JP2002233567A - 移植用組織等価物及びその製造方法 - Google Patents
移植用組織等価物及びその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 比較的大きな移植用組織等価物の製造が可能
であり、移植後の組織周辺部への固定が早期に行われ、
脱落することが抑制された移植用組織等価物を提供す
る。 【解決手段】 高い増殖率となる条件下で培養して、表
面の少なくとも一部に配置された軟骨細胞を多く含む細
胞層と、軟骨細胞が少なくコラーゲンが主体となった担
体層の二層から構成される三次元構造の移植用組織等価
物とする。
であり、移植後の組織周辺部への固定が早期に行われ、
脱落することが抑制された移植用組織等価物を提供す
る。 【解決手段】 高い増殖率となる条件下で培養して、表
面の少なくとも一部に配置された軟骨細胞を多く含む細
胞層と、軟骨細胞が少なくコラーゲンが主体となった担
体層の二層から構成される三次元構造の移植用組織等価
物とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、移植用組織等価物
及びその製造方法に関し、特に、インビトロで培養さ
れ、移植対象細胞を含むと共に培養後に生体へ移植可能
な三次元構造の移植用組織等価物及びその製造方法に関
する。
及びその製造方法に関し、特に、インビトロで培養さ
れ、移植対象細胞を含むと共に培養後に生体へ移植可能
な三次元構造の移植用組織等価物及びその製造方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞の培養や、組織の再構築によ
って治療を行う再生組織工学（TissueEngineering)が急
速に発展してきており、例えば、生体親和性の高い各種
材料で構成された担体（足場）に細胞を保持させ、イン
ビトロ（生体外）で各種細胞を培養することで移植用組
織等価物を得ている。
って治療を行う再生組織工学（TissueEngineering)が急
速に発展してきており、例えば、生体親和性の高い各種
材料で構成された担体（足場）に細胞を保持させ、イン
ビトロ（生体外）で各種細胞を培養することで移植用組
織等価物を得ている。
【０００３】移植用組織等価物としては、シート状やフ
ィルム状の担体に細胞を播種・培養した二次元的なもの
や、立体的なスポンジ状（多孔質体）の担体に細胞を培
養した三次元的なもの等が知られている。このような移
植用組織等価物は、細胞の分布状態が比較的均一になる
ように作製されていた。即ち、軟骨損傷のような立体的
な損傷を修復するための三次元的な組織等価物の構築で
は、二次元的な組織等価物の構築とは異なり、組織等価
物の厚み方向にも細胞が分布するように、細胞を播種
し、組織培養を行っていた。
ィルム状の担体に細胞を播種・培養した二次元的なもの
や、立体的なスポンジ状（多孔質体）の担体に細胞を培
養した三次元的なもの等が知られている。このような移
植用組織等価物は、細胞の分布状態が比較的均一になる
ように作製されていた。即ち、軟骨損傷のような立体的
な損傷を修復するための三次元的な組織等価物の構築で
は、二次元的な組織等価物の構築とは異なり、組織等価
物の厚み方向にも細胞が分布するように、細胞を播種
し、組織培養を行っていた。
【０００４】しかしながら、三次元的な組織等価物に対
して、細胞を比較的均一に分布させた状態に組織を形成
することは非常に困難である。殊に厚みのある大きな組
織等価物を構築する場合には、栄養物が内部にまで十分
に拡散しないことが多い。このため、このような細胞分
布が比較的均一で、大きな組織等価物を作製するには、
長期の培養期間としたり、高い細胞密度で細胞を播種す
ることが行われている。
して、細胞を比較的均一に分布させた状態に組織を形成
することは非常に困難である。殊に厚みのある大きな組
織等価物を構築する場合には、栄養物が内部にまで十分
に拡散しないことが多い。このため、このような細胞分
布が比較的均一で、大きな組織等価物を作製するには、
長期の培養期間としたり、高い細胞密度で細胞を播種す
ることが行われている。
【０００５】その一方で、組織等価物の固さは細胞密度
や産生基質と関係が深いため、細胞が均一な状態になる
ように培養した場合であっても、移植部位によっては、
細胞密度が高すぎて組織等価物が固くなり過ぎることが
ある。このような固すぎる組織等価物は、柔軟性に劣
り、生体内に移植しても移植周辺部との融合性が不十分
となり、脱落する可能性がある。また逆に、細胞密度が
低すぎると、組織修復に時間がかかるとともに、移植周
辺部への固定に時間がかかるため、固定までの期間にお
いて脱落の可能性がある。
や産生基質と関係が深いため、細胞が均一な状態になる
ように培養した場合であっても、移植部位によっては、
細胞密度が高すぎて組織等価物が固くなり過ぎることが
ある。このような固すぎる組織等価物は、柔軟性に劣
り、生体内に移植しても移植周辺部との融合性が不十分
となり、脱落する可能性がある。また逆に、細胞密度が
低すぎると、組織修復に時間がかかるとともに、移植周
辺部への固定に時間がかかるため、固定までの期間にお
いて脱落の可能性がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来技術
の問題点を鑑み、比較的大きな移植用組織等価物の製造
が可能であり、移植後の組織周辺部への固定が早期に行
われ、脱落することが抑制された移植用組織等価物及び
そのような移植用組織等価物の製造方法を提供すること
を目的とする。
の問題点を鑑み、比較的大きな移植用組織等価物の製造
が可能であり、移植後の組織周辺部への固定が早期に行
われ、脱落することが抑制された移植用組織等価物及び
そのような移植用組織等価物の製造方法を提供すること
を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、インビトロで
培養され、移植対象細胞を含むと共に培養後に生体へ移
植可能な三次元構造の移植用組織等価物において、三次
元構造を構築する細胞培養担体により主として構成され
る担体層と、前記移植用組織等価物の表面の少なくとも
一部に、前記担体層に連続して局在し、前記担体層より
も前記移植対象細胞又は細胞基質が豊富な細胞層と、を
備えたことを特徴とする移植用組織等価物を提供するも
のである。
培養され、移植対象細胞を含むと共に培養後に生体へ移
植可能な三次元構造の移植用組織等価物において、三次
元構造を構築する細胞培養担体により主として構成され
る担体層と、前記移植用組織等価物の表面の少なくとも
一部に、前記担体層に連続して局在し、前記担体層より
も前記移植対象細胞又は細胞基質が豊富な細胞層と、を
備えたことを特徴とする移植用組織等価物を提供するも
のである。
【０００８】このような本発明の移植用組織等価物は、
表面の少なくとも一部に、移植対象細胞又は細胞基質が
豊富な細胞層を有しているので、移植する際にはこの細
胞層が移植面と接触し、移植後の組織周辺部への親和性
が高くなる。また、本発明の移植用組織等価物は、この
ような細胞層よりも少ない移植対象細胞又は細胞基質濃
度であり且つ細胞培養担体により主として構成される担
体層を内部に有しているので、移植用組織等価物に適当
な柔軟性を付与することができ、移植周辺部との融合性
を確保することができる。これにより、移植用組織等価
物全体に均一に移植対象細胞を分布することなく、生体
への親和性が良好で、また移植周辺部への融合性に優れ
たものにすることができる。移植用組織等価物が組織周
辺部に固定した後では、細胞培養担体が細胞増殖の足場
となり、インビボ（生体内）での組織再構築が行われ、
移植部が均一な組織で再構成される。
表面の少なくとも一部に、移植対象細胞又は細胞基質が
豊富な細胞層を有しているので、移植する際にはこの細
胞層が移植面と接触し、移植後の組織周辺部への親和性
が高くなる。また、本発明の移植用組織等価物は、この
ような細胞層よりも少ない移植対象細胞又は細胞基質濃
度であり且つ細胞培養担体により主として構成される担
体層を内部に有しているので、移植用組織等価物に適当
な柔軟性を付与することができ、移植周辺部との融合性
を確保することができる。これにより、移植用組織等価
物全体に均一に移植対象細胞を分布することなく、生体
への親和性が良好で、また移植周辺部への融合性に優れ
たものにすることができる。移植用組織等価物が組織周
辺部に固定した後では、細胞培養担体が細胞増殖の足場
となり、インビボ（生体内）での組織再構築が行われ、
移植部が均一な組織で再構成される。
【０００９】また本発明は、インビトロで培養され、移
植対象細胞を含むと共に培養後に生体へ移植可能な三次
元構造の移植用組織等価物の製造方法において、前記三
次元構造を構築する細胞培養担体に、移植対象細胞を包
埋する包埋工程と、前記移植対象細胞を培養可能な培地
を、前記移植対象細胞が包埋された細胞培養担体に供給
する供給工程と、前記移植対象細胞の増殖率が、前記細
胞担体内部よりも前記細胞培養担体の表面において高く
なる条件下で培養し、該細胞培養担体の少なくとも一部
の表面において、前記細胞培養担体の内部よりも前記移
植対象細胞密度が高くなって、細胞密度が異なる２つの
層が形成される培養工程と、を含むことを特徴とする移
植用組織等価物の製造方法を提供するものである。
植対象細胞を含むと共に培養後に生体へ移植可能な三次
元構造の移植用組織等価物の製造方法において、前記三
次元構造を構築する細胞培養担体に、移植対象細胞を包
埋する包埋工程と、前記移植対象細胞を培養可能な培地
を、前記移植対象細胞が包埋された細胞培養担体に供給
する供給工程と、前記移植対象細胞の増殖率が、前記細
胞担体内部よりも前記細胞培養担体の表面において高く
なる条件下で培養し、該細胞培養担体の少なくとも一部
の表面において、前記細胞培養担体の内部よりも前記移
植対象細胞密度が高くなって、細胞密度が異なる２つの
層が形成される培養工程と、を含むことを特徴とする移
植用組織等価物の製造方法を提供するものである。
【００１０】このような本発明の移植用組織等価物の製
造方法では、移植対象細胞が包埋された細胞培養担体の
表面における移植対象細胞の増殖率が高くなる条件下で
培養して、細胞密度が異なる２つの層が形成されるの
で、培養を行うことによって、移植対象細胞が多い層を
細胞培養担体の表面に、移植対象細胞が少ない層を内部
にそれぞれ形成させることができる。
造方法では、移植対象細胞が包埋された細胞培養担体の
表面における移植対象細胞の増殖率が高くなる条件下で
培養して、細胞密度が異なる２つの層が形成されるの
で、培養を行うことによって、移植対象細胞が多い層を
細胞培養担体の表面に、移植対象細胞が少ない層を内部
にそれぞれ形成させることができる。
【００１１】更に本発明は、インビトロで培養され、移
植対象細胞を含むと共に培養後に生体へ移植可能な三次
元構造の移植用組織等価物の製造方法において、立体構
造を培地中で維持できる流動性担体と移植対象細胞とを
混合する混合工程と、前記混合工程により得られた混合
物を、予め載置された三次元担体の少なくとも一部の表
面に播種する播種工程と、前記流動性担体の少なくとも
一部において、実質的に移植対象細胞が集密状態となる
まで培養する培養工程と、を含むことを特徴とする移植
用組織等価物の製造方法を提供するものである。
植対象細胞を含むと共に培養後に生体へ移植可能な三次
元構造の移植用組織等価物の製造方法において、立体構
造を培地中で維持できる流動性担体と移植対象細胞とを
混合する混合工程と、前記混合工程により得られた混合
物を、予め載置された三次元担体の少なくとも一部の表
面に播種する播種工程と、前記流動性担体の少なくとも
一部において、実質的に移植対象細胞が集密状態となる
まで培養する培養工程と、を含むことを特徴とする移植
用組織等価物の製造方法を提供するものである。
【００１２】このような本発明の移植用組織等価物の製
造方法は、細胞培養担体の表面の少なくとも一部に移植
対象細胞を播種して、細胞密度の異なる２つの層を形成
するので、移植対象細胞の豊富な層を細胞培養担体の表
面側に容易に形成することができる。
造方法は、細胞培養担体の表面の少なくとも一部に移植
対象細胞を播種して、細胞密度の異なる２つの層を形成
するので、移植対象細胞の豊富な層を細胞培養担体の表
面側に容易に形成することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】図１には、本発明に係る組織等価
物１０の断面が示されている。この組織等価物１０は、
移植片として生体へ移植されるものである。この組織等
価物１０には、移植対象となる移植細胞が含まれてい
る。このような組織等価物１０は、後述する培養担体に
より構成された三次元構造を有する。組織等価物１０の
大きさは、移植場所の大きさにより異なるが、一般に、
１〜１０ｍｍの厚みを有しており、好ましくは２〜５ｍ
ｍである。
物１０の断面が示されている。この組織等価物１０は、
移植片として生体へ移植されるものである。この組織等
価物１０には、移植対象となる移植細胞が含まれてい
る。このような組織等価物１０は、後述する培養担体に
より構成された三次元構造を有する。組織等価物１０の
大きさは、移植場所の大きさにより異なるが、一般に、
１〜１０ｍｍの厚みを有しており、好ましくは２〜５ｍ
ｍである。
【００１４】組織等価物１０は、内側の担体部１２と表
面側の細胞層１４とを備えている。担体部１２は、組織
等価物１０の三次元構造を構築する培養担体と、移植組
織に適合した移植細胞とで構成されているが、主として
培養担体で構成されており、移植細胞の分布は後述する
細胞層１４よりも少ない。培養担体は、移植細胞の培養
にも適した組成を有し、このため移植細胞は、培養担体
中で成育・増殖することができる。このような培養担体
としては、生体に移植するために適した組成のものであ
れば用いることができるが、生体吸収性材料又は生体親
和性材料であることが好ましい。特に、コラーゲン、ヒ
アルロン酸、ポリロタキサン、ゼラチン、フィブロネク
チン、ヘパリン、キチン、キトサン、ラミニン、アルギ
ン酸カルシウム、ポリロタキサンヒドロゲルが挙げら
れ、これらを単独で又は２種以上を組合わせて使用する
ことができる。
面側の細胞層１４とを備えている。担体部１２は、組織
等価物１０の三次元構造を構築する培養担体と、移植組
織に適合した移植細胞とで構成されているが、主として
培養担体で構成されており、移植細胞の分布は後述する
細胞層１４よりも少ない。培養担体は、移植細胞の培養
にも適した組成を有し、このため移植細胞は、培養担体
中で成育・増殖することができる。このような培養担体
としては、生体に移植するために適した組成のものであ
れば用いることができるが、生体吸収性材料又は生体親
和性材料であることが好ましい。特に、コラーゲン、ヒ
アルロン酸、ポリロタキサン、ゼラチン、フィブロネク
チン、ヘパリン、キチン、キトサン、ラミニン、アルギ
ン酸カルシウム、ポリロタキサンヒドロゲルが挙げら
れ、これらを単独で又は２種以上を組合わせて使用する
ことができる。
【００１５】培養担体は、組織等価物１０の三次元構造
を構築し、組織等価物１０全体の構造を決定している。
このような培養担体の三次元構造は、移植細胞の増殖の
足場を提供するものでもあり、生体に近い培養環境も提
供している。このため、特に軟骨組織や骨組織の再生に
利用される培養担体は、三次元構造を示すことが必要で
あるが、三次元構造を構築することができれば、如何な
る形態のものであってもよく、ゲル状又はスポンジ状で
あることが特に好ましい。
を構築し、組織等価物１０全体の構造を決定している。
このような培養担体の三次元構造は、移植細胞の増殖の
足場を提供するものでもあり、生体に近い培養環境も提
供している。このため、特に軟骨組織や骨組織の再生に
利用される培養担体は、三次元構造を示すことが必要で
あるが、三次元構造を構築することができれば、如何な
る形態のものであってもよく、ゲル状又はスポンジ状で
あることが特に好ましい。
【００１６】細胞層１４は、担体部１２の外側に連続し
ており、組織等価物１０のほぼ全周に配置されている。
細胞層１４は、担体部１２と同様に、培養担体と移植細
胞や産生基質とで構成されているが、担体部１２よりも
移植細胞を多く含んでいる。細胞層１４での移植細胞の
細胞密度は、担体部１２の内部の細胞密度と比較して実
質的に密であればよく、実質的に集密状態、即ち、密集
して隣接する細胞同士が連続していることが好ましい。
ており、組織等価物１０のほぼ全周に配置されている。
細胞層１４は、担体部１２と同様に、培養担体と移植細
胞や産生基質とで構成されているが、担体部１２よりも
移植細胞を多く含んでいる。細胞層１４での移植細胞の
細胞密度は、担体部１２の内部の細胞密度と比較して実
質的に密であればよく、実質的に集密状態、即ち、密集
して隣接する細胞同士が連続していることが好ましい。
【００１７】細胞層１４の厚さは、組織等価物１０の表
面上に移植細胞の層が形成されていれば如何なる厚さで
あってもよいが、好ましくは２０〜５００μｍ、特に１
００〜２００μｍとすることができる。２０μｍよりも
薄いと移植細胞を含む組織等価物１０としての機能を十
分に発揮することができないため、好ましくない。ま
た、５００μｍよりも厚いものは、移植物として固すぎ
る場合があり、また培養期間が延長されて作製に時間が
かかるため効率的でないので、好ましくない。
面上に移植細胞の層が形成されていれば如何なる厚さで
あってもよいが、好ましくは２０〜５００μｍ、特に１
００〜２００μｍとすることができる。２０μｍよりも
薄いと移植細胞を含む組織等価物１０としての機能を十
分に発揮することができないため、好ましくない。ま
た、５００μｍよりも厚いものは、移植物として固すぎ
る場合があり、また培養期間が延長されて作製に時間が
かかるため効率的でないので、好ましくない。
【００１８】組織等価物１０の細胞層１４及び担体部１
２の双方に存在し得る移植細胞は、移植対象となる細胞
であり、組織等価物１０の移植先に応じて適宜選択する
ことができる。このような移植細胞には、生体への移植
が可能な細胞であれば如何なる細胞であることもできる
が、組織等価物１０の三次元構造によって効率的に増殖
可能な細胞が好ましく、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細
胞、脂肪細胞、肝細胞及びこれらの前駆細胞を挙げるこ
とができる。これらの細胞を単独で又は、移植先となる
生体部位に応じて２種以上を混合して用いることができ
る。
２の双方に存在し得る移植細胞は、移植対象となる細胞
であり、組織等価物１０の移植先に応じて適宜選択する
ことができる。このような移植細胞には、生体への移植
が可能な細胞であれば如何なる細胞であることもできる
が、組織等価物１０の三次元構造によって効率的に増殖
可能な細胞が好ましく、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細
胞、脂肪細胞、肝細胞及びこれらの前駆細胞を挙げるこ
とができる。これらの細胞を単独で又は、移植先となる
生体部位に応じて２種以上を混合して用いることができ
る。
【００１９】このような移植細胞は、細胞種により応じ
た公知の採取方法によって、生体から採取することがで
きる。採取された細胞をそのまま使用することもできる
が、場合によって、適当な培地で所定期間培養した後
に、培養担体に包埋することもできる。
た公知の採取方法によって、生体から採取することがで
きる。採取された細胞をそのまま使用することもできる
が、場合によって、適当な培地で所定期間培養した後
に、培養担体に包埋することもできる。
【００２０】移植細胞は、組織等価物１０において、移
植適合性細胞の増殖や移植環境への適合性などに関与す
る細胞基質を産生するので、組織等価物１０は、この移
植細胞の他に、この細胞から産生された細胞基質もまた
含有していてもよい。この細胞基質の濃度は、移植細胞
の基質産生能及び細胞数に依存しているため、担体部１
２よりも細胞層１４の方で高くなる。細胞基質は、密集
した移植細胞から産生されたものであってもよく、外部
から細胞基質を添加してもよい。この移植細胞及び細胞
基質は、いずれも組織等価物１０の生体への生着能及び
組織等価物１０の固さに寄与するものである。
植適合性細胞の増殖や移植環境への適合性などに関与す
る細胞基質を産生するので、組織等価物１０は、この移
植細胞の他に、この細胞から産生された細胞基質もまた
含有していてもよい。この細胞基質の濃度は、移植細胞
の基質産生能及び細胞数に依存しているため、担体部１
２よりも細胞層１４の方で高くなる。細胞基質は、密集
した移植細胞から産生されたものであってもよく、外部
から細胞基質を添加してもよい。この移植細胞及び細胞
基質は、いずれも組織等価物１０の生体への生着能及び
組織等価物１０の固さに寄与するものである。
【００２１】従って、組織等価物１０は、移植細胞又は
移植細胞及び細胞基質を豊富に有する細胞層１４を最外
層に有しているので、生体への生着率が高く、また長期
にわたって脱落することなく固定したままにすることが
できる。内側の担体部１２では、細胞数及び細胞基質の
量が共に細胞層１４よりも少ないので、細胞数及び細胞
基質の量に比例して柔軟性に富み、組織等価物１０全体
の固さ・柔軟性を生体適合性の観点から良好なものにす
ることができる。更に、組織等価物１０は、周囲を細胞
及び細胞基質が豊富な細胞層１４を有しているので、移
植後早期に固定され、固定後、移植された組織等価物１
０を足場としてインビボ（生体内）において組織を良好
に再生することができる。
移植細胞及び細胞基質を豊富に有する細胞層１４を最外
層に有しているので、生体への生着率が高く、また長期
にわたって脱落することなく固定したままにすることが
できる。内側の担体部１２では、細胞数及び細胞基質の
量が共に細胞層１４よりも少ないので、細胞数及び細胞
基質の量に比例して柔軟性に富み、組織等価物１０全体
の固さ・柔軟性を生体適合性の観点から良好なものにす
ることができる。更に、組織等価物１０は、周囲を細胞
及び細胞基質が豊富な細胞層１４を有しているので、移
植後早期に固定され、固定後、移植された組織等価物１
０を足場としてインビボ（生体内）において組織を良好
に再生することができる。
【００２２】次に、組織等価物１０の製造方法について
説明する。組織等価物１０は、上記移植細胞を、培養担
体に包埋する工程と、包埋後の培養担体に培地を供給す
る工程と、培地中で培養する培養工程とを含む工程によ
り得ることができる。
説明する。組織等価物１０は、上記移植細胞を、培養担
体に包埋する工程と、包埋後の培養担体に培地を供給す
る工程と、培地中で培養する培養工程とを含む工程によ
り得ることができる。
【００２３】包埋工程では、移植細胞と培養担体とが常
法により混合される（以下、細胞−担体混合物）。この
際、移植細胞の播種密度は、予定される培養期間や培養
担体の種類、培地の組成に依存するが、一般に、１×１
０4個／ｍｌ〜１×１０8個／ｍｌとすることが適切であ
り、約２×１０4個／ｍｌ〜２×１０7個／ｍｌが好まし
く、約２×１０5個／ｍｌ〜約２×１０6個／ｍｌが更に
好ましい。なお、特段の断りのない場合、播種密度は培
養担体に包埋した状態での密度を示す。この範囲外では
効率よく細胞密度や基質濃度が高い細胞層１４を形成す
ることが困難であり、また、特にこの範囲よりも播種密
度が少ないと、増殖率が十分でなく、二層構造を形成す
るまでの時間が長くなるため、好ましくない。
法により混合される（以下、細胞−担体混合物）。この
際、移植細胞の播種密度は、予定される培養期間や培養
担体の種類、培地の組成に依存するが、一般に、１×１
０4個／ｍｌ〜１×１０8個／ｍｌとすることが適切であ
り、約２×１０4個／ｍｌ〜２×１０7個／ｍｌが好まし
く、約２×１０5個／ｍｌ〜約２×１０6個／ｍｌが更に
好ましい。なお、特段の断りのない場合、播種密度は培
養担体に包埋した状態での密度を示す。この範囲外では
効率よく細胞密度や基質濃度が高い細胞層１４を形成す
ることが困難であり、また、特にこの範囲よりも播種密
度が少ないと、増殖率が十分でなく、二層構造を形成す
るまでの時間が長くなるため、好ましくない。
【００２４】供給工程では、移植対象細胞を培養可能な
培地が、培養担体に包埋されて得られた細胞−担体混合
物に供給される。
培地が、培養担体に包埋されて得られた細胞−担体混合
物に供給される。
【００２５】培養に用いられる基礎培地は、好ましくは
液体培地であり、培養に使用される培地の基礎となる基
礎培地には、移植細胞の通常の培養に用いられる公知の
もの全てが使用可能である。このような培地には、例え
ばダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）な
どが挙げられる。培地の供給は、液体培地の場合、通常
一般に行われているように、三次元構造を有する細胞−
担体混合物全体が液面下となるように、十分量の液体培
地を注ぎ入れることによって行われる。培養担体に包埋
されて得られた細胞−担体混合物がそのまま適当な培養
器に載置された後、培地がこの細胞−培養混合物に供給
される。
液体培地であり、培養に使用される培地の基礎となる基
礎培地には、移植細胞の通常の培養に用いられる公知の
もの全てが使用可能である。このような培地には、例え
ばダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）な
どが挙げられる。培地の供給は、液体培地の場合、通常
一般に行われているように、三次元構造を有する細胞−
担体混合物全体が液面下となるように、十分量の液体培
地を注ぎ入れることによって行われる。培養担体に包埋
されて得られた細胞−担体混合物がそのまま適当な培養
器に載置された後、培地がこの細胞−培養混合物に供給
される。
【００２６】培養工程は、担体に包埋された移植細胞の
増殖率が、担体の表面において高くなる条件下で行われ
る。このような高増殖率条件は、移植細胞の細胞種、播
種密度、培地の組成、担体に対する培地の浸透能など、
又はこれらの組み合わせにより選択される。この高増殖
率条件の一例として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの所
定種類の血清、増殖因子等を、移植細胞種に対応して選
択し、基礎培地に添加することが挙げられる。例えば、
ウサギ軟骨細胞の場合にはウシ胎児血清（ＦＢＳ）であ
ることが好ましい。また、早期に対数増殖期に移行可能
な播種密度や、このような播種密度と担体への浸透率の
高い培地との組み合わせを適宜選択することによって高
い増殖率を実現することもできる。
増殖率が、担体の表面において高くなる条件下で行われ
る。このような高増殖率条件は、移植細胞の細胞種、播
種密度、培地の組成、担体に対する培地の浸透能など、
又はこれらの組み合わせにより選択される。この高増殖
率条件の一例として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの所
定種類の血清、増殖因子等を、移植細胞種に対応して選
択し、基礎培地に添加することが挙げられる。例えば、
ウサギ軟骨細胞の場合にはウシ胎児血清（ＦＢＳ）であ
ることが好ましい。また、早期に対数増殖期に移行可能
な播種密度や、このような播種密度と担体への浸透率の
高い培地との組み合わせを適宜選択することによって高
い増殖率を実現することもできる。
【００２７】また、高増殖率の条件としての基礎培地へ
の添加物質には、アスコルビン酸を挙げることができ
る。基礎培地にアスコルビン酸を添加することによっ
て、細胞の基質産生能や増殖能を高めることができる。
この結果、組織等価物１０の内部側と比較して多くの培
地が浸透し易い表面側では、アスコルビン酸の作用によ
って多くの基質が産生されるので、担体部１２よりも産
生基質量が多い細胞層１４が形成される。
の添加物質には、アスコルビン酸を挙げることができ
る。基礎培地にアスコルビン酸を添加することによっ
て、細胞の基質産生能や増殖能を高めることができる。
この結果、組織等価物１０の内部側と比較して多くの培
地が浸透し易い表面側では、アスコルビン酸の作用によ
って多くの基質が産生されるので、担体部１２よりも産
生基質量が多い細胞層１４が形成される。
【００２８】ここで使用されるアスコルビン酸は、通常
この業界において使用されるＬ型のものならば、塩、水
和物など生理活性が失われない限り如何なる形態のもの
であってもよい。例えば、Ｌ−アスコルビン酸２−リン
酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム
塩、アスコルビン酸−２−硫酸ナトリウム塩、２−Ｏ−
α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸（ビタ
ミンＣ−２−グルコシド）等の安定型のアスコルビン酸
が挙げられる。基礎培地に添加されるアスコルビン酸と
しては、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウ
ム塩ｎ水和物の形態で添加する場合、１０〜３００μｇ
／ｍｌ、好ましくは５０〜２００μｇ／ｍｌの量で添加
することができる。
この業界において使用されるＬ型のものならば、塩、水
和物など生理活性が失われない限り如何なる形態のもの
であってもよい。例えば、Ｌ−アスコルビン酸２−リン
酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム
塩、アスコルビン酸−２−硫酸ナトリウム塩、２−Ｏ−
α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸（ビタ
ミンＣ−２−グルコシド）等の安定型のアスコルビン酸
が挙げられる。基礎培地に添加されるアスコルビン酸と
しては、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウ
ム塩ｎ水和物の形態で添加する場合、１０〜３００μｇ
／ｍｌ、好ましくは５０〜２００μｇ／ｍｌの量で添加
することができる。
【００２９】特に基礎培地に添加されるアスコルビン酸
は、液体中で分解するという性質から、凍結保存された
状態で維持されることが好ましく、基礎培地に混合され
た状態で凍結保存、例えば−５〜−２０℃で保存された
ものであることが好ましい。
は、液体中で分解するという性質から、凍結保存された
状態で維持されることが好ましく、基礎培地に混合され
た状態で凍結保存、例えば−５〜−２０℃で保存された
ものであることが好ましい。
【００３０】培養工程は、少なくとも、細胞−担体混合
物において細胞が増殖し、組織等価物１０の表面側と内
部側とで細胞数が異なって２つの層が形成される期間だ
け行えばよく、好ましくは、細胞層１４を構成する細胞
が表面に連続した略集密状態となるまでである。培養工
程を高増殖率条件下で行うので、組織等価物１０の細胞
層１４は早期に形成される。組織等価物１０の表面部で
は、培地と全面にわたり接触しているので、例えば、増
殖率の高い培地を選択することによって、培養期間を短
縮化することができる。このような状態になるまでの期
間は、播種密度及び培地の組成によって異なるが、例え
ば、２×１０6個／ｍｌの播種密度とした場合には、２
〜３週間である。
物において細胞が増殖し、組織等価物１０の表面側と内
部側とで細胞数が異なって２つの層が形成される期間だ
け行えばよく、好ましくは、細胞層１４を構成する細胞
が表面に連続した略集密状態となるまでである。培養工
程を高増殖率条件下で行うので、組織等価物１０の細胞
層１４は早期に形成される。組織等価物１０の表面部で
は、培地と全面にわたり接触しているので、例えば、増
殖率の高い培地を選択することによって、培養期間を短
縮化することができる。このような状態になるまでの期
間は、播種密度及び培地の組成によって異なるが、例え
ば、２×１０6個／ｍｌの播種密度とした場合には、２
〜３週間である。
【００３１】組織等価物１０の細胞層１４は、担体部１
２の外側のほぼ全周囲に配置されている。外周に渡って
細胞層１４を有する組織等価物１０を得るには、まず、
培養期間途中で、培養器から組織等価物１０を剥がす。
培養器から剥がされた組織等価物１０は培地中に浮遊す
るので、この状態で培養工程を継続することによって、
培地が接触している外周に渡って細胞層１４が形成され
る。
２の外側のほぼ全周囲に配置されている。外周に渡って
細胞層１４を有する組織等価物１０を得るには、まず、
培養期間途中で、培養器から組織等価物１０を剥がす。
培養器から剥がされた組織等価物１０は培地中に浮遊す
るので、この状態で培養工程を継続することによって、
培地が接触している外周に渡って細胞層１４が形成され
る。
【００３２】従って、本発明によれば、内部の細胞密度
を考慮することなく、生体への生着率及び固定が良好な
組織等価物１０を、効率よく製造することができ、入手
できる細胞数が少量でも、大きな三次元構造の組織等価
物を比較的容易に提供することができる。また組織等価
物１０では、内部にまで細胞を均一に分布する必要がな
いので、均一に分布された等価物と比較して一層早期に
製造することができる。このような組織等価物１０で
は、移植周辺組織との融合性にも富んでおり、比較的早
急に移植周縁組織に固定され、脱落の可能性を減少する
ことができる。
を考慮することなく、生体への生着率及び固定が良好な
組織等価物１０を、効率よく製造することができ、入手
できる細胞数が少量でも、大きな三次元構造の組織等価
物を比較的容易に提供することができる。また組織等価
物１０では、内部にまで細胞を均一に分布する必要がな
いので、均一に分布された等価物と比較して一層早期に
製造することができる。このような組織等価物１０で
は、移植周辺組織との融合性にも富んでおり、比較的早
急に移植周縁組織に固定され、脱落の可能性を減少する
ことができる。
【００３３】なお、組織等価物１０では、包埋工程にお
いて、移植細胞と培養担体とを混合し、担体部１２にも
移植細胞を含んでいるが、細胞層１４に細胞又は細胞基
質が存在すれば、担体部１２に細胞が存在していなくて
もよい。このような担体部１２に細胞を含まない組織等
価物は、培養担体を先に培養器に設置してから培養担体
の表面上に担体−細胞混合物を播種して培養を開始する
ことにより得ることができる。
いて、移植細胞と培養担体とを混合し、担体部１２にも
移植細胞を含んでいるが、細胞層１４に細胞又は細胞基
質が存在すれば、担体部１２に細胞が存在していなくて
もよい。このような担体部１２に細胞を含まない組織等
価物は、培養担体を先に培養器に設置してから培養担体
の表面上に担体−細胞混合物を播種して培養を開始する
ことにより得ることができる。
【００３４】この場合に用いられる担体は、上述と同様
のゲル状又はスポンジ状のものが用いられるが、移植細
胞と混合する際には、流動性を有する。このような流動
性の担体とすることにより、予め培養器に設置された担
体の表面に配置又は塗布するだけで適度にその表面が覆
われる。培養期間は、移植細胞が少なくとも担体の一部
で集密化するまでの期間又は、細胞から適当な量の細胞
基質が産生されるまでであればよい。このため、比較的
簡単な作業及び短時間で二層構造を形成することができ
る。従って、生体への融合性が高い三次元構造の組織等
価物２０を容易に作製することができる。
のゲル状又はスポンジ状のものが用いられるが、移植細
胞と混合する際には、流動性を有する。このような流動
性の担体とすることにより、予め培養器に設置された担
体の表面に配置又は塗布するだけで適度にその表面が覆
われる。培養期間は、移植細胞が少なくとも担体の一部
で集密化するまでの期間又は、細胞から適当な量の細胞
基質が産生されるまでであればよい。このため、比較的
簡単な作業及び短時間で二層構造を形成することができ
る。従って、生体への融合性が高い三次元構造の組織等
価物２０を容易に作製することができる。
【００３５】また、組織等価物１０では、その外周にわ
たって細胞層１４を有しているが、細胞層１４は移植の
際に生体との接触面に形成されていれば組織等価物の固
定性などにおいて効果を奏することができるので、全周
にわたって存在していなくても表面上の少なくとも一部
に細胞層１４が形成されていればよい。
たって細胞層１４を有しているが、細胞層１４は移植の
際に生体との接触面に形成されていれば組織等価物の固
定性などにおいて効果を奏することができるので、全周
にわたって存在していなくても表面上の少なくとも一部
に細胞層１４が形成されていればよい。
【００３６】図２は、他の組織等価物２０が示されてい
る。この組織等価物２０では、外周の一部に細胞層１４
が形成されていない箇所を有している。この組織等価物
２０は、外周の全部にわたって細胞層１４を形成させる
必要がないので、全周にわたって細胞層１４を形成させ
るよりも短期間で作製することができる。このような組
織等価物２０は、培養器上で培養を開始した後に培養器
から剥がすことなく培養工程を終了することにより容易
に得ることができる。
る。この組織等価物２０では、外周の一部に細胞層１４
が形成されていない箇所を有している。この組織等価物
２０は、外周の全部にわたって細胞層１４を形成させる
必要がないので、全周にわたって細胞層１４を形成させ
るよりも短期間で作製することができる。このような組
織等価物２０は、培養器上で培養を開始した後に培養器
から剥がすことなく培養工程を終了することにより容易
に得ることができる。
【００３７】更に図３には、他の変形例となる組織等価
物３０が示されている。この組織等価物３０では、細胞
層１４が形成されている領域は、担体部１２が露出して
いる部分よりも小さくなっている。このような組織等価
物３０は、全周の一部に形成された細胞層１４が生体と
接触するように移植される。生体と接触している細胞層
１４が生体への固着に寄与することができるので、前記
同様の効果を得ることができる。このような組織等価物
３０は、前記組織等価物２０を厚み方向に切断すること
によって容易に得ることができる。このため組織等価物
３０の形状を、移植部位の形状に合せることができ、生
体との密着性を向上させることができることからより一
層生体への固定及び組織再生を早期に実現することがで
き、且つ脱落を抑制することができる。
物３０が示されている。この組織等価物３０では、細胞
層１４が形成されている領域は、担体部１２が露出して
いる部分よりも小さくなっている。このような組織等価
物３０は、全周の一部に形成された細胞層１４が生体と
接触するように移植される。生体と接触している細胞層
１４が生体への固着に寄与することができるので、前記
同様の効果を得ることができる。このような組織等価物
３０は、前記組織等価物２０を厚み方向に切断すること
によって容易に得ることができる。このため組織等価物
３０の形状を、移植部位の形状に合せることができ、生
体との密着性を向上させることができることからより一
層生体への固定及び組織再生を早期に実現することがで
き、且つ脱落を抑制することができる。
【００３８】
【実施例】以下、本発明の内容について一実施例を挙げ
て具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら、限定さ
れるものではない。
て具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら、限定さ
れるものではない。
【００３９】＜実施例１＞（図４参照） 日本白色家兎の膝、股、肩関節から関節軟骨を採取し、
トリプシンＥＤＴＡ溶液およびコラゲナーゼ溶液で酵素
処理を行い、軟骨細胞を分離・回収した。得られた軟骨
細胞を先浄後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）／ＤＭＥ
Ｍ培地を加え、細胞密度が１×１０7個／ｍｌとなるよ
うに細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液と３％アテロコ
ラーゲンインプラント（高研社製）が１：４の割合にな
るように混合（包埋）し、培養皿にドーム状に１００μ
ｌをマウント（設置）した。この工程によって細胞密度
は希釈されるので、細胞懸濁液を１×１０7個／ｍｌの
濃度で調製した場合、コラーゲンに包埋したときの濃度
は２×１０6個／ｍｌ（２×１０5個／１００μｌ担体）
となる。
トリプシンＥＤＴＡ溶液およびコラゲナーゼ溶液で酵素
処理を行い、軟骨細胞を分離・回収した。得られた軟骨
細胞を先浄後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）／ＤＭＥ
Ｍ培地を加え、細胞密度が１×１０7個／ｍｌとなるよ
うに細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液と３％アテロコ
ラーゲンインプラント（高研社製）が１：４の割合にな
るように混合（包埋）し、培養皿にドーム状に１００μ
ｌをマウント（設置）した。この工程によって細胞密度
は希釈されるので、細胞懸濁液を１×１０7個／ｍｌの
濃度で調製した場合、コラーゲンに包埋したときの濃度
は２×１０6個／ｍｌ（２×１０5個／１００μｌ担体）
となる。
【００４０】マウントした混合液は、５％ＣＯ2、３７
℃の条件下で０．５〜１時間、静置してゲル化させ、培
地を加え、培養を開始した。培地には５０μｇ／ｍｌア
スコルビン酸（Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグ
ネシウム塩ｎ水和物：Ｃ6Ｈ6Ｏ9Ｐ・３／２Ｍｇ・ｎＨ2
Ｏ；日光ケミカルズ株式会社製）及び１００μｇ／ｍｌ
ヒアルロン酸を含むように調整した１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ
（ウシ胎児血清）−ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル
最小必須培地）を使用し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下
で、３週間培養を行った。
℃の条件下で０．５〜１時間、静置してゲル化させ、培
地を加え、培養を開始した。培地には５０μｇ／ｍｌア
スコルビン酸（Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグ
ネシウム塩ｎ水和物：Ｃ6Ｈ6Ｏ9Ｐ・３／２Ｍｇ・ｎＨ2
Ｏ；日光ケミカルズ株式会社製）及び１００μｇ／ｍｌ
ヒアルロン酸を含むように調整した１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ
（ウシ胎児血清）−ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル
最小必須培地）を使用し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下
で、３週間培養を行った。
【００４１】３週間の包埋培養後に、直径が約１０ｍ
ｍ、厚みが約３ｍｍの組織等価物が得られた。この組織
等価物の形態を確認するために、軟骨細胞の産生基質で
ある酸性ムコ多糖類に対してアルシアンブルー染色を、
細胞核に対してケルンエヒトロート染色を常法で行った
後、断面を顕微鏡で確認したところ、細胞の密度が異な
り細胞層及び担体層の二層が形成されていた。
ｍ、厚みが約３ｍｍの組織等価物が得られた。この組織
等価物の形態を確認するために、軟骨細胞の産生基質で
ある酸性ムコ多糖類に対してアルシアンブルー染色を、
細胞核に対してケルンエヒトロート染色を常法で行った
後、断面を顕微鏡で確認したところ、細胞の密度が異な
り細胞層及び担体層の二層が形成されていた。
【００４２】図５Ａ及びＢは３週間の包埋培養を経た軟
骨組織断面のアルシアンブルー染色像である。図５から
観察されるように、産生された酸性ムコ多糖類はコラー
ゲンゲルの周辺に密集しており、ゲル内部にはいくつか
のコロニーを形成するのみである。このときの細胞層の
厚さは、およそ１００〜２００μｍであった。また、軟
骨の特徴的な産生基質であるタイプIIコラーゲンの染色
像（図６Ａ及びＢ）からも同様の結果を観察することが
できる。
骨組織断面のアルシアンブルー染色像である。図５から
観察されるように、産生された酸性ムコ多糖類はコラー
ゲンゲルの周辺に密集しており、ゲル内部にはいくつか
のコロニーを形成するのみである。このときの細胞層の
厚さは、およそ１００〜２００μｍであった。また、軟
骨の特徴的な産生基質であるタイプIIコラーゲンの染色
像（図６Ａ及びＢ）からも同様の結果を観察することが
できる。
【００４３】＜実施例２＞（図７参照） 実施例１と同様の処理により軟骨細胞を分離・回収し
た。３％アテロコラーゲンインプラント（高研社製）を
培養皿にドーム状にマウント（設置）、ゲル化した上
に、細胞密度が１×１０7個／ｍｌとなるように調製し
た細胞懸濁液と０.３％アテロコラーゲン細胞懸濁液を
１：４の割合で混合した細胞−０.３％コラーゲン混合
液（２×１０6個／ｍｌ）を表層として播種し、ゲル化
後、培地を加え、培養を開始した。培地には５０μｇ／
ｍｌアスコルビン酸（実施例１で使用したＬ−アスコル
ビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物、以下、
同様）及び１００μｇ／ｍｌヒアルロン酸を含むように
調整した１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（ダルベッコ変
法イーグル最少必須培地）を使用し、３７℃、５％ＣＯ
2で、３週間培養を行った。３週間の培養後に、直径が
約１０ｍｍ、厚みが約３ｍｍの組織等価物が得られた。
この組織等価物における軟骨基質の産生を確認するため
に、酸性ムコ多糖類の検出法であるアルシアンブルー染
色を常法で行い、産生された酸性ムコ多糖類が実施例１
と同様にコラーゲンゲルの周辺に密集していることを確
認した。
た。３％アテロコラーゲンインプラント（高研社製）を
培養皿にドーム状にマウント（設置）、ゲル化した上
に、細胞密度が１×１０7個／ｍｌとなるように調製し
た細胞懸濁液と０.３％アテロコラーゲン細胞懸濁液を
１：４の割合で混合した細胞−０.３％コラーゲン混合
液（２×１０6個／ｍｌ）を表層として播種し、ゲル化
後、培地を加え、培養を開始した。培地には５０μｇ／
ｍｌアスコルビン酸（実施例１で使用したＬ−アスコル
ビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物、以下、
同様）及び１００μｇ／ｍｌヒアルロン酸を含むように
調整した１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（ダルベッコ変
法イーグル最少必須培地）を使用し、３７℃、５％ＣＯ
2で、３週間培養を行った。３週間の培養後に、直径が
約１０ｍｍ、厚みが約３ｍｍの組織等価物が得られた。
この組織等価物における軟骨基質の産生を確認するため
に、酸性ムコ多糖類の検出法であるアルシアンブルー染
色を常法で行い、産生された酸性ムコ多糖類が実施例１
と同様にコラーゲンゲルの周辺に密集していることを確
認した。
【００４４】ここで得られた組織等価物は、周辺に軟骨
細胞が密集した細胞基質が豊富に存在しているのに対し
て、内部では細胞数及び細胞基質量が共に少ないので、
厚み方向に負荷をかけると適度に変形し、適切な固さで
あることがわかる。
細胞が密集した細胞基質が豊富に存在しているのに対し
て、内部では細胞数及び細胞基質量が共に少ないので、
厚み方向に負荷をかけると適度に変形し、適切な固さで
あることがわかる。
【００４５】＜実施例３〜６＞細胞数を２×１０3個／
１００μｌ担体（実施例３）、２×１０4個／１００μ
ｌ担体（実施例４）、２×１０5個／１００μｌ担体
（実施例５）及び２×１０6個／１００μｌ担体（実施
例６）の播種密度とした以外は、実施例１と同様にし
て、培養を開始した。７日毎に細胞数と組織等価物の形
態を調べた。結果を表１に示す。表１において、×は二
層構造が殆ど認められない場合、△は一部に二層構造が
認められる場合、〇は二層構造が認められる場合を、そ
れぞれ示す。これらの結果から、いずれの播種密度であ
っても、所定期間の培養後に組織等価物を提供できるこ
とが示された。また、２×１０5個／１００μｌ担体で
播種した場合には１０日程度から、２×１０6個／１０
０μｌ担体で播種した場合には１０日以内から、組織等
価物の表面の一部に二層構造が形成されており、移植片
として早期に使用できることが示された。
１００μｌ担体（実施例３）、２×１０4個／１００μ
ｌ担体（実施例４）、２×１０5個／１００μｌ担体
（実施例５）及び２×１０6個／１００μｌ担体（実施
例６）の播種密度とした以外は、実施例１と同様にし
て、培養を開始した。７日毎に細胞数と組織等価物の形
態を調べた。結果を表１に示す。表１において、×は二
層構造が殆ど認められない場合、△は一部に二層構造が
認められる場合、〇は二層構造が認められる場合を、そ
れぞれ示す。これらの結果から、いずれの播種密度であ
っても、所定期間の培養後に組織等価物を提供できるこ
とが示された。また、２×１０5個／１００μｌ担体で
播種した場合には１０日程度から、２×１０6個／１０
０μｌ担体で播種した場合には１０日以内から、組織等
価物の表面の一部に二層構造が形成されており、移植片
として早期に使用できることが示された。
【００４６】
【表１】
【００４７】＜実施例７、比較例１〜２＞基礎培地とし
て１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを使用し、５０μｇ／
ｍｌアスコルビン酸（Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステ
ルマグネシウム塩ｎ水和物）のみを添加した培地（実施
例７）、１００μｇ／ｍｌヒアルロン酸のみを添加した
培地（比較例１）、添加物を加えていない基礎培地（比
較例２）を培養用培地として使用した以外は、実施例１
と同様に培養操作を行った。
て１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを使用し、５０μｇ／
ｍｌアスコルビン酸（Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステ
ルマグネシウム塩ｎ水和物）のみを添加した培地（実施
例７）、１００μｇ／ｍｌヒアルロン酸のみを添加した
培地（比較例１）、添加物を加えていない基礎培地（比
較例２）を培養用培地として使用した以外は、実施例１
と同様に培養操作を行った。
【００４８】図８は実施例１、図９は実施例７、図１０
は比較例１、図１１は比較例２の条件で３週間培養した
軟骨組織断面のアルシアンブルー染色像である。これら
の断面染色像から分かるように、添加物としてアスコル
ビン酸が加えられている実施例１及び７（図８及び９）
では、培養軟骨組織の表面に細胞層が形成され、２層構
造となっていることが確認できる。これに対して、比較
例１及び２（図１０及び１１）では細胞層が形成されな
い。表２は、実施例１及び７、比較例１及び２の培養軟
骨組織の二層構造の有無、基質産生及び細胞数を、実施
例１で作製された培養軟骨組織を基準にして示したもの
である。表中「基準」とは、実施例７、比較例１及び２
の基質産生及び細胞数を実施例１のものと比較する際の
基礎としたことを示す。
は比較例１、図１１は比較例２の条件で３週間培養した
軟骨組織断面のアルシアンブルー染色像である。これら
の断面染色像から分かるように、添加物としてアスコル
ビン酸が加えられている実施例１及び７（図８及び９）
では、培養軟骨組織の表面に細胞層が形成され、２層構
造となっていることが確認できる。これに対して、比較
例１及び２（図１０及び１１）では細胞層が形成されな
い。表２は、実施例１及び７、比較例１及び２の培養軟
骨組織の二層構造の有無、基質産生及び細胞数を、実施
例１で作製された培養軟骨組織を基準にして示したもの
である。表中「基準」とは、実施例７、比較例１及び２
の基質産生及び細胞数を実施例１のものと比較する際の
基礎としたことを示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】これらの実験結果から、実施例１のような
培養条件の下では、アスコルビン酸を基礎培地に添加す
ることによって、培養軟骨組織表面に細胞層を効率よく
形成できることが分かった。
培養条件の下では、アスコルビン酸を基礎培地に添加す
ることによって、培養軟骨組織表面に細胞層を効率よく
形成できることが分かった。
【００５１】＜実施例８、比較例３＞培養用培地とし
て、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｌ−アスコルビン
酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物）及び１００
μｇ／ｍｌヒアルロン酸を含有した１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ
−ＤＭＥＭを使用し、この培養用培地を２〜８℃の低温
で長期間保存したもの（比較例３）と、−５℃で長期間
凍結保存したもの（実施例８）に関して、培養軟骨組織
の細胞層形成能を比較した。
て、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｌ−アスコルビン
酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物）及び１００
μｇ／ｍｌヒアルロン酸を含有した１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ
−ＤＭＥＭを使用し、この培養用培地を２〜８℃の低温
で長期間保存したもの（比較例３）と、−５℃で長期間
凍結保存したもの（実施例８）に関して、培養軟骨組織
の細胞層形成能を比較した。
【００５２】培養操作は実施例１と同様に行ったが、培
養開始時に調製した上記培養用培地を低温保存あるいは
凍結保存し、培地交換の際にそれぞれ必要量のみを保存
状態から使用可能状態に戻して使用し、３週間培養し
た。なお、実施例１では培地交換ごとに新たに培地を調
製し、培地交換を行っている。図１２は凍結保存培地で
培養した軟骨組織断面（実施例８）のアルシアンブルー
染色像、図１３は低温保存培地で培養した軟骨組織断面
（比較例３）のアルシアンブルー染色像である。表３
は、実施例８及び比較例３の培養軟骨組織の二層構造の
有無、基質産生及び細胞数を、実施例１で作製された培
養軟骨組織を基準にして示したものである。表中「基
準」とは、実施例８及び比較例３の基質産生及び細胞数
を実施例１のものと比較する際の基礎としたことを示
す。
養開始時に調製した上記培養用培地を低温保存あるいは
凍結保存し、培地交換の際にそれぞれ必要量のみを保存
状態から使用可能状態に戻して使用し、３週間培養し
た。なお、実施例１では培地交換ごとに新たに培地を調
製し、培地交換を行っている。図１２は凍結保存培地で
培養した軟骨組織断面（実施例８）のアルシアンブルー
染色像、図１３は低温保存培地で培養した軟骨組織断面
（比較例３）のアルシアンブルー染色像である。表３
は、実施例８及び比較例３の培養軟骨組織の二層構造の
有無、基質産生及び細胞数を、実施例１で作製された培
養軟骨組織を基準にして示したものである。表中「基
準」とは、実施例８及び比較例３の基質産生及び細胞数
を実施例１のものと比較する際の基礎としたことを示
す。
【００５３】
【表３】
【００５４】これらの実験結果から凍結保存培地では細
胞層が形成されたが、低温保存培地では細胞層の形成
は、ごく僅かであった。アスコルビン酸は液体中で酸化
分解あるいは加水分解するという特性を有するので、液
体の状態で低温保存すると、徐々にその活性が低くなり
細胞層が形成されなかったと推察される。これに対し、
凍結保存では固体の状態で保存され、アスコルビン酸の
活性の低下が抑制されるので、細胞層が形成された、と
考えられる。
胞層が形成されたが、低温保存培地では細胞層の形成
は、ごく僅かであった。アスコルビン酸は液体中で酸化
分解あるいは加水分解するという特性を有するので、液
体の状態で低温保存すると、徐々にその活性が低くなり
細胞層が形成されなかったと推察される。これに対し、
凍結保存では固体の状態で保存され、アスコルビン酸の
活性の低下が抑制されるので、細胞層が形成された、と
考えられる。
【００５５】このようにアスコルビン酸含有培地であっ
ても、保存方法によってはその活性（効果）が変化する
ため、細胞層を有さない培養軟骨組織が形成される可能
性がある。これらのことから、培地に占めるアスコルビ
ン酸の活性が細胞層の形成に大きく関与していることが
分かる。
ても、保存方法によってはその活性（効果）が変化する
ため、細胞層を有さない培養軟骨組織が形成される可能
性がある。これらのことから、培地に占めるアスコルビ
ン酸の活性が細胞層の形成に大きく関与していることが
分かる。
【００５６】図１４は実施例１及び実施例７〜８並び
に、比較例１〜３までの生細胞数を測定したグラフであ
る。細胞層が形成された実施例１、実施例７及び実施例
８では、明らかに生細胞数が多く、細胞増殖活性が高く
なっていることが確認された。
に、比較例１〜３までの生細胞数を測定したグラフであ
る。細胞層が形成された実施例１、実施例７及び実施例
８では、明らかに生細胞数が多く、細胞増殖活性が高く
なっていることが確認された。
【発明の効果】以上説明したように本発明においては、
短期間で移植可能であり、移植周辺組織との融合性に富
む大型の移植用組織等価物を容易に提供することができ
る。
短期間で移植可能であり、移植周辺組織との融合性に富
む大型の移植用組織等価物を容易に提供することができ
る。
【図１】 本発明の実施の形態に係る組織等価物の断面
図である。
図である。
【図２】 本発明の実施の形態に係る他の組織等価物の
断面図である。
断面図である。
【図３】 本発明の実施の形態に係る他の組織等価物の
変形例の断面図である。
変形例の断面図である。
【図４】 本発明の実施例１の工程を説明する模式図で
ある。
ある。
【図５】 図５Ａは、本発明の実施例に係る組織等価物
断面のアルシアンブルー染色の状態を示す図、図５Ｂは
図５Ａの拡大図である。
断面のアルシアンブルー染色の状態を示す図、図５Ｂは
図５Ａの拡大図である。
【図６】 図６Ａは、本発明の実施例に係る組織等価物
断面のII型コラーゲン染色の状態を示す図、図６Ｂは図
６Ａの拡大図である。
断面のII型コラーゲン染色の状態を示す図、図６Ｂは図
６Ａの拡大図である。
【図７】 本発明の実施例２の工程を説明する模式図で
ある。
ある。
【図８】 本発明の実施例１に係る軟骨組織等価物断面
のアルシアンブルー染色である。
のアルシアンブルー染色である。
【図９】 本発明の実施例７に係る軟骨組織等価物断面
のアルシアンブルー染色である。
のアルシアンブルー染色である。
【図１０】 本発明の比較例１に係る軟骨組織等価物断
面のアルシアンブルー染色である。
面のアルシアンブルー染色である。
【図１１】 本発明の比較例２に係る軟骨組織等価物断
面のアルシアンブルー染色である。
面のアルシアンブルー染色である。
【図１２】 本発明の実施例８に係る軟骨組織等価物断
面のアルシアンブルー染色である。
面のアルシアンブルー染色である。
【図１３】 本発明の比較例３に係る軟骨組織等価物断
面のアルシアンブルー染色である。
面のアルシアンブルー染色である。
【図１４】 実施例１及び実施例７〜８並びに、比較例
１〜３までの生細胞数を測定したグラフである。
１〜３までの生細胞数を測定したグラフである。
１０ 組織等価物（移植用組織等価物） １２ 担体部（担体層） １４ 細胞層（細胞層）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 越智 光夫 広島県広島市安佐南区山本２−11−３ (72)発明者 内尾 祐司 島根県出雲市塩冶有原１−35 10−105号 (72)発明者 河▲崎▼ 賢三 島根県出雲市小山町２ 401号 (72)発明者 加藤 雅一 愛知県蒲郡市三谷北通６丁目209番地の１ 株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジ ニアリング内 (72)発明者 山本 剛之 愛知県蒲郡市三谷北通６丁目209番地の１ 株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジ ニアリング内 (72)発明者 福島 里佳 愛知県蒲郡市三谷北通６丁目209番地の１ 株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジ ニアリング内 (72)発明者 久留島 豊一 愛知県蒲郡市三谷北通６丁目209番地の１ 株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジ ニアリング内 Ｆターム(参考） 4B033 NA16 NB43 NB44 NB58 NB63 ND12 NF06 NG05 4B065 AA90 BB20 BC41 CA44 4C081 AB04 AB11 AC03 BA12 BA13 BA16 BB07 BC02 CD081 CD121 CD131 CD34 CE11 DA01 DA12 DC03 DC06 DC11 EA01 EA02 EA11 4C087 AA01 AA02 BB64 CA04 MA05 MA67 NA10 ZA96 ZC51 ZC54
Claims (12)
- 【請求項１】 インビトロで培養され、移植対象細胞を
含むと共に培養後に生体へ移植可能な三次元構造の移植
用組織等価物において、 三次元構造を構築する細胞培養担体により主として構成
される担体層と、 前記移植用組織等価物の表面の少なくとも一部に、前記
担体層に連続して局在し、前記担体層よりも前記移植対
象細胞又は細胞基質が豊富な細胞層と、 を備えたことを特徴とする移植用組織等価物。 - 【請求項２】 前記細胞層が、密集した前記移植対象細
胞で構成され、又は密集した移植対象細胞から産生され
た細胞基質を更に含むことを特徴とする請求項１に記載
の移植用組織等価物。 - 【請求項３】 前記細胞層に存在する移植対象細胞の密
度が、前記担体層の内部の細胞密度に対して実質的に密
であることを特徴とする請求項１に記載の移植用組織等
価物。 - 【請求項４】 前記細胞層の厚さが、２０〜５００μｍ
であることを特徴とする請求項１に記載の移植用組織等
価物。 - 【請求項５】 前記細胞培養担体が、生体吸収性材料又
は生体親和性材料であることを特徴とする請求項１に記
載の移植用組織等価物。 - 【請求項６】 前記細胞培養担体が、コラーゲン、ヒア
ルロン酸及びポリロタキサンの少なくとも１つであるこ
とを特徴とする請求項１に記載の移植用組織等価物。 - 【請求項７】 前記細胞は、軟骨細胞、骨芽細胞又はこ
れらの前駆細胞であることを特徴とする請求項１に記載
の移植用組織等価物。 - 【請求項８】 インビトロで培養され、移植対象細胞を
含むと共に培養後に生体へ移植可能な三次元構造の移植
用組織等価物の製造方法において、 前記三次元構造を構築する細胞培養担体に、移植対象細
胞を包埋する包埋工程と、 前記移植対象細胞を培養可能な培地を、前記移植対象細
胞が包埋された細胞培養担体に供給する供給工程と、 前記移植対象細胞の増殖率が、前記細胞担体内部よりも
前記細胞培養担体の表面において高くなる条件下で培養
し、該細胞培養担体の少なくとも一部の表面において、
前記細胞培養担体の内部よりも前記移植対象細胞密度が
高くなって、細胞密度が異なる２つの層が形成される培
養工程と、 を含むことを特徴とする移植用組織等価物の製造方法。 - 【請求項９】 前記培地は、アスコルビン酸を含有する
ことを特徴とする請求項８に記載の移植用組織等価物の
製造方法。 - 【請求項１０】 前記アスコルビン酸を含有する培地
は、凍結保存されていたものであることを特徴とする請
求項９に記載の移植用組織等価物の製造方法。 - 【請求項１１】 前記移植対象細胞を、１×１０4〜１
×１０8個／ｍｌの播種密度で前記細胞培養担体に包埋
する請求項８に記載の移植用組織等価物の製造方法。 - 【請求項１２】 インビトロで培養され、移植対象細胞
を含むと共に培養後に生体へ移植可能な三次元構造の移
植用組織等価物の製造方法において、 立体構造を培地中で維持できる流動性担体と移植対象細
胞とを混合する混合工程と、 前記混合工程により得られた混合物を、予め載置された
三次元担体の少なくとも一部の表面に播種する播種工程
と、 前記流動性担体の少なくとも一部において、実質的に移
植対象細胞が集密状態となるまで培養する培養工程と、 を含むことを特徴とする移植用組織等価物の製造方法。
Priority Applications (9)
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|---|---|---|---|
| JP2001302563A JP2002233567A (ja) | 2000-12-06 | 2001-09-28 | 移植用組織等価物及びその製造方法 |
| PCT/JP2001/010587 WO2002045766A1 (fr) | 2000-12-06 | 2001-12-04 | Equivalent tissulaire pour transplantation et son procede de production |
| EP01999395A EP1358895A4 (en) | 2000-12-06 | 2001-12-04 | TISSUE EQUIVALENT FOR TRANSPLANTATION AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
| CNB018199038A CN1327910C (zh) | 2000-12-06 | 2001-12-04 | 移植用组织等价物及其制造方法 |
| KR1020097021594A KR20090115773A (ko) | 2000-12-06 | 2001-12-04 | 이식용 조직 등가물 및 그 제조 방법 |
| US10/433,568 US20040030406A1 (en) | 2000-12-06 | 2001-12-04 | Tissue equivalent for transplantation and process for producing the same |
| KR10-2003-7007268A KR20030061415A (ko) | 2000-12-06 | 2001-12-04 | 이식용 조직 등가물 및 그 제조 방법 |
| AU2002224141A AU2002224141A1 (en) | 2000-12-06 | 2001-12-04 | Tissue equivalant for transplantation and process for producing the same |
| US11/727,521 US20070172812A1 (en) | 2000-12-06 | 2007-03-27 | Tissue equivalent for transplantation and method for producing same |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000371692 | 2000-12-06 | ||
| JP2000-371692 | 2000-12-06 | ||
| JP2001302563A JP2002233567A (ja) | 2000-12-06 | 2001-09-28 | 移植用組織等価物及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002233567A true JP2002233567A (ja) | 2002-08-20 |
Family
ID=26605347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001302563A Pending JP2002233567A (ja) | 2000-12-06 | 2001-09-28 | 移植用組織等価物及びその製造方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1358895A4 (ja) |
| JP (1) | JP2002233567A (ja) |
| KR (2) | KR20090115773A (ja) |
| CN (1) | CN1327910C (ja) |
| AU (1) | AU2002224141A1 (ja) |
| WO (1) | WO2002045766A1 (ja) |
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