JP6467493B2 - 軟骨再生材料及びその製造方法 - Google Patents
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Description
特許文献2から、II型コラーゲンが軟骨細胞の培養に有用であることは類推されるが、II型コラーゲンの関節内への移植は関節炎を誘発し(コラーゲン誘導性関節炎)、周辺の正常関節軟骨を傷害する原因となり得るため、II型コラーゲンを実際には使用することは好ましくない。また、特許文献2に記載されるようなバリア層を設けた場合でも、実際には、炎症の浸潤や血管浸潤を原因とする軟骨の骨化や繊維性軟組織浸潤を抑制することはできない。
本発明は、繊維性軟組織浸潤を抑制し、良好な軟骨再生をもたらす軟骨再生材料を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、上記軟骨再生材料の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
(1)生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料であって、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの10%以上の領域に上記軟骨基質が存在する、上記軟骨再生材料。
(2)上記多孔質体の移植面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの20%以上の領域に上記軟骨基質が存在する、(1)に記載の軟骨再生材料。
(3)上記多孔質体の生体親和性高分子が、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドである、(1)又は(2)に記載の軟骨再生材料。
(4)上記多孔質体の生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンである、(1)から(3)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
(5)上記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、下記式1で示される、(4)に記載の軟骨再生材料。
式1:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式1中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。
(6)上記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;又は
配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
の何れかである、(4)又は(5)に記載の軟骨再生材料。
(7)上記多孔質体が、生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥することにより得られる、(1)から(6)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
(9)上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンである、(1)から(8)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
(10)上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、下記式1で示される、(9)に記載の軟骨再生材料。
式1:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式1中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。
(11)上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;又は
配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
の何れかである、(9)又は(10)に記載の軟骨再生材料。
(12)上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の架橋度が4〜15である、(1)から(11)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
(13)上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の架橋度が4〜8である、(1)から(12)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
(14)上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の下記式4で示される分解速度が0.1〜20質量%/時間である、(1)から(13)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
式4: 分解速度 = ((W−We)−wo)/wo/T
式4において、Wは、コラゲナーゼによる分解及び凍結乾燥後に記録した試料の入ったチューブの質量を示し、Weは予め記録しておいたチューブの空質量を示し、woは試料の実際の添加量を示し、Tはコラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示す。
(15)上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の下記式4で示される分解速度が5〜10質量%/時間である、(1)から(14)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
式4: 分解速度 = ((W−We)−wo)/wo/T
式4において、Wは、コラゲナーゼによる分解及び凍結乾燥後に記録した試料の入ったチューブの質量を示し、Weは予め記録しておいたチューブの空質量を示し、woは試料の実際の添加量を示し、Tはコラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示す。
(17)上記多孔質体の関節腔面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの10%以上の領域に上記軟骨基質が存在する、(1)から(16)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
(18)生体親和性高分子のピンをさらに含む、(1)から(17)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
上記工程Aにおいて得られた多孔質体に軟骨細胞を播種して培養する工程B、及び
生体親和性高分子フィルムを提供する工程C、
を含む、(1)から(17)の何れか一に記載の軟骨再生材料の製造方法。
(20)上記工程Aにおいて、生体親和性高分子を含む水溶液を攪拌した後に、凍結乾燥して多孔質体を得る、(19)に記載の軟骨再生材料の製造方法。
(22)生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料であって、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの10%以上の領域に上記軟骨基質が存在する、上記軟骨再生材料を、軟骨再生を必要とする患者に移植する工程を含む、軟骨再生方法。
(23)軟骨再生材料の製造のための、生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムとの使用であって、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの10%以上の領域に上記軟骨基質が存在する、上記の使用。
本発明の軟骨再生材料は、生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含み、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの10%以上の領域に上記軟骨基質が存在するものである。
以下、本発明の構成要素について説明する。
本発明で用いる多孔質体は、生体親和性高分子から構成される。
(1−1)生体親和性高分子
生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性高分子として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン及びMPC(2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)などが挙げられる。生分解性高分子としては、具体的には、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドなどのポリペプチド(例えば、以下に説明するゼラチン等)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質(フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン)や細胞接着配列(アミノ酸一文字表記で表される、RGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列、及びHAV配列)ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
化学合成ペプチド又は化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチド又はゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護基としてFmoc基(Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基)を使用するFmoc基合成法、及び、アミノ基の保護基としてBoc基(tert-Butyl Oxy Carbonyl基)を使用するBoc基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中、後記する(1−3)リコンビナントゼラチンの内容を当てはめることができる。
リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、本発明の軟骨再生材料を培地中で培養する際及び生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類(例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど)による架橋、縮合剤(カルボジイミド、シアナミドなど)による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られている。本発明で使用する架橋方法は、好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列(X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に2配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176号公報、US特許6992172号公報、国際公開WO2004/85473号公報、国際公開WO2008/103041号公報等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質1分子中3〜50個であることが好ましく、より好ましくは4〜30個、さらに好ましくは5〜20個である。最も好ましくは12個である。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;又は
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
である。
生体親和性高分子の多孔質体の製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥することにより生体親和性高分子の多孔質体を得ることができる。生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
(a)溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が2.5℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下の温度で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
(b)工程(a)で得られた生体親和性高分子の未凍結状態の溶液を凍結する工程、および
(c)工程(b)で得られた凍結した生体親和性高分子の溶液を凍結乾燥する工程
を含む製造方法を挙げることができる。
生体親和性高分子の多孔質体の平均空孔サイズは、特に限定されないが、好ましくは、10〜400μmであり、より好ましくは20〜200μmであり、さらに好ましくは30〜100μmであり、特に好ましくは40〜90μmである。多孔質体の平均空孔サイズは、実施例「[8]リコンビナントペプチド多孔質体の空孔サイズの評価」に記載の方法に準じて測定することができる。
本発明で用いる軟骨細胞は、細胞移植を行うことができ、軟骨再生能を発揮できる限り、任意の軟骨細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する軟骨細胞は1種でもよいし、複数種の軟骨細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する軟骨細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。軟骨細胞としては、関節軟骨由来軟骨細胞、耳介軟骨由来軟骨細胞、鼻軟骨由来軟骨細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来軟骨細胞、胚性幹細胞(ES細胞)由来軟骨細胞、間葉系幹細胞(MSC)由来軟骨細胞およびダイレクトリプログラミング法によって得られた軟骨細胞からなる群から選択される少なくとも一種の軟骨細胞を使用することができる。ダイレクトリプログラミング法とは、皮膚から抽出した繊維芽細胞などの細胞などを軟骨細胞に直接変化させる手法である。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
本発明の軟骨再生材料は、生体親和性高分子の多孔質体とともに、生体親和性高分子フィルムを含む。即ち、本発明においては、軟骨細胞及び軟骨基質を含む生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを組み合わせて使用する。
生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとは、それぞれ別々にキットの形態で提供してもよいし、生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムとを一緒に貼り合せた形態で提供してもよい。好ましくは、生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとが、それぞれ別々であるキットの形態である。
生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムとをそれぞれ別々にキットの形態で提供する場合、使用者は、生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムとを一緒に貼り合せた後に移植することができる。あるいは、使用者は、生体親和性高分子フィルムを移植した後に、生体親和性高分子の多孔質体を移植してもよい。
具体的には、予め質量を測定したチューブに試料(フィルム)5mgを添加し、実際の添加量を記録する。放線菌由来のコラゲナーゼ2.5mgを50mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解させ、コラゲナーゼ溶液を得る。このコラゲナーゼ溶液1mlを、試料を添加したチューブに加え、ボルテックスにて混合後、37℃で所定の時間(=T)振とうする。その後、チューブを10000Gで1分間遠心し、上清をピペットで取り除く。さらに、超純水1mlをチューブに加え、ボルテックス後、チューブを10000Gで1分間遠心し、上清をピペットで取り除く。この操作をもう一度繰り返す。その後、試料を凍結乾燥し、試料の入ったチューブの質量を記録する。フィルムの分解速度は以下の式(式4)から算出する。
(式4) 分解速度 = ((W−We)―wo)/wo/T
式4において、Wは、凍結乾燥後に記録した、試料の入ったチューブの質量を示し、Weは予め記録しておいた、チューブの空質量を示す。woは、試料の実際の添加量を示す。Tは、コラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示す。
上記方法により測定した生体親和性高分子フィルムの分解速度は特に限定されないが、一般的には、0.1〜20[質量%/時間]であり、好ましくは0.5〜20[質量%/時間]であり、より好ましくは1〜10[質量%/時間]であり、特に好ましくは5〜10[質量%/時間]である。
本発明はさらに、上記した本発明の軟骨再生材料の製造方法を提供する。
上記製造方法は、
生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥して多孔質体を得る工程A、
上記工程Aにおいて得られた多孔質体に軟骨細胞を播種して培養する工程B、及び
生体親和性高分子フィルムを提供する工程C、
を含む。
多孔質体に対する軟骨細胞の使用量、および培養時間を調節することにより、多孔質体の移植面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの軟骨基質が存在する領域の割合(移植面側の軟骨基質充填割合)、及び多孔質体の関節腔面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの軟骨基質が存在する領域の割合(関節腔面側の軟骨基質充填割合)を調節することができる。
本発明の軟骨再生材料は、軟骨欠損の疾患部位に細胞移植の目的で使用することができる。軟骨欠損を伴う疾患としては、変形性関節症、骨軟骨欠損、離断性骨軟骨炎、外傷性軟骨損傷、骨関節炎、再発性多発軟骨炎、軟骨無形成症、椎間板損傷、椎間板ヘルニア等を挙げることができるが、特に限定されない。
移植方法としては、切開、注射、関節鏡、内視鏡等を使用した方法が挙げられる。本発明の軟骨再生材料は、細胞シート等の細胞移植物とは異なり、軟骨再生材料のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
本発明の軟骨再生材料の移植回数としては、1回だけ移植してもよいし、必要応じ2回以上の移植を行うこともできる。
本発明によれば、軟骨再生の治療において使用するための軟骨再生材料であって、生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含み、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの10%以上の領域に上記軟骨基質が存在する上記軟骨再生材料が提供される。各構成成分の好ましい範囲は本明細書中上記と同様である。
リコンビナントペプチド(リコンビナントゼラチン)として以下のCBE3を用意した(国際公開WO2008/103041号公報に記載)。
CBE3:
分子量:51.6kD
構造: GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
GRAVY値:−0.682
1/IOB値:0.323
アミノ酸配列(配列表の配列番号1)(国際公開WO2008/103041号公報の配列番号3と同じ。但し末尾のXは「P」に修正)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
また、本明細書における多孔質体とスポンジとは同義である。
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ3mm、直径51mm、側面厚さ8mm、高さ25mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)製の円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は8mmのPTFEで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も3mmのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は43mmになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
厚さ1mm、直径47mmのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は1mmのアルミで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も1mmのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚1mmのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は45mmになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に2.2mmの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。
PTFE厚・円筒形容器、およびアルミ硝子板・円筒形容器に、それぞれCBE3水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機(TF5−85ATNNN:宝製作所)内で冷却棚板を用いて底面からCBE3水溶液を冷却した。
この際の容器、CBE3水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定は、以下に記載の通りである。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
アルミ硝子板・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。 棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量10mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件A〜条件Cのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温(非冷却面液温)として容器内の円中心部の液面の液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温(冷却面液温)として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図1〜図3の通りとなった。
この図1、図2、図3から、条件A、条件B、条件Cでは棚板温度−10℃設定区間(−20℃度に下げる前)において液温が融点である0℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない(未凍結・過冷却)状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温との温度差が2.5℃以下となっていた。その後、棚板温度を−20℃へ更に下げていくことによって、液温が0℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は0℃付近で一定時間経過した。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後に0℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっていた。従って、測定している温度は氷内部の固体温度であり、つまり液温ではない。
非冷却面の液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.1℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.2℃
凝固熱発生直前の温度差:1.1℃
非冷却面の液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.0℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.1℃
凝固熱発生直前の温度差:0.9℃
非冷却面の液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.8℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:1.1℃
凝固熱発生直前の温度差:2.1℃
PTFE厚・円筒形容器、およびアルミ硝子板・円筒形容器に、それぞれ1質量%(w/w)エタノール含有CBE3水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機(TF5−85ATNNN:宝製作所)内で冷却棚板を用いて底面からCBE3水溶液を冷却した。最終濃度1質量%のエタノール含有水溶液とすることで、融点は−0.4℃となる。エタノール/水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。
この際の容器、CBE3水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定は、以下に記載の通りである。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、エタノール最終濃度1質量%、水溶液量4mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がるまで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
アルミ硝子板・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、エタノール最終濃度1質量%、水溶液量4mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がるまで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件AA及び条件BBについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温(非冷却面液温)として容器内の円中心部の液面の液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温(冷却面液温)として容器内の底部の液温を測定した。尚、ここでは1質量%エタノールが溶媒となる為、溶媒融点は−0.4℃となる。エタノール/水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。
非冷却面の液温が融点(−0.4℃)になった時の温度差:0.8℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.3℃
凝固熱発生直前の温度差:0.8℃
非冷却面の液温が融点(−0.4℃)になった時の温度差:1.3℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.0℃
凝固熱発生直前の温度差:1.3℃
厚さ1mm、直径47mmのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は1mmのアルミで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も1mmのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚1mmのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は45mmになっている。以後、この容器のことを円筒形容器と呼称する。
リコンビナントペプチドCBE3を用いて、攪拌法多孔質体を作製した。本例では、以下の組成で溶液を調製し、4℃にてホモジナイザー(AM-11、NIHONSEIKI製)で17,000rpm、30秒間攪拌し、アルミ製カップ容器に移して−80℃で3時間急冷する。その後、凍結乾燥機にて3日間凍結乾燥を行い、多孔質体を得た。このようにして得た多孔質体を、以後、攪拌法多孔質体と呼称する。
組成:10質量%多孔質体10mL分(CBE3:1000mg、超純水:9895μL、1モル/L HCl:105μL)
上記[2]及び[3]で得られた温度差の小さい凍結工程・多孔質体、上記[4]で得られたで温度差の小さいエタノール含有凍結工程・多孔質体、上記[5]で得られた薄層凍結多孔質体、及び上記[6]で得られた攪拌法多孔質体について、それぞれの多孔質体に、減圧下160℃で20時間の熱架橋を施した。
上記[7]で得られた各種の多孔質を、十分時間、生理食塩水で膨潤させた。その後、ミクロトームで凍結組織切片を作製し、HE(ヘマトキシリン・エオシン)染色標本を作製した。標本から実スケール1.5mm大の断面像を用意し、個々の空孔面積を計測し、その後、上記面積を円換算した場合の円直径を算出し、空孔サイズとした。この空孔の20か所以上の平均値を平均空孔サイズとした。その結果、上記[2]及び[3]由来の温度差の小さい凍結工程・多孔質体の平均空孔サイズは59μm、上記[4]由来の温度差の小さいエタノール含有凍結工程・多孔質体は72μm、上記[6]由来の攪拌法多孔質体は82μm、上記[5]由来の薄層凍結多孔質体は45μmであった。
4質量%濃度のCBE3水溶液を調製し、このCBE3水溶液5.4mlを、シリコン枠(8cm x 3.5cm)を設置したプラスチックトレーに流し込んだ。このプラスチックトレーを冷蔵庫内に移し、水分が無くなるまで乾燥させることでリコンビナントペプチドのフィルムを得た。上記のリコンビナントペプチドのフィルムをプラスチックトレー/シリコン枠から取り出し、減圧下160℃で熱架橋(架橋時間は48時間、72時間)を施し、動物実験の試料を得た。
上記[9]で作製したフィルムの架橋度(1分子当たりの架橋数)を算出した。測定にはTNBS(2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸)法を用いた。
ガラスバイアルに、サンプル(約10mg)、4質量%NaHCO3水溶液(1mL)及び1質量%TNBS水溶液(2mL)を添加し、混合物を37℃で3時間振とうした。その後、37質量%塩酸(10mL)及び純水(5mL)を加えた後、混合物を37℃で16時間以上静置し、サンプルとした。
ガラスバイアルに、サンプル(約10mg)、4質量%NaHCO3水溶液(1mL)及び1質量%TNBS水溶液(2mL)を添加し、直後に37質量%塩酸(3mL)を加え、混合物を37℃で3時間振とうした。その後、37質量%塩酸(7mL)及び純水(5mL)を加えた後、混合物を37℃で16時間以上静置し、ブランクとした。
純水で10倍希釈したサンプル、及び、ブランクの吸光度(345nm)を測定し、以下の(式2)及び(式3)から架橋度(1分子当たりの架橋数)を算出した。
(式2)は、リコンビナントペプチド1g当たりのリジン量(モル等量)を示す。
式2中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量(g)、wはリコンビナントペプチド質量(mg)を示す。
(式3) 1−(サンプル(式1)/未架橋リコンビナントペプチド(式1))×34
(式3)は、1分子あたりの架橋数を示す。
上記[9]で作製したフィルムの分解速度を評価した。
予め質量を測定したプラスチック製のチューブに、上記[9]で作製した試料5mgを添加し、実際の添加量を記録した。
放線菌由来のコラゲナーゼ2.5mgを50mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解させ、コラゲナーゼ溶液を得た。このコラゲナーゼ溶液1mlを、試料を添加したチューブに加え、ボルテックスにて混合後、37℃で5時間振とうさせた。その後、チューブを10000Gで1分間遠心し、上清をピペットで取り除いた。さらに、超純水1mlをチューブに加え、ボルテックスにて混合後、チューブを10000Gで1分間遠心し、上清をピペットで取り除いた。この操作をもう一度繰り返した。その後、試料を凍結乾燥し、試料の入ったチューブの質量を記録した。
(式4) 分解速度 = ((W−We)―wo)/wo/T
式4において、Wは、凍結乾燥後に記録した、試料の入ったチューブの質量を示し、Weは予め記録しておいた、チューブの空質量を示す。woは、試料の実際の添加量を示す。Tは、コラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示し、今回の試験では5時間である。
3〜4週齢の日本白色家兎をソムノペンチル静脈投与により屠殺し、大腿骨、脛骨(上腕骨)から軟骨組織を採取した。イソジン希釈液で消毒し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で洗浄し、0.25質量%トリプシンを加え37℃で約1時間反応させた後、3000ユニット/mLコラゲナーゼタイプIX溶液で約3時間反応させ、消化物をセルストレーナーに通し、残渣を除去した。その後、培地を加え、コラゲナーゼを除去するため、遠心し、上清を除去してから培地を添加した。この工程でウサギ軟骨細胞を取得した。
上記[6]で用意した攪拌法多孔質体(空孔サイズ82μm)を直径5mm、厚さ2mmに切り出し、その上に,上記[12]で用意したウサギ軟骨細胞を5.0×106cells/cm3濃度で播種し、培養を実施した。それによって、軟骨基質ありスポンジを取得した。また、ここでウサギ軟骨細胞を播種しなかった物も用意しておき、それを軟骨基質なしスポンジとして用意した。なお、上記[7]及び[8]で用意した温度差の小さいエタノール含有凍結工程・多孔質体(空孔サイズ72μm)を用いた場合も、以後の結果は同じ結果が得られたため、以下においては代表例として上記[6]由来の攪拌法多孔質体のデータを提示している。
上記[13]で細胞を播種し培養した軟骨基質ありスポンジは、培養経過(3日、7日、14日、21日、28日)とともに底面の軟骨基質充填割合の異なる軟骨基質ありスポンジを作ることができた。その底面の軟骨基質充填割合の測定は、軟骨基質ありスポンジの組織切片を作製(ホルマリン固定、パラフィン包埋)し、サフラニンO染色することで断面を可視化して評価した(図8〜図10)。
特に、このようにして作製した組織染色切片の底面部分の150μmの厚さの領域に着目し、この150μmの厚さの領域について、軟骨基質が存在し、それ故サフラニンO染色で陽性となっている領域の面積を測定した。かつ、150μmの厚さの領域全体の面積に対するサフラニンO染色陽性領域の面積の割合を求めることで「150μm層中の軟骨基質充填割合」とした。その結果、上記[13]で作製した軟骨基質ありスポンジは、「150μm層中の軟骨基質充填割合」が2.9%、5.4%、20%、33%、90%であった。
日本白色家兎(北山ラベス、SPF)22週齢オスの膝関節部位に、直径5mm、深さ2mm程度の骨軟骨欠損を作製した。
上記[15]にて作製したウサギ軟骨欠損部位に、各種評価対象のサンプルを移植し、移植後1ヶ月の時点で剖検し、移植部位周辺の骨軟骨組織切片を作製した。組織はホルマリン固定を行った後、パラフィンで包埋し、移植物を含む組織切片を作製した。切片の染色は、HE染色(ヘマトキシリン・エオシン染色)、またはサフラニンO染色、あるいはサフラニンO及びファストグリーン染色を行った。
A:良好な軟骨再生が認められる。
B:一部でわずかな軟骨再生が認められる。
C:軟骨再生が認められない。
A:繊維性軟組織の浸潤抑制が認められる。
B:繊維性軟組織の浸潤抑制が若干認められる。
C:繊維性軟組織の浸潤抑制は認められない。
D:炎症浸潤を抑制することができず、繊維性軟組織の浸潤抑制は不良である。
上記[16]と同様にして、上記[15]にて作製したウサギ軟骨欠損部位に、同一の軟骨基質充填割合(33%)の軟骨基質ありスポンジ(上記[13]及び[14])と、架橋度が異なるフィルム(上記[9]及び[10]の架橋度6及び13)を移植した。フィルムが移植面(下骨側)に存在するように移植した。移植後6ヶ月の時点で剖検し、移植部位周辺の骨軟骨組織切片を作製した。組織はホルマリン固定を行った後、パラフィンで包埋し、移植物を含む組織切片を作製した。切片染色はHE染色(ヘマトキシリン・エオシン染色)、またはサフラニンO染色、あるいはサフラニンO及びファストグリーン染色を行った。
上記[9]、[10]で作製した架橋度13のフィルムを、上記[15]で作製したウサギ軟骨欠損部位に留置し、1か月後と2か月後に剖検し、移植部位周辺の骨軟骨組織切片を作製した。組織はホルマリン固定を行った後、パラフィンで包埋し、移植物を含む組織切片を作製した。切片染色はHE染色(ヘマトキシリン・エオシン染色)を行った。
その結果を図14に示す。図14に示す通り、移植後1か月ではまだほとんど分解されていない架橋度13のフィルムも、2か月後には明らかにフィルムの端から分解が進んでいることが明瞭に示された。このことから、使用しているフィルムは生分解性を有していることが証明された。
実際の医療現場においては関節鏡を使って移植治療することが可能であることがさらに望ましい。関節鏡で移植が可能であるためには、関節鏡ポータルを通過可能であることが必要である。そのためには、分割された移植物で骨軟骨欠損を満たした場合であっても、分割しない場合と同様な軟骨再生が認められることが重要である。これを評価する方法として、十分な軟骨基質充填割合を有する軟骨基質ありスポンジを、一度分割してから欠損部位に移植した場合に、分割部分で軟骨再生が認められるかを評価した。
なお、ここでフィルムを用いている場合のフィルムとは、上記[9]で用意した架橋度13(上記[10]で測定)のフィルムを、欠損の底面積大(直径5mm)に切り出したものを使用した。
実際の医療現場においては、移植後に、移植物を欠損部位にピンで固定したいというニーズが生じることが多い。この固定が可能であるかは、移植物にピンで穴を空けた場合であっても、軟骨再生に重大な負の影響を及ぼさないことが必要である。このことを評価する方法として、十分な軟骨基質充填割合を有する軟骨基質ありスポンジを、骨軟骨欠損部位に留置したのちに、固定ピンにより貫通孔をあける検証を実施した。軟骨基質ありスポンジ及びフィルム、さらには欠損底面部の骨にまで貫く貫通孔をあけた場合であっても、軟骨再生に悪影響が出ないことを検証する。
上記[19]のような固定を行う固定ピンとしては、骨に作った貫通孔に刺した後、抜け出てこない性能を有することが求められる。同時に、生体吸収性であることも求められる。既存製品では例えばポリ−L−乳酸で作製されているグランドフィックス(グンゼ社製)などを用いることが可能である。
Claims (19)
- 生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料であって、前記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、前記多孔質体の移植面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの10%以上の領域に前記軟骨基質が存在し、前記生体親和性高分子フィルムが、前記多孔質体の移植面の一部又は全部を移植部位から隔離するためのフィルムである、前記軟骨再生材料。
- 前記多孔質体の移植面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの20%以上の領域に前記軟骨基質が存在する、請求項1に記載の軟骨再生材料。
- 前記多孔質体の生体親和性高分子が、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドである、請求項1又は2に記載の軟骨再生材料。
- 前記多孔質体の生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンである、請求項1から3の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、下記式1で示される、請求項4に記載の軟骨再生材料。
式1:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式1中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。 - 前記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;又は
配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
の何れかである、請求項4又は5に記載の軟骨再生材料。 - 前記多孔質体が、生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥することにより得られる、請求項1から6の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンである、請求項1から7の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、下記式1で示される、請求項8に記載の軟骨再生材料。
式1:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式1中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。 - 前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;又は
配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
の何れかである、請求項8又は9に記載の軟骨再生材料。 - 前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の架橋度が4〜15である、請求項1から10の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の架橋度が4〜8である、請求項1から11の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の下記式4で示される分解速度が0.1〜20質量%/時間である、請求項1から12の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
式4: 分解速度 = ((W−We)―wo)/wo/T
式4において、Wは、コラゲナーゼによる分解及び凍結乾燥後に記録した試料の入ったチューブの質量を示し、Weは予め記録しておいたチューブの空質量を示し、woは試料の実際の添加量を示し、Tはコラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示す。 - 前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の下記式4で示される分解速度が5〜10質量%/時間である、請求項1から13の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
式4: 分解速度 = ((W−We)―wo)/wo/T
式4において、Wは、コラゲナーゼによる分解及び凍結乾燥後に記録した試料の入ったチューブの質量を示し、Weは予め記録しておいたチューブの空質量を示し、woは試料の実際の添加量を示し、Tはコラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示す。 - 前記軟骨細胞が、関節軟骨由来軟骨細胞、耳介軟骨由来軟骨細胞、鼻軟骨由来軟骨細胞、iPS細胞由来軟骨細胞、ES細胞由来軟骨細胞、間葉系幹細胞由来軟骨細胞およびダイレクトリプログラミング法によって得られた軟骨細胞からなる群から選択される少なくとも一種の軟骨細胞である、請求項1から14の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記多孔質体の関節腔面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの10%以上の領域に前記軟骨基質が存在する、請求項1から15の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 生体親和性高分子のピンをさらに含む、請求項1から16の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥して多孔質体を得る工程A、
前記工程Aにおいて得られた多孔質体に軟骨細胞を播種して培養する工程B、及び
生体親和性高分子フィルムを提供する工程C、
を含む、請求項1から17の何れか一項に記載の軟骨再生材料の製造方法。 - 前記工程Aにおいて、生体親和性高分子を含む水溶液を攪拌した後に、凍結乾燥して多孔質体を得る、請求項18に記載の軟骨再生材料の製造方法。
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