CN107287152B - 用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的构建方法及培养液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的构建方法及培养液，所述培养液包括培养液A、培养液B、培养液C和培养液D，培养液A以DMEM培养液和F12培养液的混合溶液为基础液，添加NaHCO3、孕酮、丁二胺、硒酸钠、胰岛素、胎牛血清、氢化可的松、腺嘌呤、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、血管生长因子和表皮细胞生长因子；所述培养液B、培养液C和培养液D均包括培养液A、维生素C、维生素E、氯化钙、C‑木糖苷和天冬氨酸镁。另外，本发明还公开了一种利用所述培养液构建用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的方法。本发明的培养液能够达到加强组织工程双层皮肤真表皮连接的目的。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的构建方法及培养液。
背景技术
皮肤作为人体最大的一个器官，其功能强大，是人体的第一道生理屏障，可保护体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭，但人体皮肤同时也是受外在环境影响最大的器官。近年来，随着空气污染的加重，紫外线更容易透过大气层而作用于人类皮肤，加重了暴露皮肤的光老化。因此抗衰类化妆品越来越受到全世界人们的关注和青睐，国内外化妆品市场中已大量涌现出针对于皮肤的具有抗衰老功效的化妆品。《化妆品卫生管理条例》已明确规定，在化妆品上市前，企业需要为功效性产品的宣称提供充分的科学检测数据，以保障产品的功效性。而传统的化妆品功效检测往往采用动物实验的方式，但是近年来随着3R（Reduction，Replacement，and Refinement即减少、替代和优化）原则的日趋重视及组织工程技术的进步，将皮肤模型替代动物试验进行检测评价已成为化妆品安全、功效评价的趋势。
随着组织工程技术的发展，利用组织工程技术已开发出不同类型的组织工程皮肤替代物，包括表皮替代物、真皮替代物、复合皮替代物等。因组织工程全层皮肤具有由成纤维细胞构成的真皮层和表皮细胞构成的表皮层，结构更接近于天然人体结构，可以反映出皮肤衰老后的组织学变化，是目前化妆品抗衰检测的最科学、有效的检测工具。Apligraf是由Organogenesis 公司生产的第一个商品化的组织工程全层皮肤，它是以牛胶原纤维为支架，在其上种植异体成纤维细胞和角质形成细胞，体外扩增后形成了具有表皮层及真皮层双层结构的皮肤替代物。Apligraf的研制和应用揭开了组织修复学的崭新一页。此后，OrCel、EpiDerm FT、Phenion等也相继问世，全层皮肤模型的研究有了飞速发展。
目前组织工程皮肤的研究虽已取得积极进展，但至今仍存在着许多问题和困惑，比如（1）在双层皮肤模型构建过程中真皮易收缩（2）真表皮连接不紧密等，这严重影响了其在用于化妆品检测时的科学性和准确性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的培养液。培养液中添加有维生素C、维生素E、C-木糖苷和天冬氨酸镁活性物质，能够达到加强组织工程双层皮肤真表皮连接的目的。维生素C可以促进IV 、VII 型胶原、层粘连蛋白-5等蛋白的分泌，在真表皮连接的发生中起积极作用；维生素E和维生素C共同使用在抗氧化、抗衰老等过程中起协同作用；C-木糖苷可以增加基底膜成分如Ⅳ型胶原、Ⅶ型胶原和层粘连蛋白的沉积，并且，C-木糖苷还能够改善老年女性皮肤真表皮连接的超微结构，在皮肤真表皮连接重建中起重要作用；天冬氨酸镁的添加对角质形成细胞IV型胶原的分泌具有促进作用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的培养液，其特征在于，所述培养液包括用于对双层皮肤模型进行液下培养液的培养液A，用于对双层皮肤模型进行气液面培养的培养液B、培养液C和培养液D；
所述培养液A以DMEM培养液和F12培养液的混合溶液为基础液，添加NaHCO3、孕酮、丁二胺、硒酸钠、胰岛素、胎牛血清、氢化可的松、腺嘌呤、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、血管生长因子和表皮细胞生长因子，DMEM培养液和F12培养液的混合溶液中DMEM培养液和DMEM/F12培养液的体积比为3:1，培养液A中NaHCO3的浓度为3mg/mL～5mg/mL，孕酮的浓度为30nM～50nM，丁二胺的浓度为30μM～60μM，硒酸钠的浓度为10nM～20nM，胰岛素的浓度为15ng/mL～30ng/mL，胎牛血清的体积百分含量为3%～10%，氢化可的松的浓度为150ng/L～180ng/L，腺嘌呤的浓度为55μg/mL～75μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL～12ng/mL，转铁蛋白的浓度为10ng/mL～20 ng/mL，血管生长因子的浓度为5ng/mL～10ng/mL，表皮细胞生长因子的浓度为20ng/mL～25ng/mL；
所述培养液B、培养液C和培养液D均包括培养液A、维生素C 、维生素E、氯化钙、C-木糖苷和天冬氨酸镁，培养液B、培养液C和培养液D中维生素C的浓度均为50mg/L～100mg/L，维生素E的浓度均为 10mg/L～20mg/L，C-木糖苷的浓度均为20mg/L～50mg/L，天冬氨酸镁的浓度均为0.25mM～1mM，培养液B中氯化钙的浓度为15μg/mL～30μg/mL，培养液C中氯化钙的浓度为30μg/mL～45μg/mL，培养液D中氯化钙的浓度为45μg/mL～60μg/mL，且培养液D中氯化钙的浓度大于培养液C中氯化钙的浓度，培养液C中氯化钙的浓度大于培养液B中氯化钙的浓度。
另外，本发明还提供了一种利用上述培养液构建用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、胶原溶液的制备：将胶原溶解于除菌的醋酸溶液中，于4℃下静置过夜，得到胶原醋酸溶液；然后将所述胶原醋酸溶液、新生牛血清和DEME培养液按照胶原:新生牛血清: DEME（10×）=7：2：1~8.5：0.5：1的体积比混合均匀，再调节pH值至7.2～7.4，得到胶原溶液；
步骤二、细胞胶原混合液的制备：将成纤维细胞以6×105cells/mL～9×105cells/mL的密度加入步骤一中所述胶原溶液中，得到细胞胶原混合液Ⅰ；将成纤维细胞以2×105cells/mL～3×105cells/mL的密度加入步骤一中所述胶原溶液中，得到细胞胶原混合液Ⅱ；
步骤三、真皮层的接种：将30μL～50μL步骤二中所述细胞胶原混合液Ⅱ加入到Transwell小室中，37℃下静置使细胞胶原混合液Ⅱ凝固，然后将100μL～150μL的细胞胶原混合液Ⅰ加入到凝固的细胞胶原混合液Ⅱ表面；
步骤四、人工真皮的培养：待步骤三中的细胞胶原混合液Ⅰ凝固后，在Transwell小室中加入培养液E，然后将Transwell小室置于装有培养液E的培养皿中，一同放入细胞培养箱中进行真皮培养，每天换液；
步骤五、接种表皮：真皮培养4天后将表皮细胞接种于步骤四中真皮培养得到的真皮层表面，然后在所述Transwell小室中加入培养液A，并将所述培养皿内的培养液E更换为培养液A；
步骤六、双层皮肤模型的培养：将步骤五中所述Transwell小室和培养皿一同置于5％CO2、37℃条件下液下培养2天，每天换液；然后吸弃Transwell小室及培养皿中的培养液A，在所述培养皿中加入培养液B，于5％CO2、37℃条件下气液面培养2天；再吸弃所述培养皿中的培养液B，向所述培养皿中加入培养液C，于5％CO2、37℃条件下气液面培养2天；最后吸弃所述培养皿中的培养液C，向所述培养皿中加入培养液D，于5％CO2、37℃条件下气液面培养3天，得到用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型。
上述的方法，其特征在于，步骤一中所述醋酸溶液的体积浓度为0.1%，胶原醋酸溶液中胶原的浓度为4g/L～8g/L。
上述的方法，其特征在于，步骤二中所述成纤维细胞为分离培养的第5～7代细胞，分离培养的方法具体为：将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织置于培养液F中，4℃过夜，然后加入等体积的消化液，于37℃空气摇床中消化20min后终止消化，离心收集细胞，再将收集的细胞以每毫升2×105～4×105个细胞的接种量接种于培养液G中，于5％CO2、37℃条件下培养，经传代后，取第5～7代细胞。
上述的方法，其特征在于，所述培养液F以DMEM培养液为基础液，添加胶原酶、透明质酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸钠和转铁蛋白，培养液F中胶原酶的浓度为200U•mL-1，透明质酸的浓度为300U•mL-1，谷氨酰胺的浓度为2mM～10mM，孕酮的浓度为10nM～20nM，丁二胺的浓度为30μM～60μM，硒酸钠的浓度为15nM～30nM，转铁蛋白的浓度为65ng/mL～100ng/mL。
上述的方法，其特征在于，所述消化液为含有胰酶和乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液，消化液中胰酶的质量百分含量为0.25%，乙二胺四乙酸的质量百分含量为0.02%。
上述的方法，其特征在于，所述培养液G为胎牛血清和DMEM培养液按照1:9的混合的混合溶液。
上述的方法，其特征在于，步骤四中所述培养液E以DMEM培养液和DMEM/F12培养液的混合溶液为基础液，添加胎牛血清、NaHCO3、维生素C、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤和碱性成纤维细胞生长因子，DMEM培养液和F12培养液的混合溶液中DMEM培养液和F12培养液的体积比为3:1，培养液E中胎牛血清的体积浓度为3%～10%，NaHCO3的浓度为3mg/mL～5mg/mL，维生素C的浓度为50mg/L～100mg/L，胰岛素的浓度为15ng/mL～30ng/mL，氢化可的松的浓度为150ng/L～180ng/L，腺嘌呤的浓度为55μg/mL～75μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL～12ng/mL。
上述的方法，其特征在于，步骤五中所述表皮细胞的制备方法为：将第5～7代表皮细胞进行复苏，然后将复苏后的表皮细胞培养至融合率达60%~80%。
上述的方法，其特征在于，步骤五中所述表皮细胞的接种密度为0.1×105/孔～2.5×105/孔。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的培养液B、培养液C和培养液D中均添加有维生素C、维生素E、C-木糖苷和天冬氨酸镁活性物质，能够达到加强组织工程双层皮肤真表皮连接的目的。维生素C可以促进IV 、VII 型胶原、层粘连蛋白-5等蛋白的分泌，在真表皮连接的发生中起积极作用；维生素E和维生素C共同使用在抗氧化、抗衰老等过程中起协同作用；C-木糖苷可以增加基底膜成分如Ⅳ型胶原、Ⅶ型胶原和层粘连蛋白的沉积，并且，C-木糖苷还能够改善老年女性皮肤真表皮连接的超微结构，在皮肤真表皮连接重建中起重要作用；天冬氨酸镁的添加对角质形成细胞IV型胶原的分泌具有促进作用。
2、本发明构建的组织工程全层皮肤，其真皮层以胶原为支架材料，采用差异化接种的方式分两层接种，上层细胞密度相对较大，可以满足抗衰检测需要的细胞数目；下层密度相对较小，可以减少细胞生长过程中对胶原基质的利用，从而减少下层真皮收缩。因此，这种接种方式可以防止由于真皮收缩造成的真皮与底膜的脱离的现象，真皮与底膜间形成的张力可以有效的防止真皮继续收缩。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明的差异化接种方式示意图。
图2为空白对照组的HE染色照片。
图3为SSUV辐照的阴性对照组HE染色照片。
图4为抗衰阳性标准品（VC）的HE染色照片。
图5为空白对照组的IV型胶原染色结果。
图6为SSUV辐照的阴性对照组的IV型胶原染色结果。
图7为抗衰阳性标准品（VC）的IV型胶原染色结果。
图8为空白对照组（Control）、阴性对照组（SSUV）、抗衰阳性标准品（VC）组的COL-IV蛋白相对表达量。
图9为空白对照组（Control）、阴性对照组（SSUV）、抗衰阳性标准品（VC）组的炎症因子IL-1α的释放量检测结果。
图10为空白对照组（Control）、阴性对照组（SSUV）、抗衰阳性标准品（VC）组的炎症因子IL-6的释放量检测结果。
图11为空白对照组（Control）、阴性对照组（SSUV）、抗衰阳性标准品（VC）组的炎症因子IL-8的释放量检测结果。
图12为空白对照组（Control）、阴性对照组（SSUV）、抗衰阳性标准品（VC）组的炎症因子TNFα的释放量检测结果。
图13为空白对照组（Control）、阴性对照组（SSUV）、抗衰阳性标准品（VC）组的MMP-1含量检测结果。
图14为空白对照组（Control）、阴性对照组（SSUV）、抗衰阳性标准品（VC）组的真皮细胞相对密度。
具体实施方式
实施例1
本实施例的用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的构建方法，具体包括以下步骤：
步骤一、胶原溶液的制备：将胶原溶解于除菌的醋酸溶液中，于4℃下静置过夜，得到胶原醋酸溶液；然后将所述胶原醋酸溶液、新生牛血清和DEME培养液按照胶原:新生牛血清: DEME（10×）=1:1:8的体积比混合均匀，再用1M NaOH溶液调节pH值至7.2，得到胶原溶液；所述醋酸溶液的体积浓度为0.1%，胶原醋酸溶液中胶原的浓度为6g/L；
步骤二、细胞胶原混合液的制备：将成纤维细胞以7×105cells/mL的密度加入步骤一中所述胶原溶液中，得到细胞胶原混合液Ⅰ；将成纤维细胞以2×105cells/mL的密度加入步骤一中所述胶原溶液中，得到细胞胶原混合液Ⅱ；
所述成纤维细胞为分离培养的第7代细胞，分离培养的方法具体为：将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织置于培养液F中，4℃过夜，然后加入等体积的消化液，于37℃空气摇床中，180rpm消化20min后终止消化，1000rpm离心10min收集细胞，再将收集的细胞以每毫升4×105个细胞的接种量接种于培养液G中，于5％CO2、37℃条件下培养，经传代后，取第7代细胞；所述培养液F以DMEM培养液为基础液，添加胶原酶、透明质酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸钠和转铁蛋白，培养液F中胶原酶的浓度为200U•mL-1，透明质酸的浓度为300U•mL-1，谷氨酰胺的浓度为10mM，孕酮的浓度为10nM，丁二胺的浓度为50μM，硒酸钠的浓度为15nM，转铁蛋白的浓度为80ng/mL；所述消化液为含有胰酶和乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液，消化液中胰酶的质量百分含量为0.25%，乙二胺四乙酸的质量百分含量为0.02%；所述培养液G为胎牛血清和DMEM培养液按照1:9的混合的混合溶液；
步骤三、真皮层的接种：采用差异化接种方式（见图1，图中1和2分别代表不同细胞密度的真皮层，且1的密度大于2的密度）进行接种，具体为：将30μL步骤二中所述细胞胶原混合液Ⅱ加入到Transwell小室中，37℃下静置使细胞胶原混合液Ⅱ凝固，然后将120μL的细胞胶原混合液Ⅰ加入到凝固的细胞胶原混合液Ⅱ表面；
步骤四、人工真皮的培养：待步骤三中的细胞胶原混合液Ⅰ凝固后，在Transwell小室中加入200μL培养液E，然后将Transwell小室置于装有培养液E的培养皿中，于5％CO2、37℃条件下进行真皮液下培养，每天换液；所述培养液E以DMEM培养液和F12培养液的混合溶液为基础液，添加胎牛血清、NaHCO3、维生素C、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤和碱性成纤维细胞生长因子，DMEM培养液和DMEM/F12培养液的混合溶液中DMEM培养液和F12培养液的体积比为3:1，培养液E中胎牛血清的体积浓度为10%，NaHCO3的浓度为5mg/mL，维生素C的浓度为50mg/L，胰岛素的浓度为30ng/mL，氢化可的松的浓度为150ng/L，腺嘌呤的浓度为60μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/mL；
步骤五、接种表皮：将第6代表皮细胞进行复苏，然后将复苏后的表皮细胞培养至融合率达60%，待步骤四中真皮培养4天后将融合率达60%的表皮细胞按照2.5×105/孔的接种密度接种于步骤四中真皮培养得到的真皮层表面，然后在所述Transwell小室中加入200μL培养液A，并将所述培养皿内的培养液E更换为培养液A；所述培养液A以DMEM培养液和F12培养液的混合溶液为基础液，添加NaHCO3、孕酮、丁二胺、硒酸钠、胰岛素、胎牛血清、氢化可的松、腺嘌呤、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、血管生长因子和表皮细胞生长因子，DMEM培养液和F12培养液的混合溶液中DMEM培养液和F12培养液的体积比为3:1，培养液A中NaHCO3的浓度为5mg/mL，孕酮的浓度为50nM，丁二胺的浓度为30μM，硒酸钠的浓度为20nM，胰岛素的浓度为30ng/mL，胎牛血清的体积百分含量为10%，氢化可的松的浓度为180ng/L，腺嘌呤的浓度为60μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/mL，转铁蛋白的浓度为20ng/mL，血管生长因子的浓度为10ng/mL，表皮细胞生长因子的浓度为25ng/mL；
步骤六、双层皮肤模型的培养：将步骤五中所述Transwell小室和培养皿一同置于5％CO2、37℃条件下液下培养2天，每天换液；然后吸弃Transwell小室及培养皿中的培养液A，在所述培养皿中加入培养液B，于5％CO2、37℃条件下气液面培养2天；再吸弃所述培养皿中的培养液B，向所述培养皿中加入培养液C，于5％CO2、37℃条件下气液面培养2天；最后吸弃所述培养皿中的培养液C，向所述培养皿中加入培养液D，于5％CO2、37℃条件下气液面培养3天，得到用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型；培养过程中从培养液C培养第1天开始对培养的皮肤模型进行SSUV辐照（UVA：30J/cm2；UVB：50mJ/cm2），并将适量抗衰标准品（VC）均匀涂抹于皮肤模型表面，此后每天对皮肤模型执行SSUV辐照并给药操作；所述培养液B、培养液C和培养液D均包括培养液A、维生素C 、维生素E、氯化钙、C-木糖苷和天冬氨酸镁，培养液B、培养液C和培养液D中维生素C的浓度均为50mg/L，维生素E的浓度均为 10mg/L，C-木糖苷的浓度均为50mg/L，天冬氨酸镁的浓度均为1mM，培养液B中氯化钙的浓度为15μg/mL，培养液C中氯化钙的浓度为30μg/mL，培养液D中氯化钙的浓度为45μg/mL。
实施例2
本实施例的用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的构建方法，具体包括以下步骤：
步骤一、胶原溶液的制备：将胶原溶解于除菌的醋酸溶液中，于4℃下静置过夜，得到胶原醋酸溶液；然后将所述胶原醋酸溶液、新生牛血清和DEME培养液按照胶原:新生牛血清: DEME（10×）=7:2:1的体积比混合均匀，再用1M NaOH溶液调节pH值至7.4，得到胶原溶液；所述醋酸溶液的质量浓度为0.1%，胶原醋酸溶液中胶原的浓度为4g/L；
步骤二、细胞胶原混合液的制备：将成纤维细胞以9×105cells/mL的密度加入步骤一中所述胶原溶液中，得到细胞胶原混合液Ⅰ；将成纤维细胞以3×105cells/mL的密度加入步骤一中所述胶原溶液中，得到细胞胶原混合液Ⅱ；
所述成纤维细胞为分离培养的第5代细胞，分离培养的方法具体为：将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织置于培养液F中，4℃过夜，然后加入等体积的消化液，于37℃空气摇床中，180rpm消化20min后终止消化，1000rpm离心10min收集细胞，再将收集的细胞以每毫升2×105个细胞的接种量接种于培养液G中，37℃条件下于5%CO2培养箱中培养，经传代后，取第5代细胞；所述培养液F以DMEM培养液为基础液，添加胶原酶、透明质酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸钠和转铁蛋白，培养液F中胶原酶的浓度为200U•mL-1，透明质酸的浓度为300U•mL-1，谷氨酰胺的浓度为2mM，孕酮的浓度为15nM，丁二胺的浓度为30μM，硒酸钠的浓度为20nM，转铁蛋白的浓度为65ng/mL；所述消化液为含有胰酶和乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液，消化液中胰酶的质量百分含量为0.25%，乙二胺四乙酸的质量百分含量为0.02%；所述培养液G为胎牛血清和DMEM培养液按照1:9的混合的混合溶液；
步骤三、真皮层的接种：采用差异化接种方式（见图1，图中1和2分别代表不同细胞密度的真皮层，且1的密度大于2的密度）进行接种，具体为：将40μL步骤二中所述细胞胶原混合液Ⅱ加入到Transwell小室中，37℃下静置使细胞胶原混合液Ⅱ凝固，然后将100μL的细胞胶原混合液Ⅰ加入到凝固的细胞胶原混合液Ⅱ表面；
步骤四、人工真皮的培养：待步骤三中的细胞胶原混合液Ⅰ凝固后，在Transwell小室中加入200μL培养液E，然后将Transwell小室置于装有培养液E的培养皿中，于5％CO2、37℃条件下进行真皮培养，每天换液；所述培养液E以DMEM培养液和F12培养液的混合溶液为基础液，添加胎牛血清、NaHCO3、维生素C、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤和碱性成纤维细胞生长因子，DMEM培养液和F12培养液的混合溶液中DMEM培养液和F12培养液的体积比为3:1，培养液E中胎牛血清的体积浓度为3%，NaHCO3的浓度为3mg/mL，维生素C的浓度为100mg/L，胰岛素的浓度为15ng/mL，氢化可的松的浓度为180ng/L，腺嘌呤的浓度为55μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL；
步骤五、接种表皮：将第7代表皮细胞进行复苏，然后将复苏后的表皮细胞培养至融合率达80%，待步骤四中真皮培养4天后将融合率达80%的表皮细胞按照0.1×105/孔的接种密度接种于步骤四中真皮培养得到的真皮层表面，然后在所述Transwell小室中加入200μL培养液A，并将所述培养皿内的培养液E更换为培养液A；所述培养液A以DMEM培养液和F12培养液的混合溶液为基础液，添加NaHCO3、孕酮、丁二胺、硒酸钠、胰岛素、胎牛血清、氢化可的松、腺嘌呤、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、血管生长因子和表皮细胞生长因子，DMEM培养液和F12培养液的混合溶液中DMEM培养液和F12培养液的体积比为3:1，培养液A中NaHCO3的浓度为3mg/mL，孕酮的浓度为30nM，丁二胺的浓度为30μM，硒酸钠的浓度为10nM，胰岛素的浓度为15ng/mL，胎牛血清的体积百分含量为3%，氢化可的松的浓度为150ng/L，腺嘌呤的浓度为55μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL，转铁蛋白的浓度为10ng/mL，血管生长因子的浓度为5ng/mL，表皮细胞生长因子的浓度为20ng/mL；
步骤六、双层皮肤模型的培养：将步骤五中所述Transwell小室和培养皿一同置于5％CO2、37℃条件下液下培养2天，每天换液；然后吸弃Transwell小室及培养皿中的培养液A，在所述培养皿中加入培养液B，于5％CO2、37℃条件下气液面培养2天；再吸弃所述培养皿中的培养液B，向所述培养皿中加入培养液C，于5％CO2、37℃条件下气液面培养2天；最后吸弃所述培养皿中的培养液C，向所述培养皿中加入培养液D，于5％CO2、37℃条件下气液面培养3天，得到用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型；培养过程中从培养液C培养第1天开始对培养的皮肤模型进行SSUV辐照（UVA：30J/cm2；UVB：50mJ/cm2），并将适量抗衰标准品维生素C（VC）均匀涂抹于皮肤模型表面，此后每天对皮肤模型执行SSUV辐照并给药操作；所述培养液B、培养液C和培养液D均包括培养液A、维生素C 、维生素E、氯化钙、C-木糖苷和天冬氨酸镁，培养液B、培养液C和培养液D中维生素C的浓度均为100mg/L，维生素E的浓度均为 20mg/L，C-木糖苷的浓度均为20mg/L，天冬氨酸镁的浓度均为0.25mM，培养液B中氯化钙的浓度为30μg/mL，培养液C中氯化钙的浓度为45μg/mL，培养液D中氯化钙的浓度为60μg/mL。
实施例3
本实施例的用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的构建方法，具体包括以下步骤：
步骤一、胶原溶液的制备：将胶原溶解于除菌的醋酸溶液中，于4℃下静置过夜，得到胶原醋酸溶液；然后将所述胶原醋酸溶液、新生牛血清和DEME培养液按照胶原:新生牛血清: DEME（10×）=8:1:1的体积比混合均匀，再用1M NaOH溶液调节pH值至7.3，得到胶原溶液；所述醋酸溶液的浓度为0.1%，胶原醋酸溶液中胶原的浓度为8g/L；
步骤二、细胞胶原混合液的制备：将成纤维细胞以6×105cells/mL的密度加入步骤一中所述胶原溶液中，得到细胞胶原混合液Ⅰ；将成纤维细胞以2.5×105cells/mL的密度加入步骤一中所述胶原溶液中，得到细胞胶原混合液Ⅱ；
所述成纤维细胞为分离培养的第6代细胞，分离培养的方法具体为：将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织置于培养液F中，4℃过夜，然后加入等体积的消化液，于37℃空气摇床中，180rpm消化20min后终止消化，1000rpm离心10min收集细胞，再将收集的细胞以每毫升3×105个细胞的接种量接种于培养液G中，于5％CO2、37℃条件下培养，经传代后，取第6代细胞；所述培养液F以DMEM培养液为基础液，添加胶原酶、透明质酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸钠和转铁蛋白，培养液F中胶原酶的浓度为200U•mL-1，透明质酸的浓度为300U•mL-1，谷氨酰胺的浓度为5mM，孕酮的浓度为20nM，丁二胺的浓度为60μM，硒酸钠的浓度为15nM，转铁蛋白的浓度为100ng/mL；所述消化液为含有胰酶和乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液，消化液中胰酶的质量百分含量为0.25%，乙二胺四乙酸的质量百分含量为0.02%；所述培养液G为胎牛血清和DMEM培养液按照1:9的混合的混合溶液；
步骤三、真皮层的接种：采用差异化接种方式（见图1，图中1和2分别代表不同细胞密度的真皮层，且1的密度大于2的密度）进行接种，具体为：将50μL步骤二中所述细胞胶原混合液Ⅱ加入到Transwell小室中，37℃下静置使细胞胶原混合液Ⅱ凝固，然后将150μL的细胞胶原混合液Ⅰ加入到凝固的细胞胶原混合液Ⅱ表面；
步骤四、人工真皮的培养：待步骤三中的细胞胶原混合液Ⅰ凝固后，在Transwell小室中加入200μL培养液E，然后将Transwell小室置于装有培养液E的培养皿中，于5％CO2、37℃条件下进行真皮培养，每天换液；所述培养液E以DMEM培养液和F12培养液的混合溶液为基础液，添加胎牛血清、NaHCO3、维生素C、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤和碱性成纤维细胞生长因子，DMEM培养液和F12培养液的混合溶液中DMEM培养液和F12培养液的体积比为3:1，培养液E中胎牛血清的体积浓度为5%，NaHCO3的浓度为4mg/mL，维生素C的浓度为80mg/L，胰岛素的浓度为20ng/mL，氢化可的松的浓度为160ng/L，腺嘌呤的浓度为75μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为12ng/mL；
步骤五、接种表皮：将第5代表皮细胞进行复苏，然后将复苏后的表皮细胞培养至融合率达70%，待步骤四中真皮培养4天后将融合率达70%的表皮细胞按照1.5×105/孔的接种密度接种于步骤四中真皮培养得到的真皮层表面，然后在所述Transwell小室中加入200μL培养液A，并将所述培养皿内的培养液E更换为培养液A；所述培养液A以DMEM培养液和F12培养液的混合溶液为基础液，添加NaHCO3、孕酮、丁二胺、硒酸钠、胰岛素、胎牛血清、氢化可的松、腺嘌呤、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、血管生长因子和表皮细胞生长因子，DMEM培养液和F12培养液的混合溶液中DMEM培养液和F12培养液的体积比为3:1，培养液A中NaHCO3的浓度为4mg/mL，孕酮的浓度为40nM，丁二胺的浓度为50μM，硒酸钠的浓度为15nM，胰岛素的浓度为20ng/mL，胎牛血清的体积百分含量为5%，氢化可的松的浓度为160ng/L，腺嘌呤的浓度为75μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为12ng/mL，转铁蛋白的浓度为15ng/mL，血管生长因子的浓度为8ng/mL，表皮细胞生长因子的浓度为22ng/mL；
步骤六、双层皮肤模型的培养：将步骤五中所述Transwell小室和培养皿一同置于5％CO2、37℃条件下液下培养2天，每天换液；然后吸弃Transwell小室及培养皿中的培养液A，在所述培养皿中加入培养液B，于5％CO2、37℃条件下气液面培养2天；再吸弃所述培养皿中的培养液B，向所述培养皿中加入培养液C，于5％CO2、37℃条件下气液面培养2天；最后吸弃所述培养皿中的培养液C，向所述培养皿中加入培养液D，于5％CO2、37℃条件下气液面培养3天，得到用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型；培养过程中从培养液C培养第1天开始对培养的皮肤模型进行SSUV辐照（UVA：30J/cm2；UVB：50mJ/cm2），并将适量抗衰标准品（VC）均匀涂抹于皮肤模型表面，此后每天对皮肤模型执行SSUV辐照并给药操作；所述培养液B、培养液C和培养液D均包括培养液A、维生素C 、维生素E、氯化钙、C-木糖苷和天冬氨酸镁，培养液B、培养液C和培养液D中维生素C的浓度均为80mg/L，维生素E的浓度均为 15mg/L，C-木糖苷的浓度均为40mg/L，天冬氨酸镁的浓度均为0.5mM，培养液B中氯化钙的浓度为20μg/mL，培养液C中氯化钙的浓度为40μg/mL，培养液D中氯化钙的浓度为50μg/mL。
对本发明实施例1构建的双层皮肤模型进行衰老相关指标的检测：
1、对构建的双层皮肤模型一部分进行组织固定、石蜡包埋，并进行HE染色及免疫组化染色（COL-IV），结果见图2-图8；对比图2-图4以及图5-图7可以看出，本发明实施例1构建的双层皮肤模型有完整的真皮、表皮、基底膜结构，与天然皮肤结构相似，并且细胞密度大，真表皮连接紧密。从图8和图9中可以看出，在受到SSUV刺激后，真皮层细胞密度、IV型胶原含量都有显著降低，而加入抗衰活性物后，真皮层细胞密度、IV型胶原含量有明显的改善。图8和图9中的Control为空白对照组，SSUV为SSUV辐照的阴性对照组，VC为抗衰阳性标准品组。
2、将构建的双层皮肤模型的另一部分用液氮速冻，-80℃保存，用于RNA的提取。采用real-time PCR的方法对炎症因子IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα的表达量进行检测，结果见图10-图13。当皮肤受到紫外线辐射后，细胞内会产生过量的活性氧，诱导炎症因子的释放。从图10-图13中可以看出，本发明实施例1构建的双层皮肤模型受到SSUV刺激后，炎症因子IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα释放量显著增加，而加入抗衰活性物后与SSUV组相比被显著抑制。图10和图13中的Control为空白对照组，SSUV为SSUV辐照的阴性对照组，VC为抗衰阳性标准品组。
3、收集双层皮肤模型培养液，采用ELISA的方法进行MMP-1释放量的检测，结果见图14。MMP-1是降解I型和III型胶原最主要的酶，当MMP-1过量表达时，特异性降解细胞外基质，破坏胶原纤维和弹力纤维的正常结构，导致皮肤出现皱纹细纹等衰老症状，因此MMP-1释放量是评价光老化的重要指标。从图14中可以看出，本发明实施例1构建的双层皮肤模型受到SSUV刺激后，MMP-1释放了显著提高，而MMP-1释放量的增多可以被抗衰活性物抑制。图14中的Control为空白对照组，SSUV为SSUV辐照的阴性对照组，VC为抗衰阳性标准品组。
按照上述方法对本发明实施例2和实施例3构建的双层皮肤模型进行衰老相关指标的检测，结果显示，构建的双层皮肤模型有完整的真皮、表皮、基底膜结构，与天然皮肤结构相似，并且细胞密度大，真表皮连接紧密。组织学染色结果显示，在受到SSUV刺激后，真皮层细胞密度、IV型胶原含量都有显著降低，而加入抗衰活性物后，真皮层细胞密度、IV型胶原含量有明显的改善。在受到SSUV刺激后，MMP-1释放了显著提高，炎症因子IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα释放量显著增加，而加入抗衰活性物VC后与SSUV组相比被显著抑制。
综上所述，本发明构建的双层皮肤模型可以模拟天然皮肤响应UV刺激，并且在加入抗衰活性物后，各指标又有明显的恢复。说明本发明构建的双层皮肤模型可以准确有效的评估抗衰功效，适用于抗衰类化妆品的功效评估。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (6)
1.一种利用培养液构建用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、胶原溶液的制备：将胶原溶解于除菌的醋酸溶液中，于4℃下静置过夜，得到胶原醋酸溶液；然后将所述胶原醋酸溶液、新生牛血清和DEME培养液 10×按照胶原:新生牛血清: DEME 10×=7:2:1~8.5:0.5:1的体积比混合均匀，再调节pH值至7.2～7.4，得到胶原溶液；
步骤二、细胞胶原混合液的制备：将成纤维细胞以6×105细胞/mL～9×105细胞/mL的密度加入步骤一中所述胶原溶液中，得到细胞胶原混合液Ⅰ；将成纤维细胞以2×105 细胞/mL～3×105 细胞/mL的密度加入步骤一中所述胶原溶液中，得到细胞胶原混合液Ⅱ；
步骤三、真皮层的接种：将30μL～50μL步骤二中所述细胞胶原混合液Ⅱ加入到Transwell小室中，37℃下静置使细胞胶原混合液Ⅱ凝固，然后将100μL～150μL的细胞胶原混合液Ⅰ加入到凝固的细胞胶原混合液Ⅱ表面；
步骤四、人工真皮的培养：待步骤三中的细胞胶原混合液Ⅰ凝固后，在Transwell小室中加入培养液E，然后将Transwell小室置于装有培养液E的培养皿中，在5％CO2、37℃条件下进行真皮培养，每天换液；
步骤五、接种表皮：真皮培养3~4天后将表皮细胞接种于步骤四中得到的真皮层表面，然后在所述Transwell小室中加入培养液A，并将所述培养皿内的培养液E更换为培养液A；
步骤六、双层皮肤模型的培养：将步骤五中所述Transwell小室和培养皿一同置于5％CO2、37℃条件下液下培养2天，每天换液；然后吸弃Transwell小室及培养皿中的培养液A，在所述培养皿中加入培养液B，于5％CO2、37℃条件下气液面培养2天；再吸弃所述培养皿中的培养液B，向所述培养皿中加入培养液C，于5％CO2、37℃条件下气液面培养2天；最后吸弃所述培养皿中的培养液C，向所述培养皿中加入培养液D，于5％CO2、37℃条件下气液面培养3天，得到用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型；
所述培养液由用于对双层皮肤模型进行液下培养的培养液A，用于对双层皮肤模型进行气液面培养的培养液B、培养液C和培养液D组成；
所述培养液A以DMEM培养液和F12培养液的混合溶液为基础液，添加NaHCO3、孕酮、丁二胺、硒酸钠、胰岛素、胎牛血清、氢化可的松、腺嘌呤、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、血管生长因子和表皮细胞生长因子，DMEM培养液和F12培养液的混合溶液中DMEM培养液和F12培养液的体积比为3:1，培养液A中NaHCO3的浓度为3mg/mL～5mg/mL，孕酮的浓度为30nM～50nM，丁二胺的浓度为30μM～60μM，硒酸钠的浓度为10nM～20nM，胰岛素的浓度为15ng/mL～30ng/mL，胎牛血清的体积百分含量为3%～10%，氢化可的松的浓度为150ng/L～180ng/L，腺嘌呤的浓度为55μg/mL～75μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL～12ng/mL，转铁蛋白的浓度为10ng/mL～20ng/mL，血管生长因子的浓度为5ng/mL～10ng/mL，表皮细胞生长因子的浓度为20ng/mL～25ng/mL；
所述培养液B、培养液C和培养液D均包括培养液A、维生素C、维生素E、氯化钙、C-木糖苷和天冬氨酸镁，培养液B、培养液C和培养液D中维生素C的浓度均为50mg/L～100mg/L，维生素E的浓度均为10mg/L～20mg/L，C-木糖苷的浓度均为20mg/L～50mg/L，天冬氨酸镁的浓度均为0.25mM～1mM，培养液B中氯化钙的浓度为15μg/mL～30μg/mL，培养液C中氯化钙的浓度为30μg/mL～45μg/mL，培养液D中氯化钙的浓度为45μg/mL～60μg/mL，且培养液D中氯化钙的浓度大于培养液C中氯化钙的浓度，培养液C中氯化钙的浓度大于培养液B中氯化钙的浓度；
步骤四中所述培养液E以DMEM培养液和F12培养液的混合溶液为基础液，添加胎牛血清、NaHCO3、维生素C、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤和碱性成纤维细胞生长因子，DMEM培养液和F12培养液的混合溶液中DMEM培养液和DMEM/F12培养液的体积比为3:1，培养液E中胎牛血清的体积浓度为3%～10%，NaHCO3的浓度为3mg/mL～5mg/mL，维生素C的浓度为50mg/L～100mg/L，胰岛素的浓度为15ng/mL～30ng/mL，氢化可的松的浓度为150ng/L～180ng/L，腺嘌呤的浓度为55μg/mL～75μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/mL～12ng/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述醋酸溶液的浓度为0.1%体积分数，胶原醋酸溶液中胶原的浓度为4g/L～8g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述成纤维细胞为分离培养的第5～7代细胞，分离培养的方法具体为：将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织置于培养液F中，4℃过夜，然后加入等体积的消化液，于37℃空气摇床中消化20min后终止消化，离心收集细胞，再将收集的细胞以每毫升2×105～4×105个细胞的接种量接种于培养液G中，在5％CO2、37℃条件下培养，经传代后，取第5～7代细胞；所述培养液F以DMEM培养液为基础液，添加胶原酶、透明质酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸钠和转铁蛋白，培养液F中胶原酶的浓度为200U•mL-1，透明质酸的浓度为300U•mL-1，谷氨酰胺的浓度为2mM～10mM，孕酮的浓度为10nM～20nM，丁二胺的浓度为30μM～60μM，硒酸钠的浓度为15nM～30nM，转铁蛋白的浓度为65ng/mL～100ng/mL；所述培养液G为胎牛血清和DMEM培养液按照1:9混合的混合溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述消化液为含有胰酶和乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液，消化液中胰酶的质量百分含量为0.25%，乙二胺四乙酸的质量百分含量为0.02%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤五中所述表皮细胞的制备方法为：将第5～7代表皮细胞进行复苏，然后将复苏后的表皮细胞培养至融合率达60%~80%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤五中所述表皮细胞的接种密度为0.1×105/孔～2.5×105/孔。
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