CN111450321A - 人工皮肤替代物及其无支架自组装构建方法和用途 - Google Patents

人工皮肤替代物及其无支架自组装构建方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN111450321A
CN111450321A CN201910046704.5A CN201910046704A CN111450321A CN 111450321 A CN111450321 A CN 111450321A CN 201910046704 A CN201910046704 A CN 201910046704A CN 111450321 A CN111450321 A CN 111450321A
Authority
CN
China
Prior art keywords
human
cell
artificial skin
derived
substitute
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910046704.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王志刚
陈虎
姚咏明
杨彩哲
姜玉峰
李冰
李天民
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Huafu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Huafu Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Huafu Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Huafu Biotechnology Co ltd
Priority to CN201910046704.5A priority Critical patent/CN111450321A/zh
Publication of CN111450321A publication Critical patent/CN111450321A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3886—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/60—Materials for use in artificial skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C12N5/0698—Skin equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C12N2502/094—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells keratinocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本公开涉及一种人工皮肤替代物及其无支架自组装构建方法和用途。具体来说，本公开涉及一种人工皮肤代替品，所述人工皮肤代替品的制备方法以及前述人工皮肤代替品的治疗用途。本公开涉及的人工皮肤代替品的制备方法中的制备原料不含有任何支架结构的成分，例如人工合成的支架结构。与此同时，本公开的人工皮肤替代物不涉及其它动物来源的基质，降低了产品的免疫原性；并且采用人源材料，显著降低或者去除制备动物衍生产品相关的成本，和由于制备动物生物制品而带来的疾病传播的风险。

Description

人工皮肤替代物及其无支架自组装构建方法和用途
技术领域
本公开涉及生物医用材料领域。具体来说，其涉及一种人工皮肤替代物。更具体来说，其尤其涉及一种人工皮肤替代物及其无支架自组装构建方法和用途。
背景技术
皮肤组织是人体最大的器官，也是人体与外界环境直接接触的第一道屏障。严重皮肤创伤或烧伤导致的皮肤缺损通常难以自行修复以恢复原有的形态和功能。因此，可以通过手术植入皮肤替代物可以加快愈合速度，提高愈合质量。
目前为止，国内外已有多个人工皮肤替代物应用于临床。现有技术中采用的人工皮肤替代物包括Alloderm(人体无细胞冻干真皮细胞)、SureDerm(人体无细胞冻干真皮细胞)、OASIS Wound Matrix(猪无细胞冻干的小肠粘膜下层细胞)、Biobrane(超薄有机硅作为表皮模拟薄膜，3D尼龙长丝作为真皮类似物，含有I型胶原蛋白肽)、Integra(皮肤类似物：牛胶原蛋白和软骨素-6-硫酸盐GAG；表皮类似物：硅氧烷聚合物聚硅氧烷)、EpiDex(来自头皮毛囊外根鞘的培养角质形成细胞)、EPIBASE(培养的角质形成细胞)、MySkin(培养的角质形成细胞)、DenovoDerm(自体皮肤替代品)、Pelnac(猪腱衍生的去端肽胶原I型，海绵层用硅胶膜)、Dermagraft(生物可吸收的polygalactin网状基质接种人新生儿成纤维细胞)、TransCyte(胶原蛋白涂层尼龙网接种同种异体新生儿人包皮成纤维细胞)、Permacol(猪无细胞二异氰酸酯交联真皮)、PLGA/chitosan membrane(PLGA/壳聚糖混合电纺纳米纤维膜)、Biodegradable polyurethane(可生物降解的聚氨酯微纤维)、Permaderm(用牛胶原和GAG底物培养的自体成纤维细胞和角质形成细胞)、Apligraf(牛胶原基质接种新生儿包皮成纤维细胞和角质形成细胞)、OrCel(I型胶原基质接种新生儿包皮成纤维细胞和角质形成细胞)、Oasis(来自猪小肠粘膜下层的完整基质，用于急性，慢性和烧伤创面的伤口闭合刺激)等。前述人工皮肤替代物的使用使得急性创面愈合的速度较传统治疗方法提前了2-5天，也使过去一些久治不愈的慢性难愈合创面的愈合率由既往的60％上升至90％。
然而如上所述，虽然现有技术中存在许多类型的人工皮肤替代物，但是一些类型如无细胞，真皮或表皮细胞，没有细胞或只有一种细胞类型(例如成纤维细胞或角质形成细胞)，因此细胞分泌的种类和数量上可用于伤口愈合的基质蛋白明显更少，导致功效降低。
与此同时，诸如Apligraf的人工皮肤替代物可以促进来自成纤维细胞和角质形成细胞的生长因子的伤口愈合。许多复合皮肤移植物使用动物来源的基质，例如如牛胶原蛋白，作为支架结构来构建皮肤。例如，目前采用的人工皮肤替代物，人真皮是通过将人成纤维细胞包埋在牛胶原中而形成的，即以牛胶原蛋白作为支架结构制备人工皮肤替代物。与此同时，现有技术中采用在过度融合条件下，通过延长培养可以使动物来源的成纤维细胞产生多种细胞外基质，包括I型胶原蛋白，以嵌入它们自身的细胞以形成真皮。但是，由于动物来源的胶原蛋白不同于天然的人类皮肤细胞外基质，因此前述产品仅具有有限的愈合伤口的效力。此外，这些动物衍生产品可引起免疫原性，并具有疾病传播的风险。与此同时，生产这些基质蛋白质的成本很高，不同生产批次之间的差异进一步推高了生产成本。
例如，CN107349475B公开了一种纳米纤维膜与干细胞层层叠加的人工组织工程皮肤。但是，其必须采用脂肪干细胞作为原料制备人工皮肤替代物，并且在制备人工皮肤替代物的过程中，脂肪干细胞的活性会发生明显的降低或者死亡。
CN108096624A公开了一种利用人体血液制备纤维蛋白原，然后将所述纤维蛋白原成膜得膜片，进而将所述膜片用含抑肽酶的溶液处理后与皮肤生长助剂混合得到细胞支架的方法。但是，前述方法采用了直接人体来源的制品(即人体血液)作为原材料，因而使得上述方法制得的产品具有疾病传染的风险。与此同时，上述方法公开的原料中还包含皮肤生长助剂，例如生长因子/维生素，而上述成分的采用也增加了前述方法的生产成本。
US10149924B1同样公开了一种直接可用的可生物降解和生物相容性人工皮肤替代物及其制备方法。但是，其采用的制备原料中包含壳聚糖/明胶作为支架结构，并且其均不来源于人类；与此同时，其实施例采用的原料中的细胞均只有一种细胞。
因此，开发一种新的，低成本的，有利提高创面愈合的效力的人工皮肤替代物具有十分重要的意义。
参考文献
1.Savoji,H.,et al.,Skin Tissue Substitutes and Biomaterial RiskAssessment and Testing.Front Bioeng Biotechnol,2018.6:p.86.
2.Bhardwaj,N.,D.Chouhan,and B.B.Mandal,Tissue Engineered Skin andWound Healing:Current Strategies and Future Directions.Curr Pharm Des,2017.23(24):p.3455-3482.
发明内容
发明要解决的问题
基于现有技术中存在的上述问题，本公开提供了一种人工皮肤替代物及其无支架自组装构建方法和用途。
用于解决问题的方案
在本公开涉及的技术方案中，通过对细胞进行较长时间的培养，使得作为制备原料的人源细胞自身能够通过依靠自身分泌的基质蛋白，而不是通过其它外源支架结构的物质，形成人工皮肤替代物。
在一个实施方案中，本公开提供一种人工皮肤代替品，所述人工皮肤代替品包含作为制备原料的第一人源细胞和第二人源细胞，并由所述第一人源细胞和所述第二人源细胞叠加形成；并且，所述制备原料不含有支架结构。
根据本公开的人工皮肤代替品，所述人工皮肤代替品的第一人源细胞选自成纤维细胞或间充质干细胞；可选的，所述第一人源细胞选自成纤维细胞；优选的，所述第一人源细胞选自人皮肤成纤维细胞。
根据本公开的人工皮肤代替品，所述人工皮肤代替品的第二人源细胞选自角质形成细胞；优选的，所述第二人源细胞选自人表皮角质形成细胞。
在另一个实施方案中，本公开提供一种人工皮肤代替品的制备方法，包括如下步骤：
细胞培养步骤：将第一人源细胞和/或第二人源细胞作为制备原料进行培养；
无支架细胞来源的真皮替代物的形成步骤：将在所述细胞培养步骤中培养后的第一人源细胞作为所述无支架细胞来源的真皮替代物的形成步骤中的待培养细胞进行培养；
人工皮肤替代物的形成步骤：将在所述无支架细胞来源的真皮替代物的形成步骤中得到的第一人源细胞进行培养后，将所述第二人源细胞和所述第一人源细胞进行共培养，从而得到人工皮肤替代物；并且，
所述制备原料不含有支架结构。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，所述第一人源细胞选自成纤维细胞或间充质干细胞；可选的，所述第一人源细胞选自成纤维细胞；优选的，所述第一人源细胞选自人皮肤成纤维细胞。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，所述第二人源细胞选自角质形成细胞；优选的，所述第二人源细胞选自人表皮角质形成细胞。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，所述无支架细胞来源的真皮替代物中的所述细胞来源自成纤维细胞。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，在所述第一人源细胞的培养步骤中，培养所述成纤维细胞的培养液为DMEM培养液；可选的，所述DMEM培养液为高葡萄糖DMEM培养液；优选的，所述DMEM培养液进一步含有胎牛血清；优选的，所述DMEM培养液中所述胎牛血清的重量体积比为2-20％；优选的，所述DMEM培养液中所述胎牛血清的重量体积比为10％。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，在所述第二人源细胞的培养步骤中，培养所述角质形成细胞的培养液为DermaLife K培养液或KGM培养液。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，在所述无支架细胞来源的真皮替代物的形成步骤中，所述成纤维细胞的起始接种浓度为0.2-2X 106个/孔；可选的，所述成纤维细胞的培养液为含有2-20％(重量体积比)的胎牛血清和10-200μg/mL抗坏血酸或其盐的DMEM培养液；优选的，所述胎牛血清的含量为10％；优选的，所述抗坏血酸或其盐的含量为100μg/mL；优选的，所述抗坏血酸或其盐选自2-磷酸-L-抗坏血酸或2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，所述成纤维细胞的培养时间为2-6周；优选的，所述成纤维细胞的培养时间为4周；可选的，所述成纤维细胞的培养条件为在37℃、含有5％CO2的条件下进行培养。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，其特征在于，所述人工皮肤替代物的形成步骤中，将所述无支架细胞来源的真皮替代物的形成步骤，培养得到的成纤维细胞进行收集并更换培养液，加入所述角质形成细胞后，和所述成纤维细胞继续共培养。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，其中，所述成纤维细胞和所述表皮角质形成细胞的比例选自1:1-1:4；可选的，所述成纤维细胞和所述表皮角质形成细胞的比例为1:2。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，更换后的培养液为还原型FAD培养液；可选的，所述还原型FAD培养液为含有胎牛血清和抗坏血酸或其盐的培养液；优选的，所述还原型FAD培养液中所述胎牛血清的重量体积比2-20％，优选10％；优选的，所述还原型FAD培养液中所述抗坏血酸或其盐的含量为10-200μg/mL，优选100μg/mL；优选的，所述抗坏血酸或其盐选自2-磷酸-L-抗坏血酸或2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，所述角质形成细胞的起始接种浓度为0.25-2×105个/孔。
根据本公开提供的人工皮肤代替品的制备方法，将所述成纤维细胞和所述角质形成细胞进行浸没共培养，得到上皮细胞共培养物，进而获取所述上皮细胞共培养物，得到所述人工皮肤代替品；可选的，所述获取为气提式外环流获取。
在另一个实施方案中，本公开还提供一种人工皮肤代替品，其通过前述制备方法得到。
在另一个实施方案中，本公开还提供一种人工皮肤代替品在制备治疗皮肤缺损的医用材料中的应用；可选的，所述皮肤缺损为皮肤烧伤。
在另一个实施方案中，本公开还提供一种治疗皮肤损伤的方法，其特征在于，将本公开中的人工皮肤代替品施用至皮肤缺损处；可选的，所述皮肤缺损为皮肤烧伤。
发明的效果
在一个实施方案中，本公开涉及的人工皮肤代替品的制备方法中的制备原料不含有任何支架结构的成分。示例性的，所述制备方法和通过前述方法制备得到的产品不包含动物来源或者人工合成的材料或基质。
在一个实施方案中，本公开使用人成纤维细胞产生真皮和角质形成细胞以产生表皮，而不涉及其它动物来源的基质，因此降低了产品的免疫原性；与此同时，采用人源材料，可以显著降低或者去除制备动物衍生产品相关的成本，和由于制备动物生物制品而带来的疾病传播的风险。
在另一个实施方案中，本公开使用的原料中不含有人工合成的材料，因此降低了制备相关人工合成材料的成本，并且降低了可能存在的产生强免疫原性和毒性的风险。
在一个实施方案中，本公开通过允许成纤维细胞分泌细胞外基质，进而利用人成纤维细胞形成真皮，所述细胞外基质可以模拟人体皮肤的体内环境，从而改善移植物摄取并增强伤口愈合功效。
在另一个实施方案中，本公开通过在通过细胞共培养制备人工皮肤替代物的过程中，通过控制培养液中成纤维细胞(Fibroblast)和角质形成细胞(Keratinocyte)的比例和/或加入的先后顺序，进而使得培养的细胞形成类似皮肤(skin-like)的结构，进而用于人工皮肤替代物。
在一个实施方案中，本公开可以通过延长成纤维细胞的培养时间，调整成纤维细胞的培养液组分，以及阶段性的在表皮层上平铺成纤维细胞，进而调整制备得到的人工皮肤替代物的厚度。
附图说明
图1所示的是光学显微镜下成纤维细胞培养的形态学观察示意图。
图2所示的是光学显微镜下角质形成细胞形态学观察示意图。
图3所示的是深孔板中的transwell示意图。
图4所示的是成熟的3D皮肤结构示意图。
图5所示的是人工皮肤替代物的苏木精-伊红(H&E)的染色结果示意图。
图6所示的是成纤维细胞接种密度对于人工皮肤替代物厚度的影响示意图。成纤维细胞的密度为0.2万个细胞/孔(A)、0.6万个细胞/孔(B)或200万个细胞/孔(C)，用于人工皮肤替代物的构建结果。
具体实施方式
定义
在本公开的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
本公开中的“动物来源”是指非智人(Homo sepiens)的来源。示例性的，本公开中的“动物来源的细胞”是指来源于非智人(Homo sepiens)的细胞，例如来源于牛(Bovine)的细胞。
本公开中的“支架结构”是指动物细胞来源的细胞基质或人工合成的材料。示例性的，所述支架结构可以为动物来源的胶原蛋白或人工合成的纳米纤维膜。
本公开中的“成纤维细胞(Fibroblast)”也称为纤维母细胞，是疏松结缔组织的主要细胞成分，属于终末分化细胞，这种细胞会制造胶原蛋白等蛋白质由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。
本公开中的“间充质干细胞(MSC)”是一种多能干细胞，存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)，具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能。
本公开中的“角质形成细胞(Keratinocyte)”是表皮的主要构成细胞，数量占表皮细胞的80％以上，在分化过程中产生角蛋白。根据分化阶段和特点可分为五层，由内至外分别为基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。
本公开中的“苏木精-伊红(H&E)染色”是一种常用的细胞染色方法。细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。
本公开中的“DMEM培养液(Dulbecco's modified Eagle's medium)”是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养液，是在MEM培养液的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型DMEM培养液(葡萄糖含量低于4500mg/L)和低糖型的DMEM培养液(葡萄糖含量低于1000mg/L)。
实施方式
苏木精-伊红(H&E)染色实验
本领域技术人员应当了解，H&E染色是组织学广泛使用的染色方法。与此同时，现有技术中已经研发了用于H&E染色的许多变化形式和方案，并且在本公开可以应用的情况下，本公开不限于任何具体变量、方案、系统等。一般的H&E系统可以限定为包括四个核心染色试剂：苏木精、分化剂、上蓝试剂和伊红，以及用于脱蜡、再水化、脱水和透明(clearing)所需的清洗剂和溶剂。
一般代表性的H&E染色方案包括如下步骤：(i)(使用二甲苯或二甲苯替代物)脱蜡；(ii)(使用醇类)再水化；(iii)水洗；(iv)苏木精；(v)水洗；(vi)分化剂；(vii)水洗；(viii)上蓝；(ix)水洗；(x)醇；(xi)伊红；(xii)(使用醇类)脱水；以及(xiii)(使用二甲苯或二甲苯替代物)透明化(Sheenan,D.C.and Hrapchak,B.B.:Theory and Practice ofHistotechnology 2nd ed.Columbus,OH,Battelle Press,1980)。
在一个实施方案中，本公开通过在通过细胞共培养制备人工皮肤替代物的过程中，通过控制培养液中成纤维细胞(Fibroblast)和角质形成细胞(Keratinocyte)的比例和/或加入的先后顺序，进而使得培养的细胞形成类似皮肤(skin-like)的结构，进而用于人工皮肤替代物。
在一个实施方案中，前述成纤维细胞和角质形成细胞的比例可以选自1:1-1:4。
在一个优选的实施方案中，前述成纤维细胞和角质形成细胞的比例为1:2。
在另一个实施方案中，在细胞共培养的过程中，先加入成纤维细胞，再加入角质形成细胞。采用这样的方式，可以更容易的控制成纤维细胞，使其不会过度生长，并且可以阻止角质形成细胞覆盖细胞培养液质的全部表面。进而使得培养的细胞形成类似皮肤(skin-like)的结构，进而用于人工皮肤替代物。
在一个实施方案中，本公开可以通过延长成纤维细胞的培养时间，调整成纤维细胞的培养液组分，以及阶段性的在表皮层上平铺成纤维细胞，进而增加制备得到的人工皮肤替代物的厚度。
在一个可选的实施方案中，纤维细胞的培养时间可以选自2-8周。
在一个优选的实施方案中，纤维细胞的培养时间为4周。
在一个可选的实施方案中，培养成纤维细胞的培养液中加入抗坏血酸，增加制备得到的人工皮肤替代物的厚度。申请人发现，可以通过加入抗坏血酸，进而加快人源成纤维细胞的胶原蛋白的合成和分泌，进而制备得到厚度增加的人工皮肤替代物。
在一个优选的实施方案中，加入的抗坏血酸的含量为10-100μg/ml。
在一个优选的实施方案中，每隔5-10天在表皮层上平铺成纤维细胞。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
实施例中采用的所有试剂，除非另有强调，否则均可以通过商业途径购买获得。
实施例1：成纤维细胞的培养方法
将NHDF(正常人皮肤成纤维细胞，Normal human dermal fibroblasts)在加入2％(重量/体积比)的胎牛血清(FCS，Invitrogen)的高葡萄糖型DMEM培养液(Lonza)中，在37℃，5％CO2的条件下进行培养。当细胞培养至铺满70％-90％培养板时，将所述培养的成纤维细胞培养备用。
实施例2：成纤维细胞的培养方法
实施例2和实施例1的培养方法相似，除了将高糖型DMEM培养液(Lonza)中加入10％(重量/体积比)的胎牛血清(Invitrogen)之外(而不是实施例1中的2％的胎牛血清)，其它的培养条件相同。
实施例3：成纤维细胞的培养方法
实施例3和实施例1的培养方法相似，除了将高糖型DMEM培养液(Lonza)中加入20％(重量/体积比)的胎牛血清(Invitrogen)之外(而不是实施例1中的2％的胎牛血清)，其它的培养条件相同。
实施例1-3培养的成纤维细胞的培养结果相似。示例性的，实施例2培养的成纤维细胞的培养结果如图1所示。
实施例4：间充质干细胞的培养方法
实施例4的细胞培养条件和实施例1相同。即实施例4采用和实施例1相同的培养方法，用于培养间充质干细胞。
实施例5：间充质干细胞的培养方法
实施例5的细胞培养条件和实施例2相同。即实施例5采用和实施例2相同的培养方法，用于培养间充质干细胞。
实施例6：间充质干细胞的培养方法
实施例6的细胞培养条件和实施例3相同。即实施例6采用和实施例3相同的培养方法，用于培养间充质干细胞。
实施例7：角质形成细胞的培养方法
将NHEK(正常人表皮角质形成细胞，Normal human epidermal keratinocytes)在DermaLife K培养液(Lifeline)中进行培养。当细胞培养至铺满70％-90％培养板时，将所述培养的成纤维细胞培养备用。
实施例8：角质形成细胞的培养方法
实施例8和实施例7的培养方法相似，除了将DermaLife K培养液(Lifeline)替换为KGM培养液(Lonza)之外，其它的培养条件相同。
实施例7-8培养的角质形成细胞的培养结果相似。示例性的，实施例7培养的角质形成细胞的培养结果如图2所示。
实施例9：无支架细胞来源的真皮替代物的形成
将实施例1-3培养得到的0.2-2X 106个NHDF细胞被接种至半透明的6孔的深孔细胞培养板(transwell，Corning)中，在37℃，5％CO2的细胞培养条件下培养2-6周。
其中，NHDF的细胞培养液为：含有2-20％的胎牛血清(FCS，Invitrogen)和10-200μg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸(Sigma)的DMEM培养液(Lonza)。
实施例9培养的角质形成细胞的培养结果如图3所示。
实施例10：人工皮肤替代物的形成
将实施例9培养得到的NHDF细胞进行收集，并将前述细胞的培养液进行更换后，在细胞培养孔中继续进行培养2-8周。
其中，更换后的培养液为还原型FAD培养液(reduced FAD，rFAD)。前述rFAD培养液为含有2-20％的胎牛血清(FCS，Invitrogen)，10-200μg/mL 2-磷酸L-抗坏血酸三钠盐(Sigma)，0.4-20μg/mL氢化可的松(Sigma)，and1×10-10M霍乱毒素(Sigma)。
通过前述rFAD培养液将NHDF细胞进行培养2-8周后，对于每个细胞培养孔，加入0.25-2×105个通过实施例7-8培养得到的NHEK细胞。可选的，前述NHDF细胞和NHEK细胞的含量比为1:1-1:4。在本实施例中，申请人采用了前述NHDF细胞和NHEK细胞的含量比为1:2。
将前述NHDF细胞和NHEK细胞浸没共培养，生长2-7天后，将前述共培养物进行气提式外环流(air-lifted)获取，培养液每隔一天更换一次。
实施例10培养得到的无支架人工皮肤替代物的3D皮肤结构如图4所示。
实施例11：苏木精-伊红(H&E)染色实验
将实施例10培养得到的无支架人工皮肤替代物在10％的中性缓冲福尔马林溶液中保存后，采用苏木精-伊红(H&E)对前述无支架人工皮肤替代物进行染色。
从染色结果可以观察到，前述培养得到的人工皮肤替代物具有表皮和真皮的结构。由于前述人工皮肤替代物的制备原料均属于人源，因此，根据染色结果，前述实施例10制备得到的产物可以作为用于人体的无支架人工皮肤替代物。
实施例12：无支架人工皮肤替代物的厚度测定
对于实施例11得到的无支架人工皮肤替代物，用20倍放大倍率捕捉皮肤替代物的图像，并用参考比例尺计算其厚度。
实验结果如图6所示。从图6可以看出，最初的成纤维细胞的接种密度对于最终得到的无支架人工皮肤替代物的厚度具有明显的影响。其中，图6中成纤维细胞的密度分别为0.2万个细胞/孔(A)、0.6万个细胞/孔(B)或200万个细胞/孔(C)
当最初的成纤维细胞的接种密度为0.2-2x 106个细胞时，最终得到的无支架人工皮肤替代物的厚度为20μm-180μm。
实施例14：无支架人工皮肤替代物的厚度影响因素
需要注意的是，人工皮肤替代物的厚度的变化虽然十分重要，但是其只是实际应用时需要考虑的一部分内容。具体来说，在人工皮肤替代物的厚度和功效之间没有直接必然相关性的报导，可以理解的是，厚实的皮肤很容易移植来治疗伤口，但是植入更多的细胞会增加生产成本。事实上，在很多情况下，患者仅需要使用细胞板上培养的融合的细胞，就可以用于伤口的愈合。
申请人发现，可以通过以下实施方式，增加人工皮肤替代物的厚度。
在一个实施方式中，可以将成纤维细胞的培养时间相应的延长。在本公开的技术方案中，成纤维细胞的适宜培养时间为2-8周。因此，将成纤维细胞的培养时间延长的方法，培养得到的无支架人工皮肤替代物的厚度将有明显的增长。在一个优选的方案中，成纤维细胞的培养时间为4-8周。
在另一个实施方式中，可以在培养成纤维细胞的培养液中加入适量的抗坏血酸。在本公开的技术方案中，抗坏血酸的适宜加入含量为10-200μg/mL。因此，可以通过加入更高浓度的抗坏血酸，培养得到的无支架人工皮肤替代物的厚度将有明显的增长。在一个优选的方案中，抗坏血酸的适宜加入含量为100-200μg/mL。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种人工皮肤代替品，其特征在于，所述人工皮肤代替品包含作为制备原料的第一人源细胞和第二人源细胞，并由所述第一人源细胞和所述第二人源细胞叠加形成；并且，所述制备原料不含有支架结构。
2.根据权利要求1所述的人工皮肤代替品，其特征在于，所述人工皮肤代替品的第一人源细胞选自成纤维细胞或间充质干细胞；可选的，所述第一人源细胞选自成纤维细胞；优选的，所述第一人源细胞选自人皮肤成纤维细胞。
3.根据权利要求1或2所述的人工皮肤代替品，其特征在于，所述人工皮肤代替品的第二人源细胞选自角质形成细胞；优选的，所述第二人源细胞选自人表皮角质形成细胞。
4.一种人工皮肤代替品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
细胞培养步骤：将第一人源细胞和/或第二人源细胞作为制备原料进行培养；
无支架细胞来源的真皮替代物的形成步骤：将在所述细胞培养步骤中培养后的第一人源细胞作为所述无支架细胞来源的真皮替代物的形成步骤中的待培养细胞进行培养；
人工皮肤替代物的形成步骤：将在所述无支架细胞来源的真皮替代物的形成步骤中得到的第一人源细胞进行培养后，将所述第二人源细胞和所述第一人源细胞进行共培养，从而得到人工皮肤替代物；并且，
所述制备原料不含有支架结构。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一人源细胞选自成纤维细胞或间充质干细胞；可选的，所述第一人源细胞选自成纤维细胞；优选的，所述第一人源细胞选自人皮肤成纤维细胞。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述第二人源细胞选自角质形成细胞；优选的，所述第二人源细胞选自人表皮角质形成细胞。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述无支架细胞来源的真皮替代物中的所述细胞来源自成纤维细胞。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述第一人源细胞的培养步骤中，培养所述成纤维细胞的培养液为DMEM培养液；可选的，所述DMEM培养液为高葡萄糖DMEM培养液；优选的，所述DMEM培养液进一步含有胎牛血清；优选的，所述DMEM培养液中所述胎牛血清的重量体积比为2-20％；优选的，所述DMEM培养液中所述胎牛血清的重量体积比为10％。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述第二人源细胞的培养步骤中，培养所述角质形成细胞的培养液为DermaLife K培养液或KGM培养液。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在所述无支架细胞来源的真皮替代物的形成步骤中，所述成纤维细胞的起始接种浓度为0.2-2X106个/孔；可选的，所述成纤维细胞的培养液为含有2-20％(重量体积比)的胎牛血清和10-200μg/mL抗坏血酸或其盐的DMEM培养液；优选的，所述胎牛血清的含量为10％；优选的，所述抗坏血酸或其盐的含量为100μg/mL；优选的，所述抗坏血酸或其盐选自2-磷酸-L-抗坏血酸或2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述成纤维细胞的培养时间为2-6周；优选的，所述成纤维细胞的培养时间为4周；可选的，所述成纤维细胞的培养条件为在37℃、含有5％CO2的条件下进行培养。
12.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述人工皮肤替代物的形成步骤中，将所述无支架细胞来源的真皮替代物的形成步骤，培养得到的成纤维细胞进行收集并更换培养液，加入所述角质形成细胞后，和所述成纤维细胞继续共培养。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述成纤维细胞和所述表皮角质形成细胞的比例选自1:1-1:4；可选的，所述成纤维细胞和所述表皮角质形成细胞的比例为1:2。
14.根据权利要求12或13所述的制备方法，其特征在于，更换后的培养液为还原型FAD培养液；可选的，所述还原型FAD培养液为含有胎牛血清和抗坏血酸或其盐的培养液；优选的，所述还原型FAD培养液中所述胎牛血清的重量体积比2-20％，优选10％；优选的，所述还原型FAD培养液中所述抗坏血酸或其盐的含量为10-200μg/mL，优选100μg/mL；优选的，所述抗坏血酸或其盐选自2-磷酸-L-抗坏血酸或2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述角质形成细胞的起始接种浓度为0.25-2×105个/孔。
16.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，将所述成纤维细胞和所述角质形成细胞进行浸没共培养，得到上皮细胞共培养物，进而获取所述上皮细胞共培养物，得到所述人工皮肤代替品；可选的，所述获取为气提式外环流获取。
17.一种人工皮肤代替品，其特征在于，其由权利要求4-16任一项所述的制备方法得到。
18.权利要求1-3任一项或权利要求17所述的人工皮肤代替品在制备治疗皮肤缺损的医用材料中的应用；可选的，所述皮肤缺损为皮肤烧伤。
19.一种治疗皮肤损伤的方法，其特征在于，将权利要求1-3的任一项或权利要求17所述的人工皮肤代替品施用至皮肤缺损处；可选的，所述皮肤缺损为皮肤烧伤。
CN201910046704.5A 2019-01-18 2019-01-18 人工皮肤替代物及其无支架自组装构建方法和用途 Pending CN111450321A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910046704.5A CN111450321A (zh) 2019-01-18 2019-01-18 人工皮肤替代物及其无支架自组装构建方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910046704.5A CN111450321A (zh) 2019-01-18 2019-01-18 人工皮肤替代物及其无支架自组装构建方法和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111450321A true CN111450321A (zh) 2020-07-28

Family

ID=71671508

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910046704.5A Pending CN111450321A (zh) 2019-01-18 2019-01-18 人工皮肤替代物及其无支架自组装构建方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111450321A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021059298A1 (en) * 2019-09-26 2021-04-01 Indian Institute Of Technology Delhi Acellular artificial skin substitute and method of preparation thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010048917A1 (en) * 1998-03-09 2001-12-06 Warren Hoeffler Skin equivalent and methods of forming and using same
CN1868422A (zh) * 2005-05-25 2006-11-29 中国人民解放军第四军医大学口腔医院 修复皮肤缺损的人工皮肤的制备方法
CN101879329A (zh) * 2010-06-21 2010-11-10 蒋明军 含基底膜的人工皮肤构建方法及人工皮肤
CN104726396A (zh) * 2015-04-17 2015-06-24 陕西博溪生物科技有限公司 一种全层皮肤模型的构建方法
US20180112188A1 (en) * 2015-03-26 2018-04-26 Université De Bordeaux Skin reconstruction method

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010048917A1 (en) * 1998-03-09 2001-12-06 Warren Hoeffler Skin equivalent and methods of forming and using same
CN1868422A (zh) * 2005-05-25 2006-11-29 中国人民解放军第四军医大学口腔医院 修复皮肤缺损的人工皮肤的制备方法
CN101879329A (zh) * 2010-06-21 2010-11-10 蒋明军 含基底膜的人工皮肤构建方法及人工皮肤
US20180112188A1 (en) * 2015-03-26 2018-04-26 Université De Bordeaux Skin reconstruction method
CN104726396A (zh) * 2015-04-17 2015-06-24 陕西博溪生物科技有限公司 一种全层皮肤模型的构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ROXANE POULIOT，ET AL.: "Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice", 《TRANSPLANTATION》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021059298A1 (en) * 2019-09-26 2021-04-01 Indian Institute Of Technology Delhi Acellular artificial skin substitute and method of preparation thereof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mazlyzam et al. Reconstruction of living bilayer human skin equivalent utilizing human fibrin as a scaffold
EP1201749B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Knorpelimplantaten mittels in vitro gezüchteter Chondrozyten
US20040101959A1 (en) Treatment of tissue with undifferentiated mesenchymal cells
US20200179567A1 (en) Regionally specific tissue-derived extracellular matrix
US9592255B2 (en) Scaffold-free three dimensional nerve fibroblast constructs
KR19990022216A (ko) 자연적으로 분비되는 세포외 매트릭스 조성물과 그 방법
KR20000052709A (ko) 와튼제대교질에서 분리된 세포를 이용하여 연골 조직을 생산
WO2005113747A2 (de) Multizelluläre gewebe- und organkultursysteme
Kinikoglu et al. Reconstruction of a full-thickness collagen-based human oral mucosal equivalent
KR20060110637A (ko) 분화된 어린 지방 세포와 생분해성 중합체의 이식에 의한신체의 부피 대체 방법
WO2010040302A1 (zh) 从人或动物胚胎提取间质性干细胞及提取其分泌物的方法
CN107050517B (zh) 无外源支架血管化组织工程骨及其制备方法
Nilforoushzadeh et al. Regenerative medicine applications in wound care
WO2021012677A1 (zh) 一种仿生的预脉管化材料及其制备方法和应用
CN114917412A (zh) 一种光敏性水凝胶材料在制备促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中的应用及产品
Pajoum et al. In vitro co-culture of human skin keratinocytes and fibroblasts on a biocompatible and biodegradable scaffold
EP1727893A2 (en) Autogenic living scaffolds and living tissue matrices: methods and uses thereof
CN109112101B (zh) 一种成纤维细胞培养基及其应用
CN111450321A (zh) 人工皮肤替代物及其无支架自组装构建方法和用途
Ni et al. Stem‐cell based soft tissue substitutes: Engineering of crosslinked polylysine‐hyaluronic acid microspheres ladened with gingival mesenchymal stem cells for collagen tissue regeneration and angiogenesis
KR20200066218A (ko) 인체 유래 성분을 함유하고 조직 특이적 세포 분화 효과를 갖는 3d 프린팅 바이오 잉크 조성물 및 그 제조방법
Oh et al. Fabrication and characterization of epithelial scaffolds for hair follicle regeneration
WO2006048783A2 (en) Autogenic living scaffolds and living tissue matrices: methods and uses thereof
US20030180270A1 (en) Methods and compositions for treating bone defects
Shin et al. Comparison of hair dermal cells and skin fibroblasts in a collagen sponge for use in wound repair

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200728