KR20000052709A - 와튼제대교질에서 분리된 세포를 이용하여 연골 조직을 생산 - Google Patents

와튼제대교질에서 분리된 세포를 이용하여 연골 조직을 생산 Download PDF

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안토니에프. 푸르초
브리안에이. 나우톤
줄리아 산로만
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나우톤 질 케이.
어드밴스드 티슈 사이언스, 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 태관 특히 와튼제대교질로부터 미숙-연골세포를 분리하고 이를 이용하여 연골을 만들기 위해 연골세포로 유도하는 것에 관계한다. 분리된 미숙-연골세포와 여기에서 유도된 연골세포는 배양물에서 유사분열에 의해 확장되어, 치료목적으로 이용하기 위한 새로운 연골을 만드는데 이용된다. 미숙-연골세포 또는 연골세포의 "은행"은 냉동 보관하여, 이를 해동하면, 필요한때에 새로운 연골을 만들 수 있다.

Description

와튼제대교질에서 분리된 세포를 이용하여 연골 조직을 생산{Production of cartilage tissue using cells isolated from Wharton's jelly}
2. 발명의 배경
2.1. 연골 조직의 대체용으로 이용
류마티스, 골관절증 또는 외상과 같은 질병에 의해 연골이 손상되는 경우 심각한 물리적 변형과 쇠약을 초래한다. 사람 관절 연골이 노쇠함에 따라 연골의 완전한 압착성 및 인장성이 변하게 된다. 무릎 관절 연골의 표면 지역은 처음 30년간 인장 강도가 증가하다가 그 이후로 나이가 들어감에 따라 인장 강도가 상당히 감소하게 되는데, 이는 관절 표면에서 콜라겐Ⅱ에 감지 가능한 정도의 손상이 있다. 깊은 부위 연골 또한 콜라겐 함량은 감소하지 않으나 나이가 들면서, 인장 강도가 점진적으로 감소되는 것을 볼 수 있다. 이와 같은 관찰에서 나이가 들어감에 따라 연골의 기계적 그리고 구조적 조직에 변화가 있고 외상 손상에서 연골이 손상되기도 쉬움을 볼 수 있다. 골 관절증의 연골에서는 콜라겐Ⅱ가 과다하게 손상되어 콜라겐 소섬유에도 주름이 생기게 된다. 류마티스 관절염에서, 폴리몰포백혈구 세포로부터 방출되는 프리 라디칼과 단백질 분해 효소의 복합 작용으로 인하여, 관절 표면에 상당한 손상이 있음을 볼 수 있다(Tiku et al., 1990. J. Immunol. 145:690-696). 연골 세포에 의해 연골 매트릭스 분해 및 단백질 분해 효소 유도되는 것은 인터루킨-1(IL-1) 또는 종양 괴사인자-α(TNF-α)에 의해 주로 유도되는 것으로 보인다(Tyler, 1985, Biochem. J. 225:493-507).
따라서, 대부분의 연골 질병 및 외상을 치료하는데 있어서, 대체 연골 조직으로 사용할 수 있는 물질이 필요하다.
2.2. 연골 손상의 경우에 현행 치료법
연골 손상에 대한 현행 치료법은 미용을 목적으로 한 실리콘 또는 관절 재배치를 위한 금속 합금 등으로 대체하는 것이다. 보철 장치의 대체는 원래 연골이 가지는 완전한 기능을 회복하지 못하고, 아래 조직과 뼈가 손상된다. 영구적 외부 물질이 체내에 있게 되어, 유래되는 심각한 장기간 복합증은 감염, 부식과 불안정성을 포함한다.
뼈 세포에 이식된 멸균된 뼈 또는 뼈 분말 또는 외과용 강을 이용하면, 세포 서포트가 생분해되지 않는 특성으로 인하여 대부분 성공하지 못한다. 미국 특허 4,609,551(Caplan, 1986년 9월 2일 공고)에 따르면, 섬유아세포는 시험관과 생체에 연골 형성 반응을 촉진시킬 수 있는 가용성 뼈 단백질에 최소 3일간 시험관에서 노출시킨다. 활성화된 섬유 아세포를 생분해 가능한 매트릭스에 복합시키거나 또는 이형이식과 보철장치에 관절 주사 또는 부착에 의해 생체 내로 옮긴다. 이 방법의 단점은 단기간 배양물에서는 연골이 형성되지 않고, 따라서 연골 합성을 위해, 이식부위에 노출된 섬유아세포에 과도하게 의존하게 된다.
또는 연골 세포를 분리하여, in vitro에서 유사분열에 의해 확장시키고, 손사 부위에 직접 투여하여 in vivo 상태에서 새로운 연골 조직을 만들게 하거나 또는 배양하여, in vitro 상태에서 새로운 연골 조직을 만들어 이를 조직 손상 부누이에 이식한다. 예를 들면, 이국 특허 4,846,835(Grande, 1989년 7월 11일자 공고)에 따르면, 3차원 콜라겐 매트릭스에 자생 연골 세포를 접종시키고, 관절 연골 병소 부위에 in vivo에서 삽입시키고, 봉합된 골막 플랩을 이용하여, 고정시킨다. Vacanti et al의 미국 특허 5,041,138에서는 생체에서 연속적 이식 시에 생분해 가능한 매트릭스에 연골 세포를 접종하기 위한 연골 구조의 성장에 대해 상술한다.
2.3. 연골세포를 생산하는 세포 종류
연골 세포는 정상적인 성숙한 연골 조직에서 얻을 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 4,846,835(Grande, supra), 미국 특허 5,041,138(Vacanti et al.,)에서는 콜라게나제 용액에 관절 연골을 삭이고, 그 다음 이식하기 전에 in vitro 배양 배지에 연골 세포를 유사분열에 의해 확장시켜 연골 세포를 얻는다고 설명하고 있다.
일단 유사분열에 의해 확장된 연골세포 집단을 수득하면, 세포는 원래 모세포를 유도한 다시 동일 개체에 이식하거나(자가이식) 또는 상이한 개체에 이식한다(이종이식). 또한, 이종 이식은 동일한 종의 관련된 또는 무관한 개체(동종)에서 얻은 연골 세포를 이용하거나 또는 상이한 종(이종)에서 얻은 연골 세포를 이용할 수 있다. 또는, 연골 세포는 이종 또는 동종인 주화세포주(established cell line)에서 얻을 수 있다.
자가 이식의 경우에, 환자로부터 연골 세포 또는 미숙 연골 세포를 회수하고, 그 다음 효과적인 이식을 위해 충분한 수 또는 밀도가 되도록 유사분열로 확장시킨다. 그러나, 효과적인 세포 수 또는 밀도를 가지도록 충분한 확장을 하는데 걸리는 시간은 자가 배양물의 효과적인 이용을 배제할 수도 있는데, 그 이유는 연골을 어느 정도 복구하는데에는 외과적인 손상이 일어난 직후 또는 짧은 시간 내에 실행해야 하기 때문이다. 또 다른 한계는 세포의 유사분열 능력인데, 이는 세포가 확장되는 시간 및 치료용으로 만들어지는 최종 세포수가 제한 요인이 되기 때문이다. 또한, 심각할 정도로 쇠약해지는 관절 질환은 환자의 신체 전반에 연골 조직의 분괴를 일으키고, 연골 배양을 시작하기 위해 이용할 수 있는 병에 걸리지 않은 고유 연골 조직이 거의 남아 있지 않는다.
이종 배양을 이용하는 경우에도 문제점이 있는데, 가령 새로 형성된 그리고 이식된 연골 조직에 대한 면역반응 및 거부 가능성이 있다. 또한, 이종 이식의 경우에는 조직 또는 세포주에 있는 임의 감염성 물질이 개체로 전염되는 위험이 있다.
간엽세포가 연골을 만드는 세포의 또 다른 원료로 가능성이 있다. 간엽세포는 일반적으로 여러 번 분열하여, 연골, 뼈, 건, 인대, 골 기질 및 결합조직등을 포함하는 자손 세포를 만드는 전능 세포(multipotentional call)로 알려져 있다. 이 정의에 따르면, 이와 같은 간엽세포는 일반적으로 제어할 수 없고 또는 일정한 수의 유사분열을 하지 않는다(Caplan, 1991, J. Orthopaed. Res. 9:641-650)고 일려져 있다. 미국 특허 5,197,985 및 5,226,914(Caplan et al., 각각 1993년 3월 30일 공고, 1993년 7월 13일 공고)에서는 사람 골수에서 유도한 간엽 세포를 분리하여, 배양물에서 복제시켜, 이를 활성화시켜 뼈 또는 연골로 분화시키는 것에 대해 상술하고 있다. 유사하게, 미국 특허 5,846,359(Caplan et al., 1996년 1월 23일자 공고)에서는 사람 간엽 세포 및 이 세포에 대한 단클론 항체를 설명한다. 다시, 세포를 배양하여, 다양한 세포형으로 분화시키는 것에 대해 설명한다. 그러나, 상기 Caplan 특허에서는 뼈를 만드는 것에만 국한되고 있다. 사실, 이와 같은 세포를 이용하여, 연골 세포를 만들거나 또는 상기 공정을 이용하여 연골 세포를 만들었다는 문헌은 없다. 또한, 간엽세포는 자가 이식을 하지 못하기 때문에, 이를 이용하여, 상기에서 설명하는 것과 같은 면역 거부 또는 감염성 물질의 전염등의 문제를 해결하지는 못하였다. 또한, Caplan 특허에서는 연골 세포를 만들 수 있는 세포 원료로써 태관의 와튼제대교질에 대한 언급은 없다.
따라서, 질병 또는 외상을 치료하기 위해 새로운 연골 조직을 만드는 방법은 면역 반응을 일으키는 위험이 없고, 감염성 물질을 옮기는 위험이 없는 연골 세포로 바로 이용할 수 있는 장점이 있다.
2.4. 연골을 만드는데 있어서 성장인자 및 호르몬의 역할
성장인자는 세포대사에 파라크린 또는 오토크린 효과를 가지고, 하기에서 설명하는 것과 같이 연골 세포 분할, 매트릭스 합성 및 분해를 지연시키거나 또는 강화시킬 수 있다.
2.4.1. 성장인자-β의 형질 변환
TGF-β는 많은 세포 형태의 성장과 분화를 조절하는 관련된 이량체 단백질의 성장족에 관계한다.(Baranard et al., 1990, Biochem. Biophys. Acta. 1032:79-87; Roberts and Sporn, 1990, pp. 419-472 M.B.Sporn and A.B. Roberts(eds.), Peptide Growth Factors and Their Receptors I, Springer-Verlag, Berlin). 이족에는 TGFβ-1(Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705; Moses et al., 1981, Cancer Res. 41:2842-2848; Roberts et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5339-5343; Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244), TGF-β2(DeMartin et al., 1987, EMBO J. 6:3676-3677;Hanks et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 79-82; Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26, 2406-2410; Madisen et al., 1988, DNA 7, 1-8; Marquardt et al., 1987, Biol. Chem. 262:12127-12131, Seyedin et al., 1987, J. Bio. Chem. 262:1946-1949), TGF-β3(Derynck et al., 1988, EMBO J. 7:3737-3743; Jakowlew et al., 1988, Endocrinnol. 2, 747-755, TGF-β4(Jakowlew et al., 1988, Mol. Endocrinnol. 2:1064-1069), TGF-β5(Kondaiah et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:1089-1093), 그리고 분명히 연관된 Mullerian 저해물질(Cate et al., 1986, Cell. 45:685-698) 인히빈스(Mason et al., 1985, Nature 318:659-663), 뼈 모양 유전자 단백질(Wozney et al., 1988, Science 242:1528-1534), 그리고 OP-1(Ozkaynak et al., 1990, EMBO J. 9:2085-2093)를 포함한다. 신규 발견된 것은 OP-2(Ozkaynak et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:25220-25227), GDF-1(Lee, 1990, Mol. Endocrinnol. 4:1034-1040); GDF-3와 GDF-9(McPherron and Lee, 1993, J. Biol. Chem. 268:3444-3449)와 노달(Zhou et al., 1993, Nature 361:543-546)를 포함한다.
TGF-β는 세포증식에서 이의 효과가 특징화되었다. 이는 쥐 신장 섬유 아세포(Robert 1981)의 고정-무관한 성장을 촉진시키고, 원숭이 신장 세포(Tucker et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6757-6761)의 성장을 저해시켰다. 그 이후에도 많은 다양한 생물학적 효과를 나타내고 있는데; 뼈 형성을 촉진시키고(Noda and Camilliere, 1989, Endocrinnol. 124:2991-2995; Joyce et al., 1990, J. Cell. Biol. 110:2195-2207; Marcelli et al., 1990, J. Bione Mineral Res. 5:1087-1096; Beck et al., 1991, J. Bone Mineral Res. 6:961; Mackie and Trechsel, 1990, J. Cell. Biol. 110, 2195-2207), 쥐 근육 세포가 연골-특이적 거대분자를 생산시키도록 유도하고(Seyedin et al., 1984, J. Biol. Chem. 261:5693-5695; Seyedin et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5693-5695; and Seyedin et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:1946-1949), 초기 조혈 조상 세포의 성장을 저해시키고(Goey et al., 1989, J. Immunol. 143:877-880), T 세포(Kehrl et al., 1986, J. Exp. Med. 163:1037-1050), B 세포(Kasid et al., 1988, J. Immunol. 141, 690-698), 쥐케라틴 세포(Pietenpol et al., 1990, Cell 61:777-785; Coffey et al., 1988, Cancer Res. 48:1596-1602), 그리고 몇가지 사람 암세포수(Roberts et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:119-123; Ranchalis et al., 1987, Biophys. Res. commun. 148:783-789)의 성장도 저해한다. TGF-β는 콜라겐과 피브로넥틴의 합성과 분비는 증가시키고(Ignotz and Massague, 1986, J. Biol. Chem. 261:4337-4345; Centrella et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:2869-2874; Malemud et al., 1991, J. Cell Physio. 149:152-159; Galera et al., 1992, J. Cell Physio. 153:596-606; Phillips et al., 1994, Soc. Inv. Derm. 103-2:228-232), 칼에 베인 상처의 치유를 가속화시키고 (Mustoe et al., 1987, Science 237:1333-1335), 쥐의 유선 체외이식조직에서 카제인 합성을 억제하고(Robinson et al., 1993, J. Cell. Biol. 120:245-251), 쥐의 간 상피 세포에서 pRb의 DNA합성과 포스포릴화를 저해하고(Whitson and Itakura, 1992, J. Cell. Biochem. 48:305-315), BFGF 결합 프로테오글리칸의 생산을 자극하고(Nugent and Edelman, 1992, J. Biol. Chem. 267:21256-21264), EGF 수용체의 포스포릴화와 유표피 육종 세포의 증식을 조절하고 (Goldkorn and Mendelsohn, 1992, Cell Growth and Differentiation) 그리고 자궁상피 세포에 아포프토시스를 유도하고(Rotello et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3412-3415), 배양된 간세포와 퇴행성간(Oberhammer et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5408-5412)에서도 유도한다. TGF-β는 내피에 호중구 흡착을 방해함으로써 재환류 손상에 대해 심장 보호를 중개하고((Lefer et al., 1990, Science 249, 61-64; Lefer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. sci. USA 90:1018-1022), 쥐에서 실험적인 자가 면역 질환에 대해서도 보호한다(Kuruvilla et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2918-2921).
근육 세포와 연골 세포에서 연골 특이적 거대 세포의 생산을 유도하는 TGF-β의 능력에 대한 전술한 보고와는 대조적으로, TGF-β는 병아리 흉골 연골 세포에 의해 콜라겐Ⅱ의 합성을 섬유아세포 성장인자와 함께 공조하여 저해시키고(Horton et al., 1989, J. Cell Physio. 141:8-15) 그리고 TGF-β는 쥐 연골 세포에서 콜라겐Ⅱ의 생산을 저해한다(Rosen et al., 1988, J. Cell Physio. 134:337-346). 사실 TGF-β는 배양물에서 대부분 정상세포 형태의 증식을 원형질성 저해제로 작용하고 생체내에서 생물학적 활성이 상당히 다양함을 보여주고 있다(Alexandrow, M.G., and Moses, H.L., 1995, Cancer Res. 55:1452-1457).
TGF-β1은 사람과 돼지 혈소판 (Assoian et al., 1993)에서, 사람 태반(Frolick et al., 1983)에서 얻을 수 있고 재조합 TGF-β1이 현재 이용될 수 있다(Gentry et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427).
2.4.2. 인슐린과 유사한 성장인자 Ⅰ와 Ⅱ(IGF-1 와 IGF-Ⅱ)
인슐린 단독으로는 콜라겐 매트릭스 합성의 자극에 IGF-I보다 더 강력하지는 못하다. 그러나, 인슐린은 저농도 혈청(1%) 존재 하에 프로테오글리칸 합성을 강화시킨다. IGF-I(이는 소마토메틴 c로 지정되었으며)는 생체 내에서 콜라겐과 프로테오글리칸 합성을 유도하는 강력한 물질이다(Lindahl et al., 1987, J. Endocrinnol. 115:263-271; Markower et al., 1989, Cell. Biol. Int. Rep. 13:259-270).
IGF-Ⅱ는 DNA와 RNA합성을 촉진시키고 태아 세포에서 클론 성장의 자극에서 IGF-I보다 더 강력한데 반면 IGF-I는 성인 연골세포에서 더 효과적이다. IGF-Ⅱ는 프로테오글리칸 합성을 자극하는데 그러나, 인슐린과 같이 IGF-I보다는 효과가 적다.(McQuillan et al., 1986, Biochem. J. 240:423-430).
2.4.3. 성장호르몬(GH).
GH를 장관외 투여하면, 생체내에서 국소화된 성장판 발생을 촉진시킨다. 하수체 절제하면 성장판 연골 세포에서 IGF-I가 사라지게되고, 이는 합성이 중단됨을 나타낸다. 한편, GH로 국소 또는 전신 처리하면 IGF-I가 나타나게 된다. 시험관에서 세포성장시에 GH의 직접적인 자극 효과에 대한 보고(Maro et al., 1989, Endocrinnology 125:1239-1445)와 이것이 효과가 없다는 보고와 상반된다(Burch et al., 1985, J. Clin. Endocrinnol. Metab. 60:747-750).
2.4.4. 다른 성장인자
상피 성장인자(EGF)단독으로는 연골 세포 증식에 효과가 없다. 인슐린과 함께 EGF는 프로테오글리칸 합성을 촉진하고 연골 세포 증식을 유도한다(Osborn et al., 1989, J. Orthop. Res. 7:35-42). 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)는 태아 관절 연골에서 프로테오글리칸 합성을 저해하는데(Hamerman et al., 1986, J. Cell. Physiol. 127:317-322), 그러나 성인 관절 연골에서는 IGF-I와 추가 기능이 있으며 프로테오글리칸 합성을 촉진시킨다.(Osborn, K.D., et al., 1989, J. Orthop. Res. 7:35-42). 혈소판 유도 성장인자(PDGF)역시 프로테오글리칸의 합성을 강화시킨다(Prins et al., 1982, Arthritis Rheum. 25:1228-1238). 특정 골 형성 단백질(BMPs)는 연골 생성을 자극하고, 연골 생산을 촉진시킨다(Inada et al., 1996, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 222(2):317-322; Hattersley et al., 1995, J. Bone and Mineral Res. 10(1):PS163).
3. 발명의 요약
본 발명은 in vivo 또는 in vitro에서 다양한 치료 용도를 가지는 연골 조직을 생산하는 방법 및 그 조성물에 관계한다. 본 발명에 따르면, 연골 조상 세포 또는 "미숙-연골세포"를 태관, 좀더 구체적으로는 와튼제대교질로부터 분리하여, 배양시켜, 연골 조직을 만드는 연골 세포를 만든다. 본 발명은 in vitro 배양 기술을 이용하여, 와튼제대교질에서 미숙-연골세포를 분리할 수 있다는 것을 발견한 것에 일부 기초한다.
본 발명의 구체예에서, 와튼제대교질로부터 분리된 미숙-연골세포를 유사분열을 이용하여 확장시키고, in vitro에서 배양하여, 치료용 연골 조직을 만들 수 있는 연골세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 와튼제대교질로부터 분리된 미숙-연골세포를 분화시켜, 세포 은행에 냉동 보관하여, 나중에 이를 해동시켜, 필요에 따라 연골 세포를 만드는데 이용한다. 가령, 와튼제대교질는 개체가 출생한 후에 바로 개체의 태관으로부터 모은다. 본 발명의 세포는 이와 같이 모아진 물질에서 분비 또는 생산되는데, 모아진 물질은 개체가 살아가는 동안에 수년간 "세포 은행"에 냉동 보관할 수 있다. 필요한 때에 은행에서 세포를 빼내어, 해동시킬 수 있는데, 개체가 연골뿐만 아니라 뼈, 인대 또는 건등의 간엽 조직의 치료 또는 대체 및 증식을 요하는 시기에 해동된 세포를 이용하여 새로운 조직을 만들 수 있다.
와튼제대교질에서 분리한 세포의 "운명적인" 성질로 인하여, 본 발명에 따른 이식된 세포 또는 이로부터 만들어진 연골 조직에 대한 면역 거부를 최소화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 구체예에서, 이와 같은 세포는 이를 필요로 하는 환자에게 사용할 수 있는 "언제든지 제공하는 세포"의 역할을 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 세포를 환자에 주사할 또는 이식할 하이드로겔 용액에 현탁시킨다. 또는, 세포는 먼저 하이드로겔에 접종을 시키고, 배양하여, 이식한다. 적절하게는 세포는 하이드로겔에서 배양하고 이를 유사분열에 의해 확장시키고 이식한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포에서 새로운 연골 조직을 준비하여, 이를 이용하여 현재 당분야에서 이용할 수 있는 또는 앞으로 개발된 복구, 대체 또는 증대 기술을 이용하여, 환자의 연골 조직을 복구, 대체 및 증대시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 세포를 삼차원 프레임워크 또는 스카폴드에 접종하고, 이때 3차원 프레임워크 또는 스카폴드눈 미숙-연골세포 또는 연골 세포에 의해 연결될 수 있는 틈, 구멍 또는 입구를 가지는 생체 적합성있는 무생물 물질로 구성된다. 적절한 in vitro 조건에서, 접종된 세포는 삼차원 프레임워크를 에워싸고, 세포외 매트릭스를 분비하여 in vivo에 이식할 수 있는 새로운 살아있는 연골 조직을 만든다. 또는, 본 발명의 세포는 삼차원 프레임워크에 접종시키고, 바로 개체의 치료 부위에 이식한다. 접종된 세포는 in vivo에서 새로운 연골 조직을 만들 수 있도록 처리한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포가 접종될 삼차원 프레임워크에는 하나이상의 생활성 물질 또는 항-염증제, 생장인자, 면역억제제등에서 선택된 다른 화합물이 포함되거나 피복되어 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포는 삼차원 프레임워크에 접종시키고, 생장시켜, 이를 용기에 넣고, 이 용기는 간헐적으로 압력을 변화시킬 수 있으며, 또는 연골 조직 구성물을 in vitro에서 생산할 수 있도록 고안된 바이오리액터에 넣고, 이때 바이오리액터는 생장하는 동안에 챔버에 압력을 가할 수 있고, 대류에 의해 연골세포로 적절한 영양분을 공급할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포는 삼차원 프레임워크에 부착시키지 않고 주사등을 이용하여 in vivo에서 직접 투여하여, 그 부위에 새로운 연골 조직을 만든다.
본 발명의 구체예에서는 본 발명의 세포에 의해 만들어진 새로운 연골 조직으로부터 세포외매트릭스를 추출하여, 추가 처리함으로써 연골의 재생 또는 대체 또는 미용상 목적으로 얼굴 및 신체의 다른 부위에 연골 증가에 유용한 조성물을 만든다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, TGF-β또는 BMP-2, BMP-12, BMP-13과 같은 BMPs등의 생장인자를 외부에서 공급하여, 본 발명의 세포를 자극시켜 연골을 만든다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포를 유전공학적으로 조작하여, 특정한 종류의 생장인자, 펩티드, 단백질 및 다른 분자를 생산하거나 또는 그 양을 증가시켜, 이와 같이 생산된 물질은 생산되는 연골의 양을 증가시키는 역할을 하거나 또는 이식과 연관된 거부 또는 염증등의 위험을 감소시킴으로써 이식 성공률을 개선시킨다.
1. 개요
본 발명은 연골 조직을 생산하는 조성물 및 그 방법에 관계한다. 좀더 구체적으로는 본 발명은 와튼제대교질(Whaton's jelly; 태생아의 제대에 가득한 물질)와 같은 탯줄도관의 미숙-연골세포(pre-chondrocyte)를 분리하는 방법에 관계하는데, 이때 미숙 세포는 연골 조직을 만드는 연골 세포가 된다. 분리된 미숙 연골 세포 또는 연골 조직으로 되는 연골 세포를 배양물에서 유사분열로 연장시켜, 광범위한 치료 용도를 가지는 연골 조직을 형성하도록 유도한다. 본 발명의 미숙 연골 세포 또는 이로부터 생산되는 연골 세포를 냉동 보존하여, 세포 "은행"을 만들고, 이는 해동하여 필요한 경우에 새로운 연골 조직을 만드는데 이용한다. 사람 연골 조직을 생산하는데 특히 유용하게 이용된다.
본 발명은 미숙 연골 세포를 와튼제대교질로부터 분리하여, 이를 삼차원 프레임에 접종하여, 연골 조직이 형성되도록 유도하는 실시예를 통하여 설명한다.
도 1A는 세포가 접종된 삼차원 프레임워크상에 in vitro에서 형성된 새로운 연골 조직을 나타낸다. 본 발명의 세포는 PGA 펠트 프레임워크에 접종하여, 이를 4주간 완전배지(RPMI 1640, 10% FBS, 5% ES, 항생제, 하이드로코르티손이 없는 항진균제)(TGF-β1 없음)에서 생장시킨 것을 4X 확대한 것이다. 선은 ㎜단위이다.
도 1B는 세포가 접종된 삼차원 프레임워크상에 in vitro에서 형성된 새로운 연골 조직을 나타낸다. 본 발명의 세포는 PGA 펠트 프레임워크에 접종하여, 이를 72시간 완전배지(RPMI 1640, 10% FBS, 5% ES, 항생제, 하이드로코르티손이 없는 항진균제)에서 배양하고, TGF-β1 10ng/㎖를 포함하는 배지에서 72시간 배양하고, 마지막으로 TGF-β1 없는 배지에서 추가 3주간 생장시킨 것이다. 4X 확대한 것. 선은 ㎜단위이다. 연골은 도 1A의 것보다 더 크고 더 조밀하다.
도 1C는 세포가 접종된 삼차원 프레임워크상에 in vitro에서 형성된 새로운 연골 조직을 나타낸다. 본 발명의 세포는 PGA 펠트 프레임워크에 접종하여, 이를 72시간 완전배지(RPMI 1640, 10% FBS, 5% ES, 항생제, 하이드로코르티손이 없는 항진균제)에서 배양하고, 그 다음 세포 배양물은 TGF-β1 없는 완전 배지에서 72시간 배양하고, 마지막으로, TGF-β1 없는 완전 배지에서 추가 2.5주간 생장시킨 것이다. 4X 확대한 것. 선은 ㎜단위이다. 연골은 도 1A의 것보다 더 크고 더 조밀하다.
도 2A는 도 1B에서 설명하는 것과 같이 배양된 새로운 연골 조직의 헤마토실린 및 에오신 착색된 부분(4㎛)을 나타낸다. 조직에서는 상당한 매트릭스 침착은 보이나, 히알린 연골의 특징인 열공은 없다. 확대 100X
도 2B는 도 1C에서 설명하는 것과 같이 배양된 새로운 연골 조직의 헤마토실린 및 에오신 착색된 부분(4㎛)을 나타낸다. 조직에서는 상당한 매트릭스 침착은 보이나, 히알린 연골의 특징인 열공은 없다. 확대 100X.
도 2A는 도 1B에서 설명하는 것과 같이 배양된 새로운 연골 조직의 사프로닌 O 착색된 부분(7-8㎛)을 나타낸다. 확대 100X
도 3B는 도 1B에서 설명하는 것과 같이 배양된 새로운 연골 조직의 사프로닌 O 착색된 부분(7-8㎛)을 나타낸다. 확대 100X.
도 4A는 도 1B에서 설명하는 것과 같이 배양된 새로운 연골 조직의 면역 착색된 부분(4㎛)을 나타낸다. 부분은 정상적인 혈청(이소타입 기준)으로 처리한다. 면역과산화효소 반응을 이용하여 착색을 만든다. 확대 100X.
도 4B는 도 1B에서 설명하는 것과 같이 배양된 새로운 연골 조직의 면역 착색된 부분(4㎛)을 나타낸다. 부분은 사람 타입 I에 대한 항체로 처리한다. 면역과산화효소 반응을 이용하여 착색을 만들고, 콜라겐 타입 I의 경우에는 양성 착색이 된다. 확대 100X.
도 4C는 도 1B에서 설명하는 것과 같이 배양된 새로운 연골 조직의 면역 착색된 부분(4㎛)을 나타낸다. 부분은 사람 타입 II에 대한 항체로 처리한다. 면역과산화효소 반응을 이용하여 착색을 만들고, 콜라겐 타입 II의 경우에는 양성 착색이 된다. 확대 100X.
도 4D는 도 1C에서 설명하는 것과 같이 배양된 새로운 연골 조직의 면역 착색된 부분(4㎛)을 나타낸다. 부분은 사람 타입 I에 대한 항체로 처리한다. 면역과산화효소 반응을 이용하여 착색을 만들고, 콜라겐 타입 I의 경우에는 양성 착색이 된다. 확대 100X.
도 4E는 도 1C에서 설명하는 것과 같이 배양된 새로운 연골 조직의 면역 착색된 부분(4㎛)을 나타낸다. 부분은 사람 타입 II에 대한 항체로 처리한다. 면역과산화효소 반응을 이용하여 착색을 만들고, 콜라겐 타입 II의 경우에는 양성 착색이 된다. 확대 100X.
도 5는 새로운 연골 조직 구조체의 착색 강도를 요약한 것이다. 상기 도 1A(TGF-β1 없음, 처리 안함), 도 1B(TGF-β1 x1), 도 1C(TGF-β1 x2)와 같이 처리하여 배양한다. 강도는 0 내지 +4등급으로 매긴다. 사프로닌 O(SAF) 및 트리크롬(TRICH)으로 구조체를 착색한 것을 관절 연골 조직 부분을 착색한 것과 비교한다(양성 기준, +4). 타입 I 또는 타입 II에 대한 항체로 구조체를 면역착색한 후에, 면역 과산화효소 반응을 하여, 이소타입 기준 혈청(음성 기준, 0)으로 착색한 것과 비교한다.
도 6A은 새로운 연골 조직 구조의 종단면 면적(μm2)을 나타낸다. 3주 배양물을 총 3주간 상기 도 1A(TGF-β1 없음, 처리 안함), 도 1B(TGF-β1 x1), 도 1C(TGF-β1 x2)와 같이 처리하여 배양한다. 6주 배양물은 상기와 같이 배양을 실시하나, 추가 3주는 TGF-β1 없는 완전 배지로 배양을 계속한다. 컴퓨터를 이용하여 면적을 측정한다. 이 데이터는 도 1A-C에서 나타낸 것을 정량화한다. 약 3주간 최대 면적 증가가 있었다.
도 6B은 배양물에서 3주후에 새로운 연골 조직 구조의 종단면 면적(μm2)을 나타낸다. 배양물은 처리를 하지 않거나 또는 다음의 생장 인자로 처리한다; 뇌하수체 추출물(PE, 10㎍/㎖)의 경우, 본 발명의 세포는 PGA 펠트 프레임워크에 접종하고, 72시간동안 완전배지(RPMI 1640, 10% FBS, 5% ES, 항생제, 하이드로코르티손이 없는 항진균제)에서 배양하고, 그 다음 PE(10㎍/㎖)를 포함하는 배지에서 72시간 배양하고, 마지막으로 PE없는 배지에서 추가 3주간 생장시킨 것이다; TGF-β1 + 상피 생장 인자(EGF, 100ng/㎖)을 도 1B에서 설명하는 방법으로 첨가하는데, 단 상피생장인자는 TGF-β1과 함께 첨가한다; TGF-β1 + 인슐린 유사 생장 인자(IGF, 100ng/㎖)도 도1B에서 설명하는 방법으로 첨가하는데, 단 인슐린 유사 생장 인자는 TGF-β1과 함께 첨가한다. 컴퓨터를 이용하여 면적을 측정한다. 이 데이터는 도 1A-C에서 나타낸 것을 정량화한다. 약 3주간 최대 면적 증가가 있었다.
본 발명은 연골 질병 또는 연골 손상을 치료하는데 이용되는 새로운 연골 조직을 만들거나 추가 연골을 제공하여 연골 구조를 보강하는데 이용되는 새로운 연골 조직을 만드는 방법 및 그 조성물을 제공하는데; 이는 (a) 와튼제대교질로부터 미숙-연골세포를 분리하는 방법; (b) 분리된 미숙-연골세포 또는 이로부터 분화된 연골세포(통칭하여 본 발명의 세포)를 유사분열에의해 확장시키는 방법; (c) 새로운 연골 조직이 형성되거나 유도되는 조건하에 본 발명의 유사분열에 의해 확장된 세포 집단을 배양하는 방법을 포함한다. 또한 본 발명은 유사분열에 의해 확장된 또는 다른 방법에 의해 확장된 본 발명의 세포; 이로부터 생산된 새로운 연골 조직; 이로부터 추출된 세포외 매트릭스 및 3차원 연골 세포/프레임워크 구조등을 포함하나 이에 한정되지 않는 전술한 방법에 의해 만들어진 생성물에 관계한다. 본 발명은 또한, 상기와 같은 세포, 구조 및 조직을 in vivo에서 연골 복구, 대체 또는 증강을 위해 이용하거나 또는 새로운 연골 조직 또는 생활성 물질을 만드는데 이용하거나 또는 치료제 또는 미용제 등의 세포독성을 테스트하는데 이용하기 위해 3차원 연골 조직 배양물을 in vitro에서 형성하는데 사용되는 것에 관계한다.
와튼제대교질로부터 분리한 미숙-연골세포 및 이로부터 분화된 연골 세포를 이용하여 질병 또는 외상으로 손상된 연골을 복구 또는 채체할 수 있는 새로운 연골 조직을 만들 수 있다. 또한, 본 발명의 세포를 냉동 보존 및 보관하여, 세포 "은행"으로 만들어 개체가 살아가는 동안에 질병 또는 외상으로 상실한 연골 세포를 복구 또는 대체하기 위해 새로운 연골 조직을 만드는데 이용할 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 세포를 이용하여 세포 "은행" 또는 상시 제공할 수 있는 세포"로 만들어 임의 개체가 필요한 시기에 이를 이용하여 연골 조직을 만들 수 있도록 하는 것에 관계한다.
여기에서 사용된 "미숙-연골 세포"는 (1) 다분화능 또는 계통이 정해지지 않은 조상세포, 일반적으로 당분야에서 말하는 "간세포(stem cell)"로써, 무제한적인 유사분열을 할 수 있어, 이 세포를 재생하거나 또는 연골세포로 분화될 수 있는 자손 세포를 만들 수 있는 세포; (2) 간세포의 유사분열에 의해 생산된 계통이 정해지지 않은 자손 세포로 종국에는 연골세포로 분화될 세포를 의미한다. 미숙-연골세포가 분화되어나오는 간세포와는 달리, 계통이 정해지지 않은 자손세포는 일반적으로 다른 자손 세포를 생산하기 위해 무제한적인 유사분열을 할 수 없지만, 대신 종국에는 연골세포로 분화되는 것을 말한다.
여기에서 언급하는 "연골세포"는 (1) 미숙-연골세포로부터 분화되는 세포; (2) 모 연골세포의 유사분열에서 발생되는 세포; (3) 자체적으로 또는 다른 세포와 연합하여 연골 조직을 구성하는 또는 이를 생산하는 세포외매트릭스("ECM")을 분비할 수 있는 태관 원료 가령 와튼제대교질으로부터 유도되는 임의 세포를 말한다.
여기에서 사용된 "본 발명의 세포"는 (1)와튼제대교질과 같은 태관원료에서 분리된 미숙-연골세포; (2) 연골세포; (3) 전술한 미숙-연골세포 및 연골세포의 혼합된 복합물을 말한다.
여기에서 사용된 것과 같은 "연골 조직"은 당분야에서 일반적으로 인자하는 것으로, 이는 ECM에 포함된 세포로 구성된 특정한 타입의 조밀한 결합조직을 말한다(see, for example, Cormack, 1987, Ham's Histology, 9th Ed., J.B. Lippincott Co., pp. 266-272). 연골 세포의 생화학적인 조성은 형태에 따라 달라지지만, 일반적으로 연골세포의 조성은 콜라겐, 프로테오글리칸 및 물로 구성된 조밀한 ECM가 에워싸고 있는 연골세포로 구성된다. 몇 가지 형태의 연골세포가 당분야에서 공지되어 있는데, 예를 들면, 히알린 연골세포, 관절 연골세포, 늑골 연골세포, 섬유성 연골세포, 반원 연골, 탄성 연골, 청각 연골, 황색연골을 포함한다. 임의 형태의 연골을 만드는 것이 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명은 사람에게서 이용할 수 있는 새로운 연골 조직을 만드는 방법 및 그 조성물에 관계한다. 그러나, 본 발명은 말, 개, 고양이, 양, 돼지를 포함하는 임의 포유류에서 이용할 수 있는 새로운 연골 조직을 만드는 방법 및 조성물에 관계한다. 이와 같은 동물을 치료하는 것도 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명은 설명을 목적으로 다음과 같은 단락으로 나눈다; (i) 와튼제대교질로부터 미숙-연골세포 분리; (ii) 연골세포 분화 및 새로운 연골 조직의 생산; (iii) 미숙-연골세포 및 연골세포 "은행" 정립; (iv) in vivo에서 미숙-연골세포 및 연골세포의 용도; (v) in vitro에서 3차원 연골조직의 정립; (vi) 새로운 연골 조직의 용도; (vii) 유전공학적으로 조작된 연골세포.
5.1. 와튼제대교질에서 미숙-연골세포의 분리
본 발명의 미숙-연골세포는 태관 원료 적절하게는 와튼제대교질에서 분리한다. 와튼제대교질는 성긴 점액성 결합조직으로 태관에서 발견되는 젤라틴성 물질이고, 이는 섬유아세포, 콜라겐 섬유 및 주로 히알루론산으로 구성된 무정형 기초 물질로 설명된다(Takechi et al., 1993, Placenta 14:235-45). 와튼제대교질의 조성 및 조직에 대해 다양한 연구가 진행되었다(Wharton's jelly (Gill and Jarjoura, 1993, J. Rep. Med. 38:611-614; Meyer et al., 1983, Biochim. Biophys. Acta 755:376-387). 와튼제대교질에서 "섬유아세포-유사 세포"를 분리하여, 이를 in vitro에서 분리하는 것에 대해 설명한 보고도 있다(Wharton's jelly (McElreavey et al., 1991, Biochem. Soc. Trans. 636th Meeting Dublin 19:29S).
본 발명에 따른 미숙-연골세포를 분리하고 배양하기 위해, 와튼제대교질을 모으기 위해서는, 임신 기간이 끝나자마자 바로 태관을 수득한다. 예를 들면, 태관 또는 이의 일부분은 출생후 바로 실험실로 옮기는데, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)와 같은 배지를 포함하는 멸균된 플라스크, 비이커 또는 배양 접시 등의 멸균 용기를 이용한다. 태관은 와튼제대교질를 모으기전과 모으는 동안에 멸균 상태에서 유지되고 취급되는 것이 바람직하고, 추가로 70% 에탄올로 태관을 처리하고, 이어서 멸균 증류수로 닦아내는 처리를 하여 표면을 멸균할 수 있다. 태관은 와튼제대교질을 추출하기 전에 약 3-5℃에서 최고 3시간동안 간단하게 냉동을 시키지 않고 보관할 수 있다.
당분야에 공지된 방법을 이용하여 멸균상태에서 태관으로부터 와튼제대교질을 수득할 수 있다. 예를 들면, 외과용 매스를 이용하여 태관을 약 1인치 정도의 조각으로 절단하고, 각 조각은 CaCl2(0.1 g/ℓ) 및 MgCl2·6 H2O (0.1 g/ℓ)을 포함하는 충분한 양의 인산완충염(PBS)을 포함하는 50㎖ 원심분리 튜브와 같은 멸균 용기로 옮겨, 부드럽게 교반을 하면서 표면에 있는 혈액을 제거한다. 그 다음 부분에서 표피층 또는 껍질이 되는 외층을 태관의 종축을 따라 개봉한다. 와튼제대교질은 일반적으로 태관의 세 개 혈관사이에 위치한다. 혈관과 표피층은 멸균 핀셋 및 가위로 바로 제거하고, 와튼제대교질를 수득하여 이를 100 ㎜ TC-처리된 배양 접시등의 멸균 용기에 넣는다. 와튼제대교질는 더 작은 부분 가령 배양을 위해 2-3 ㎣으로 절단한다.
화는 적절한 조건하에서 in vitro 배양 배지에서 배양하여, 그 안에 있는 임의 미숙-연골세포가 증식되도록 한다. 임의 적절한 형태의 배양 배지를 이용하여, 본 발명에 따른 미숙-연골세포를 분리하는데, 예를 들면 배지는 DMEM, McCoys 5A 배지(Gibco), Eagle's basal 배지, CMRL 배지, Glasgow 최소 필수 배지, Ham's F-12 배지, Iscove's modified Dulbecco's 배지, Liebovitz' L-15 배지, RPMI 1640 배지 등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 배양 배지에는 한 가지 이상의 성분이 보충될 수 있는데, 예를 들면, 태아 송아지 혈청(FBS), 말 혈청(ES), 사람 혈청(HS), 미생물 오염을 조절하기 위한 한 가지 이상의 항생제, 항진균제 예를 들면, 페니실린 G, 스트렙토마이신 설페이트, 암포테리신 B, 젠타마이신, 니스타틴등을 단독 또는 복합하여 포함할 수 있다.
가장 적절한 배양 배지, 배지 준비, 세포 배양 기술 등의 위한 방법은 당분야에 공지되어 있고, 이는 다양한 자료를 통하여 설명하고 있다(Doyle et al., (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester; and Ho and Wang (eds.), 1991, Animal Cell Bioreactors, Butterworth-Heinemann, Boston).
충분한 시간 동안(약 10-12일) 와튼제대교질을 배양한 후에, 외식된 조직에 있는 미숙-연골세포는 조직 밖으로 생장하는 경향이 있어, 이로부터 세포가 이동하거나 세포가 분할된다. 이들 미숙-연골세포를 떼내어 동일한 또는 처음에 사용된 배지와는 다른 형태의 새로운 배지를 포함하는 별도의 배양 용기에 넣고, 이때 미숙-연골세포군은 유사분열에 의해 확장된다.
또는, 와튼제대교질에 있는 다른 세포 형은 미숙-연골세포를 분리할 수 있는 소집단으로 분취할 수 있다. 이는 세포 분리용 표준 기술을 이용하면 되는데, 예를 들면, 효소적으로 처리하여 와튼제대교질을 이의 성분 세포로 분리하고, 형태학적 또는 생화학적 표식을 이용하여 특정 세포형의 클로닝 및 선별, 원하지 않는 세포는 선택적으로 분리(음성 선별), 혼합된 집단에서 소이빈 응집을 이용한 분별적인 세포 응집에 기초한 분리, 냉동-해동 과정, 혼합된 집단에서 차등적으로 세포가 흡착하는 성질을 이용하여 분리, 여과, 통상적인 구역 원심분리(카운터-스트리밍 원심분리), 단위 비중 분리, 카운터커런트 분포, 전기영동, 형광에 의해 활성화되는 세포 분류(FACS)등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 클로닝 선별 및 세포 분리 기술에 대한 내용은 다음 문헌을 참고로 한다(Freshney, 1994, Culture of Animal Cells; A Manual of Basic Techniques, 3d Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, Which is incorporated herein by reference.).
미숙-연골세포를 배양하는 적절한 구체예에서, 와튼제대교질은 약 2-3 ㎣의 부분으로 절단하고, 이를 TC-처리된 배양접시(배양접시 바닥에는 유리 슬라이드가 있음)에 둔다. 조직 부분은 또 다른 유리 슬라이드로 덮고, 완전 배지(예를 들면 10% FBS, 5% ES 및 페니실린 G(100 ㎍/㎖), 스트렙토마이신 설페이트(100 ㎍/㎖), 암포테리친(250 ㎍/㎖), 젠타마이신(10 ㎍/㎖)을 포함하는 항균 화합물로 구성된 RPMI 1640, pH 7.4-7.6)에 배양한다. 조직은 37℃, 5% CO2에서 10-12 일간 배양하는 것이 적절하다.
배지는 피펫으로 접시에서 배지를 조심스레 빼내고, 새로운 배지를 채워넣는 방식으로 필요에 따라 교환한다. 접시와 슬라이드의 표면에 충분한 수 또는 밀도의 세포가 축적될 때 까지 배양을 지속한다. 예를 들면, 완전하게 합류되지 않고 약 70% 합류가 적절하다. 원래 외식된 조직 부분은 떼어내고, 남아있는 세포는 표준 기술을 이용하여 트립신으로 처리한다. 트립신으로 처리한 후에, 세포는 수득하여, 새로운 배지에 넣고 상기와 같이 다시 배양한다. 배지는 트립신으로 처리한 후 24시간에 적어도 1회 교환하여 임의 부유하는 세포를 제거한다. 배양물에 남아있는 세포는 미숙-연골세포로 간주한다.
일단 미숙-연골세포를 분리한 후에는 이들 집단은 유사분열에 의해 확장시킨다. 미숙-연골세포는 이들의 밀도가 3 내지 6.5 ×104/㎠ 또는 배양 접시의 표면에 어느정도의 합류가 될 때 까지 새로운 배지로 계대한다. 미숙-연골세포를 배양하는 동안에 세포는 배양 용기의 벽에 달라붙어, 증식을 계속하고, 합류 단층을 이룬다. 이와 같은 현상은 세포 일부분을 새로운 배양 용기로 옮기면 예방하거나 최소화할 수 있는데, 그 이유는 배양용기에 합류 단층이 존재하면 배양물에서 세포 생장이 중단되는 경향이 있기 때문이다. 세로의 일부분을 새로운 배양 용기에 새로운 배지로 옮기거나 합류된 단층을 제거하면 세포의 증식성 활성이 통상적으로 복귀된다. 이와 같이 제거하거나 옮기면 약 25% 합류를 초과하는 미숙-연골세포를 가지는 임의 배양 용기에서 실시할 수 있다. 또는, 액상 배양물은 오비탈 교반기에서 교반하여, 용기 벽에 세포가 부착되는 것을 방지한다.
적절한 구체예에서, 연골 조직은 적은 수의 계대를 한 미숙-연골세포를 이용하여 만든다. 예를 들면, 2-4회 정도의 계대는 세포가 연골 조직으로 분화되고, 생산하는 능력을 보존하는 최적의 계대 수인 것으로 간주된다. 그러나, 본 발명은 일단 미숙-연골세포가 배양물에서 정립되면, 연골 세포를 생산할 수 있는 연골 조직의 조상세포로 역할을 할 수 있는 능력이 유지되는데, 가령, 세포가 적절한 밀도 또는 합류 비율에 도달하게 되면 세포 배양물을 새로운 배지로 정규적으로 계대하거나 적절한 생장 인자로 처리하거나 배양 배지 또는 배양 과정을 변형시키거나 상기 언급한 내용을 복합하면 그 능력이 유지된다.
본 발명에 따르면, 미숙-연골세포는 개체 자신의 태관으로부터 수집한 와튼제대교질에서 구할 수 있다. 또는 태아 또는 새로 태어난 아기의 태관에서 수득한 와튼제대교질에서 구할 수 있는데, 이때 이와 같은 치료가 필요한 개체는 태아 또는 어린아기의 부모가 될 수 있다. 또는, 와튼제대교질로부터 분리된 세포의 "운명적인" 성질 때문에, 본 발명의 세포 또는 이로부터 생산된 새로운 연골 조직의 면역 거부를 최소화시킬 수 있다. 그 결과, 이와 같은 세포는 새로운 연골 조직을 원하는 개체에게 새로운 연골 조직을 제공하는 "지속적인 제공 세포"로 이용될 수 있다.
5.2. 연골세포의 분화 및 연골 조직 생산
일단 정립되면, 미숙-연골세포 배양물은 새로운 연골 조직을 만들 수 있는 연골세포을 만드는데 이용된다. 미숙-연골세포가 연골세포로 분화되고, 이로부터 연골 조직이 만들어지는 것은 아스코르베이트 유무 하에, BMP-13 또는 TGF-β등의 BMPs와 같은 특정 외생 생장 인자를 배양 배지에 추가하면 촉진시킬 수 있다.
또는, 미숙-연골세포를 유전공학적으로 조작하여, 이식전후에 연골세포가 성공적으로 분화되거나 또는 연골 생산을 개시하도록 TGF-β(TGF-β1)와 같은 특정 생장 인자에 대한 유전자를 발현시키도록 한다.
본 발명은 또한, 연골세포의 배양물 및 미숙-연골세포와 연골세포로 구성된 배양물을 만들고 이를 유지하는 방법을 포함한다. 미숙-연골세포의 경우에, 일단 연골세포 배양물 또는 미숙-연골세포와 연골세포 혼합 배양물을 만들고, 세포 집단은 in vitro에서 연골 형성 없이 세포가 증식할 수 있도록 하는 유도 조건하에 가령, TGF-β또는 다른 생장인자가 결여된 배양 배지로 세포를 계대하여 유사분열적으로 세포를 확장시킨다. 미숙-연골세포의 배양물의 경우에, 연골세포 및 미숙-연골세포와 연골세포 혼합 배양물은 충분한 세포 밀도에 도달한 경우에 새로운 배지로 옮긴다. 따라서, 세포 단층이 형성되는 것은 세포의 일부분을 새로운 배양 용기로 옮기거나 새로운 배지로 이동시켜 최소화한다. 이와 같이 제거하거나 이동시키는 것은 약 25% 합류된 세포 단층을 가지는 임의 배양 용기를 이용하여 실시할 수 있다. 또는, 배양 시스템을 교반시켜 세포가 흡착되지 않도록 한다.
5.3. 세포 은행 설립
일단 본 발명의 세포가 상기와 같이 배양물을 이루면, 이들은 세포 "은행"으로 유지되거나 보관되는데 세포 은행은 in vitro에서 규칙적인 이동을 요하는 세포 배양물 또는 이들을 냉동보존한 것으로 구성된다.
본 발명의 세포를 냉동 보관하는 방법은 공지의 방법에 따라 실시되는데 예를 들면 Doyle et al., 1995, supra.에서 설명하는 것을 참고로 한다. 예를 들면, 세포를 "냉동 배지"에 현탁하는 것으로 구성되나 이에 국한시키지는 않는데, 가령 배양 배지는 15-20% FBS, 10% 디메틸설폭시드(DMSO)와 5-10% 글리세롤로 구성되고, 세포 밀도는 약 4-10 ×106cells/㎖이 된다. 세포는 유리 또는 플라스틱 앰플(Nunc)에 분배하고, 이를 봉하여 미리 프로그램된 냉동기 챔버에 넣는다. 적절한 냉동 속도는 실험을 통하여 결정한다. 예를 들면, 융합 열을 통하여 -1℃/min의 온도 변화를 제공하는 냉동 프로그램을 이용할 수 있다. 일단 앰플의 온도가 -180℃에 도달되면, 이를 액체 질소 저장 부위로 이동시킨다. 냉동 보관된 세포는 몇 년이 저장할 수 있는데 주기적으로 적어도 5년마다 생존성을 유지하는지를 점검한다.
본 발명의 냉동 보관된 세포는 세포 은행을 구성하고, 이의 일부분은 해동시켜 "빼내고", 이를 이용하여 필요에 따라 새로운 연골 조직을 만든다. 해동은 일반적으로 신속하게 이루어지는데 예를 들면 액체 질소에서 보관된 앰플을 37℃ 수조로 이동시키는 것이다. 앰프안에 해동된 내용물은 멸균 상태하에서 10% FBS, 5% ES를 포함하는 RPMI 1640등의 배지를 가지는 배양 용기에 즉각 옮긴다. 배양 배지 있는 세포 밀도는 약 3-6 ×105cells/㎖이 되도록 하여 세포가 배지를 조건화시켜. 가능한 한 지연 form 상을 예방한다. 배양물에서 일단 세포를 역상 현미경으로 매일 검사하여, 세포 증식을 감지하고, 이들이 적정 밀도를 가지면 계대배양한다.
본 발명의 세포는 필요에 따라 은행으로부터 빼내고, 이를 이용하여 하기에서 설명하는 in vitro에서 3차원 연골 배양물로 새로운 연골 조직을 생산하거나 또는 in vivo에서 새로운 연골 조직을 필요로 하는 부위에 세포를 직접 투여하여 새로운 연골 조직을 만든다. 위에서 설명한 것과 같이, 본 발명의 세포를 이용하여 세포가 분리된 원래 개체에 이용될 수 있는 새로운 연골 조직(자가이식)을 만들 수 있다. 또는, 본 발명의 세포는 임의 개체에 이용할 수 있는(이형이식) 새로운 연골 조직을 만들 수 있는 항상 제공하는 세포로 이용된다.
5.4. in vivo에서 미숙-연골세포와 연골세포의 용도
본 발명의 세포를 이용하여, 외상 또는 질병으로 인하여 연골조직이 손상된 경우에 연골 조직을 복구, 대체를 요하는 개체를 치료하거나 안면 또는 신체의 다른 부위에 미용상으로 연골을 보강하기 위한 용도에 이용된다. 본 발명의 세포를 이용하여, 새로운 연골 조직을 만드는데, 따라서 생산된 연골 조직을 이용하는 것은 공지의 방법 또는 개발될 방법을 이용한다. 예를 들면, 본 발명의 세포는 손상 조직에 바로 투여되거나 또는 이식 또는 주입되어 새로운 연골 조직을 in vivo에서 만들 수 있다.
구체예에 따르면(이에 국한시키지는 않지만), 본 발명의 세포로 구성된 조성물을 준비하여, 새로운 연골 조직이 생성되기를 원하는 부위에 직접 주사한다. 예를 들면, 본 발명의 세포는 주사용 하이드로겔 용액에 현탁한다. 또는, 세포를 포함하는 하이드로 겔 용액은 틀에서 경화시켜 이식하기전에 세포가 분산된 매트릭스를 만들도록 한다. 또는 일단 매트릭스가 경화되면, 세포 조성물을 배양하여, 세포가 유사분열에 의해 확장되고 이를 이식한다. 하이드로겔은 유기 고분자(천연 도는 합성)로써 공유, 이온 또는 수소 결합을 통하여 연결되어, 물분자를 포집하는 3차원 개방 격자 구조를 만들어 겔을 형성한다. 하이드로겔을 형성하는데 이용되는 물질의 예로는 알지네이트, 이의 염과 같은 폴리사카라이드, 폴리포스파진. 폴리아크릴레이트(이온에 의해 교차결합되거나 또는 PluronicsTM또는 TetronicsTM와 같은 블록 중합체; 이들은 각각 폴리에틸렌 옥시드-폴리프로필렌 글리콜 블록 혼성중합체로 온도 또는 pH에 의해 교차결합됨)등을 포함한다.
일반적으로, 이들 중합체는 물, 완충염 용액 또는 수용성 알코올 용액(전하를 띈 측기를 가지는 또는 이의 단가 이온 염)에서 부분적으로 용해될 수 있는 것이다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측기를 가지는 고분자로는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메타아크릴산), 아크릴산 및 메타아크릴산 혼성중합체, 폴리(비닐 아세테이트), 설폰화된 폴리스티렌과 같은 설폰화된 고분자등을 포함한다. 아크릴 또는 메타아크릴산과 비닐 에테르 단량체 또는 복합체와 반응하여 형성된 산성 측기를 가지는 혼성중합체를 이용할 수 있다. 산성기의 예로는 카르복실산기, 설폰산기, 할로겐화된(적절하게는 플로오르화된) 알코올기, 페놀성 OH기, 산성 OH 기등이 있다.
음이온과 반응할 수 있는 염기성 측기를 가지는 고분자를 예로 들면, 폴리(비닐 아민), 폴리(비닐 피리딘), 폴리(비닐 이미다졸), 일부 이미노 치환된 폴리포스파젠등이 있다. 고분자의 암모니움 또는 4가 염은 질소 또는 펜던트 이미노기에서 만들어질 수 있다. 염기성 측기를 예로들면 아미노 및 이미노기가 된다.
알지네이트는 실온의 물에서 이가양이온과 이온에 의해 교차결합되어 하이드로겔 메트릭스를 형성한다. 이와 같은 유순한 조건으로 인하여, 알지네이트는 하이브리도마 세포 포집용으로 가장 흔히 이용되는 고분자이다(미국 특허 4,352,883 to Lim). Lim 공정에 따르면, 포집될 생물학적 물질을 포함하는 수용액에 수용성 고분자 용액을 현탁하고, 현탁액은 다가 양이온과 접촉하여 별도의 미소구모양으로 방울을 형성하여, 미소구의 표면은 폴리아미노 산과 교차결합하여 포집된 물질 주변에 반투성 막을 형성한다.
폴리포스파젠은 일중 결합과 이중 결합을 교차 반복하면서 분리되는 질소 및 인으로 구성된 기본 구조를 가지는 고분자이다. 각 인 원자에는 두 개의 측쇄("R")가 공유 결합되어 있다. 폴리포스파젠에서 반복되는 단위의 일반 구조식은 다음과 같고, 이때 n은 정수이다;
교차 결합에 적합한 폴리포스파젠은 이가 또는 삼가 양이온과 염 다리를 형성할 수 있는 산성인 측쇄기를 가진다. 적절한 산성 측쇄기로는 카르복실산기와 설포닌산기가 된다. 가수분해에 안정한 폴리포스파젠은 Ca2+또는 Al3+와 같은 이가 또는 3가 양이온에 의해 교차결합되는 카르복실산 측쇄를 가지는 단량체로 형성된다. 고분자는 이미다졸, 아미노산 에스테르 또는 글리세롤 측쇄를 가지는 단량체가 결합되어 가수분해에 의해 분해되도록 합성된다. 예를 들면, 폴리음이온성 폴리[비스(카르복실라토페녹시)포스파젠(PCPP)을 합성할 수 있는데, 이는 실온 또는 실온이하에서 수용성 매체에 용해된 다가양이온과 교차 결합하여 하이드로겔 매트릭스를 만든다.
생분해가능한 폴리포스파젠은 적어도 두 개의 상이한 타입의 측쇄를 가지는데, 다가 양이온과 염 다리를 형성할 수 있는 산성 측쇄, in vivo 조건하에서 이미다졸기, 아미노산 에스테르, 글리세롤 및 글루코실을 가수분해할 수 있는 측기를 가진다. 여기에서 사용된 생분해 가능한 또는 생체부식가능한이란 말은 원하는 용도(통상 in vivo 치료법)에서 수용가능한 기간 내에 용해되거나 분해되는 고분자를 의미하는데, 약 25℃ 내지 38℃ 온도 범위의 pH6-8의 생리적 용액에 노출되면, 통상 5년 이하, 적절하게는 약 1 년 이하의 기간 동안에 용해되는 고분자를 말한다. 측쇄가 가수분해되어 고분자가 부식된다. 가수분해 가능한 측쇄를 예로 들면, 치환안된 그리고 치환된 이미다졸 및 아미노산 에스테르로, 이때 측기는 아미노 결합을 통하여 인 원자에 결합되어 있다(이와 같은 방식으로 R기가 부착된 폴리포스파젠 중합체는 폴리아미노포스파젠으로 공지되어 있다). 폴리이미다졸포스파젠의 경우에, 폴리포스파젠 기본 구조에서 "R"기중 일부는 고리에 있는 질소 원자를 통하여 기본 구조의 인에 부착된 이미다졸 링이 된다. 다른 "R"기는 가수분해에 참여하지 않는 유기 잔기로써 예를 들면 메틸 페녹시 기 또는 다른 기가 된다(Allcock, et al., Macromolecule 10:824-830 (1977)). 하이드로겔 물질을 합성하는 방법 및 이와 같은 하이드로겔을 준비하는 방법은 당분야에 공지되어 있다.
이와 같은 세포 조성물은 선택된 세포외 매트릭스 성분 가령, 당분야에 공지된 한 가지 이상의 콜라겐 타입, 생장 인자 및 약물을 포함하는 한 가지 이상의 다른 성분이 추가로 포함된다. 세포 조성물에 통상 포함될 수 있는 생장 인자에는 당분야에 공지된 또는 앞으로 확인될 수 있는 한 가지 이상의 생장 인자를 포함하는데, 예로들면, TGF-β족, IGF-I, IGF-II, 생장 호르몬, BMP-13와 같은 BMPs등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 또는, 본 발명의 세포를 유전공학적으로 조작하여, BMP-13 또는 TGF-β와 같은 생장 인자를 발현 및 생산한다. 본 발명의 세포를 유전공학적으로 조작하는 상세한 방법은 하기에서 상술한다. 세포 조성물에 포함될 수 있는 약물에는 항염증제 및 국소 마취제등이 포함된다. 조성물에는 다른 성분이 포함될 수 있는데; (1) 적절한 pH와 등장성을 제공하는 완충액; (2) 윤활제; (3) 투여 부위에 세포가 유지될 수 있도록 점성 물질 가령, 알지네이트, 한천 및 식물성 검; (4) 투여 부위에 원하는 효과 예를 들면, 연골 조직이 형성되는 것을 강화 또는 변형 또는 이의 물리화학적 특징의 강화 및 변화 또는 세포의 생존능을 지원하거나 염증 또는 거부를 저해하는 등의 효과를 낼 수 있는 다른 세포 형을 포함하나 이에 국합시키지 않는다. 세포가 투여 부위를 벗어나지 않도록 적절한 상처를 덮는 것으로 가린다. 이와 같은 상처를 덮을 수 있는 것은 당분야에 공지되어 있다.
또는, 본 발명의 세포는 in vivo에서 바로 이식된 삼차원 프레임워크 또는 스카폴드에 접종되는데, 이때 접종된 세포는 프레임워크의 표면에서 증식되어, 개체의 세포와 공조하여 in vivo에서 연골 조직을 대체한다. 삼차원 프레임워크를 이용하는 것은 하기에서 상술한다. 이와 같은 프레임워크는 위에서 설명한 하나이상의 생장 인자, 약물 또는 다른 성분과 임의 복합시켜, 연골 형성을 자극하거나 또는 본 발명의 실행을 강화 또는 개선시킨다.
5.5. in vitro에서 3차원 연골 배양물의 정립
본 발명의 세포를 이용하여, in vitro에서 새로운 연골 조직을 만들 수 있는데, 배양된 새로운 연골 조직은 바로 이식되거나 또는 연골 조직의 복구, 대체 또는 증강을 요하는 개체 부위에 삽입된다.
구체예에 따르면(이에 한정시키지는 않음), 본 발명의 세포를 이용하여, in vitro에서 3차원 조직 구조물을 만들고 이를 in vivo에서 주입한다. 3차원 조직 구조물을 만드는 예로는 미국 특허 4,963,489, issued October 16, 1990, to Naughton et al.,에서 설명한다. 예를 들면, 본 발명의 세포는 삼차원 프레임워크 또는 스카폴드에 "접종"하고, in vitro에서 증식 또는 생장시켜, 살아있는 연골 조직을 만들고, 이를 in vivo에서 이식시킨다.
본 발명의 세포는 배양 용기에서 부합류 또는 합류되로독 생장시켜, 배양물로부터 들어올리고, 이를 삼차원 프레임워크에 접종시킨다(Naughton et al., 1987, J. Med. 18:219-250). 고농도의 세포 106내지 5 ×107cells/㎖를 삼차원 프레임워크에 접종시키면, 상대적으로 짧은 시간동안에 삼차원 서포트를 만들게 된다.
삼차원 프레임워크는 임의 물질 및 임의 모양으로 만들어질 수 있는데 이는 (a) 세포가 부착할 수 있고(또는 한 층이상으로 세포가 생장할 수 있도록 하고); (b) 세포가 한층이상으로 생장할 수 있는 것을 말한다. 다수의 상이한 물질을 이용하여, 매트릭스를 말들 수 있는데, 예를 들면, 나일론(폴리아미드), 다크론(폴리에스테르), 폴리스테린, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 화합물(가령, 폴리비닐클로라이드), 폴리카르보네이트(PVC), 폴리테트라플로오르에틸렌(PTFE, 테플론), 테르모녹스(TPX), 니트로셀룰로오즈, 목화, 폴리글리콜산(PGA), 콜라겐(스폰지, 노끈 또는 다른 편직 실의 형), 고양이 장 봉합사, 셀롤로오즈, 젤라틴 및 다른 자연 발생 생분해가능한 물질 또는 다양한 폴리하이드록시알카노에이트을 포함하는 합성 물질등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 이들 물질을 메쉬 형으로 편직하여 삼차원 프레임워크 또는 스카폴드를 만든다.
적절한 구체예에 따르면, 프레임워크는 펠트형이고 이는 생체흡수가능한 물질 예를 들면, PGA, PLA, 폴리글루코네이트(PLGA) 또는 히알루론산등으로 만들어진 다층필라멘트 실로 구성된다. 방사는 표준 직물을 처리하는 공정을 이용하여 펠트로 만들 수 있는데, 예를 들면 주름을 잡고, 절단하고, 빗질하고, 바늘로 꿰매는 등의 방법으로 구성된다. 추가 적절한 구체예에 따르면, 펠트는 완전 배지에 미리 담그고, 펠트의 다공성은 80-98%이고, 펠트의 밀도는 30-60㎎/cc이고, 펠트의 두께는 1-7 ㎜가 된다.
또한, 3차원 프레임워크는 유용한 모양으로 주형하여, 귀의 외부 부분 또는 치료, 대체 또는 증강시켜야 되는 신체에서 다른 특정 구조를 가지도록 만든다.
나일론, 폴리스테린등과 같은 특정 물질은 세포가 부착되기에는 좋지 않는 기질이다. 이와 같은 물질이 삼차원 프레임워크에 이용되는 경우에, 본 발명의 세포를 접종시키기 전에 매트릭스를 선처리하여 세포가 매트릭스에 부착이 잘 되도록 하는 것이 좋다. 예를 들면, 본 발명의 세포를 접종시키기 전에, 나일론 매트릭스는 0.1M 아세트산으로 처리하고, 폴리리신, PBS, 콜라겐에 배양하여, 나일론을 피복시킨다. 폴리스테렌은 황산을 이용하여 유사하게 처리한다. 배양물이 장시간동안 유지되거나 냉동보관되는 경우에, 나일론, 다르콘, 폴리스테린, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 테플론, 목화 등의 분해되지 않은 물질을 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 이용될 수 잇는 통상의 나일론 메쉬는 Nitex(이는 평균 포어 크기가 210㎛이고, 직경이 90㎛(#3-210/36 Tetko, Inc., N.Y.)인 나일론 필터 메쉬)이다.
또한, 삼차원 프레임워크의 외부 표면을 변형시켜, 세포의 부착 또는 생장을 개선시키거나 또는 연골 조직의 분화를 개선시키는데, 예를 들면, 프레임워크에 한 가지 이상의 단백질(가령, 콜라겐, 탄성 섬유, 그물 모양의 섬유), 당단백질, 글리코자미노글리칸(가령, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라틴 설페이트등), 세포 매트릭스 및 젤라틴, 알지네이트, 한천, 아가로즈, 식물성 검등으로 코팅하여 처리한다.
본 발명의 세포는 프레임워크에 접종한다. 배양물에서 재생시키는 것이 중요하기 때문에, 연골의 경우 in vivo에서 발견되는 세포 미세 환경 및 in vivo에 이식하기 전에 또는 in vitro에서 이용되는 본 발명의 세포가 생장되는 정도는 다양하다. 또한, 아스코르베이트와 함께 TGF-β와 같은 생장 인자를 세포 접종 전에 또는 접종시키는 동안에 배양 배지에 첨가하여, 연골세포 분화를 촉진시키고, 연골 세포에 의해 연골 형성을 촉진시킨다. 배양물에 유지되는 TGF-β의 농도를 모니터하여, 생장이 최적화되도록 조절한다.
또는, 본 발명의 세포는 BMP-13 또는 TGF-β와 같은 생장 인자를 발현시키고 만들 수 있도록 유전공학적으로 조작될 수 있다. 예를 들면, TGF-β의 유전자 또는 코딩 서열을 조절 프로모터에 연합되도록 위치시켜, 배양물에서 TGF-β가 생산되도록 조절할 수 있다. 본 발명의 세포는 유전공학적으로 조절하여, 이식에 유익한 다른 유전자 생성물을 만들 수 있는데, 예를 들면, 항-GM-CSF, 항-TNF, 항-IL-1, 항-IL-2등을 포함한다. 또한, 세포는 유전공학적으로 조작하여, 염증을 촉진시키는 고유 유전자 생성물의 발현을 제거할 수 있는데, 여기에는 GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2등이 속하고, 또한 거부 위험을 낮추기 위해 "MHC" 발현을 제거한다. 또한, 세포는 유전공학적으로 조작하여, 환자에서 유전자 활성을 조절하는 유전자 치료법에 이용하여, 연골 이식 결과를 지원하거나 개선시킨다. 유전공학적으로 조작된 세포를 스크린하여, (1) in vivo에서 류마티스 질환 또는 염증 반응의 증상을 제거하고; (2) 면역학적 감독 및 거부를 피할 수 있는 세포주를 선별한다.
본 발명의 세포에 추가하여, 3차원 프레임워크에 다른 세포를 추가하여, 3차원 프레임워크에 형성된 새로운 연골 조직의 한 가지 이상의 특징을 변형시키거나 생장을 개선시킨다. 이와 같은 세포에는 섬유아세포, 내피세포, 혈관주변세포, 대식세포, 단세포, 혈장세포, 유선 세포, 지방세포등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
삼차원 프레임워크를 변형시켜, 세포 생장 및 연골 조직이 생장되는 것을 강화시키거나 주입물의 거부 위험을 줄인다. 따라서, 국소, 지연 방출을 위해, 한 가지 이상의 생물학적 활성 화합물이 프레임워크에 추가되는데, 예를 들면, 항-염증물질, 면역억제제 또는 생장인자를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 지연 방출 조성물의 예로는 생물학적으로 활성을 가지는 화합물과 폴리(라틱산), 폴리(라틱 및 글리콜산 혼성물), 메틸셀룰로오즈, 히알루론산, 콜라겐 등과 같은 생체 적합성있는 고분자로 구성된다. 약물 운반 수용체에 사용되는 분해가능한 고분자의 구조, 선별 및 이를 사용하는 것은 몇 가지 문헌을 참고한다(A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3:279-292). 제약학적 조성물에서 고분자를 선별하고 이용하는 안내서는 M. Chasin and R. Langer (eds.), 1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Vol. 45 of Drugs and the Pharmaceutical Sciences, M. Dekker, New York.을 참고로 한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포를 "바이오리엑터"에서 3차원 배양 시스템과 복합하여 이용함으로써, 고유 사람 연골 조직의 생화학적, 물리학적 그리고 구조적 성질을 가지는 연골 조직 구조물을 만드는데, 그 방법은 고유 연골 조직에 의해 경험하는 일반적인 환경 조건하에 세포를 배양하여 조직을 만든다. 따라서, 3차원 배양 시스템은 간헐적인 주기적 가압 조건하에 유지되고, 본 발명의 세포에는 대류에 의해 적절한 영양분의 공급이 이루어진다. 2-5㎜ 두께의 대체 연골 조직 구조를 통하여, 본 발명의 세포에 적절한 영양분 공급을 유지시키는 것은 구조물의 실제 밀도가 증가되기 때문에 상당히 중요하다. 압력이 미세공 3차원 연골 구조를 통하여 유체를 흐르게 하기 때문에, 구조물에 있는 세포로부터 폐기물을 수거하고, 영양분을 공급하는 과정이 개선된다. 바이오리엑터의 모양은 여러 가지가 있는데, 예를 들면, "피스톤-스타일"의 경 플라스틱 바이오리엑터; 주름상자; "압력 판"이 있는 연성 플라스틱 백; "롤러 핀"이 있는 연성 플라스틱 백등을 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
본 발명의 세포를 삼차원 프레임워크에 접종한 후에, 프레임워크에 세포는 적절한 배양 배지에서 배양한다. 많은 시판되는 배지를 이용할 수 있는데, 가령, DMEM, RPMI 1640, Fisher's, Iscove's McCoy's 등의 배지가 사용하기에 적합하다. 다른 유용한 배지를 실험적으로 만들 수 있다. 이와 같은 배양 배지에는 하나이상의 다른 성분, 가령 FBS, ES, HS 또는 상기에서 설명한 항생제 및 항진균제를 포함한다.
삼차원 프레임워크는 배양하는 동안에 증식 활성을 최대로 하기 위해 현탁시키거나 부유시킬 수 있다는 것이 중요하다. 또한, 배양물은 사용된 배지, 해체된 방출 세포를 제거하고, 새로운 배지를 제공하기 위해 주기적으로 "공급"된다. TGF-β가 존재하는 경우에 이의 농도는 이 단계에서 조절된다. 약 10ng/㎖의 TGF-β농도가 바람직하다. 연골세포 배양물에서, 비-필수 아미노산인 프롤린, 아스코르베이트(약 50 ㎍/㎖)이 배양물에 포함될 수 있다.
이와 같은 공정은 바이오리엑터에서 실행할 때 상당히 유용한데, 이는 본 발명의 세포가 접종된 3차원 프레임워크를 보유하는 닫힌 시스템이다. 바이오리엑터는 오염 가능성을 줄이고, 배양물을 간헐적이고 주기적인 가압 조건에 유지시켜, 대류에 의해 삼차원 프레임워크를 통하여 세포로 영양분을 적절하게 공급하는 환경 조건을 만들 수 있다.
배양 기간 동안에, 본 발명의 세포는 일반적으로 선형으로 생장되어, 이를 덮고, 삼차원 프레임워크에 콜로니를 형성하여, 프레임워크의 입구 또는 구멍 안으로 생장하게 된다. 프레임워크의 구멍은 본 발명의 세포가 가로지를 수 있을 정도의 적절한 크기이어야 한다. 메쉬 형의 프레임워크를 이용하는 경우에, 구멍의 크기는 약 150 내지 220㎛이고, 이 정도에서 작업이 잘된다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 삼차원 구조 및 구조의 복잡성에 따라서, 다른 크기의 포어가 작업에 더 적합할 수 있다. 사실, 본 발명의 세포가 상당 시간 동안 뻗어 나가고, 복제를 할 수 있다면 임의 모양 및 구조도 사용될 수 있다.
세포가 부착된 삼차원 프레임워크를 배양하는 동안에 매트릭스로부터 증식된 세포가 방출된다. 이와 같이 방출된 세포는 배양 용기의 벽에 부착되어, 이들은 계속적으로 증식되고, 합류 단층을 이룬다. 이와 같은 현상은 공급하는 동안에 방출되는 세포를 제거하거나 또는 새로운 배양 용기에 삼차원 프레임워크를 이동시켜, 예방하거나 최소화할 수 있다. 상기에서 설명한 것과 같이 용기에 합류된 단층이 존재하는 경우에는 삼차원 프레임워크 또는 배양물에서 세포 생장이 중단될 수 있다. 합류된 단층을 제거하거나 새로운 반응 용기에 포함된 새로운 배지로 프레임워크를 옮기면 삼차원 배양 시스템의 증시 활성은 통상적으로 복귀한다. 이와 같이 제거하거나 이동하는 경우에는 25% 합류를 초과하는 세포 단층을 가지는 임의 배양 용기에서 실행할 수 있다. 또는, 배양 용기는 오비탈 교반기에서 교반하여, 방출되는 세포가 흡착되는 것을 방지하거나 또는 주기적으로 배양물을 공급하는 대신에, 배양 시스템에 대류에 의해 지속적으로 새로운 배지가 들어오도록 만들 수 있다. 유속을 조절하여, 삼차원 배양 시스템안에 증식을 최대로 하고, 프레임워크로부터 제거되는 세포 수를 최대화하여, 용기 벽에 흡착되지 않고, 생장하여, 합류되도록 한다. 임의 경우에서, 방출되는 세포를 수집하고 장래에 이용할 수 있도록 냉동 보관한다.
5.6. 새로운 연골 조직의 용도
본 발명의 세포 및 연골 조직은 다양한 용도에 이용된다. 여기에는 상기에서 설명하는 것과 같이 부착된 형 또는 부착안된 형의 세포 이식 또는 주입하는 것을 포함하거나 또는 본 발명의 세포에 의해 생산되는 새로운 연골 조직에서 준비된 3차원 매트릭스를 주입하는 방법을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 세포, 조직 및 세포외매트릭스는 질병 또는 외상으로 인하여 손상된 연골 조직을 복구, 대체 및 보강하는데 이용하거나 정상적으로 발달되지 않는 연골 조직을 복구, 대체, 보강하는데 이용되거나 또는 미용상의 목적으로 이용된다.
또한, 본 발명의 세포 또는 연골 조직은 다음의 용도에 이용될 수 있다; (1) 화합물, 알레르기 물질, 생장/조절 인자. 제약학적 조성물등의 효과 및 세포 독성을 in vitro에서 스크린하거나; (2) 특정 질병의 메카니즘을 밝히거나; (3) 약물 또는 생장 인자가 작용하는 메카니즘을 연구하거나; (4) 환자에서 암을 진단하고 모니터하는 경우; (5) 유전자 치료법; (6) 생물학적으로 활성이 있는 생성물을 만드는 경우.
5.6.1. in vivo에서 이식
본 발명에 따라 생산된 연골 조직을 이용하여 손상된 또는 파괴된 연골 조직을 복구하거나 대체하고, 기존의 연골 조직을 보강시키고, 새로운 또는 변형된 조직을 도입시키고, 인공 보철을 변형시키고, 생물학적 조직 또는 구조를 결합시킨다. 예를 들면, 본 발명의 특정 구체예에는 (i) 삼차원 배양물에서 생장시킨 대체 연골 조직 구조물로 피복한 엉덩이 보철; (ii) 연골 조직 구조물로 무릎 재건; (iii) 관절 연골의 재구성 및 대체를 요하는 다른 관절 보철; (iv) 연골 조직 구조물로 미용상 재구성등을 포함하나 이에 국한시키지 않는다.
예를 들면, 무릎, 엉덩이, 팔목, 발목 등을 포함하는 몇 가지 관절에서 관절 연골의 내부 혼란 정도는 관절경을 이용하여 평가한다. 관절경 외과술은 그 비중이 상당히 증가되고, 성공적인데, 무릎의 경우에 3 내지 4 ㎜ 직경의 아주 작은 절단 기구를 이용한다. 관절경으로 보이는 시각 부위에 수술 장치를 가져오는 삼각법의 경우에 다수의 입구를 요구하고; 또는 절단 기구는 관절경 자체의 채널을 통과하는데 이 경우 관절에서 한 개의 입구만 필요하다(Jackson, R.W., 1983, J. Bone Joint Surg. [AM] 65:416). 관절경을 이용한 수술로 손상된 또는 악화된 부분을 선택적으로 제거하고, 연골 세포를 이식하여 성공적으로 이용된다. 연골 조직 구조를 이용하여 상이한 형태의 주요 재건 수술을 한다. 상세한 과정은 Resnick, D., and Niwayama, G., (eds), 1988, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2d ed., W.B. Sanders Co.,에서 설명한다.
복구 부위에 주입된 세포 또는 연골 조직을 고정시킨다면, 손상된 연골의 성공적인 복구 또는 대체를 강화시킬 수 있다. 사전 고정 기술을 이용하지 않는 경우에, 이식후에 관절을 움직이는 경우에는 새로운 세포 또는 연골 조직이 부위에서 이탈하게 된다. 제 위치에 새로운 세포 또는 연골 조직을 고정하는데에는 다양한 방법을 이용하는데, 예를 들면, 생체적합성이 있는 조직으로부터 유도된 패취를 제 위치에 고정시키거나; 생체흡수 가능한 봉합사 또는 다른 고정 물질 예를 들면, 핀, 스테이플, 택, 나사 또는 고정 물질; 비-흡착성 고정 장치 가령, 봉합사, 핀, 나사 및 고정장치; 접착제; 접촉 고정물을 이용하는 등이 있다.
5.6.2. 세포외 매트릭스의 치료요법적 용도
본 발명의 세포 또는 이로부터 생성된 살아있는 연골 조직을 이식하는 대신에, 연골 조직의 복구, 대체 또는 보강을 요하는 개체에 이들 세포 또는 조직에서 생산되는 세포외매트릭스("ECM")를 투여하는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 3차원 배양 시스템을 이용하여, 본 발명의 세포를 사용하여 in vitro에서 새로운 연골 조직을 만들고, 원하는 양의 ECM이 프레임워크에 분비되고, 새로운 조직으로 구성된 세포를 제거하고, ECM은 주사용 물질 등을 만들기 위해 추가 처리한다.
따라서, 새로운 연골 조직으로 구성된 세포를 죽이고, 임의 세포 찌꺼기는 프레임워크에서 제거한다. 이 공정은 여러 가지 방법으로 실행할 수 있다. 예를 들면, 살아있는 연골 조직은 냉동보존제 없이 액화 질소에 섬광 냉동시키거나 또는 연골 조직은 멸균 증류수에 담구어 삽투압에 반응하여 세포가 파열된다.
일단 세포가 죽으면, 세포 막이 파열되고, EDTA, CHAPS 또는 양쪽성 계면활성제와 같은 순한 계면활성제로 세척하여 세포 찌꺼기를 씻어낸다. 순한 계면활성제로 세척하면 이것이 막에 결합된 단백질을 용해시키는데, 주로 이와 같은 단백질이 매우 항원성이 크다.
또는 연골 조직은 효소적으로 처리하거나 또는 세포 내용물을 제거할 수 있는 세포 막을 파열하는 시약으로 추출한다. 이와 같은 효소로는 뉴클레아제(가령, 데옥시리보뉴클레아제 및 리보뉴클레아제), 포스포리파제, 리파제등이 있다. 계면활성제의 예로는 TRITON X-100, 옥틸페녹시 폴리에톡시-에탄올(Rohm and Haas), BRIJ-35, 폴리에톡시에탄올 라우릴 에테르(Atlas Chemical Co.), TWEEN 20, 폴리에톡시에탄올 소르비탄 모노라우레이트(Rohm and Haas), LUBROL-PX 또는 폴리에틸렌 라우릴 에테르(Rohm and Haas)와 같은 비-이온성 계면활성제, 도데실 설페이트 나트륨, 설폰화된 고차 지방족 알코올, 설폰화된 알칸 및 설폰화된 알킬라우렌(7 내지 22개 탄소원자; 분지쇄 또는 직쇄 사슬)과 같은 이온성 계면활성제등을 포함한다.
ECM을 수집하는 것은 다양한 방법으로 실시할 수 있으나, 이는 생분해가능한 또는 생분해되지 않은 삼차원 프레임워크에 새로운 연골 조직이 형성되었느냐에 따라 달라진다. 예를 들면, 프레임워크가 생분해되지 않는 것이라면, 프레임워크를 초음파분쇄하거나, 고압의 물을 분사하거나, 기계적으로 긁어내거나 또는 계면활성제 또는 효소로 처리하는 등의 과정으로 ECM을 수집한다.
프레임워크가 생분해가능한 경우에는 프레임워크를 용액에 분해시키거나 용해시켜 수집할 수 있다. 또는, 생분해가능한 프레임워크가 ECM과 함께 주사할 수 있는 물질로 구성되는 경우에, 프레임워크와 ECM은 완전하게 처리한다. 또는 ECM은 상기에서 설명한 생분해되지 않는 프레임워크에서 ECM을 수집하는 방법중 임의 방법으로 생분해가능한 프레임워크에서 제거할 수 있다. 모든 수집 과정은 본 발명의 연골세포에 의해 생성되는 ECM이 변성되지 않도록 고안하는 것이 바람직하다.
일단 ECM가 수집되면, 이는 추가로 처리할 수 있다. 따라서, 당분야에 공지된 기술을 이용하여, ECM을 균질화시켜, 미세한 입자로 만들면, 외과용 바늘을 통과할 수 있다. 원하는 경우에 ECM 성분은 감마 방사 등으로 교차 연결시킬 수 있다. 적절하게는 ECM은 0.25 내지 2M rad로 방사시켜, 멸균하고, ECM을 교차 연결시킨다. 글루타알데히드와 같은 독성이 있는 물질을 이용하여 화학적으로 교차 연결시키는 것이 가능하지만, 적절한 것은 아니다.
ECM에 존재하는 다양한 형태의 콜라겐의 양과 그 비율은 하나이상의 다른 세포 형에서 분비되는 ECM과 본 발명의 의해 생산되는 ECM를 혼합하면 조절할 수 있다. 또한, 단백질, 생장인자 또는 약물과 같은 생물학적으로 활성이 있는 물질을 ECM 준비물에 복합할 수 있다. 예를 들어, 생물학적으로 활성이 있는 물질에는 TGF-β와 같은 조직 생장 인자를 포함하여 주사 부위에 조직의 치료 및 복구를 촉진시킬 수 있다.
개체에게 투여할 ECM 조제물은 일반적으로 조제물의 이온 강도를 등장성(가령 0.1 내지 0.2)으로 조절하고, 생리학적 pH(가령, pH 6.8 내지 7.5)로 조정한다. 또한, 리도카인(통상 농도는 중량의 0.3wt%)과 같은 국소 마취제를 첨가하여, 주사할 때 국소 통증을 줄인다. 또한, ECM 조제물에는 제약학적 수용 가능한 담체를 포함한다. 다양한 수용성 담체를 이용할 수 있는데, 예를 들면, 물, 완충수, 0.4% 염등이 있다. ECM 조제물에는 또한 제약학적 조성물의 반감기를 연장시키는 추가 성분이 포함되는데, 예를 들면 보존제, 단백질 안정화제등이 있다. ECM 조제물은 통상적인 공지의 멸균 방법을 이용하여 멸균할 수 있다. ECM 조제물에는 적절한 생리학적 조건에 요구되는 제약학적으로 수용 가능한 보조제 예를 들면, pH 조절 및 완충제, 독성 조절제등(아세테이트 나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락테이트 나트륨)을 포함할 수 있다.
ECM 조제물은 피하 등의 다양한 투약형을 채택할 수 있다. 투약 가능한 조성물을 만들고, 개체에 투여하는데 필요한 실제 방법은 당분야에 공지되어 있고, 이는 Remington's Pharmaceutical Science, 17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa(1985)에 상술하고 있다.
ECM 조제물에는 신체에서 내성을 가지는 유체 윤활제를 포함할 수 있다. 이와 같은 윤활제를 이용하면, 일반적으로 주사부위에 주사능, ECM의 내구성 및 분산을 개선시키고, 성분의 점도를 변형시켜 스파이크 정도를 줄일 수 있다. 스파이크는 조직으로 조성물이 주사되기보다는 주변으로 조성물이 새어나오게 되는 원인이 된다. 예시적인 윤활제로는 글리세롤, 글리코겐, 말토즈등이 포함된다. 유기 고분자 물질 가령, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루론산, 비-섬유성 콜라겐(숙시닐화된 콜라겐)등이 윤활제로 작용할 수 있다.
그 다음 최종 ECM 조제물을 주사기 또는 다른 장치에 넣어, 조직이 결손된 부위 또는 증강을 원하는 부위에 매트릭스를 정확하게 정치시킨다. 경피 증강을 위한 조제물의 경우에, "주사가능한"이란 의미는 조제물이 정상적인 조건하에, 정상적인 압력하에, 실질적인 스파이크없이 25가우지이하의 주사기로부터 분산될 수 있다는 것을 의미한다. 조제물의 정확한 정위를 위해서, 27가우지(200μI.D.) 또는 30가우지(150μI.D.)의 바늘이 바람직하다. 이와 같은 바늘을 통하여 압출되는 최대 입자 크기는 다음과 같은 인자에 의해 복합적으로 조절된다; 입자 최대 크기, 입자상(길이:폭), 입자 견고성, 입자의 표면 거침성, 입자:입자 흡착에 영향을 주는 관련 인자, 현탁유체에서 점탄성 성질, 바늘을 통하여 유동되는 유속.
상기에서 주사용 ECM을 준비하는 상기에서 설명하는 공정은 멸균 물질을 이용하여 멸균 조건하에서 실행하는 것이 바람직하다. 제약학적 수용가능한 담체에 포함된 처리된 ECM 조성물은 경피를 통하여 주사하거나 또는 피하를 통하여 주사하여, 연조직을 증강시키거나 또는 원래 기형 또는 후천적인 결함 또는 미용상의 결점을 복구하거나 교정한다. 이와 같은 상태를 예를 들자면, 반면 왜소체, 뺨 협골 형성부진, 한쪽 유방 형성부진, 흉곽 함요, 흉근 발육부진(Poland's anomaly), 구개열복구에 따른 인두 불완전 또는 부점막 구개열(인두후부 이식)에 따른 인두 불완전과 같은 선천적 기형; 내려 앉은 반흔, 피하 이상(원판 낭창 홍반에 따른), 케라틴 병소, 무핵 한구에서 안구함몰(상위 구 증후군), 안면의 여드름 구멍, 피하 이상과 함께 선형 공피증, 안장 코 기형, Romber's 질병, 한쪽 성대 마비 등의 후천적인 결함(외상후, 외과술후, 감염후); 미관 주름 선, 비순의 깊은 주름, 입주위 주름, 홀쭉한 뺨 및 유방 형성부진등의 미용상의 결함이 포함된다. 제약학적 수용 가능한 담체에 처리된 ECM을 신체 괄약근이 있는 내부조직으로 주사하여, 이와 같은 조직을 보강시킨다.
5.6.3. in vitro에서 화합물의 세포독성 및 효과를 스크린
본 발명의 세포 및 연골 조직을 in vitro에서 이용하여, 제약학적 물질, 생장/조절 인자, 항-염증제등의 효과 및 세포독성에 대해 다양한 화합물을 스크린한다. 이를 위해, 본 발명의 세포 또는 상기에서 설명한 조직 배양물을 in vitro에서 유지시키고, 테스트할 화합물에 노출시킨다. 세포 독성 화합물의 활성은 배양물에서 세포를 파괴하거나 죽이는 능력으로 평가된다. 이는 치명적인 착색 기술을 이용하여 평가할 수 있다. 생장/조절 인자의 효과는 in vitro에서 살아있는 세포(전체 세포수 및 분화된 세포수) 수를 분석하여 평가한다. 표준 세포 또는 조직학 기술을 이용하여 실시할 수 있는데, 여기에는 형태-특이적인 세포 항원을 정의하는 항체를 이용하는 면역조직화학 기술을 이용하는 것도 포함된다. 현탁 배양물 또는 3차원 시스템에 있는 본 발명의 세포에서 다양한 약물의 효과를 평가한다.
본 발명의 세포 및 연골 조직을 생리학적 또는 병리학적 조건을 연구하는데 모델 시스템으로 이용한다. 예를 들면, 고정된 관절은 상대적으로 많이 고통을 받는다. 연골세포의 대사 활성은 프로테오글리칸이 손상되었을 때 그리고 물 함량이 증가되었을 때 영향을 받는 것으로 나타난다. 정상적인 백색의 번쩍이는 연골 조직의 외양이 활기가 없는 푸른 색으로 변화되면 연골세포의 두께가 감소된다. 그러나, 이와 같은 변화량은 영양 결손으로 인한 것인데, 스트레스에 따른 대사 항상성에서 개시되는 것인지는 아직 밝혀지지 않았다. 본 발명의 세포 및 연골 조직을 이용하여 상이한 생리학적 조건 가령 간헐적인 가압하에, 연골 구조로 영양 매체를 펌프하여, 연골의 영향 요구 조건을 결정할 수 있다. 이는 특히, 외상 손상으로 인해 병에 걸리기 쉬운 약해진 연골 가령 무릎에서의 과절 연골의 인장 강도가 나이에 따른 또는 손상에 따른 원인인지를 연구하는데 유용하다.
본 발명의 세포 및 연골 조직을 이용하여, 류마티스 질환으로 인하여 활액으로 방출되는 사이토킨 및 다른 전-염증 중개물질 예를 들면 IL-1, TNF와 같은 물질의 작용 메카니즘을 연구한다. 따라서, 환자의 관절 액을 in vitro에서 테스트하여, 본 발명의 세포 생장에 이들 화합물의 효과를 연구한다. 또한, 특정 환자에게 가장 효과적인 세포독성 또는 제약학적 물질을 스크린할 수 있는데, 이와 같은 물질은 연골세포의 재흡수를 줄이거나 예방하는 또는 관절 연골세포의 균형된 생장을 강화시키는 것이 된다. in vitro에서 효과가 있는 것으로 증명이 되는 물질을 이용하여 환자를 치료할 수 있다.
5.7. 유전공학적으로 조작된 연골세포 및 연골
본 발명의 세포 및 연골 조직은 in vivo에서 유전자 및 유전자 생성물을 도입시키는 운반체로 작용하여 유전자 치료법에 이용된다. 다음은 본 발명의 세포 또는 이로부터 생산된 조직을 유전공학적으로 조작하는 것에 대해 설명한다.
원하는 유전자 생성물을 발현시키는 세포 또는 이로부터 생산된 연골 조직을 유전자 생성물이 결손된 개체에 주입할 수 있다. 예를 들면, 다양한 류마티스 또는 관절 질환 등을 예방 또는 경감시킬 수 있는 생성물을 발현하는 유전자 가령, 염증 반응을 예방하는 등의 유전자는 이러한 질환에서는 이의 발현이 과소하게 발현되거나 또는 하향 조절된다. 또는, 유전자 생성물의 활성이 감소되어, 일병 질병 또는 전부를 명시한다. 이러한 경우에, 활성 유전자 생성물의 수준은 유전자 요법에 의해 증가되는데 예를 들면, 본 발명의 세포를 조작하여, 활성 유전자 생성물을 생산하고, 조작된 세포 또는 이로부터 생산된 조직을 필요로 하는 개체에 이식한다.
한 구체예에서, 본 발명의 세포를 유전공학적으로 조작하여, 항-염증 유전자 생성물을 발현시켜, 이식이 실패할 위험을 줄이고 또는 류마티스 질환 또는 염증 반응으로 인하여, 연골 조직에 퇴행성 변화를 줄이는 작용을 하도록 한다. 예를 들면, 본 발명의 세포를 유전공학적으로 조작하여, 하나이상의 항-염증 유전자 생성물을 발현시키는데, 예를 들면, 과립세포-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), TNF, IL-1, IL-2 또는 다른 염증성 사이토킨을 중화시키는 항체의 이디오타입에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현시킨다. IL-1은 프로테오글리칸 및 콜라겐 II, IX, XI의 합성을 감소시키는 것으로 보인다(Tyler et al., 1985, Biochem. J. 227:869-878; Tyler et al., 1988, Coll. Relat. Res. 82:393-405; Goldring et al., 1988, J. Clin. Invest. 82:2026-2037; and Lefebvre et al., 1990, Biophys. Acta. 1052:366-372). TNF는 또한, 프로테오글리칸 및 타입 II 콜라겐의 합성을 저해시키지만, IL-1보다는 그 정도가 약하다(Yaron, I., et al., 1989, Arthritis Rheum. 32:173-180; Ikebe, T., et al., 1988, J. Immunol. 140:827-831; and Saklatvala, J., 1986, Nature 322:547-549). 또는, 본 발명의 세포를 유전공학적으로 조작하여, BMP-13 또는 TGF-β와 같은 연골 생산을 자극하는 유전자 생성물을 만든다. 또한, 예를 들면, 본 발명의 세포를 유전공학적으로 조작하여, 숙주에의해 이식편을 거부하지 않도록 사람의 상보적인 조절 단백질을 인코드하는 유전자를 발현시키게 할 수 있다(McCurry et al., 1995, Nature Medicine 1:423-427).
본 발명의 세포를 유전공학적으로 조작하는데 유용하게 이용되는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 원하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA 구조 또는 벡터를 만들어, 이를 이용하여 본 발명의 하나이상의 세포를 형질변환 또는 형질감염시킨다. 이와 같은 원하는 유전자를 가지고, 이 유전자를 발현시킬 수 있는 는 형질변환된 또는 형질감염된 세포를 선택하고, 배양물에서 콜로니를 연장시킬 수 있다. 소요 유전자를 포함하는 DNA 구조를 준비하는 방법, 세포를 형질변환 또는 형질감염시키는 방법, 원하는 유전자를 발현시키는 방법등은 당분야에 공지되어 있다(Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, N.Y.; and Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). 또한, Seldon et al., 1987, Science 236:714-718이 설명하는 트랜스캐로트 이식 기술을 이용할 수 있다. 이들 모든 공개 문헌은 참고문헌으로 첨부한다.
본 발명의 세포는 다양한 벡터를 이용하여 조작할 수 있는데, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-연합된 바이러스 벡터와 같은 합체 바이러스성 벡터 또는 파필로마 바이러스 벡터, SV40 벡터, 아데노바이러스 벡터와 같은 비-합체 바이러스 벡터 또는 복제-결손 바이러스 벡터등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 세포로 DNA를 도입하는 다른 방법에는 리포좀, 전기천공, 입자 건 또는 직접적인 DNA 주입등을 이용할 수 있다.
숙주 세포에는 작용할 수 있도록 이에 관여하는 하나 이상의 적절한 발현 조절 원소 예를 들면, 프로모터 또는 인헨서 서열, 전사 종료물질, 폴리아데닐화 부위 등에 의해 조절된 DNA와 선택성 표식이 형질도입된다. 외부 DNA를 도입시킨 후에, 조작된 세포는 풍부한 배지에서 생장을 시키고, 그 다음 선택성 배지로 전환시킨다. 외부 DNA에 선택성 표식은 선택에 대해 저항성을 제공하여, 세포에 외부 DNA가 안전하게 통합될 수 있도록 하는데, 가령, 플라스미드의 경우에, 이들의 크로모좀으로 들어가 포카이(foci)를 형성하여, 클론되고 이들이 세포주로 확장된다. 이와 같은 방법을 이용하면, 유전자 생성물을 발현시키는 세포주를 편리하게 만들 수 있다.
임의 프로모터를 이용하여, 삽입된 유전자를 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 바이러스 프로모터에는 CMV 프로모터/인헨서, SV 40, 파필로마바이러스(papillomavirus), 입스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 엘라스틴 유전자 프로모터 및 β-글로빈등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 적절하게는, 원하는 유전자의 발현을 조절하는데 이용되는 조절 원소를 이용하면, 유전자의 발현을 조절할 수 있고, in vivo에서 필요한 경우에만 생성물을 합성할 수 있다. 일시적인 발현을 원하는 경우에, 비-합체 또는 복제-결손 벡터에 구성 프로모터를 이용하는 것이 바람직하다. 또는 유도성 프로모터를 이용하면, 필요한 경우에 삽입된 유전자가 발현되도록 한다. 유도성 프로모터에는 메탈로티오닌 및 열 쇼크 단백질과 연합된 것을 이용하나 이에 국한시키지는 않는다.
설명하는 조직 특이성을 나타내는 전사 조절 부위로는 췌장 선방 세포에서 활성이 있는 엘라스타제 I 유전자 조절 부위(Swit et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성이 있는 인슐린 유전자 조절 부위(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); 임파 세포에서 활성이 있는 이뮤노글로블린 유전자 조절 부위(Grosschedl et al., 1984, Cell 3S:647-658; Adams et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); 뇌의 핍지신경교세포에서 활성이 있는 미엘린 염기성 단백질 조절 부분(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골근육에서 활성이 있는 경사슬-2 유전자 조절 부분(Shani, 1985, Nature 314:283-286); 해마에서 활성이 있는 고나도프로핀 방출 호로몬 유전자 조절 부위(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378);등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
본 발명의 세포를 유전공학적으로 조작하여, 주입 주위에 염증 또는 거부를 촉진시키는 인자의 발현을 "실격"시킨다. 표적 유전자 발현 수준 또는 표적 유전자 활성 수준을 줄이는 음성 조절 기술은 하기에서 설명한다. 여기에서 말하는 "음성 조절"이란 조절(변조) 처리 없이 표적 유전자 생성물의 활성 또는 수준에 비해 표적 유전자 생성물의 활성 또는 수준을 감소시키는 것을 말한다. 상동 재조합 기술을 이용하여, 유전자를 완전하게 비활성시켜(통상 "실격(knock out)"으로 칭함) 발현을 방해하는 여러 가지 기술을 이용하여 연골세포에 대한 유전자 발현을 감소시키거나 또는 실격시킨다. 통상적으로, 단백질의 주요 부위를 인코드하는 엑손(또는 그 부분의 5' 엑손)은 neo와 같은 양성 선택성 표식을 이용하여, 표적 유전자로부터 정상적인 mRNA가 생산되는 것을 방해하고, 따라서 유전자가 비활성화된다. 유전자의 일부를 결손시키거나 또는 전제를 결손시켜 유전자를 비활성화시킨다. 개놈과는 떨어져있는 표적 유전자에 상동인 두 부분을 가지는 표적 유전자를 이용하여 두 부분에 끼어있는 서열을 제거할 수 있다(Mombaerts et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084-3087).
표적 유전자의 발현을 저해하는 안티센스 및 리보자임 분자를 이용하여, 표적 유전자의 활성 수준을 줄일 수 있다. 예를 들면, 주요 조직 적합성 유전자 복합체(HLA)의 발현을 억제하는 안티센스 RNA가 면역 반응에 따라 가장 다양하게 변화되는 것으로 나타났다. 또한 삼중 나선 분자를 이용하여, 표적 유전자 활성 수준을 감소시킬 수 있다. 이와 같은 기술은 L.G. Davis et al. (eds), 1994, Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn., which is incorporated herein by reference에서 설명한다.
상기에서 설명한 임의 기술을 이용하여, 본 발명의 세포 내에서 IL-1 발현을 실격시켜, 본 발명의 세포에 의해 이식된 연골세포의 재흡착 위험을 줄일 수 있다. 유사하게, MHC II 분자의 발현을 실격시켜, 이식된 조직이 거부될 위험을 줄인다.
일단 본 발명의 세포를 유전공학적으로 조작하면, 이들을 환자에 직접 주입하여, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2 또는 다른 염증 사이토킨등에 대한 항체를 중화시키는 이디오타입에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은 항-염증 유전자 생성물을 만들어 류마티스 관절염 또는 관절 질환의 증상을 줄일 수 있다. IL-1은 연골 재흡착의 강력한 자극물질이고, 연골세포에 의해 염증 중개물질을 생산하는 데 있어서 자극물질이다(Campbell et al., 1991, J. Immun. 147:1238-1246). 또는 유전공학적으로 조작된 세포를 이용하여, in vitro에서 새로운 연골 조직을 만들어 상기에서 설명하는 바와 같이 개체에 주입할 수 있다.
유전자 치료법에 이용되는 본 발명의 조성물 용도 및 그 방법은 여러 가지 장점을 가진다. 우선, 배양물이 진핵세포로 구성되기 때문에, 유전자 생성물은 적절히 발현되고 처리되어 활성 생성물을 이룬다. 둘째, 유전자 치료법 기술은 일반적으로 형질감염된 다수 세포가 임상학적으로 관련성, 유용성 측면에서 그 가치가 증가되고 있어 유익하다. 따라서, 상기에서 설명하는 삼차원 배양물을 이용하면, 관절 질환을 치료하는데 효과적인 형질감염된 세포의 수를 유사분열에 의해 확장시키고, 유전자 생성물의 수준을 증가시킬 수 있다.
5.8. 생물학적 분자의 생산
추가 구체예에서, 본 발명의 세포를 in vitro에서 배양하여, 다량의 생물학적 생성물을 만들 수 있다. 예를 들면, 원하는 특정 생물학적 생성물(가령, 생장 인자, 조절 인자 또는 펩티드 호로몬)을 자연상태에서 만들 수 있는 또는 생물학적 생성물을 만들 수 있도록 유전공학적으로 조작한 세포를 상기에서 설명하는 3차원 배양 시스템을 이용하여 클론에 의해 확장시킨다. 세포가 영양 배지로 생물학적 생성물을 분비하면, 생성물은 표준 분리 기술을 이용하여, 소모된 배지로부터 생성물을 분리할 수 있다. 이와 같은 분리 기술로는 분별 단백질 침전법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 전기영동, HPLC등이 있다. "바이오리엑터"를 이용하여, in vitro에서 3차원 배양물에 공급물을 제공한다. 기본적으로 3차원 배양물을 통하여 새로운 배지가 통과할 때, 생물학적 생산물은 배양물로부터 씻겨나와 밖으로 흘러나온 물질에서 상기와 같이 생성물을 분리할 수 있다.
또는, 원하는 생물학적 생산물은 세포에 남겨두고, 세포를 용해시켜 이를 수득할 수 있다. 생물학적 생산물은 상기에서 설명한 기술중 한 가지를 이용하여 정제한다.
6. 실시예: 와튼제대교질로부터 미숙-연골세포의 분리 및 연골 조직으로 유도
6.1 재료 및 방법
사람의 태관은 출산 후 바로 구한다. 멸균 상태에서 태관으로부터 와튼제대교질을 절제하고, 이를 2-3 ㎣으로 절단하여 약 50-100 조직 단편을 100 ㎜ TC-처리된 배양접시(배양접시의 아래에는 멸균 슬라이드 글라스가 있음)에 둔다. 슬라이드 글래스를 각 조직 단편에 두어 세포가 슬라이드사이에 끼어 있게 하고, 가볍게 묶어 조직 단편과 글라스간이 접촉이 잘되도록 한다. 조직 단편에는 20㎖ 완전 배지(가령 RPMI 1640, 10% FBS, 5% ES), 페니실린 G(100 ㎍/㎖), 스트렙토마이신 설페이트(100 ㎍/㎖), 암포테리친 B(250 ㎍/㎖), 젠타마이신(10 ㎍/㎖) pH 7.4-7.6이 흐르도록 한다. 조직 단편은 37℃, 5% CO2에서 배양시키고, 배지는 일주일에 2회 교환시킨다.
10-12일 후에, 원래 조직 단편을 제거하고, 슬라이드와 배양 접시에 부착된 세포는 표준 기술을 이용하여 트립신으로 처리한다. 트립신으로 처리한 후에, 세포를 수집하고, 빼내어, 초기 밀도가 0.75 - 1.0 ×106되도록 새로운 배지를 담고 있는 TI75플라스트에 넣는 다음 상기와 같이 배양한다. 배지는 24시간 트립신으로 처리한 후에 교환시켜 부유하는 세포를 제거한다. 미숙-연골세포는 완전 배지에서 계대하여 각 계대시마다 최종 세포 밀도가 3 내지 6.5 ×104cells/㎠가 되도록 한다.
세 번째 계대를 한 후에, 미숙-연골세포는 "냉동 배지:완전한 배양 배지, 10% DMSO)"에 밀도가 4-10 ×106cells/㎖되도록 옮긴다. 냉동 배지를 세포를 첨가하기 전에 4℃에 두고, 배지에 남아있는 세포는 몇 분간 4℃에 두어 냉동하기 전에 평형을 이루게 한다. 세포는 플라스틱 앰플(Nunc, Naperville, MD)에 분배하고, 봉하여 예정된 냉동기의 냉동실(770 Cryomed)로 옮긴다. 냉동 프로그램은 융합열을 통하여 -1℃/min의 비율로 온도를 줄인다. 앰플은 액체 질소 저장소로 옮긴다. 액체 질소 앰플을 37℃ 수조에 넣어 세포를 해동시킨다. 앰플의 해동된 내용물은 멸균 상태에서 바로 완전 배지를 포함하고 있는 배양 용기로 옮긴다. 배양 배지에서 포기 세포 밀도는 3-6 ×105cells/㎖로 조절한다. 일단 배양물에서 역상 현미경을 이용하여 세포 증식이 었었는지를 검사하여, 이들의 밀도가 약 3-6.5 ×104cells/㎠에 도달하면, 새로운 배지로 계대한다.
최초 배양물에서 약 4회정도의 계대에 의해 유사분열로 확장한 후에, 약 4 ×106세포를 3차원 프레임워크에 접종한다.
PGA-펠트로 구성된 3차원 프레임워크는 13 ±1 ㎛ 두께를 가지는 PGA 섬유(Albany International, Mansfield, MA)를 이용하여 만든다. PGA 섬유는 모아서, 직경 1㎝, 두께 2 ㎜, 밀도 1.50-1.64 gm/㎤, 무게 5.5-6.5㎎(porosity ?? 97%)인 구조를 만든다. PGA 펠트 구조는 전자빔을 이용하여 멸균한다.
PGA 펠트 구조는 충분한 양의 완전배지(10% FBS, 5% ES를 포함하는 RPMI 1640)를 담고 있는 멸균 용기에 PGA 펠트 구조를 담구어 미리 적시게 하고, 피펫을 이용하여 PGA 펠트 구조의 모든 부분에 배지가 닿도록 한다. PGA 펠트 구조는 37℃에서 2hr.동안 배양한다.
12-웰 멸균 배양 플레이트(Corning Glassworks, New York)의 각 웰은 1.5㎖ 1% 아가로즈(FMC Bioproducts, Rockville, MD)로 피복시키고, 젤을 만들어, 1㎖ 완전 배지와 아스코르베이트(50 ㎍/㎖)를 각 웰에 첨가한다. 아가로즈를 이용하여, 펠트로부터 떨어져나온 세포를 붙잡아 이들이 단층을 이루는 것(단층은 펠트에서 세포 생장을 방해함)을 방지한다. 본 발명의 세포를 아스코르베이트가 포함된 완전배지에 현탁시켜 밀도가 4 ×107cells/㎖되도록 한다. PGA 펠트 구조물을 배지로부터 빼내어, 건조시키고, 100㎕ 세포 현탁액(4 ×106cells/㎖)을 건조 PGA 펠트 구조에 피펫을 이용하여 접종한다. 세포가 접종된 PGA 펠트 구조는 각 웰의 배지에 넣는다. 세포 접종된 PGA 펠트 구조를 가지는 배양 플레이트는 오비탈 쉐이크(100rpm)에서 37℃, 2시간동안 배양하고, 4㎖ 완전배지와 아스코르베이트를 첨가하고, 배양 플레이트는 3일간 상기 조건에서 배양한다. 그 다음 세포가 접종된 PGA-펠트 구조를 빼내어, 아가로즈가 없는 6-웰 배양 접기의 새로운 웰에 넣고 72시간 배양하는데, 이 웰에는 아스코르베이트와 TGF-β1(10 ng/㎖)을 포함한다. 그 다음 세포-접종된 PGA 펠트 구조를 빼내어, TGF-β1가 없는 완전 배지를 포함하는 웰에 넣고, 매 3일마다 배지를 교환하면서 3주간 배양한다.
배양 종료시점에, 세포-접종된 PGA 펠트 주고는 파라핀에 끼워놓은 10% 중성 완충된 파라핀에 고정시키고, 분절한다(4-6 ㎛). 부분은 각 헤마토실린/에오신(도 2A-B), 알키안 블루, 루테니움 레드, 사프라닌 O(도 3A) 또는 트리크롬(도 3B)으로 착색을 시키거나 항-콜라겐 I 또는 II 항체로 라벨한 후에 면역과산화효소로 처리한다(도 4A-4E).
6.2. 결과
3주 배양 과정 후에, 세포-접종된 PGA 구조물은 TGF-β1 펄스에 노출시켜 딱딱한 반짝거리는 "조직"을 만들고, 이는 연골 조직과 일체성을 가지고(도 1A, 1B), TGF-β1에 노출 안된 세포-접종된 PGA 펠트 구조 역시 연골 조직 특이적인 성질을 가지는 "조직"을 만드나, TGF-β1-처리된 세포보다는 더 작다(도 1C). 면역착색에서는 콜라겐 I과 콜라겐 II(도4A-4E)의 침착을 보여준다.
모든 환자, 특허 출원, 공고에 대해서 참고문헌으로 첨부한다.
본 발명은 개별적으로 한 가지를 설명하기 위해 특정 구체예를 들어 설명을 하였으나 본 발명을 이에 한정시키고자 함은 아니다. 여기에서 설명하는 것에 추가하여, 기능적으로 등가의 방법 및 조성물이 있음을 인지할 것이다. 이와 같은 변형은 본 발명의 범위에 속한다.

Claims (93)

  1. 태관의 와튼제대교질으로부터 유도된 미숙-연골세포로 구성된 미숙-연골세포 집단에 있어서, 이 세포 집단은 연골 조직을 만드는 세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 분리된 미숙-연골세포 집단.
  2. 태관의 와튼제대교질으로부터 유도된 미숙-연골세포와 연골세포가 복합 구성된 미숙-연골세포 집단에 있어서, 이 세포 집단은 연골 조직을 만드는 세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 분리된 미숙-연골세포 집단.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 미숙-연골세포는 계통이 지정되지 않은 다분화능 선조 세포인 것을 특징으로 하는 분리된 미숙-연골세포 집단.
  4. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 미숙-연골세포는 계통이 지정되지 않은 세포인 것을 특징으로 하는 분리된 미숙-연골세포 집단.
  5. 태관의 와튼제대교질으로부터 유도된 연골세포로 구성된 연골세포 집단에 있어서, 이 세포 집단은 연골 조직을 만드는 세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 분리된 연골세포 집단.
  6. 제 5 항에 있어서, 연골세포는 세포외 매트릭스를 분비할 수 있는 능력이 있는 것을 특징으로 하는 연골세포 집단.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세포는 생분해가능한, 생체적합성이 있는 하이드로겔 용액에 있는 것을 특징으로 하는 연골세포 집단.
  8. 제 7 항에 있어서, 하이드로겔은 알지네이트 또는 이의 염으로 구성된 것을 특징으로 하는 연골세포 집단.
  9. 태관의 와튼제대교질로부터 미숙-연골세포를 분리하는 방법에 있어서, 태관으로부터 와튼제대교질을 모으고, 미숙-연골세포 증식에 적합한 배양 배지에서 in vitro상태에서 와튼제대교질을 배양하고, 이로부터 증식된 미숙-연골세포를 분리하는 과정으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 태관의 와튼제대교질로부터 미숙-연골세포를 분리하는 방법에 있어서, 태관으로부터 와튼제대교질을 모으고, 미숙-연골세포 증식에 적합한 배양 배지에서 in vitro상태에서 와튼제대교질을 배양하고, 이로부터 증식된 미숙-연골세포를 분리하고, 미숙-연골세포를 배양하여, 이로부터 연골 조직을 생산할 수 있는 연골세포 생산을 유도하여, 연골세포를 분리하는 과정으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 또는 2 항에 따른 세포를 이식 또는 주입하는 방법에 있어서, 세포를 in vivo에서 주입하여 조직 등가물이 형성되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 따른 미숙-연골세포와 효과적인 생장 인자를 포함하는 배양 배지로 구성된 미숙-연골세포 배양물에 있어서, 배양 배지는 미숙-연골세포를 유사분열에 의해 확장시키는 것을 특징으로 하는 미숙-연골세포 배양물.
  13. 제 2 항에 따른 미숙-연골세포와 효과적인 생장 인자를 포함하는 배양 배지로 구성된 미숙-연골세포 배양물에 있어서, 배양 배지는 미숙-연골세포를 유사분열에 의해 확장시키는 것을 특징으로 하는 미숙-연골세포 배양물.
  14. 제 12 항 또는 13 항에 있어서, 미숙-연골세포는 계통이 정해지지 않은 선조세포인 것을 특징으로 하는 미숙-연골세포 배양물.
  15. 제 12 항 또는 13 항에 있어서, 미숙-연골세포는 계통이 정해지지 않은 세포인 것을 특징으로 하는 미숙-연골세포 배양물.
  16. 제 5 항에 따른 연골세포와 효과적인 생장 인자를 포함하는 배양 배지로 구성된 연골세포 배양물에 있어서, 배양 배지는 연골세포를 유사분열에 의해 확장시키는 것을 특징으로 하는 연골세포 배양물.
  17. 제 16 항에 있어서, 연골세포는 세포외 매트릭스를 분비할 수 있는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 연골 세포 배양물.
  18. 미숙-연골세포를 배양하는 방법에 있어서, 태관의 와튼제대교질으로부터 미숙-연골세포를 배양하여, 미숙-연골세포가 유사분열에 의해 확장되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 미숙-연골세포는 연골 조직을 생산할 수 있는 연골세포를 만들도록 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 연골세포는 세포외 매트릭스를 분비하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 연골세포를 배양하는 방법에 있어서, 태관의 와튼제대교질으로부터 연골세포를 배양하여, 연골세포가 유사분열에 의해 확장되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 연골세포는 연골 조직을 생산할 수 있도록 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 연골세포는 세포외 매트릭스를 분비하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 미숙-연골세포와 연골세포 복합물을 배양하는 방법에 있어서, 태관의 와튼제대교질으로부터 미숙-연골세포와 연골세포를 배양하여, 미숙-연골세포와 연골세포가 유사분열에 의해 확장되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 미숙-연골세포는 연골 조직을 생산할 수 있도록 추가 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 연골세포는 세포외 매트릭스를 분비하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항 또는 2 항에 따른 세포를 이식 또는 주입하는 방법에 있어서, 세포를 in vivo에서 주입하여 조직 등가물이 형성되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 12, 13, 16 항에 따른 세포 배양물에서 약물의 효과를 측정하는 방법에 있어서,
    (a) 약물에 세포 배양물을 노출시키고; 그리고
    (b) 배양물에서 태관의 와튼제대교질로부터 유도된 세포에서 약물의 영향을 측정하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 태관의 와튼제대교질으로부터 미숙-연골세포를 분리하고, in vitro에서 세포를 배양하는 것으로 구성된 공정에의해 생산된 것을 특징으로 하는 사람의 미숙-연골세포.
  30. 태관의 와튼제대교질으로부터 미숙-연골세포를 분리하고, in vitro에서 세포를 배양하는 것으로 구성된 공정에의해 생산된 것을 특징으로 하는 사람의 미숙-연골세포 배양물.
  31. 태관의 와튼제대교질으로부터 미숙-연골세포를 분리하고, 효과량의 생장인자를 포함하는 배양 배지에 세포를 배양하여, 미숙-연골세포가 연골 세포로 분화되도록 유도하고, 이로부터 분화된 연골세포를 배양하는 것으로 구성된 공정에의해 생산된 것을 특징으로 하는 사람의 미숙-연골세포.
  32. 제 31 항에 있어서, 연골세포는 세포외 매트릭스를 분비하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. in vitro에서 준비된 연골 조직에 있어서, 살아있는 연골 조직는 태관의 와튼제대교질에서 유도되는 간질 세포와 간질세포가 분비하는 자연 단백질이 3차원 구조로 만들어진 생체 적합성 있는 무생물 물질에 부착되고, 세포를 에워싸고, 간질 세포에 의해 사이 공간이 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 in vitro에서 분지된 연골 조직.
  34. 제 33 항에 있어서, 간질 세포는 미숙-연골세포, 연골세포 또는 이의 복합물로 구성된 것을 특징으로 하는 연골조직.
  35. 제 33 항에 있어서, 프레임워크는 산화에틸렌으로 처리하는 것을 특징으로 하는 연골 조직.
  36. 제 33 항에 있어서, 프레임워크는 전자빔으로 처리하는 것을 특징으로 하는 연골 조직.
  37. 제 33 항에 있어서, 프레임워크는 생분해가능한 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 연골 조직.
  38. 제 37 항에 있어서, 생분해가능한 물질은 폴리글리콜산, 목화, 고양이 장 봉합사, 셀롤로오즈, 젤라틴, 콜라겐 또는 폴리하이드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 연골 조직.
  39. 제 38 항에 있어서, 폴리글리콜산은 펠트형인 것을 특징으로 하는 연골 조직.
  40. 제 33 항에 있어서, 프레임워크는 생분해-불가능한 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 연골 조직.
  41. 제 40 항에 있어서, 생분해불가능한 물질은 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리카르보네이트, 폴리테트라플로오르에틸렌, 니트로셀룰로오즈 화합물인 것을 특징으로 하는 연골 조직.
  42. 제 38 항에 있어서, 폴리글리콜산은 메쉬형인 것을 특징으로 하는 연골 조직.
  43. 제 38 항에 있어서, 간질 세포는 태관의 와튼제대교질에서 유도된 미숙-연골세포, 태관의 와튼제대교질에서 유도된 연골세포, 섬유아세포, 섬유아-유사 세포, 근육 세포, 태관 세포 또는 태관 혈액에서 유도한 골수 세포로 구성된 것을 특징으로 하는 연골 조직.
  44. 제 33 항에 있어서, 발현 요소의 제어하에 외부 유전자가 트랜스펙트된 간질 세포가 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 연골 조직.
  45. in vitro에서 연골 조직을 배양하는 방법에 있어서, 태관의 와튼제대교질으로부터 유도된 간질 세포를 효과적인 생장 인자를 포함하는 배양 배지에 접종하여 배양하고, 간질 세포와 간질세포 자연적으로 분비되는 결합 조직 단백질이 생체 적합성이 있는 무생물로 형성된 프레임워크에 부착되어 이를 에워싸고, 간질세포에 의해 공간이 연결되는 3차 구조를 만드는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 in vitro에서 연골 조직을 배양하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 간질 세포는 미숙-연골세포, 연골세포 또는 이의 복합물로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 45 항에 있어서, 간질 세포는 태관의 와튼제대교질에서 유도된 미숙-연골세포, 태관의 와튼제대교질에서 유도된 연골세포, 섬유아세포, 섬유아-유사 세포, 내피세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단세포, 백혈구세포, 혈장세포, 유선세포, 지방세포, 태관 세포 또는 태관 혈액에서 유도한 골수 세포로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 46 항에 있어서, 발현 요소의 제어하에 외부 유전자가 트랜스펙트된 간질 세포가 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 45 항에 있어서, 프레임워크는 생분해가능한 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 생분해가능한 물질은 폴리글리콜산, 목화, 고양이 장 봉합사, 셀롤로오즈, 젤라틴, 콜라겐 또는 폴리하이드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 폴리글리콜산은 펠트형인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 50 항에 있어서, 프레임워크는 산화에틸렌으로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 50 항에 있어서, 프레임워크는 전자빔으로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 45 항에 있어서, 프레임워크는 생분해-불가능한 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 생분해불가능한 물질은 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리카르보네이트, 폴리테트라플로오르에틸렌, 니트로셀룰로오즈 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 45 항에 있어서, 폴리글리콜산은 메쉬형인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 45 항에 있어서, 생장인자는 TGF-β인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 45 항에 있어서, 배양 배지에는 효과량의 아스코르베이트가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 45 항에 있어서, 배양 배지는 정지조건에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 45 항에 있어서, 배양 배지는 대류 및 주기적인 가압으로 동적 상태로 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. in vivo에서 제33항에 따른 연골 조직을 이식 또는 주입하는 방법에 있어서, in vitro에서 준비된 살아있는 기질 조직을 in vivo에 주입하고, 이때 살아있는 연골 조직은 태관의 와튼제대교질로부터 유도된 기질 세포와 기질 세포에 의해 자연상태에서 분비되는 결합조직 단백질이 프레임워크에 부착되어 이를 에워싸는 것으로 구성되는데, 이때 프레임워크는 생체적합성이 있는 무생물 물질로 구성되고, 사이 공간은 간질 세포에 의해 연결되어, 조직 등가물이 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 33 항에 따른 연골 조직에서 약물의 효과를 측정하는 방법에 있어서,
    (a) 3차원 연골 조직 세포 배양물에 약물을 노출시키는데, 이때 3차원 세포 배양물은 in vitro에서 준비된 살아있는 기질 조직에서 생장된 태관의 와튼제대교질에서 유도된 세포로 구성되고, 이때 살아있는 기질 조직은 기질 세포와 기질 세포에 의해 자연상태에서 분비되는 결합조직 단백질이 프레임워크에 부착되어 이를 에워싸는 것으로 구성되는데, 이때 프레임워크는 생체적합성이 있는 무생물 물질로 구성되고, 사이 공간은 간질 세포에 의해 연결되고; 그리고
    (b) 배양물에서 태관의 와튼제대교질에서 유도된 세포에 약물의 영향을 결정하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 유전공학적으로 조작된 연골 조직에서 생물학적 생산물을 만드는 방법에 있어서,
    (a) 발현 요소의 제어하에 외부 유전자가 트랜스펙트된 태관의 와튼제대교질에서 유도된 기질 세포를 배양하여 외부 유전자 생성물을 배양물에서 발현되도록 하고, 이때, 트랜스펙트된 기질 세포와 트랜스펙트된 기질세포에 의해 분비되는 결합조직 단백질은 생체적합성이 있는 무생물로 된 프레임워크에 부착되어 실제 이를 에워싸서, 기질 세포에 의해 공간이 연결된 3차원 구조를 만들고; 그리고
    (b) 배양물에서 외부 유전자 생성물을 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 3차원 세포 배양물에서 생물학적 생산물을 만드는 방법에 있어서,
    (a) 발현 요소의 제어하에 외부 유전자가 트랜스펙트된 태관의 와튼제대교질에서 유도된 기질 세포로 구성된 유전공학적으로 만들어진 연골 조직에 접종된 실질 세포를 배양하여, 외부 유전자 생성물을 배양물에서 발현되도록 하고, 이때, 트랜스펙트된 기질 세포와 트랜스펙트된 기질세포에 의해 분비되는 결합조직 단백질은 생체적합성이 있는 무생물로 된 프레임워크에 부착되어 실제 이를 에워싸서, 기질 세포에 의해 공간이 연결된 3차원 구조를 만들고; 그리고
    (b) 배양물에서 외부 유전자 생성물을 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 61, 62, 63 또는 64 항에 있어서, 간질 세포는 미숙-연골세포, 연골세포 또는 이의 복합물로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  66. (a) 효과량의 생장 인자를 포함하는 배지에 와튼제대교질로부터 유도된 미숙-연골세포를 배양하여, 연골세포로 분화되도록 유도하고; 그리고
    (b) 3차원 프레임워크에 연골세포와 연골 세포에 의해 자연 분비되는 결합조직 단백질을 접종하여, 3차원 프레임워크에 생존 세포가 군집하여, 연골세포에 의해 연결된 사이 공간을 가지는 3차원 구조를 형성하는 단계로 구성된 공정에 의해 생산된 것을 특징으로 하는 연골 조직.
  67. 연골 조직의 복구, 대체 또는 보강이 필요한 환자에서 연골 조직을 복구, 대체 또는 보강하는 방법은 태관의 와튼제대교질에서 유도된 연골 조직을 만드는 세포 조성물을 주입 또는 이식하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 67 항에 있어서, 연골 조직을 만드는 세포는 연골 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 67 항에 있어서, 연골 조직을 만드는 세포는 미숙-연골 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 67 항에 있어서, 연골 조직을 만드는 세포는 연골 세포와 미숙-연골세포 복합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 67 항에 있어서, 조성물에는 세포 생장 인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 67 항에 있어서, 조성물에는 항-염증 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 68, 69 또는 70 항에 있어서, 세포 조성물은 3차원 프레임워크에 접종을 한 후에, in vivo 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 68, 69, 70 항에 있어서, 세포 조성물은 우선 3차원 프레임워크에 접종하고, 상아있는 간질 세포는 in vitro에서 만들어 지고, 이때 살아있는 간질 세포는 태관의 와튼제대교질에서 유도된 간질 세포와 간질 세포에 의해 자연적으로 분비되는 결합조직 단백질이 생체 적합성 있는 무생물 물질에 부착되어 이를 에워싸고, 간질 세포에 의해 사이 공간이 연결된 3차원 구조로 만들어진 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 태관의 와튼제대교질에서 유도된 세포군으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포 은행.
  76. 제 75 항에 있어서, 세포는 미숙-연골세포로 구성된 것을 특징으로 하는 세포 은행.
  77. 제 75 항에 있어서, 세포는 연골세포로 구성된 것을 특징으로 하는 세포 은행.
  78. 제 75 항에 있어서, 세포는 태관의 와튼제대교질에서 유도된 미숙-연골세포와 이로부터 분화된 연골세포로 구성된 것을 특징으로 하는 세포 은행.
  79. 제 76, 77 또는 78 항에 있어서, 세포는 냉동 보관되는 것을 특징으로 하는 세포 은행.
  80. 제 76, 77 또는 78 항에 있어서, 세포는 in vitro에서 배양물에서 연속하여 계대하는 것을 특징으로 하는 세포 은행.
  81. 태관의 와튼제대교질에서 유도된 미숙-연골세포를 냉동 보관하여, 해동하여 이를 배양하였을 때 미숙-연골세포가 분화되도록 유도하는 공정에 의해 만들어진 미숙-연골세포 은행.
  82. 태관의 와튼제대교질에서 유도된 연골세포를 냉동 보관하여, 해동하여 이를 배양하였을 때 연골세포가 연골 조직을 만들 수 있는 공정에 의해 만들어진 연골세포 은행.
  83. 태관의 와튼제대교질에서 유도된 세포를 분리하여, 냉동 보관하고, 해동하여 이를 배양하였을 때 연골 조질을 만들 수 있는 능력을 세포가 보유할 수 있도록 하는 공정에 의해 만들어진 미숙-연골세포 및 연골세포 은행.
  84. 태관의 와튼제대교질에서 연골 조직을 만들 수 있도록 유도되는 세포를 분리하여, in vitro에서 이들 세포를 배양하고, 이때 세포는 이들의 형태학을 보유하는 것을 특징으로 하는 공정에 의해 만들어진 세포 은행.
  85. 제 84 항에 있어서, 분리된 세포는 연골세포로 구성된 것을 특징으로 하는 세포 은행.
  86. 제 84 항에 있어서, 분리된 세포는 미숙-연골세포로 구성된 것을 특징으로 하는 세포 은행.
  87. 제 84 항에 있어서, 분리된 세포는 연골세포 및 미숙-연골세포 복합물로 구성된 것을 특징으로 하는 세포 은행.
  88. 태관의 와튼제대교질에서 유도된 연골 조직을 만드는 세포에 의해 분비되는 것을 특징으로 하는 세포외 매트릭스
  89. 연골 조직에서 세포외 매트릭스를 분리하는 방법에 있어서, 연골 조직은 태관의 와튼제대교질에서 유도된 연골세포로 구성되고, 이는
    (a) in vitro에서 와튼제대교질에서 유도된 세포를 배양하여, 세포가 세포외 매트릭스를 분비하도록 유도하고; 그리고
    (b) 배양물에서 세포에 의해 분비된 세포외 매트릭스를 분리하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제 89 항에 있어서, 연골세포는 미숙-연골세포 배양물에서 수득하고, 이때 미숙-연골세포는 태관의 와튼제대교질에서 유도되고, 미숙-연골세포가 유사분열에 의해 확장되어, 연골 조직을 만들 수 있도록 유도시키기 위해 in vitro에서 배양하는 것을 특징으로 하는 세포외 매트릭스.
  91. 태관의 와튼제대교질로부터 세포를 분리하는 공정에 의해 생성된 세포외매트릭스에 있어서, 세포는 세포외 매트릭스를 분비할 수 있도록 유도하는 능력이 있고, in vitro에서 세포를 배양하여, 세포가 세포외 매트릭스를 분비하도록 유도되고, 배양물에서 세포에 의해 분비되는 세포외매트릭스를 분리하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 세포외매트릭스
  92. 제 91 항에 있어서, 분리된 세포는 미숙-연골세포로 구성된 것을 특징으로 하는 세포외매트릭스.
  93. 연골 조직의 복구, 대체, 또는 증강이 필요한 환자에게 제88, 89, 91항에 따른 세포외매트릭스 조성물을 주입 또는 이식하는 것을 특징으로 하는 연골 조직의 복구, 대체 또는 증강 방법.
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