CN104726396A - 一种全层皮肤模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种全层皮肤模型的构建方法，该全层皮肤模型具有成纤维细胞组成的真皮层和表皮细胞组成的表皮层，可用于替代动物皮肤组织进行化妆品等的物质检测；本发明通过梯度时间进行真皮层细胞的接种，同时联合Vc的使用，促使真皮层的细胞大量分泌胶原并形成成熟的胞外基质，在细胞复层化的过程中胞外基质又为细胞提供了天然的三维支架和生长空间，提高了其生物活性和生物相容性；同时，通过多次借种与细胞增殖自身的复层化过程相结合，增加了真皮层的厚度、机械强度、稳定性；真皮层与表皮结合后，培养液能够满足真皮层和表皮层细胞的活性及生物学功能的发挥。

Description

一种全层皮肤模型的构建方法

技术领域

本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种可替代皮肤进行化妆品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、一次性卫生用品等产品的安全性与功效检测及其他与皮肤接触的材料的安全性与功效性评价的全层皮肤模型的构建方法。

背景技术

皮肤模型是指利用工程学和细胞生物学的原理和方法，在体外人工制备的皮肤替代品。全层皮肤模型与正常皮肤结构高度类似，具有完整的表皮层和真皮层结构，除可用来修复、替代缺损的皮肤组织外，其最大的用途在于替代人体皮肤组织进行化妆品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、一次性卫生用品、与皮肤接触材料的安全性与功效性评价。

真皮层的体外构建技术是全层皮肤模型开发的关键。目前，主要有两种类型的技术：一种是应用材料学和生物工程学原理构建的真皮替代物，该类体外构建技术不利于细胞生长，难以实现替代真皮组织进行细胞功能的检测与评价。另一类是应用细胞复合材料培养的方法，比如以胶原等天然材料为支架，复合成纤维细胞构建成真皮层，并于其上接种表皮细胞，进一步构建成全层皮肤结构(如专利CN101062429、CN103041453A)。但此法获得的人工皮肤无法完全替代皮肤组织进行化妆品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、皮肤接触性材料等的测试评价要求。用支架材料和活细胞构建的皮肤模型在培养过程中伴随着活细胞自身胶原的分泌以及支架材料的降解，导致人工皮肤组织收缩现象，严重影响全层皮肤模型体外构建中的传质效率，造成边缘收缩与培养器皿壁的分离，同时真表皮层之间不能形成与天然皮肤一致的基底膜结构，均对体外测试结果有影响。

目前尚未有不采用支架材料，仅依靠细胞自身分泌的细胞外基质构建形成的真皮层结构以及由真皮层支持生发的表皮结构结合形成的全层皮肤结构。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是：构建一种全层皮肤模型，该皮肤模型不含外源支架材料，具有成纤维细胞及自分泌细胞外基质组成的真皮层和表皮细胞组成的表皮层，结构更接近人体皮肤结构，具有良好的力学性能、结构稳定性和细胞应答敏感性等特点，可应用于多种皮肤替代测试。

本发明的全层皮肤模型的体外构建方法，包括以下步骤：

步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的分离培养

成纤维细胞分离培养：将已去除脂肪和结缔组织的1mm³的皮肤组织，置于含有胶原酶200U·ml^-1、透明质酸300U·ml^-1的培养液I中，放置4℃过夜；再加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；用培养液Ⅱ调整细胞密度，每毫升2×10⁵～4×10⁵个/cm²细胞接种，5％CO₂、37℃条件下培养；

表皮细胞分离培养：将表皮组织浸没于1.2U/mL的消化液中，置入4℃条件下16～20h；在无菌条件下撕下表皮层，将表皮层放入37℃预热的消化液中，维持37℃消化10min后终止：每2min震荡3下；无菌200目筛网过滤，800r/min离心6min后弃上清；加入37℃预热的PBS缓冲液，吹打至均匀后，再次800r/min离心6min后，弃上清：加入培养液I，吹打至均匀；按照3×10⁴～5×10⁴个/cm²的密度接种，移入5％CO₂、37℃条件下培养，取第3～7代细胞用于构建。

其中培养液I为DMEM(sigma公司生产)，含有谷氨酰胺2～10mM、孕酮10～20nM、丁二胺30～60μM、硒酸钠15～30nM、转铁蛋白65～100ng/ml；培养液II为10％胎牛血清(FBS)+90％DMEM；消化液为含有0.25％胰酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲液(PBS)。

步骤二、真皮层构建

取第5～10代成纤维细胞，按照每毫升培养液Ⅲ含0.5×10⁶～3×10⁶个成纤维细胞进行接种，置于5％CO₂、37℃条件下培养2～3小时，加入培养液Ⅳ培养；每隔22～26小时更换培养液Ⅳ一次，共培养12～14天。

其中培养液Ⅲ是在DMEM培养液中添加体积比9:1的FBS，添加50～100mg/L的维生素C(V_C)；培养液Ⅳ为75％DMEM+25％DMEM/F12(体积比为3：1)，添加NaHCO₃为3～5mg/ml，孕酮30～50nM，丁二胺30～60μM，硒酸钠10～20nM，50～100mg/L的维生素C，胰岛素15～30ng/ml，胎牛血清3～10％，氢化可的松150～180ng/L，腺嘌呤55～75μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子8～12ng/ml，转铁蛋白10～20ng/ml，血管生长因子5～10ng/ml。

步骤三、表皮层构建

将培养液Ⅳ吸弃，将准备好的第3～7代表皮细胞按0.1×10⁵～1.5×10⁵个/cm²接种于真皮层表面，加入培养液Ⅴ-SK1培养；置于5％CO₂、37℃条件下培养，每隔22～26小时换液一次，共培养48小时，得到双层皮肤。其中，培养液Ⅴ-SK1:培养液Ⅳ+表皮生长因子(0.6～2ng/ml)+角质细胞生长因子(KGF)(0.5～5ng/ml)+粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(2.5～10ng/ml)；

步骤四、全层皮肤的培养

将制备的双层皮肤取出，放在培养支架表面，加入培养液Ⅴ-SK1进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK2，进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK3，液面与皮肤表面平齐；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK4，液面与培养支架平齐，继续培养至结束，得到全层皮肤。

步骤四中的培养条件均为37℃，5％CO₂环境。

其中，培养液Ⅴ-SK2:培养液Ⅳ+氯化钙(15～30μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表皮细胞生长因子(20～25ng/ml)；培养液Ⅴ-SK3:培养液Ⅳ+氯化钙(150～200μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表皮细胞生长因子(20～30ng/ml)；培养液Ⅴ-SK4:培养液Ⅳ+氯化钙(1～20mg/ml)+表皮细胞生长因子(10～35ng/ml)。

本发明所构建的模型，是通过维生素C诱导成纤维细胞快速增殖并大量分泌胞外基质，胞外基质与细胞均匀分布和排列形成的多层细胞膜片，其厚度达到200～300μm；膜片形成后在膜片上进行表皮细胞接种，接种后进行复层化培养，待表皮复层化且厚度达到150～200μm后，全层皮肤模型构建成功。

本发明对全层皮肤模型进行了构建工艺上的创新，无需添加外源支架材料，通过真皮层发育和三维培养体系的建立，促使真皮层的细胞大量分泌胶原并形成成熟的胞外基质，在细胞复层化的过程中胞外基质又为细胞提供了天然的三维支架和生长空间，最大程度保留和提高了真皮层细胞分泌的活性因子，构建了接近天然皮肤的细胞微环境及皮肤结构；同时，通过多次接种与细胞增殖自身的复层化过程相结合，增加了真皮层的厚度、机械强度、稳定性；此外，在真皮层的构建过程中避免了外源材料的添加；真皮层与表皮结合后，培养液能够满足真皮层和表皮层细胞的活性及生物学功能的发挥，避免真皮层不生长和降解的发生，同时真表皮连接紧密并形成良好的基底膜结构。如此完整的皮肤模型，可用于替代动物、人体皮肤组织开展活性物质的安全性与功效性检测。

与现有技术相比，本发明所使用的细胞培养膜片技术能促进细胞形成较好的胞外基质和促进细胞三维生长的支架结构，以保证细胞的活力和生物学功能。较现有采用胶原做支架材料复合成纤维细胞构建真皮的方法，避免了成纤维细胞在构建过程中降解外源胶原和自分泌胶原进行重新组装的过程。本发明最大程度地重现了细胞在体内参与组织形成的过程。避免胶原降解过程中出现的支架收缩而导致的表皮层与真皮层结合不紧密，出现气液面控制不准确、表皮层细胞过度角质化等问题。

与现有产品相比，本发明所制备的全层皮肤具有以下优点：

(1)具有较好的真表皮结构，成纤维细胞分泌胶原并复层化替代以支架材料为载体的真皮层，厚度及细胞分布密度与天然皮肤接近；

(2)与在外源支架材料基础上构建的皮肤模型相比，其胞外基质主要由真皮细胞自分泌形成，避免了在测试过程中因外源支架材料的存在而影响测试结果；

(3)多批次的实验证明，本发明所用的细胞膜片技术制备的真皮层，其厚度、细胞数量以及组织活力可以做到稳定控制；

(4)真皮层细胞具有较好的由自身分泌胞外基质形成的微环境，有利于细胞活性与功能的保持；

(5)真皮层与表皮层结合紧密，真表皮结构与天然皮肤结构一致；

(6)无外源材料支架的真皮层含有更多成纤维细胞分泌的因子与保外基质，能更好的促进和支持表皮增殖与分化；

(7)不收缩，与小室形成密闭的实体；

(8)应用范围广，可用于化妆品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、一次性卫生用品、与皮肤接触材料的安全性与功效性评价。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为全层皮肤的组织学切片照片。其中b是表皮层，a是真皮层。

图2为全层皮肤进行化妆品原料有效性测试应用过程照片

其中，图2-1为全层皮肤进行化妆品原料有效性测试样品孵育照片；

图2-2为全层皮肤进行化妆品原料有效性测试样品孵育后皮片清洗照片；

图2-3为全层皮肤进行化妆品原料有效性测试样品孵育后活性指示剂溶出示意图。

具体实施方式

实施例1.一种全层皮肤模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的分离培养：成纤维细胞分离培养，将已去除脂肪和结缔组织的包皮组织切成1mm³的皮肤组织置于含有胶原酶200U·ml^-1、透明质酸300U·ml^-1的培养基I中，放置4℃过夜，再加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；用含有培养液Ⅱ调整细胞密度2×10⁵个/cm²细胞接种，5.0％CO₂、37℃条件下培养；

表皮细胞分离培养，将表皮层组织浸没于1.2U/mL的消化液中，置入4℃条件下20h；在无菌条件下撕下表皮层，将表皮层放入37℃预热的消化液中，在37℃条件下，消化10min后终止，每2min震荡3下；无菌200目筛网过滤，800r/min离心6min后弃上清；加入37℃预热的PBS缓冲液，吹打至均匀后再次800r/min离心6min后弃上清，加入培养液I，吹打至均匀；按照3×10⁴/cm²的密度接种，移入5％CO₂、37℃条件下培养，取第3代细胞用于构建。

其中培养液I为DMEM，含有谷氨酰胺5mM、孕酮10nM、丁二胺35μM、硒酸钠15nM、转铁蛋白65ng/ml(sigma)；培养液II为10％FBS+90％DMEM；消化液为含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS。

步骤二、真皮层构建：取P7代的成纤维细胞，每1ml培养液Ⅲ含1.1×10⁶个成纤维细胞，取0.2mL接种于0.5cm²的trans-well小室；放入含5％CO₂、37℃孵箱中培养3小时，加入培养液Ⅳ；每隔22小时更换培养液Ⅳ一次，共培养12天。

其中培养液Ⅲ是在DMEM培养液中添加体积比9:1的FBS，添加50mg/L的V_C；培养液Ⅳ为75％DMEM+25％DMEM/F12(体积比为3：1)，含有NaHCO₃3mg/ml，孕酮30nM，丁二胺50μM，硒酸钠10nM，55g/L的维生素C，胰岛素15ng/ml，胎牛血清5％，氢化可的松150ng/L，腺嘌呤75μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子8ng/ml，转铁蛋白15ng/ml，血管生长因子5ng/ml。

步骤三、表皮层构建：将培养液Ⅳ吸弃，将第3代的表皮细胞按1×10⁵个/cm²接种于真皮层表面，加入培养液Ⅴ-SK1培养；置于5％CO₂、37℃孵箱培养，每隔26小时换液一次，共培养48小时，获得双层皮肤。

其中，培养液Ⅴ-SK1:培养液Ⅳ+表皮生长因子(0.6ng/ml)+KGF(5ng/ml)+GM-CSF(2.5ng/ml)；

步骤四、全层皮肤的培养：将制备的全层皮肤取出放在不锈钢培养支架表面，加入培养液Ⅴ-SK1进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK2，继续气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK3，液面与皮肤表面平齐；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK4，液面与培养支架平齐继续培养至结束；培养条件均为37℃，5％CO₂环境。

其中，培养液Ⅴ-SK2:培养液Ⅳ+氯化钙(22μg/ml)+维生素C(50μg/ml)+表皮细胞生长因子(20ng/ml)；培养液Ⅴ-SK3:培养液Ⅳ+氯化钙(200μg/ml)+维生素C(50μg/ml)+表皮细胞生长因子(20ng/ml)；培养液Ⅴ-SK4:培养液Ⅳ+氯化钙(1.5mg/ml)+表皮细胞生长因子(22ng/ml)。

本实施例制备的全层皮肤大体观察呈乳白色皮片，真皮层厚度约为100.0μm，组织学切片中可观察到真皮层有大量的胞外基质合成，结构类似天然皮肤真皮乳突层的结构(如图1中a所示)，表皮层厚度约为150μm，表皮结构包括：基底层、棘层、颗粒层、透明层、角质层的清晰结构(如图1中b所示)。

实施例2.一种全层皮肤模型的构建方法

步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的分离培养

成纤维细胞分离培养：将已去除脂肪和结缔组织的包皮皮片剪成1mm³的皮肤组织置于含有胶原酶200U·ml^-1、透明质酸300U·ml^-1的培养液I中，放置4℃过夜，再加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；用含有培养液Ⅱ调整细胞密度4×10⁵个/cm²细胞接种，5％CO₂、37℃湿度条件下培养。

表皮细胞分离培养：将表皮组织浸没于1.2U/mL的消化液中，置入4℃条件下20h；在无菌条件下撕下表皮层，将表皮层放入37℃预热的消化液中，在37℃条件下，消化10min后终止，每2min震荡3下；无菌200目筛网过滤，800r/min离心6min后弃上清；加入37℃预热的PBS缓冲液，吹打至均匀后再次800r/min离心6min后弃上清，加入培养液I，吹打至均匀；按照5×10⁴/cm²的密度接种，移入5％CO₂、37℃条件下培养，取第4代细胞用于构建。

其中培养液I为DMEM，含有谷氨酰胺10mM、孕酮20nM、丁二胺30μM、硒酸钠25nM、转铁蛋白100ng/ml；培养液II为10％FBS+90％DMEM；消化液为含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS。

步骤二、真皮层构建：取P7代的成纤维细胞，每1ml培养液Ⅲ含0.9×10⁶成纤维细胞，取0.2mL接种于0.5cm²的trans-well小室；放入含5％CO₂、37℃孵箱中培养3小时，加入培养液Ⅳ培养；每隔36小时更换培养液Ⅳ一次，共培养14天。

其中培养液Ⅲ是在DMEM培养液中添加体积比9:1的FBS，添加100mg/L的V_C；培养液Ⅳ为75％DMEM+25％DMEM/F12(体积比为3：1)，含有NaHCO₃5mg/ml，孕酮40nM，丁二胺60μM，硒酸钠20nM，75mg/L的维生素C，胰岛素30ng/ml，胎牛血清10％，氢化可的松180ng/L，腺嘌呤55μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子12ng/ml，转铁蛋白20ng/ml，血管生长因子10ng/ml。

步骤三、表皮层构建：将培养液Ⅳ吸弃，将准备好的第4代表皮细胞按1.5×10⁵个/cm²接种于真皮层表面，加入培养液Ⅴ-SK1培养；置于5％CO₂、37℃孵箱培养，每隔22小时换液一次，共培养48小时，得到双层皮肤。

其中，培养液Ⅴ-SK1:培养液Ⅳ+表皮生长因子(2ng/ml)+KGF(2.5ng/ml)+GM-CSF(10ng/ml)。

步骤四、全层皮肤的培养：将制备的全层皮肤取出放在不锈钢培养支架表面，加入培养液Ⅴ-SK1进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK2，进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK3，液面与皮肤表面平齐；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK4，液面与培养支架平齐继续培养至结束；培养条件均为37℃，5％CO₂环境。

其中，培养液Ⅴ-SK2为培养液Ⅳ+氯化钙(22μg/ml)+维生素C(100μg/ml)+表皮细胞生长因子(25ng/ml)；培养液V-SK3:培养液Ⅳ+氯化钙(200μg/ml)+维生素C(100μg/ml)+表皮细胞生长因子(30ng/ml)；培养液V-SK4:培养液Ⅳ+氯化钙(2mg/ml)+表皮细胞生长因子(30ng/ml)。

全层皮肤，真皮层厚度约为100.0μm，组织学切片观察看到真皮层有大量的胞外基质合成，结构类似天然皮肤真皮乳突层的结构，表皮层厚度约为130μm，表皮结构包括基底层、棘层、颗粒层、透明层、角质层的清晰结构。

全层皮肤可用于创伤治疗或化妆品原料检测，可进行化妆品原料功效检测。构建后将全层皮肤在200mJ的UVA进行皮肤损伤化妆品原料进行测试。损伤后的皮肤用干细胞因子EGF进行涂层(图2-1)并孵育，孵育24小时候进行冲洗洗去剩余样品(图2-2)，最后进行SOD试剂盒对损伤细胞修复活力进行检测对比(图2-3)，酶标仪读取数值，EGF处理组与对照组相比OD值显著高于对照组，证明该模型可用于化妆品原料的功效评价。

Claims (3)

1.一种全层皮肤模型的构建方法，其特征在于：该全层皮肤模型无外源材料支架，具有成纤维细胞组成的真皮层和表皮细胞组成的表皮层；

其构建方法，包括以下方法步骤：

步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的分离培养

成纤维细胞分离培养：将已去除脂肪和结缔组织的1mm³的皮肤组织，置于含有胶原酶200U·ml^-1、透明质酸300U·ml^-1的培养液I中，放置4℃过夜；再加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；用含培养液Ⅱ调整细胞密度每毫升2×10⁵～4×10⁵细胞接种，5％CO₂、37℃条件下培养；

表皮细胞的分离培养：将表皮组织浸没于1.2U/mL的消化液中，置入4℃条件下16～20h；在无菌条件下撕下表皮层，将表皮层放入37℃预热的消化液中，在37℃条件下，消化10min后终止：每2min震荡3下；无菌200目筛网过滤，800r/min离心6min后弃上清；加入37℃预热的PBS缓冲液，吹打至均匀后，再次800r/min离心6min后，弃上清：加入I培养液，吹打至均匀；按照3×10⁴～5×10⁴/cm²的密度接种，移入5％CO₂、37℃条件下培养，取第3～7代细胞用于构建；

所述培养液I，为DMEM含有谷氨酰胺2～10mM、孕酮10～20nM、丁二胺30～60μM、硒酸钠15～30nM、转铁蛋白65～100ng/ml；培养液II为10％胎牛血清+90％DMEM；消化液为含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS溶液；

所述培养液Ⅱ，为10％FBS+90％DMEM。

步骤二、真皮层构建

取第5～10代成纤维细胞，每毫升培养液Ⅲ含0.5×10⁶～3×10⁶个成纤维细胞，置于5％CO₂、37℃条件下培养2～3小时；加入培养液Ⅳ,每隔22～26小时更换培养液Ⅳ一次，共培养12～14天；

所述培养液Ⅲ，是在DMEM培养液中添加体积比9:1的FBS，添加50～100mg/L的维生素C；

所述培养液Ⅳ，为体积比75％DMEM+25％DMEM/F12，添加NaHCO₃为3～5mg/ml，孕酮30～50nM，丁二胺30～60μM，硒酸钠10～20nM，50～100mg/L的维生素C，胰岛素15～30ng/ml，胎牛血清3～10％，氢化可的松150～180ng/L，腺嘌呤55～75μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子8～12ng/ml，转铁蛋白10～20ng/ml，血管生长因子5～10ng/ml；

步骤三、表皮层构建

将培养液Ⅳ吸弃，将准备好的第3～7代表皮细胞按0.1×10⁵～1.5×10⁵个/cm²接种于真皮层表面，加入培养液Ⅴ-SK1培养；置于5％CO₂、37℃孵箱培养，每隔22～26小时换液一次，共培养48小时，得到双层皮肤；

其中，培养液Ⅴ-SK1:培养液Ⅳ+表皮生长因子(0.6～2ng/ml)+KGF(0.5～5ng/ml)+GM-CSF(2.5～10ng/ml)；

步骤四、全层皮肤的培养

将制备的全层皮肤取出，放在培养支架表面，加入培养液Ⅴ-SK1进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK2，进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK3，液面与皮肤表面平齐；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK4，液面与培养支架平齐，继续培养至结束；

培养液Ⅴ-SK2:培养液Ⅳ+氯化钙(15～30μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表皮细胞生长因子(20～25ng/ml)；

培养液Ⅴ-SK3:培养液Ⅳ+氯化钙(150～200μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表皮细胞生长因子(20～30ng/ml)；

培养液Ⅴ-SK4:培养液Ⅳ+氯化钙(1～20mg/ml)+表皮细胞生长因子(10～35ng/ml)。

2.根据权利要求1所述全层皮肤模型的构建方法，其特征在于：步骤一的表皮细胞的分离培养中,所述消化液含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS。

3.根据权利要求1所述全层皮肤模型的构建方法，其特征在于：步骤四中的培养条件，均为37℃，5％CO₂环境。