢滴加于皮肤模型的组织表面，阴性对照不加SDS溶液；
(4)最后一块组织给药后，将所有的6孔板转移到恒温培养箱中(37±1℃、5±1％CO2、95％相对湿度)培养18h；
(5)在组织孵育结束前预备1mg/mL MTT溶液，并向12孔板每孔加入300μL的MTT溶液，用于后续的MTT法测试；
(6)根据设计给药孵育时间，在孵育结束前15min，将所有培养板从恒温培养中取出，转移到无菌工作台中；
(7)待第一个给药组织的孵育时间到设计的时间点，用移液枪每次吸取10ml PBS清洗组织两次；
(8)将清洗好的组织培养小室放于无菌吸水纸上，每个小室的清洗步骤必须在1min内完成；
(9)最后一个组织培养小室清洗后，用无菌棉签小心地拭干每个组织的表面；
(10)将清洗好并且干燥的组织，转移至加有MTT测试溶液的12孔板中；
(11)将12孔板转移到恒温培养箱中(37±1℃、5±1％CO2、95％相对湿度)，孵育3h±5min。
(12)MTT孵育完成后，采用枪头从孔板中轻柔的吸去MTT溶液，孔板中加入PBS溶液，清洗3次；
(13)洗涤完毕后，将组织底面用吸水纸擦干，转移到新的12孔板中，在培养小室内外各加入750μL异丙醇，它能够溶解MTT产生的结晶；
(14)采用封口膜密封12孔板间隙，4℃静置过夜溶解；
(15)用酶标仪测OD570的值，并计算各个SDS浓度下模型的细胞活性。
不同浓度SDS下，实施例1制备的皮肤模型的细胞活性如图3所示，实施例2制备的皮肤模型的细胞活性如图4所示；从图3-4可以看出：本发明方法制备的表皮模型的细胞活性更高(图4)，表皮模型屏障功能更好。
实施例4：SDS损伤后皮肤模型的组织学结构观察
(1)重复实施例3的步骤(1)-步骤(4)；
(2)用移液枪吸取10ml PBS清洗孵育结束的组织两次；
(3)用手术刀片沿模型边缘进行环切后，放入装有4％多聚甲醛溶液的1.5mL离心管中，固定，送至第三方公司进行石蜡包埋和HE染色；
(4)取已封片完成的组织置于正置显微镜下拍照，观察皮肤模型的组织学结构。
实施例5：皮肤模型的应用——化妆品屏障功效测试
(1)准备2.0mg/ml的SDS，透明质酸钠(透明质酸钠与SDS等体积混合，SDS浓度为2.0mg/ml)、牛I型胶原蛋白(牛I型胶原蛋白与SDS等体积混合，SDS浓度为2.0mg/ml)、纯化水；
(2)将刚成熟或者刚复苏好的皮肤模型(实施例2制备)转移到无菌六孔板中(提前添加0.9mL培养基b)，在六孔板上标注测试物的编号；
(3)在超净工作台中进行所有的给药操作：每隔1min分钟进行给药，确保给药后，留有充分的浸洗时间间隔；用移液器吸取80μL测试物缓慢滴加于皮肤模型的组织表面。阴性对照加纯化水溶液；
(4)最后一块组织给药后，将所有的6孔板转移到恒温培养箱中(37±1℃、5±1％CO2、95％相对湿度)培养18h；
(5)在组织孵育结束前预备1mg/mL MTT溶液，并向12孔板每孔加入300μL的MTT溶液，用于后续的MTT法测试；
(6)根据设计给药孵育时间，在孵育结束前15min，将所有培养板从恒温培养中取出，转移到无菌工作台中；
(7)待第一个给药组织的孵育时间到设计的时间点，用移液枪每次吸取10ml PBS清洗组织两次；
(8)将清洗好的组织培养小室放于无菌吸水纸上，每个小室的清洗步骤必须在1min内完成；
(9)最后一个组织培养小室清洗后，用无菌棉签小心地拭干每个组织的表面；
(10)将清洗好并且干燥的组织，转移至加有MTT测试溶液的12孔板中；
(11)将12孔板转移到恒温培养箱中(37±1℃、5±1％CO2、95％相对湿度)，孵育3h±5min；
(12)MTT孵育完成后，采用枪头从孔板中轻柔的吸去MTT溶液，孔板中加入PBS溶液，清洗3次；
(13)洗涤完毕后，将组织底面用吸水纸擦干，转移到新的12孔板中，在培养小室内外各加入750μL异丙醇，它能够溶解MTT产生的结晶；
(14)采用封口膜密封12孔板间隙，4℃静置过夜溶解。
(15)用酶标仪测OD570的值，并计算各个SDS浓度下模型的细胞活性。
不同测试溶液下，化妆品屏障功效皮肤模型(实施例2制备)的细胞活性如图5所示，从图中可以看出：透明质酸钠和牛I型胶原蛋白作用于损伤的皮肤后，皮肤模型的细胞活性在80％以上，而损伤后的皮肤的细胞活性只有不到20％，说明透明质酸钠和牛I型胶原蛋白有皮肤屏障修复的功能。
实施例6：皮肤模型的应用——化妆品屏障功效测试的进一步验证
(1)重复实施例5的步骤(1)-步骤(4)；
(2)用移液枪吸取10ml PBS清洗孵育结束的组织两次；
(3)用手术刀片沿模型边缘进行环切后，放入装有4％多聚甲醛溶液的1.5mL离心管中，固定。送至第三方公司进行石蜡包埋和HE染色。
(7)取已封片完成的组织置于正置显微镜下拍照，观察皮肤模型的组织学结构。
实施例4的SDS(浓度为2mg/ml)损伤后皮肤模型的组织学结构如图6所示。透明质酸钠组(损伤修复组)皮肤模型的的组织学结构如图7所示，牛I型胶原蛋白组(损伤修复组)皮肤模型的组织学结构如图8所示。未损伤皮肤模型(正常皮肤模型)的组织学结构如图9所示，从图中可以看出：图6-9的对比结果符合预期，证实了本发明的表皮模型可以用于化妆品屏障功效的评价。

Claims (7)

1.一种3D表皮模型的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)从包皮组织中分离出原代的角质细胞或复苏原代的角质细胞，并用含有ROCKinhibitor Y-27632的角质细胞培养基培养角质细胞至P2或P3代；待细胞生长融合度达到80±5％时收集细胞，并用培养基a重悬角质细胞使其密度达到200±50万/ml；
(2)取IV型胶原蛋白溶液和层粘连蛋白溶液包被transwell小室的聚碳酸酯膜；24±4h吸去IV型胶原蛋白和层粘连蛋白；
(3)每个transwell小室中接种重悬的角质细胞，小室外加入培养基a，使小室内外界面相平；
(4)用培养基a浸没培养1～2天；
(5)用培养基b浸没培养1～2天；
(6)用培养基b气液培养11～13天，得到3D表皮模型；
所述含有ROCK inhibitor Y-27632的角质细胞培养基为：含ROCK inhibitor Y-2763210～20μM、庆大霉素1-1.5％的角质细胞培养基；
所述培养基a为含胎牛血清5％～10％、表皮生长因子0.1～0.3ng/ml、胰岛素4～6μg/ml、谷氨酰胺0.5～2mM、ROCK inhibitor Y-27632 10～20μM、庆大霉素1-1.5％的角质细胞培养基；
所述培养基b为含胎牛血清5％～10％、表皮生长因子0.1～0.3ng/ml、胰岛素4～6μg/ml、谷氨酰胺0.5～2mM、CaCl2 0.8～2.4mM、维生素C 45～60μg/ml、软脂酸0.02～0.03mM、葡萄糖神经酰胺0.03～0.05mM、胆固醇0.02～0.04mM、亚油酸0.01～0.02mM、BSA0.02～0.028mM、庆大霉素1-1.5％的角质细胞培养基；
所述培养基a或b中，每500ml角质细胞培养基，还加入2μg/ml的浓缩的真皮生长因子125μl～500μl，其中真皮生长因子为实验室中已经培养过真皮成纤维细胞的真皮细胞培养基上清液的浓缩液。
2.如权利要求1所述的一种3D表皮模型的制备方法，其特征是，所述步骤(2)取IV型胶原蛋白溶液和层粘连蛋白溶液包被transwell小室的聚碳酸酯膜具体为：取5～15μg/ml的IV型胶原蛋白溶液和10～20μg/ml层粘连蛋白溶液等体积来包被transwell小室的聚碳酸酯膜；所述IV型胶原蛋白溶液为将IV型胶原蛋白加入0.5M醋酸溶液中；层粘连蛋白溶液为将层粘连蛋白加入pH7.0-7.2磷酸盐缓冲液中。
3.如权利要求1所述的一种3D表皮模型的制备方法，其特征是，所述步骤(3)每个面积0.47cm2的transwell小室中接种100μl～400μl重悬的角质细胞。
4.权利要求1所述的方法制备的3D表皮模型。
5.权利要求4所述的3D表皮模型在化妆品或者药品的安全性评价中的应用。
6.权利要求4所述的3D表皮模型在化妆品功效性评价中的应用。
7.权利要求4所述的3D表皮模型在皮肤相关的基础研究中的应用。
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