JPH04505717A - 細胞培養物からのインビボでの軟骨の新生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 立　からのインビボでの　の　生 曳朋ｆｌ晟 本出願は、１９８９年４月１７日に出願されたＪｏｓｅｐｈ　Ｐ、　Ｖａｃａｎ ｔｉ。

Ｃｈａｒｌｅｓ　Ａ、　ＶａｃａｎｔｉおよびＲｏｂｅｒｔ　Ｓ、　Ｌａｎｇｅ ｒによる米国特許出願系０７７３３９．１５５号「細胞培養物からのインビボで の軟骨の新生」の一部継続出願である。上記出願は、１９８７年１１月２０日に 出願されたＪｏｓｅｐｈ　Ｐ、　ＶａｃａｎｔｉおよびＲｏｂｅｒｔ　Ｓ、　Ｌ ａｎｇｅｒによる米国特許出願系０７７１２３．５７９号「人工マトリックスを 用いる、制御された細胞移植による器官のキメラ新生」の一部継続出願であり、 そしてこの出願は、１９８６年１１月２０日に出願されたＪｏｓｅｐｈ　Ｐ、　 ＶａｃａｎｔｆおよびＲｏｂｅｒｔ　Ｓ、　Ｌａｎｇｅｒによる米国特許出願系 ０６７９３３，０１８号「人工マトリックスを用いる器官のキメラ新生」の一部 継続出願である。

米国政府は、ＮＩＨ承認番号６Ｍ２６６９８により本発明について権利を有する 。

本発明は、一般に医学および細胞培養物の分野に関し、詳細には、生体適合性の 人工マトリックス上に形成される移植可能な軟骨構造の領域に関する。

Ｊｏｓｅｐｈ　Ｐ、　ＶａｃａｎｔｉおよびＲｏｂｅｒｔ　Ｓ、　Ｌａｎｇｅｒ による１９８７年１１月ＺＱＢに出願された米国特許出願系０７７１２３．５７ ９号「人工マトリックスを用いる、制御された細胞移植による器官のキメラ新生 」、および１９８６年１１月２０日に出願された米国特許出願系０６／９３３． ０１８号「人工マトリックスを用いる器官のキメラ新生」には、細胞培養技術を 用いて所望の機能を有する細胞をポリマーの足場上に増殖させた後、細胞−ポリ マー足場を、その接着および平衡化の後に機能的器官等個物が生成されるための 接着、生育および機能に適当な患者の部位に移植する、方法および手段が記載さ れている。成功は、移植される細胞の周囲の環境に接着する能力および血管形成 を刺激する能力に依存する。必要に応じ、接着、生存または増殖のために、細胞 培養の間に栄養分および成長因子が補充される。

構造物が移植されて生育および血管新生が起きた後に得られる疑似器官は、提供 された組織の実賀要素および血管および宿主のマトリックス要素から形成される キメラである。初めの細胞培養に用いられる足場ポリマーは、時間がたつと分解 される材料で構築され、従ってキメラの器官中には存在しない。移植に続く血管 新生により、移植された細胞の可溶性生成物を制御する正常なフィードバック機 構が機能するようになる。マトリックスまたは支持構造を作るための好ましい材 料は、例えばポリグリコール酸、ポリオルトエステル、またはポリアンヒドリド のような生体分解性の人工ポリマーであり、これらは制御された速度で加水分解 され、再吸収される。これらの材料は、分解性、操作性、サイズおよび形状につ いて最適な調節を提供するが、テフロンのような生体分解性でない′物質を含む 他め材料も用いられ得る。いくつかの実施態様では、細胞接着を促進するために 、これらの材料の上にはゼラチンまたは４苺ロースのような東二め材料が置かれ る。ポリマーマトリックスは、マトリックスが移植されて血管新生が起こるまで 細胞の生存と生育を維持するために、接着のための適当な部位と、細胞培養から の栄養分の適当な拡散との両者が与えられるような形状をしていなければならな い。器官の構築のために好ましい構造物は、大きな表面積を有し、その結果栄養 分、廃棄物、およびガスの比較的浅い濃度勾配が得られて、均一な細胞生育およ び増殖が生じる、ポリマーファイバーから形成された繊維性の三次元構造物であ る。

米国特許出願第０６／９３３，０１８号および米国特許出願第０７／１２３．５ ７９号は、肝細胞および腸および膵臓から単離された細胞の培養および移植の成 功と、それに続いて、生理活性分子の産生および分泌を含め正常の機能が伴うこ とのい（つかの例を開示する。このような分子の例には、下垂体細胞からの成長 ホルモン、膵臓細胞からのインシュリンおよびグリコーゲン、および肝臓細胞か らの凝固因子が含まれる。しかし、これらの出願に記載されるように、異なる型 の、機能を発揮する「器官」が必要であり、そのうちの一つは主に構造上の機能 を提供する。これらの出願に有用な細胞の型の例には、軟骨および骨前駆細胞が 含まれる。

関節炎または外傷のような病気により生じる軟骨の損傷は、体の奇形および衰弱 の主な原因となる。今日の医学では、軟骨の損失のための主要な治、療法は、美 容上の再建のためのシリコン、または関節リラインメントのための合金のような −ｉ物による置き換えである。補綴物の載置には、元の軟骨が下の組織および骨 の無視できないほどの損失と共に、異物の刺激性の赫在が伴う。他に永久的な異 物に褌う長期間にわたる問題には、感染、侵食および不安定性が含まれる。

真正に生体適合性で機能性の補綴物が存在しないことは、熱傷、あるいは自動車 事故または戦争のような外傷により鼻または耳を損失した人に対して、徹底的で 悲惨な影響を与える。このような患者に対して外科医が行える最良の方策は、下 肢の一部から一片の軟骨を、必要な輪郭に近付けて切り取り、それを鼻または耳 が損失した部分の皮膚ポケット内に挿入することである。

以前には、骨は、実際の滅菌された骨または骨粉、あるいは骨細胞を植え付けた 多孔性手術用スチールの断片を用いて、次にこれを移植することにより置換され ていた。骨粉および水和コラーゲン格子を用いた方法の例は、Ｂａｌ　ｌの米国 特許第４．４８５，０９７号である。細胞を植え付けた多孔性金属補綴物の移植 の例は、Ｍｅａｒｓの米国特許第４．５５３．２７２号である。これらの移植の 成功は、一部には細胞支持体の非分解性の性質のために、限定されていた。骨表 面を覆う軟骨の置換には、いままで実際、はとんどなにも用いられなかった。現 時点では、関節内で軟骨がすり減りまたは損傷された場合、１９８９年１月２６ 日に公開された国際特許出願公開第ＷＯ３９１００４１３号が実際に、グリコサ ミノグリカン補綴半月を膝に移植して、隣接する組織内に成長させることを記載 してはいるが、軟骨を置換する方法はない。残存する細胞の増殖と修復を刺激す るために幾つかの調製物が試みられているが、はとんどの場合、ｆｉｌｌ（７） 修復は外科手術により行われる。軟骨の退化する疾病にかかっている患者は、鎮 痛または消炎作用を有する薬剤か、または症状を軽減するためにヒアルロン酸に 頼ることしかできない。

今日まで、自己または同種異系軟骨のどちらからも、新しい軟骨の成長は、はと んど成功していない。Ｊ、　Ｍ、　Ｗｏｚｎｅｙう、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４２ ．１５２８−１５３４　（１９８８年１２月１６日）の報告するように、最近、 組換型の骨形態形成タンパク質の移植により、インビボでの顕微鏡で見える小島 の軟骨形成が、組織学的に実証された。Ｊ、　Ｕｐｔｏｎ、　Ｐｌａｓｔｉｃ　 ａｎｄ　Ｒｅｃｏｎｓｔ　ｕｃｔｉｖｅ　Ｓｕｒ　ｓｒ、　ａｌｌ（２）、　１ ６６−１７４　（１９８１年８月）に記載のように、フリーの自己移植片である 軟骨膜組織弁を用いた新しい軟骨の形成においては、限定された成功が達成され た。しかし、細胞培養物からインビボでの軟骨成長を成功させた報告はまだない 。

従って、本発明の目的は、細胞生育および軟骨移植のための一時的な足場として の人工マトリックスを、設計、構築および使用するための方法および手段を提供 することである。

本発明の目的はさらに、軟骨構造物の支持体としてインビトロおよびインビボの 両方での細胞増殖のために渭いられる、生体分解性の無毒なマトリックスを提供 することである。

本発明の目的はさらに、関節および表面どうしが接触する他の部位のガラス軟骨 を置換す条ため、並びに形成および再形成外科手術のための弾性軟骨を置換する ために、インビトロとインビボの両方での細胞の生育に使用され得る、生体分解 性で無毒なマトリックスを提供することである。

本発明の池の目的は、その中で細胞が、その正常の形態とその細胞により体内で 通常産生される生理活性分子を分泌する細胞機能とを維持する、インビトロの系 を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、生体分解性の無毒のマトリックスとともに移植され た軟骨細胞から、新たに骨を成長させる方法および手段を提供することである。

及豆立！１ 軟骨の構造物および表面を成長させ移植するための、方法および人工マトリック ス、ならびに軟骨細胞により製造される生理活性分子の産生が開示されている。

さらに、生体分解性マトリックス上に移植された軟骨細胞から、新たな骨を発育 させるための方法およびマトリ・１クスが開示されている。

好ましい実施態様では、軟骨細胞は生体分解性ポリマー、非分解性物質またはそ れらの組合せから形成される繊維状マトリックス上で軟骨細胞を培養して増殖さ せる。細胞は、細胞がインビボで生存し、増殖するのに適当な細胞量と密度にな るまで、インビトロで培養し得、または血管形成阻害因子し得る。あるいは、移 植のための適当な細胞数が利用可能な場合、これらの細胞をマトリックスに付着 させてインビトロでの増殖無しに直接移植し得る。ポリマーのマトリックスの利 点の一つは、最終製品を患者自身の耳または鼻に非常に似せるように、これらを 個体に基づく所望の形に鋳造または成型することができることである。一方、柔 軟な生体分解性マトリックスもまた使用され得る。これらは例えば関節に移植時 に変形可能であり、続いてインビボでの細胞生育および増殖を介して再成形され 得る。

１［ｉリライニングのためのガラス軟骨の成長、軟骨構造物の形成または再構築 置換のための弾性軟骨の成長、および大きな骨の欠損の修復を示す実施例を記載 する。

区１ユ１星ユｌ豆 図１ａおよび１ｂは、軟骨細胞を植え付けた生体分解性マトリックスを移植され た（図１ａは移植の前後）；および５から６週間生育させた後の皮膚の下の軟骨 プレートを示す（図１ｂ）、ヌードマウスの頭部の写真である。これらは、顔の 輪郭に添ったプレートの構築を示している。

図２は、ファイバーに植え付けて３時間後の、２つのポリマー繊維に接着したウ シ軟骨細胞の位相差顕微鏡写真である。

図３は、培養１０日後の軟骨細胞をヘマトキシリンおよびエオシン染色したもの である。

図４ａおよび図４ｂは、培１１２１６ｒ後の、ポリ７−ファイバーに接着した軟 骨細胞の位相差顕微鏡像である。図４ａは４ｘ＠率である。図４ｂは２０×倍率 である。

図５は、屈曲させてウシ軟骨細胞を植え付けたポリグラフチン９１Ｇフアイバー を、ヌードマウス中で８．１８．２８．４９および８１日培養後の顕微鏡写真で ある。

図６は、移植後８ミロの、矢印の所に小さな軟骨小島を示す、ヘマトキシリンお よびエオシン染色された軟骨細胞の４×拡大写真である。

Ｉ！Ｉ７は、図６の軟骨小島の２０Ｘ写真である。

図８は、移植後２８ａ目の、ポリマーマトリックス上のヘマトキシリンおよびエ オシン染色した軟骨細胞の２０ｘ写真であり、ポリマーが周囲の組織に吸収され たことを示している。

図９８および９ｂは、動物に移植後８１ａ目の、ヘマトキシリンおよびエオシン 染色した軟骨細胞の写真である。図９ａは２０×、図９ｂは４×である。

図１０ａおよび１０１）は、ウサギ膝関節内膜の構築を示す写真である二図１０ ａは、軟骨細胞を植え付けない手術用メツシュを上に載せて、軟骨細胞を植え付 けたポリグリコール酸の手術用メ・ノシュを縫合することを示し：図１０ｂは、 ５週間後の軟骨プレートの形成を示す。

良悪！ＪコＩｌ礼五 以下にさらに詳細に説明するように、軟骨細胞、繊維芽細胞、および／または骨 前駆細胞を単離して分散させ、次に、それに続（軟骨構造物の形成のためのイン ビボでの移植のために、インビトロで生体適合性マトリックスに混合する。一つ の実施態様において、細胞が表面に接着するまで細胞をマトリックスとともにイ ンキ１ベートし、次に、手術して準備した受容者の部位にマトリックスを移植す る。部位を準備する方法は、再構築及び形成外科分野の当業者の知るところであ る。他の実施態様においては、細胞をマトリックスに混合し、細胞が接着して所 望の量に増殖するまでインキ１ベートし、次に移植する。　マトリックスは、生 体分解性の、非生体分解性の、または生体分解性と非生体分解性の組み合わせの 材料である。これらの材料は、インビトａかインビボかにかかわらず、適切な栄 養分と廃棄物の拡散およびガス交換が可能であるため高密度の細胞が生じるよう に形作られた後再成形され宿主組織に組み込まれる。軟骨細胞、骨前駆細胞およ び繊維芽細胞等を含む、軟骨前駆細胞は、栄養分とガス交換についての要求性が 、肝細胞のようなある種の型の細胞とは存意に相違する。その結果、マトリック スは移植肝細胞に用いられる構造よりも緊密な構造に形作られ得る。

軟骨はマトリックス中に埋められた細胞からなる、特別な型の密な結合組織であ る。軟骨にはいくつかの種類が存在する。コラーゲン繊維を含有する均質なマト リックスを有する透明軟骨は、関節軟骨、肋骨軟骨、鼻中隔、喉頭および気管に 見いだされる。関節軟骨は、骨の関節表面を覆うガラス軟骨である。肋骨軟骨は 真性肋骨と胸骨とを結合する。黄色軟骨は軟ｔｍ胞を支持する弾性繊維のネット ワークであり、主に喉頭蓋、外耳、および耳萱に見いだされる。以下に述べるよ うに、移植軟骨は、主に移植部位およびマトリックスに植え付けられた軟骨細胞 の型に依存した、１つまたはそれ以上の型の軟骨から形成され得る。

好マしい方法では、ポリマーのファイバーは軟骨細胞を含有する培養培地中に置 かれ、ここで軟骨細胞はファイ／ｓｌ−に多層になって接着し、その正常な円形 形状を維持している。

この円形形状は、軟骨細胞にとって、正常な機能の維持、および軟骨マトリック スおよび血管新生阻害因子のような他の生理活性分子の分泌に必須であるようで ある。この方法は、接着した軟骨細胞複合物をかき乱すことなく、ポリマーと細 胞からなる足場を動物に移植することをも可能にする。大きな表面積を有し、正 常に機能する軟骨細胞を高密度で含有するこの複合物の動物への移植は、細胞に 拡散により適切に栄養分を供給し、そして軟骨形成を伴う機能し得る軟骨細胞の 定着の成功の後、宿主組織に再成形され組み込まれることを可能にする。

下記の実施例は、形態学的および機能的に正常に見え、そして細胞ポリマー足場 を動物に移植してポリマーの吸収に従い新しい組織等個物の形成される定着の成 功することを、可能にするのに充分な細胞密度にまで増殖する軟骨細胞を、生体 分解性のポリマーのファイバー上で培養して生育させることが可能であることを 示す。

実施例の一つにおいては、この組織の可視的および組織学的特性は、それが正常 のヒト胎児軟骨に非常に似たガラス軟骨（１型コラーゲンよりもむしろ■型コラ ーゲンが存在することに基づく）であることを示す。他の実施例では、弾性軟骨 の生検により得られる軟骨細胞はポリマー構造物に接着し、移植された複合物を ほぼ覆った。さらに他の実施例では、骨の欠損が、ポリマー構造に接着した軟骨 細胞をその欠失に移植して、これを骨に成長させることにより修復される。これ らの実施例は、ポリマーのファイバーの足場は必須であり、遊離の軟骨細胞を注 入しても、また軟骨細胞が接着していないポリマーファイバーを移植しても軟骨 形成が起こらないことを示す。この軟骨形成の発達は、減じられた血管新生およ び繊維組織の形成を伴う。このことは多分、軟骨細胞をインビトロで繊維上で培 養した血清を測定することにより示されているように、新たに形成された軟骨に よる血管形成阻害因子の産生を反映する。

軟骨細胞はまず、当業者に公知の技術を用いて単離され、培養される。いくつか の型の細胞とは対照的に、軟骨細胞は適当なマトリックス上に直接植え付けて、 最初にインビトロで細胞を増殖することな（移植され得る。移植のために充分な 細胞数が入手可能でない場合は、細胞をまずインビトロでマトリックス上で培養 する。細胞が生育してマトリックスを覆い始めたら、これを接着、生育および機 能するのに適当な患者の部位に移植する。生体分解性のポリマーマトリックスノ 利点の一つは、血管形成および他の生理活性化合物が直接組み入れられることに より、インビボにおいてマトリ、２クスが分解するに従いこれらの化合物が徐々 に遊離されることである。細胞−ポリマー構造物に血管が形成されて構造物が分 解するのにしたがって、細胞はその生来の特徴に従０分化する。

好ましい実施態様においては、マトリックスはポリアンヒドリド、ポリオルトエ ステル、ポリグリコール酸およびそれらの共重合体、混合物および組合せのよう な、生体吸収性、または生体分解性のポリマーから形成される。コラーゲンおよ び架橋されたグリコサミノグリカンもまた支持物質として用いられ得る。いくつ かの場合には、テフロン、ナイロン、ポリエステル、またはエチレンビニルアセ テートのような非生体分解性の材料もまた、単独あるいは生体分解性の材料と組 み合わせて用いられ得る。非生体分解性の材料は、表面どうしの接触する関節の ライニングの置換には好ましくないが、耳゛および鼻の形成のような幾つかの場 合には、構造上の利点を有する０ ポリ゛マーへの細胞の接着は基底膜成分、アガー、アガロース、ゼラ゛′チン、 アラビアゴム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカ ン、接着ペプチド、これらの混合物、および、細胞培養分野の当業者の知るとこ ろの、生物学的マトリックス分子に類似する特性を有する他の物質ノヨウな物質 でポリマーをコートすること１こより促進される。

全てのポリマーは、細胞を適度（二支持し、次（為でそれを成長および増殖をさ せるに必要な、機械的および生化学的／ｆラメーターを満足させなければならな ０゜栄養素、成長因子、分。

化あるいは脱分化誘導物質、分泌成生物、イムノモジュレータ−１炎症抑制物質 、退行因子（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ）、リンパ性ネットワーク あるいは神経線維の内成長を促進あるいは可能にする生物学的活性物質、ヒアル ロン酸、および薬物を含む因子がマトリックスに導入あるいはマトリックスとと もに与えられ得る。同様に、接着ペプチドＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の ようなペプチドを含有するポリマーがマトリックス形成に使用するために合成さ れ得る。

ここでは、好まれるポリマーは吸収可能な合成縫合糸の材料として開発された、 グリコリドとラクチドの比が９０　：　１０のコポリマーであり、Ｖｉｃｒｙｌ Ｒ吸収性縫合糸束（Ｅｔｈｉｃｏｎ、　Ｉｎｃ、。

Ｓｏｍｅｒｖｆｌｌｅ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）として製造されているポリグ ラフチン（ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ）　９１０である（Ｃｒａｉｇ　Ｐ、Ｈ，、 ｆｉｌｌｉａｍｓ　Ｊ、Ａ、、　Ｄａｖｉｓ　Ｋ、Ｗ、ら：Ａ　Ｂｆｏｌｏｇｆ ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ９１０　ａｎｄ 　Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ　Ａｃ１ｄ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ａｂｓｏｒｂａ ｂｌｅ　５ｕｔｕｒｅｓ、　Ｓｕｒｇ、　１４１；　１０１０．　（１９７５） ）。ポリグリコール酸からなる、市販の手術用メツシュ、Ｄｅｘｏｎ”は新しい 関節裏装の構築への使用に好ましい。

ポリマーはインストロンテスター（Ｉｎｓｔｒｏｎ　ｔｅｓｔｅｒ）を用いて測 る引張力、ゲル浸透クロマトグラフィーによるポリマーの分子量（ａｐｃ＞、示 差走査熱量計（ＤＳＣ）により測定されるガラスに転移する温度および赤外線分 光（ＩＲ）により調べる結合構造のような機械的特質；エイムス試験を含む初期 スクリーニングテストおよび催奇形性試験および、免疫原性、炎症、放出および 分解を調査するための動物への移植試験により調べられる毒性に関して特徴付け られ得る。インビトロでの細胞の接着および生存度は、走査電子顕微鏡、組織学 および放射性同位元素による量的査定により評価され得る。

ファイバー（縫合糸あるいは縫製されていないメ、ｙシュ）は製造者により提示 されたように使用され得る。別の形態は以下の方法の１つを用いて組立て得る； 溶剤注型：塩化メチレンのような適当な溶媒のポリマー溶液をファイバー型のレ リーフ構造上に注型する。溶媒の蒸発後、薄い膜が得られる。

圧縮成形：ポリマーを適当な型に圧縮（３０，０ＯＯｐｓｉ）する。

フィラメントの伸線加工：融解ポリマーからフィラメントを伸線加工する。

網目形成：網目はファイバーを圧縮してフェルト様の材質にすることにより形成 される。

現時点では、球形、波形、平坦、星形、単束あるいは他のファイバーとからませ た、ファイバーで形成される網目様構造が好ましい。ファイバーの使用は、目然 界で容量の増加に比例させることにより表面積を増加させるという問題を解決し てきたのと同じ原則に基づく。全ての多細胞生物は、繰り返し分岐する構造を使 用している。分岐する系は器官間のコミユニケージ菖ンネットワークおよび各器 官の機能的単位に代表される。このタイプの立体構造に細胞を撒いたり移植する ことは多数の細胞がその各々が宿主環境にさらされるかたちで移植されることを 可能にし、血管新生が達成される一方、栄養分と排泄物の目出な交換が可能とな る。

重合マトリックスは、所望の最終形態、構造、および機能によって柔軟あるいは 硬固に作製される。鼻あるいは耳を作製するためには、フェルト様あるいは固体 の材質のファイバーあるいはシートを軟骨板をまねて切断する。縫製された材料 、縫製されていない材料、あるいは編まれた材料のいずれも使用され得る。ベロ ア（ｖｅｌｏｕｒ）のような材料は、適当な縫製された材料の１例である。ファ イ／＜−は、より安定な構造を形成するために、溶媒の添加あるいは溶解によっ て互いに融合され得る。その他に、ファイノイーのマ・７トに水を高圧で噴射す ることによりファイバーをからめて、より硬固な構造を形成し得る。関節の表面 を濃酸するには、より柔軟なファイバーのマットを関節の全表面に合わせて切断 し、次いでそれを移植中に必要なように、手術によって準備された受容する関節 にあてる。好ましい実施態様では、関節に存在する軟骨を除去し、軟骨細胞を撒 いたメツシュを用いて関節の輪郭に沿わせ、次いで軟骨細胞を撒いていないメツ シュを撒かれたメツシュの上に縫合して、細胞が増殖し、関節を作り直し、その 結果できた関節構造が周囲の宿主組織および骨に統合されるまで、軟骨細胞を守 り、保護する。ファイノイーのマトリックスを使用することの明かな利点は、移 植時に構造を新しい形にし、再配置することが簡単なことである。

スポンジ様構造もまた、使用され得る。その構造は、十分な量の細胞が接着して 生存可能で機能的な移植組織を形成するのに適する表面を提供する、構造の表面 でつながった、空隙を有する空洞状スポンジでなければならない。

本発明の利点は、同様の技術を使用して、鼻、耳および関節の他の成分を骨およ び神経の前駆細胞を用いて構築し得ることである。例えば、内耳の骨の形のマト リックスは、ポリマーを鋳造して適当なサイズおよび立体構造の空洞のある形を 形成し、次いでそれに骨前駆細胞を撒き、必要に応じてインビトロで培養し、次 いで耳道に移植することにより形成され得る。エウスタキオ管の主要な部分およ び内耳は軟骨からなる。前記技術は、鼓膜あるいは移植された軟骨を被覆する皮 膚の製造にも同等に適用され得る。神経細胞もまた、再構築された耳の内部ある いは近隣に移植され得る。

当業者の知るところのマトリックス材料に関する方法を用いて、マトリックスを 細胞と混合する前に滅菌する。生体分解性のポリマーのような材料は、マド１ル ツクスを細胞と混合する前にエチレンオキサイドで滅菌し、脱気して注意深（取 り除く。テフロンあるいはナイロンのような材料はオートクレーブで滅菌され得 る。

細胞は、宿主、血縁にあたる提供者あるいは確立された細胞株に虫来し得る。１ つ、あるいはそれ以上の細胞株の接着のために単一のマトリックスを用いる本方 法の１変法では、最初の細胞接着および発育が各集団、例えば骨前駆細胞および 軟骨細胞の集団に対して、マトリ・１クス内で分かれて起こるように、足場を構 築する。

他では、種々のタイプの細胞の特異的な位置での接着を至適にするために、異な る材料から単一も足場が形成され得る。

接着は細胞の種類とマトリックスの組成物の両方の機能による。生体検査で得ら れる軟骨細胞は弾性軟骨または硝子軟骨で有り得る。

これらの細胞−マトリックス構造は、インビボでの移植のみではなく、Ｂｕｎｎ ｉｎｇら、　Ｗｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　１３９．７５−８０（１９８４ ）およびＲｕｇｈｌｅｙら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１６９．７２１−７２ ４（１９７Ｂ）により報告されているプロテイナーゼインヒビター、およびＬａ ｎｇｅｒら、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９１．７Ｏ−７２（１９７６）に報告されて いるコラゲナーゼインヒビターのような生物活性分子の産生にも有用である。

以下に示す限定を意図しない実施例は、細胞培養および移植で生物侵食性の人工 ポリマーに調製された細胞の実際の旬着、およびこのポリマー−細胞足場の動物 への植え付けを証明する。実施例はさらに、マトリックスに接着した細胞か、正 常に機能し血管新生抑制因子のような生物活性分子全分泌し、従って、インビト ロでのそのような分子の主縦が可能であることを証明する。

図１ａおよび１ｂは、顔の輪郭板（ｃｏｎｔｏｕｒ　ｐｌａｔｅ）のインヒポで の生成の本発明方法を示す。軟骨細胞を軟骨から単離し、以下に述べる技術と同 様の標準的技術を用いて分散させた。

外科用メツシュ（Ｄｅｘｏｎ”″、ファイノゞ−性ボリグリコール酸メッシ、− ）に軟骨細胞を撒き、軟骨細胞が接着するまでインキュベートした。次いで、図 １ａに示すように、マトリックスをヌードマウスの頭部に移植した。図１ｂに示 すように、５から６週間後には、軟骨坂が形成されていた。

１五見」」衝動λ尺並 関節の軟骨を、当日早朝に屠殺された２週齢の分生の肩から採取した。肩をポビ ドン−ヨード１０％溶液（Ｂｅｔａｄｉｎｅ、　Ｐｕｒｄｕｅ　Ｆｒｅｄｅｒｉ ｅｋ　Ｃｏ、、Ｎｏｒｗａｌｋ、　Ｃｏｒｉｎ、）で洗浄し、次イテ無菌条件下 で、付着している筋肉をその下にある骨から切除して関節表面を露出させる。次 いで、関節の結合部表面の軟骨を＃１０のメス（Ｂａｒｄ−Ｐａｒｋｅｒ、　Ｒ ｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、　Ｎｅｗ　ｊｅｒｓｅｙ）を用いて下部の骨から切除する 。軟骨を１辺５＋ｕ＋＋以下の小片に切り、電解質を含有するリン酸緩衝生理的 食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、中性ｐ旧こ調整した。次に、軟骨をクロストリ ジウムコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　ＣＬＳ　Ｉｆ　１４０Ｕ／ａ＋ ｇ）の０．２％溶液中で、３７℃でインキュベートし、にｌａｇｓｂｒｕｎ　（ Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙ＋＋ｏｌｏｇｙ、　Ｖａｔ、　ＶＩＩＩ）に記載 のように、−晩振盪した。

次いで、この懸濁液を１５３μｇのナイロンシーブ（Ｔｅｔｋｏ、　Ｅｌｍｆｏ ｒｄ、　Ｎ、Ｙ、　１０５２３＞で濾過した。次いで、遠心して細胞を懸濁液か ら集め、ＰＢＳ溶液で２回洗浄し、血球計算板で数えた。

溶液をＩｎＯｒｐｍで遠心し、細胞＠濁層の上の上澄みを、溶液の軟骨細胞の濃 度が５　Ｘ　１．０７細胞／ｃｅになるまでマイクロピペットによる吸引で除去 した。

次ぎに、ポリグラフチン３７０およびステリン酸カルシウム（”Ｑ−Ｖｉｃｒｙ ｌ”　５ｕｔｕｒｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ、　Ｅｔｈｉｅｏｎ、Ｉｎｃ、、　Ｓｏ ｍｅｒｖｉｌｌｅ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）でコートされた、グリコリドとラ クチドの９０−１０コポリマーであるポリグラフチン９１０の編まれた糸を、約 １７ｍ＋ｍの長さに切った。片方の端をほどいて、直径１４ミクロンの複数のフ ァイバーを露出した。これに続く生検中にポリマーの位置を示すためにもう一方 の端に結び目を作った。２つのポリマーファイバーを各々、３５ｍｍのサイズの ２６フアルコン組織培養皿に置いた。２００μＬの上記溶液を２つのファイバー の各々の培養プレートの１５個のウェルに加えた。従って３０個のファイバーを 軟骨細胞を含有する溶液に露出させ（試験用）、２２個のポリマーは軟骨細胞に 露出させない（対照〉。次ぎに、へムｌ’−１２培ｉｌＬ液、ＬＱ％ウシ胎仔血 清、Ｌ−グｋｌ　ミン（２９２μｇ／ｅｅ）、ペニシリン（ＬＯＯＵ／ｅｃ）、 ストレプトマイシン（１００μｇ／ｅｅ）およびアスコルビン酸く５μｇ／ｅｃ ）を含有する２ｅｅの溶液を各ウェルに加えた。３７℃で３．６．１１．１８． ２１、および２８日間インキュベート後に、各グループから６個のファイバーに ついて、位相差顕微鏡下で軟骨細胞の存在および形態について調べ、次いで、ヘ マトキシリン−エオシン染色および、軟骨のムコポリサッカライドの強酸性の硫 酸塩である、コンドロイチン硫酸を染色するためのアルデヒド−アルシアンツク シン染色を用いて組織学的に評価した。

図２は、ファイバーに細胞を撒いた後３時間の２つのポリマーファイバーに接着 したウシ軟骨細胞の位相差顕微鏡写真である。軟骨細胞が丸く、正常な形態であ ることに注目する・−とが重要である。この形態は、軟骨成分の分泌のために必 要である。図３は、培養１０日後にヘマトキシリンおよびエオシンで染色した細 胞の写真である。図４３および４ｂは、培養２４日後のポリマーファイバーに接 着している細胞の位相差顕微鏡写真である。軟骨細胞が互いにファイバーを折り 曲げて他の軟骨細胞に接触しているように観察される。図４３は、ポリマーファ イバー間の空間を埋める軟骨細胞の密度が、非常に高いことを示す４倍の倍率の 写真である。図４ｂは、軟骨細胞がポリマーファイバーの端まで来ると、ある程 度の密度になるまで増殖して結節様のものを形成するようであることを示す、２ ０倍の写真である。培養２４日後、これらの細胞の間のマトリックスはへマド牛 シ（Ｊンーエオシン染色で塩基性染色され、軟骨の存在を証明している。細胞は 培養２４日後には１．０日後よりさらに互いに離れでいる。培養４週間後、位相 差顕微鏡下で、１ミリマーフ７・イボ−間の間隙を架橋１−でいる軟骨・細胞が 見える。

残りの４０個の）ｒ４バ・−を（試験用２４個おＪ、び対照用１６個）４から５ 週齢の４０匹の雄のヌードマウス（胸腺欠損ＮＣｒ／ｎｕｄｅ／Ｓｄｅ、　Ｄｅ ｐｔ、　ｏｆ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ ｔｉｓ　ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）の首のつ け根中央の背中の皮下に外科的に移植した。これらの移植の３５例（試験用１９ 例および対照用１６例）を、ファイバーをインビトロで３日間インキュベートシ た後に行い、全て試験用である残りの５例の移植を、ファイバーを１０日間、イ ンビトロでインキュベートシタｌ、行った。移植されたマウス５匹（対照１匹、 １０日間インキュベートした軟骨細胞用１匹および３日間インキュベートした軟 骨細胞用３匹）を各々、次の期間後、即ち、８．１８．２８．４９及び８１日後 に殺した。次いで、周囲組織から移植片を簡単に分離する組織用ブレーンを用い て鋭く切断することにより、移植片を周囲組織から切除した。従って、標本は主 に移植された組織を含み、動物からの内因性組織は最小限であった。

各標本をホルマリンで固定し、重量を計り、それが置き換えた液体の容量を測定 してその容積を計算した。その重量および容積を時間と相関させ、座標にプロッ トした。全ての標本を肉眼的に、およびヘマトキシリン−エオシン染色と、軟骨 の主要組成物であるコンドロイチン硫酸の存在を知るためのアルデヒドーアルシ アンブクシン染色とによって組繊学的に評価した。

図５は、ウシ軟骨細胞を撒いたポリグラフチン９１０フアイバ、−のヌードマウ スで培養後、８．１１Ｂ、２８．４９および８１日口の叩微禮写真である。１図 ６は、矢印の位置に軟骨の小島を示す移植後８８目の、ヘマトキシリン−エオシ ン染色した細胞の４倍の写真である。、図７は、図６の軟骨の小島の２０倍の写 真である。

図８は、２８日後の移植片の２０倍の写真であり、ポリマーが周囲組織に吸収さ れていることを示す。図９１は、動物に移植後８１日目の２０倍の写真である。

図９ｂは、同移植片の４倍の写真であり、これは１０週齢の正常なヒト胎児軟骨 に非常に類似して見える。

対照実験では、１０匹のマウスの同じ部位の皮下に、５ｘｌＯ’個の軟骨細胞を 含有する２００μＬの懸濁液を細胞をポリマーに接着させないで注射した。５例 の軟骨細胞を含有する懸濁液はまず分生の肩から単離し、次にマウスに注射した 。同時に単離した軟骨細胞を含有する他の５例の懸濁液は注射前にインビトロで ３日間インキュベートした。これらのマウスは同じ期間後膜され、投与された部 分を、軟骨細胞あるいは軟骨を証明するため同じ方法で組織学的に評価した。

結果は軟骨細胞が生物分解性合成ポリマーファイバーに細胞培養中で接着し、細 胞−ポリマー足場が動物内に移植され得るに十分な細胞密度になるまで増殖して 、定着と軟骨形成とが成功することを証明する。ウシ軟骨細胞の存在する培養液 中でインキュベートされたポリグラフチン９１０のファイバーは、それに接着し た軟骨細胞を有し、２０匹のヌードマウスの背部皮下に外科的に移植された。対 照として、軟骨細胞を含まない培養液中でインキュベートされた１６組のファイ バーを同じ方法で１６匹のヌードマウスに移植し、１０匹のマウスに５ｘｌＯ’ 個の軟骨細胞を含む０．２ｃｃの培養液を同じ部位に注射した。

３群のマウスを８、工８．２８．４９および８１日後に殺し、移植片を肉眼的に および組織学的に評価した。２０例中１８例の、軟骨細胞をインビトロで接着さ せた移植片で、本実験の期間中を通して発達する、正常なヒト胎児軟骨と見かけ 上区別できない軟骨の組織学的証拠があった。さらに、本実験期間中、２７日目 までにポリマーファイバーは溶解し始め、ヘマト牛シリンーエオシン染色および アルデヒド−アルシアンツクシン染色によると、軟骨は８日目の線維組織および 血管新生の存在する軟骨は孤立した軟骨小島から、均一な軟骨の塊にまで、組織 学的に発達した。軽い炎症を伴う、移植片への血管新生が最初に見られるが、時 間がたうて、軟骨マトリックスが敷かれて、正常な軟骨の成熟に見られるように 軟骨細胞間の距離が増すとともに新しい血管は退行した。多型核白血球数および 巨細胞数の減少により証明される炎症性反応が減少するのに相関してポリマーが 消失した。８１日目までに、炎症性反応あるいはポリマーの残留は殆ど証明でき なくなった。

ヘマトキシリン−エオシン染色による判定で、対照ポリマー移植片内には軟骨の 存在をを証明するものはなかった。多型核白血球、巨細胞および線維芽細胞を伴 う軽い炎症反応が２８日目まで認められ、その後は移植片を証明するものはなか った。軟骨形成はまた、軟骨細胞懸濁液を投与したすべての部位で証明されなか った。

結論として、軟骨細胞は容易にポリマーファイバーに接着する。インビトロで軟 骨細胞とともにインキュベートされた６つの試験用ファイバーでは顕微鏡下で、 複数の細胞層が、静かに細胞のついたファイバーを攪拌してもファイバーから細 胞が遊離しないほど十分に接着しているのが見られた。細胞はその正常な丸い形 態を維持し、それらが増殖した培養液の分析は、これらの細胞が血管新生抑制因 子を産生じたことを証明した。ポリマーファイバーに接着した軟骨細胞数および 軟骨細胞層の数は、時間と共に進行的に増加するようであり、ファイバーの形態 を再成し、ファイバー間の小距離を架橋するようであった。軟骨細胞を入れずに インビトロでインキュベートした６つの対照ファイバーは、組織学的評価におい て軟骨細胞を証明するものはなにも示さなかった。インビトロでは、全てのポリ マーファイバー（対照および試験用）は２７日までに溶解し始めた。肉眼的およ びヘマト牛シリンーエオシン染色による組織学的試験において、対照の１６標本 のどれも軟骨の証拠を示さなかった。それとは対照的に、試験群の２０標本中１ ８標本は肉眼的に、およびヘマト牛シリンーエオシン染色による組織学的に軟骨 形成の証拠を示した。８日目に摘出された移植片の組織的検査は、ファイバーが 、多型核白血球および巨細胞の浸潤からなる、軽い炎症反応の証拠とともに孤立 した軟骨の「巣」を有する線維性の組織に埋められていることを示した。１８日 目までおよび２８日目までの期間中、これらの軟骨島は成長し、合併して大きな 軟骨の均一な塊になった。４９および８１日目の移植片への血管新生の証拠はな かった。また、多型核白血球および巨細胞の数の減少を特徴とする、時間に伴う 炎症反応の証拠の減少が見られた。

２８日後にはポリマーファイバーの証拠はほとんどなかった。

この軟骨のサイズの増加は以前見られた線維性組織の消費によるようであり、少 なくとも一時的に、先に見られた血管新生および軽い炎症反応からの回復に伴っ ている。またこれは、生体分解性ポリマーファイバーの吸収と伴っていた。時間 を経るについて、ポリマーの痕跡がほとんどない軟骨のみになり、標本が正常な ヒト胎児軟骨に組織学的に非常に類似する、均一な軟骨の塊になるまで、ポリマ ーファイバーは進行的に軟骨に置き換えられた。両群で、重量と容積との間に強 い正の相関があり、対照群の移植片では、最初のサイズの増加の後、時間ととも に重量および容量が急速に減少した。試験群（軟骨細胞が接着したポリマーの移 植群）の重量および容積は、最初、対照群にみられた増加と平行したが、その後 、４９日目までに安定したサイズにとどまった。２番目の対照群での遊離細胞の 懸濁液の注射においては、投与したどの部位にも軟骨形成の証拠はなかった。

Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギの遠位大腿骨を新しい軟骨でリラインした。

図１０ａに示すように、軟骨細胞を植え付けた、培養物中の外科用Ｄｅｘｏｎ門 メツシュを、手術して準備したウサギの膝関節内に移植し、次に軟骨細胞を植え 付けないメツシュをその上に載せた。膝は、全ての存在する軟骨を磨砕または切 除することにより準備した。上載するメプシニは、軟骨細胞が増殖（、て、図１ ０１）に示すように移植後５週間口に新たなライニングが形成されるまで軟骨細 胞の生存を保証し保護するために、植え付けを行つたメツシュ上に縫合する。

軟骨は、肉眼および組織学の両方において、正常の軟骨−前項界面に一致する様 式で、下にある骨に付着しているように見える。アビビービオチン−パーオキシ ダーゼ複合体法を用いて、免疫化学的に新たに成長した軟骨を分析すると、■型 コラーゲンの存在と、Ｉ型コラーゲンの非存在とが示された。このことは、Ｉ型 コラーゲンが正常のガラス軟骨に存在しない一方、■型フラーゲンがほとんど独 占的にガラス軟骨に存在することが知られている点で意味深い。

ガラス関節軟骨の欠損を最適に修復するためには、多数の細胞の移植が必要であ る。計数は、ガラス関節軟骨の単位量当りの軟骨細胞の濃度、および既知のサイ ズの欠損を作った場合に除去された軟骨中に存在する軟骨細胞の実際の数に基づ く。必要に応じ、生検により得られた軟骨細胞をインビトロで増殖させた後、移 植後に最適な数の細胞をポリマーに接着させる。

ｍ：　を植え・けたマトリックスからの、インビボでの正常な弾性　の ヒト弾性軟骨の生検により得られた軟骨細胞を、インビトロでポリマーファイバ ーに接着させ、そして移植した。組織学的に正常な弾性軟骨が、移植された複合 物に近い寸法で成長した。

実Ｊ１１１：　（ＤＸ　ＧＤｆｉｔ６ｆ−ｈ（７）？　）−ＩＪ　−ｔ　ｊ　ｘ ｆＯ（１１４至笠１２、それに　く「Ｊ腫 Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギの脛骨を骨の半径の約２倍、欠損させた。欠 損部位の骨膜を除去した。ポリマーメツシュに上記のように軟骨細胞を植え付け 、欠損部位に移植した。組織学的および化学的分析を用いて、移植物が骨を形成 したことを確認できる。同様のモデルを用いた、細胞を移植物に植え付けないコ ントロールでは、欠損は骨よりもむしろ繊維性の組織で満たされる。

本発明を特定の実施態様に関連して述べてきたが、表面積および周囲の栄養含有 環境にさらされることを最適化されたマトリックス上に軟骨細胞を培養すること により軟骨移植物を構築する方法および手段の、様々な変化と改変は、当業者に は明かである。このような改変と様々な変化とは、添付の請求の範囲の範囲内に 入ることが意図される。

Ｆ［Ｇ、ｌＢ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、４Ａ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９Ａ ＦＩＧ、９Ｂ Ｆ［Ｇ、ｌ０Ａ ＦＩＧ、！ＯＢ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年１０月１７日

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．栄養環境中の生体適合性マトリックスおよび該マトリックスに接着した軟骨 細胞を含む、軟骨構造物を成長させるための系であって、該マトリックスが血管 新生無しに、接着細胞の栄養分および廃棄物の自由な交換が提供されるように構 築されている、系。
2. ２．前記マトリックスが、加水分解により分解される物質群、および酵素的に分 解される物質群から選択される、生体分解性材料から形成されている、請求項１ に記載の系。
3. ３．前記材料が、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、 ポリ乳酸、コラーゲン、およびこれらの共重合体、混合物および組合せからなる 群から選択される、請求項２に記載の系。
4. ４．前記材料が、テフロン、ナイロン、エチレンビニル酢酸、ポリエステル類お よびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の系。
5. ５．前記マトリックスが、生体分解性と非分解性材料との組合せから形成されて いる、請求項１に記載の系。
6. ６．前記マトリックス上に、基底膜成分、アガー、アガロース、ゼラチン、アラ ビアゴム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、グリコサ ミノグリカン、接着ペプチドおよびこれらの混合物からなる群から選択されるコ ーテイングをさらに含む、請求項１に記載の系。
7. ７．骨、皮膚および神経前駆細胞からなる群から選択される細胞をさらに含む、 請求項１に記載の系。
8. ８．前記マトリックスが堅い構造物を形成する、請求項１に記載の系。
9. ９．前記マトリックスが、接着表面の形に従う柔軟な構造物を形成する、請求項 １に記載の系。
10. １０．前記マトリックスが、繊維または繊維メッシュから形成されている、請求 項１に記載の系。
11. １１．前記軟骨構造物によって生理活性分子が産生される、請求項１に記載の系 。
12. １２．前記生理活性分子が前記栄養環境中に分泌される、請求項１１に記載の系 。
13. １３．軟骨細胞に対する影響をもつ、前記栄養環境中の物質またはポリマーをさ らに含む、軟骨構造物を成長させるための請求項１に記載の系。
14. １４．軟骨細胞に分化することが可能な細胞をさらに含む、軟骨構造を成長させ るための請求項１に記載の系。
15. １５．軟骨細胞が軟骨マトリックスを形成した、軟骨構造物を成長させるための 請求項１に記載の系。
16. １６．栄養環境中の生体適合性マトリックスを供給する工程、および 該マトリックスに軟骨細胞を接着させて軟骨構造物を形成する工程 を包含する、軟骨構造物を製造するための方法。
17. １７．前記マトリックスが、加水分解により分解される物質群および酵素的に分 解される物質群からなる群から選択される、生体分解性材料から形成されている 、請求項１６に記載の方法。
18. １８．前記材料が、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸 、ポリラクト酸、コラーゲン、およびこれらの共重合体、混合物および組合せか らなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. １９．前記材料が、テフロン、ナイロン、エチレンビニルアセテート、ポリエス テル、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の方 法。
20. ２０．前記マトリックスが、生体分解性と非分解性材料との組合せから形成され ている、請求項１６に記載の方法。
21. ２１．マトリックスを、基底膜成分、アガー、アガロース、ゼラチン、アラビア ゴム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、グリコサミノ グリカン、およびこれらの混合物からなる群から選択される物質でコートする工 程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
22. ２２．骨、皮膚、および神経前駆細胞からなる群から選択される細胞を供給する 工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
23. ２３．前記マトリックスが堅い構造に形成される、請求項１６に記載の方法。
24. ２４．前記マトリックスが、接着表面の形に添う柔軟構造に形成される、請求項 １６に記載の方法。
25. ２５．前記栄養環境がインビボであって、前記マトリックスに細胞を接着させる 工程、およびインビトロでマトリックス上に細胞を最初に増殖させることなく、 該マトリックスに接着した細胞を動物に移植する工程をさらに包含する、請求項 １６に記載の方法。
26. ２６．前記細胞をマトリックスに接着させる工程、該マトリックス上の細胞をイ ンビトロで栄養培地中で増殖させる工程、次に該マトリックス上の細胞をインビ ボに移植する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
27. ２７．前記構造物を顔の付属物の一部として移植することをさらに包含する、請 求項１６に記載の方法。
28. ２８．前記構造物を関節表面に移植することをさらに包含する、請求項１６に記 載の方法。
29. ２９．生理活性分子が産生されるまで、インビトロにおいて前記マトリックス上 の細胞を栄養培地中で培養することをさらに包含する、生理活性分子を生産する ための請求項１６に記載の方法。
30. ３０．前記栄養培地から生理活性分子を抽出することをさら包含する、請求項２ ９に記載の方法。
31. ３１．前記マトリックス上の細胞から生理活性分子を抽出することをさらに包含 する、請求項２９に記載の方法。
32. ３２．栄養環境またはポリマー中に物質を供給する工程、および該物質が軟骨細 胞に対して影響するかどうかを決定する工程、をさらに包含する、請求項１６に 記載の方法。
33. ３３．軟骨細胞に対する前記物質の影響を特徴付けることをさらに包含する、請 求項１６に記載の方法。
34. ３４．前記軟骨細胞に分化する能力を有する細胞を提供する工程、および前記軟 骨細胞への分化を誘導する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
35. ３５．前記軟骨細胞が骨細胞に誘導される、請求項１９に記載の方法。
36. ３６．前記構造物が、炎症により損傷された軟骨を修復するために移植される、 請求項１６に記載の方法。
37. ３７．前記構造物が、外傷により損傷された軟骨を修復するために移植される、 請求項１６に記載の方法。
38. ３８．前記構造物が、加齢により損傷された軟骨を修復するために移植される、 請求項１６に記載の方法。
39. ３９．前記構造物が、軟骨に先天的に欠陥のある場合に該軟骨を修復するために 移植される、請求項１６に記載の方法。