CN107405422A

CN107405422A - 软骨再生材料及其制造方法

Info

Publication number: CN107405422A
Application number: CN201680016571.1A
Authority: CN
Inventors: 中村健太郎; 三好隼人; 羽田智子; 渡部正利喜
Original assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd; Fujifilm Corp
Current assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd; Fujifilm Corp
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2016-03-17
Publication date: 2017-11-28
Also published as: EP3260142A4; EP3260142A1; US11160902B2; US20190216976A1; EP3260142B1; JP6467493B2; WO2016148246A1; JPWO2016148246A1

Abstract

本发明的课题在于提供一种抑制纤维性软组织浸润，并带来良好的软骨再生的软骨再生材料及上述软骨再生材料的制造方法。根据本发明，提供一种软骨再生材料，其包括生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜，其中，上述多孔体含有软骨细胞及软骨基质，且在上述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在上述软骨基质。

Description

软骨再生材料及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种包括生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜的软骨再生材料及上述软骨再生材料的制造方法。

背景技术

关节骨软骨缺损通常很难自然再生，因此正在积极尝试基于细胞移植治疗的再生医疗。具体而言，正在尝试利用支架(Scaffold)，且作为培养软骨以细胞结构体的形状移植细胞。

专利文献1中记载有一种包括多孔体的细胞支撑体，该多孔体由生物降解性材料构成且具有规定的特性。专利文献1中所记载的细胞支撑体能够用作培养细胞的载体，且在实施例中，记载有将包括重组明胶或天然明胶原材料的多孔体用作细胞支撑体。

专利文献2中记载有一种多层膜，其包括主要包含胶原蛋白II型，并具有海绵状的开放型结构的基质层及至少一个具有相对不浸透性的封闭型结构的阻挡层。专利文献2中记载有上述多层膜尤其适合用于骨头组织或软骨组织在生物体内再生。

以往技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2011/108537号公报

专利文献2：日本特表2001-519210号公报

发明内容

发明要解决的技术课题

对于关节骨软骨缺损，已知注入细胞的悬浮液的移植治疗，但无法仅通过投给细胞来向缺损部位嫁接细胞，且再生效果不够充分。并且，如上述，多次尝试利用支架(Scaffold)，且作为培养软骨以细胞结构体的形状移植细胞，但实际上在培养软骨的移植中，存在因炎症的浸润或血管浸润而培养软骨成为骨头或纤维性软组织的案例，且软骨再生效果未必充分，因此要求显示更高的软骨再生效果的细胞结构体。

专利文献1中所记载的细胞支撑体由多孔体构成，且作为骨再生材料而有用，但就软骨再生能而言不明确，该多孔体由生降解性材料构成，并具有规定的气孔率、规定的平均气孔尺寸、气孔间连通孔及规定的吸水率。

根据专利文献2可类推II型胶原蛋白在软骨细胞的培养中有用，但将II型胶原蛋白移植到关节内时有可能成为引起关节炎(胶原蛋白衍生性关节炎)，并损伤害周边的正常关节软骨的原因，因此实际上不优选使用II型胶原蛋白。并且，即使在如专利文献2中所记载那样设有阻挡层的情况下，实际上也无法抑制因炎症的浸润或血管浸润引起的软骨的骨化或纤维性软组织浸润。

如上述，培养软骨的移植中存在因炎症的浸润或血管浸润而所移植的培养软骨部分成为纤维性软组织的问题。

本发明的应解决的课题在于提供一种抑制纤维性软组织浸润，并带来良好的软骨再生的软骨再生材料。而且，本发明的应解决的课题在于提供上述软骨再生材料的制造方法。

用于解决技术课题的手段

本发明人等为了解决上述课题而进行深入研究的结果，发现包括生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜的软骨再生材料中，上述多孔体含有软骨细胞及软骨基质，且在上述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在上述软骨基质时，抑制纤维性软组织浸润，并且带来良好的软骨再生。本发明是鉴于这些见解而完成的。

即，根据本发明，可提供以下发明。

(1)一种软骨再生材料，其包括生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜，其中，上述多孔体含有软骨细胞及软骨基质，且在上述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在上述软骨基质。

(2)根据(1)所述的软骨再生材料，其中，在上述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的20％以上的区域存在上述软骨基质。

(3)根据(1)或(2)所述的软骨再生材料，其中，上述多孔体的生物相容性高分子为重组肽或化学合成肽。

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述多孔体的生物相容性高分子为重组明胶或化学合成明胶。

(5)根据(4)所述的软骨再生材料，其中，上述重组明胶或化学合成明胶由下述式1表示，

式1：A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B

式1中，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一个，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一个，m为2～10的整数，n为3～100的整数，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列。

(6)根据(4)或(5)所述的软骨再生材料，其中，上述重组明胶或化学合成明胶为如下肽中的任一个：

包括序列号1中所记载的氨基酸序列的肽；

包括在序列编号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或加成了一个或数个氨基酸的氨基酸序列，并且具有生物相容性的肽；或

包括具有80％以上与序列号1中所记载的氨基酸序列相同的序列同源性的氨基酸序列，并且具有生物相容性的肽。

(7)根据(1)至(6)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述多孔体可通过冷冻干燥包括生物相容性高分子的水溶液而得到。

(8)根据(1)至(7)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子薄膜为用于将上述多孔体的移植面的一部分或全部与移植部位隔离的薄膜。

(9)根据(1)至(8)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子为重组明胶或化学合成明胶。

(10)根据(9)所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子由下述式1表示，

式1：A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B

(11)根据(9)或(10)所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子为如下肽中的任一个：

包括序列号1中所记载的氨基酸序列的肽；

(12)根据(1)至(11)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子的交联度为4～15。

(13)根据(1)至(12)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子的交联度为4～8。

(14)根据(1)至(13)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子的由下述式4表示的降解速度为0.1～20质量％/小时，

式4：降解速度＝((W-We)-wo)/wo/T

式4中，W表示在基于胶原酶的降解及冷冻干燥后记录的添加有试样的管的质量，We表示预先记录的管的空质量，wo表示试样的实际添加量，T表示在胶原酶溶液中的振荡时间。

(15)根据(1)至(14)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子的由下述式4表示的降解速度为5～10质量％/小时，

式4：降解速度＝((W-We)-wo)/wo/T

(16)根据(1)至(15)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述软骨细胞为选自包括源自关节软骨的软骨细胞、源自耳廓软骨的软骨细胞、源自鼻软骨的软骨细胞、源自iPS细胞的软骨细胞、源自ES细胞的软骨细胞、源自间充质干细胞的软骨细胞及通过直接重新编程法得到的软骨细胞的组中的至少一种软骨细胞。

(17)根据(1)至(16)中任一项所述的软骨再生材料，其中，在上述多孔体的关节腔面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在上述软骨基质。

(18)根据(1)至(17)中任一项所述的软骨再生材料，其还包括生物相容性高分子的销。

(19)一种(1)至(17)中任一项所述的软骨再生材料的制造方法，其包括：

工序A，冷冻干燥包括生物相容性高分子的水溶液而得到多孔体；

工序B，对在上述工序A中得到的多孔体接种软骨细胞而进行培养；及

工序C，提供生物相容性高分子薄膜。

(20)根据(19)所述的软骨再生材料的制造方法，其中，在上述工序A中，在搅拌包括生物相容性高分子的水溶液之后，进行冷冻干燥而得到的多孔体。

(21)一种软骨再生材料，其用于软骨再生的治疗中，其中，该软骨再生材料包括生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜，上述多孔体含有软骨细胞及软骨基质，且在上述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域中存在上述软骨基质。

(22)一种软骨再生方法，其包括将软骨再生材料移植到需要进行软骨再生的患者的工序，该软骨再生材料包括生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜，且上述多孔体含有软骨细胞及软骨基质，在上述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在上述软骨基质。

(23)一种用于制造软骨再生材料的生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜的使用，其中，上述多孔体含有软骨细胞及软骨基质，且在上述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在上述软骨基质。

发明效果

本发明的软骨再生材料抑制纤维性软组织浸润，并带来良好的软骨再生，且在细胞移植治疗中有用。根据本发明的软骨再生材料的制造方法，能够制造抑制上述纤维性软组织浸润，并带来良好的软骨再生的本发明的软骨再生材料。

附图说明

图1表示条件A的液温特性曲线。

图2表示条件B的液温特性曲线。

图3表示条件C的液温特性曲线。

图4表示条件AA的液温特性曲线。

图5表示条件BB的液温特性曲线。

图6表示仅移植了海绵(无薄膜)的组织的染色结果。

图7表示移植了海绵(无细胞)和薄膜的组织的染色结果。

图8表示关于移植面的软骨基质填充比例为90％的细胞培养海绵和薄膜的移植前及移植后的组织的染色结果。

图9表示关于移植面的软骨基质填充比例为20％或33％的细胞培养海绵和薄膜的移植前及移植后的组织的染色的结果。

图10表示关于移植面的软骨基质填充比例为2.9％或5.4％的细胞培养海绵和薄膜的移植前及移植后的组织的染色的结果。

图11表示在没有薄膜或有薄膜的情况下移植移植面的软骨基质填充比例为20％的细胞培养海绵之后的组织的苏木素-伊红(HE)染色的结果。

图12表示在没有薄膜或有薄膜的情况下移植移植面的软骨基质填充比例为20％的细胞培养海绵之后的组织的藏红O染色的结果。

图13表示使用了移植面的软骨基质填充比例为33％的细胞培养海绵和薄膜(交联度6或13)的兔子膝关节软骨缺损的情况下的长期移植试验(6个月)的结果。

图14表示薄膜(交联度13)在生物体内的降解。

图15表示关于软骨再生材料的分割移植的在生物体内验证的结果。

图16表示验证软骨再生材料固定于缺损部位的结果。

图17表示CBE3制销的制作。

图18表示验证了基于CBE3制销的软骨再生材料的固定性的结果。

图19表示海绵与薄膜的位置关系。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行详细说明。

本发明的软骨再生材料包括生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜，上述多孔体含有软骨细胞及软骨基质，且在上述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在上述软骨基质。

本发明的软骨再生材料抑制纤维性软组织浸润，并带来良好的软骨再生，因此能够用于软骨再生。本发明的软骨再生材料例如能够用作用于对软骨缺损部位移植的移植材料。

包括生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜，上述多孔体含有软骨细胞及软骨基质，且在上述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在上述软骨基质的本发明的软骨再生材料如上述那样抑制纤维性软组织浸润，并带来良好的软骨再生为完全预料外的显著效果。专利文献1中，记载有关于骨再生的内容，但未对软骨再生进行研究。另外，骨再生与软骨再生为不同的现象，且无法从骨再生作用预想软骨再生作用。并且，专利文献2中关于在多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在软骨基质的本发明的特征既没有记载也没有启示，且专利文献2中没有关于能够实现通过上述特征而抑制纤维性软组织浸润，并带来良好的软骨再生的效果的任何启示。

本发明的软骨再生材料中，在多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上(优选20％以上，更优选30％以上)的区域存在上述软骨基质。在本说明书中将上述的在多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的软骨基质所存在的区域的比例称为“软骨基质填充比例”。如上述，通过将移植面侧的软骨基质填充比例设为10％以上，本发明的软骨再生材料能够抑制纤维性软组织浸润，并带来良好的软骨再生。另外，移植面侧的软骨基质填充比例的上限并无特别限定，既可以为100％，也可以小于100％。

优选在本发明的软骨再生材料中，在多孔体的关节腔面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上(更优选20％以上，进一步优选30％以上，更进一步优选50％以上)的区域存在软骨基质。另外，关节腔面侧的软骨基质填充比例的上限并无特别限定，既可以为100％，也可以小于100％。

多孔体的移植面是与指生物体内的缺损部相接一侧的面(为图19的海绵时是下表面)，多孔体的关节腔面是指与移植面相反一侧的面(为图19的海绵时是上表面)。

关于软骨基质填充比例的测定，能够按照本说明书的实施例的“[14]底面的软骨基质填充比例不同的评价”中所记载的方法而进行。即，制作(甲醛固定、石蜡包埋)多孔体的切片，并进行藏红O染色而将截面可视化来进行评价。即，从组织染色切片的移植面(底面)或关节腔面(与移植面相反一侧的面)的表面着眼于150μm的厚度，测定了通过藏红O染色而成为阳性的区域的面积。通过求出藏红O染色阳性区域的面积对表面至150μm的整个区域的面积的比例而能够求出150μm层中的软骨基质填充比例。

以下，对本发明的构成要件进行说明。

(1)生物相容性高分子的多孔体

本发明中所使用的多孔体由生物相容性高分子构成。

(1-1)生物相容性高分子

生物相容性是指，与生物接触时，不引起如长期且慢性炎症反应等显著的有害反应。若本发明中所使用的生物相容性高分子为具有生物相容性的高分子，则对于是否在生物内进行降解并无特别限定，优选为生物降解性高分子。作为非生物降解性高分子，具体而言可举出聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯、不锈钢、钛、硅酮及MPC(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)等。作为生物降解性高分子，具体而言可举出重组肽或化学合成肽等多肽(例如，以下说明的明胶等)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素及壳聚糖等。上述中，尤其优选重组肽。这些生物相容性高分子可以被设计成提高细胞粘附性。具体而言，能够使用如下方法，即“基于相对于基材表面的细胞粘附基质(纤连蛋白、玻连蛋白、层连蛋白)或细胞粘附序列(以氨基酸单字母代码表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKV AV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列)肽的涂布”、“基材表面的氨基化、阳离子化”或“基材表面的等离子处理、基于电晕放电的亲水性处理”。

若重组肽或化学合成钛等的多肽的种类具有生物相容性，则并无特别限定，例如，优选明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、pronectin、层连蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白、丝蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、Retronectin，最优选为明胶、胶原蛋白、去端肽胶原。本发明中所使用的明胶优选为天然明胶、重组明胶或化学合成钛，更优选为重组明胶。在此所述的天然明胶是指，通过源自天然的胶原蛋白制成的明胶。

化学合成肽或化学合成明胶是指人工合成的肽或明胶。明胶等肽的合成可以为固相合成也可以为液相合成，但优选为固相合成。肽的固相合成对与本领域人员来说是公知的，例如可列举作为氨基的保护基而使用Fmoc基(芴甲氧羰(Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl)基)的Fmoc基合成法及作为氨基的保护基而使用Boc基(叔丁基羰(tert-ButylOxy Carbonyl)基)的Boc基合成法等。另外，化学合成明胶的优选方式在本说明书中能够与后述(1-3)重组明胶的内容相符。

关于重组明胶，在本说明书中后述。

本发明中所使用的生物相容性高分子的亲水性值“1/IOB”值优选为0～1.0。更优选为0～0.6，进一步优选为0～0.4。IOB是指，由藤田穆提出的基于表示有机化合物的极性/非极性的有机概念图的亲水性和疏水性的指数，其详细内容例如在“PharmaceuticalBulletin”，vol.2,2,pp.163-173(1954)、“化学领域”vol.11,10,pp.719-725(1957)、“FRAGRANCE JOURNAL”，vol.50,pp.79-82(1981)等中进行了说明。简单而言，将所有的有机化合物的根源设为甲烷(CH₄)，将其他化合物全都视为甲烷的衍生物，并将其碳原子数、取代基、相变部、环等分别设定为恒定数值，相加其得分之后求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，并将该值绘制在以有机性值为X轴、无机性值为Y轴的图上。有机概念图中的IOB是指，有机概念图中的无机性值(IV)与有机性值(OV)之比、即为“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机概念图的详细内容可参考《新版有机概念图-基础与应用-》(甲田善生等著、三共出版、2008)。本说明书中，以求出IOB的倒数的“1/IOB”值表示亲水性和疏水性。该符号表示“1/IOB”值越小(接近0)，越亲水。

通过将本发明中所使用的生物相容性高分子的“1/IOB”值设定在上述范围，上述生物相容性高分子的亲水性变高，并且吸水性变高，因此该高分子有效地作用于营养成分的保持。

当本发明中所使用的生物相容性高分子为多肽时，上述多肽的以总平均亲水性(Grand average of hydropathicity(GRAVY))值表示的亲水性和疏水性指数优选为0.3以下且-9.0以上，更优选为0.0以下且-7.0以上。总平均亲水性(Grand average ofhydropathicity(GRAVY))值能够通过“Gastei ger E.,Hoogland C.,Gattiker A.,DuvaudS.,Wilkins M.R.,Appel R.D.,Bairoch A.；Protein Identification and AnalysisTools on the ExP ASy Server；(In)John M.Walker(ed)：The Proteomics ProtocolsHandbook,Humana Press(2005).pp.571-607”及“Gasteiger E.,Gatt iker A.,HooglandC.,Ivanyi I.,Appel R.D.,Bairoch A.；ExPASy：the proteomics server for in-depthprotein knowledge and analysis.；Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003).”中所记载的方法得到。

通过将本发明中所使用的生物相容性高分子的GRAVY值设定在上述范围内，上述生物相容性高分子的亲水性变高，并且吸水性变高，由此该高分子有效地作用于营养成分的保持。

(1-2)交联

本发明中所使用的生物相容性高分子可以交联也可以不交联，优选交联。通过使用经交联的生物相容性高分子，可得到防止在培养基中培养本发明的软骨再生材料时及移植到生物时瞬间降解的效果。作为通常的交联方法，已知有热交联、基于醛类(例如，甲醛、戊二醛等)的交联、基于缩合剂(碳化二亚胺、氨腈(cyanamide)等)的交联、酶交联、光交联、紫外线交联、疎水性相互作用、氢键、离子性相互作用等。本发明中所使用的交联方法优选为热交联、紫外线交联或酶交联，尤其优选为热交联。

当进行基于酶的交联时，作为酶，若具有高分子之间的交联作用，则并无特别限定，优选能够使用谷氨酰胺转氨酶及漆酶谷氨酰胺转氨酶，最优选能够使用谷氨酰胺转氨酶。作为使用谷氨酰胺转氨酶进行酶交联的高分子的具体例，若为具有赖氨酸残基及谷氨酰胺残基的蛋白质，则并无特别限制。谷氨酰胺转氨酶可以源自哺乳类，也可以源自微生物，具体而言，可举出作为AJINOMOTO CO.,INC.制ACTIVA系列、作为试剂贩卖的源自哺乳类的谷氨酰胺转氨酶、例如，ORIENTAL YEAST CO.,LTD.制、Upstate USA Inc.制、BiodesignIntern ational制等源自豚鼠肝脏的谷氨酰胺转氨酶、源自山羊的谷氨酰胺转氨酶、源自兔子的谷氨酰胺转氨酶等及源自人类的凝血因子(Factor XIIIa、Haemat ologicTechnologies,Inc.)等。

只要能够进行交联，则进行交联(例如，热交联)时的反应温度并无特别限定，优选为-100℃～500℃，更优选为0℃～300℃，进一步优选为50℃～300℃，进一步优选为100℃～250℃，更进一步优选为120℃～200℃。

(1-3)重组明胶

本发明中所述的重组明胶是指，具有通过基因重组技术制成的类似明胶的氨基酸序列的多肽或蛋白样物质。能够在本发明中所使用的重组明胶优选为在胶原蛋白中具有以特征性Gly-X-Y表示的序列(X及Y分别独立地表示氨基酸中的任一个)的重复。在此，多个Gly-X-Y可以分别相同也可以不同。优选在一分子中包含2个序列以上的细胞粘附信号。作为本发明中所使用的重组明胶，能够使用具有源自胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。例如，能够使用EP1014176号公报、US专利6992172号公报、国际公开WO2004/85473号公报、国际公开WO2008/103041号公报等中所记载的重组明胶，但并不限定于此。作为本发明中所使用的重组明胶，优选为以下形态的重组明胶。

重组明胶由于天然明胶的固有能力而生物相容性优异，并且并非源自天然，因此无需担心牛海绵状脑病(BSE)等，从而非感染性优异。并且，与天然明胶相比，重组明胶均匀，且序列已被确定，因此在强度及降解性方面也能够通过交联等而减少模糊并精密地设计。

重组明胶的分子量并无特别限定，优选为2000以上且100000以下(2kDa以上且100kDa以下)，更优选为2500以上且95000以下(2.5kDa以上且95k Da以下)，进一步优选为5000以上且90000以下(5kDa以上且90kDa以下)，最优选为10000以上且90000以下(10kDa以上且90kDa以下)。

重组明胶优选在胶原蛋白中具有以特征性Gly-X-Y表示的序列的重复。在此，多个Gly-X-Y可以分别相同也可以不同。在Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X及Y表示任意氨基酸(优选甘氨酸以外的任意氨基酸)。在胶原蛋白中，以特征性Gly-X-Y表示的序列是指，明胶/胶原蛋白的氨基酸成分及序列中，与其他蛋白质相比为非常特殊的部分结构。在该部分结构中，甘氨酸占总体的约3分之1，在氨基酸序列中是每3个中重复一个。甘氨酸为最简单的氨基酸，针对分子链的配置的束缚也较少，对凝胶化时的螺旋结构的再生贡献较大。以X及Y表示的氨基酸中包含较多的亚氨酸(脯氨酸、羟脯氨酸)，优选占总体的10％～45％。优选重组明胶的序列的80％以上，更优选95％以上，最优选99％以上的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。

通常的明胶中，极性氨基酸中具有电荷的氨基酸与无电荷氨基酸以1:1的比率存在。在此，极性氨基酸是指，具体而言，半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及精氨酸，这些中极性无电荷氨基酸是指，半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸。在本发明中所使用的重组明胶中，所构成的所有氨基酸中，极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。并且，上述极性氨基酸中的无电荷氨基酸的比例优选为5％以上且小于20％，更优选为5％以上且小于10％。而且，优选在序列上不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任一个氨基酸，优选两个以上的氨基酸。

在通常的多肽中，已知有作为细胞粘附信号而起作用的最小氨基酸序列(例如，Nagai Co.,Ltd.出版发行的“病态生理”Vol.9、No.7(1990年)527页)。本发明中所使用的重组明胶优选在一分子中具有两个以上的作为这些细胞粘附信号而发挥作用的最小氨基酸序列。作为具体的序列，从粘附的细胞的种类较多的方面考虑，优选以氨基酸单字母代码表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKD I序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列。更优选RGD序列、YIG SR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，尤其优选为RGD序列。RGD序列中，优选为ERGD序列。通过使用具有细胞粘附信号的重组明胶，能够提高细胞的基质生产量。例如，作为细胞，在使用了间充质干细胞的情况下，在软骨分化中能够提高糖胺聚糖(GAG)的生产。

作为本发明中所使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD之间的氨基酸数在0～100之间，优选在25～60之间不均匀。

从细胞粘附、增值性的观点考虑，该最小氨基酸序列的含量优选在蛋白质1分子中为3～50个，更优选为4～30个，进一步优选为5～20个。最优选为12个。

在本发明中所使用的重组明胶中，RGD序列(基序)相对于氨基酸总数的比例优选至少为0.4％。当重组明胶包括350个以上的氨基酸时，优选350个氨基酸的每一段至少包含一个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例更优选至少为0.6％，进一步优选至少为0.8％，进一步优选至少为1.0％，更进一步优选至少为1.2％，最优选至少为1.5％。关于重组肽内的RGD基序的数量，每250个氨基酸优选至少为4个，更优选至少为6个，进一步优选至少为8个，进一步优选为12个以上且16个以下。RGD基序的0.4％的比例中，每250个氨基酸对应于至少一个RGD序列。RGD基序的数量为整数，因此为了满足0.4％的特征而包括251个氨基酸的明胶应包含至少两个RGD序列。关于本发明的重组明胶，优选每250个氨基酸包含至少两个RGD序列，更优选每250个氨基酸至少包含3个RGD序列，进一步优选每250个氨基酸包含至少4个RGD序列。作为本发明的重组明胶的另一方式，包含至少4个RGD基序，优选至少包含6个，更优选至少包含8个，进一步优选包含12个以上且16个以下的RGD基序。

重组明胶可以局部性水解。

优选本发明中所使用的重组明胶由式1：A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B表示。n个X分别独立地表示氨基酸的任一个，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一个。m为2～10的整数，优选为3～5。n为3～100的整数，优选15～70，更优选50～65。A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列。

更优选本发明中所使用的重组明胶由式：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)₆₃]₃-Gly(式中，63个X分别独立地表示氨基酸的任一个，63个Y分别独立地表示氨基酸的任一个。另外，63个Gly-X-Y可以分别相同也可以不同。)表示。

重复单元中优选键合多个天然存在的胶原蛋白的序列单元。在此所述的天然存在的胶原蛋白是指，若天然存在则可以为任一个，优选为I型、II型、III型、IV型或V型胶原蛋白。更优选为I型、II型或III型胶原蛋白。根据另一方式，上述胶原蛋白的来源优选为人、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选源自人。

本发明中所使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。

优选重组明胶未被去胺基化。

优选重组明胶不具有端肽。

优选重组明胶为通过对氨基酸序列进行编码的核酸而制备的实质上纯多肽。

作为本发明中所使用的重组明胶尤其优选为如下钛：

(1)包括序列编号1中所记载的氨基酸序列的肽；

(2)包括序列编号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或加成了一个或数个氨基酸的氨基酸序列，且具有生物相容性的肽；或

(3)包括具有80％以上(优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上)与序列编号1中所记载的氨基酸序列相同的序列同一性的氨基酸序列，且具有生物相容性的肽。

“缺失、取代或加成了一个或数个氨基酸的氨基酸序列”中的“一个或数个”是指，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，尤其优选为1～3个。

关于本发明中所使用的重组明胶，本领域技术人员能够通过公知的基因重组技术来制造，例如能够依照EP1014176A2号公报、美国专利第6992172号公报、国际公开WO2004/85473号公报、国际公开WO2008/103041号公报等中所记载的方法来制造。具体而言，获取对规定的重组明胶的氨基酸序列进行编码的基因，并将其编入表达载体而制作重组表达载体，将其导入适当的宿主而制作转化体。以适当的培养基培养所得到的转化体，由此生成重组明胶，因此通过从培养物回收所产生的重组明胶，能够制备本发明中所使用的重组明胶。

(1-4)生物相容性高分子的多孔体的制造方法

生物相容性高分子的多孔体的制造方法并无特别限定，例如，通过冷冻干燥包括生物相容性高分子的水溶液能够得到生物相容性高分子的多孔体。作为生物相容性高分子的多孔体的制造方法的一例能够列举如下制造方法，该方法包括：

(a)在溶液内液温最高的部分的温度和在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，且以在溶液内液温最高的部分的温度为溶剂的熔点以下的温度将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态的工序；

(b)对在工序(a)中得到的生物相容性高分子的未冷冻状态的溶液进行冷冻的工序；及

(c)对在工序(b)中得到的已冷冻的生物相容性高分子的溶液进行冷冻干燥的工序。

将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态时，在溶液内液温最高的部分的温度和在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下(优选2.3℃以下，更优选2.1℃以下)，即通过将温度之差设为较小，所得到的多孔体的孔隙不均变少。另外在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差的下限并无特别限定，只要为0℃以上即可，例如可以为0.1℃以上、0.5℃以上、0.8℃以上或0.9℃以上。由此所制造的多孔体能够实现更高的软骨再生效果。

工序(a)的冷却例如优选经由热传导率比水低的原材料(优选特氟龙(注册商标))而冷却，且能够将在溶液内液温最高的部分假设成距离冷却面最远的部分，并能够将在溶液内液温最低的部分假设成冷却面的液温。

优选在工序(a)中，产生凝固热紧前的在溶液内液温最高部分的温度和在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，更优选为2.3℃以下，进一步优选为2.1℃以下。在此“产生凝固热紧前的温度差”是指，在产生凝固热时的1秒钟前～10秒钟前之间温度差变最大时的温度差。

优选在工序(a)中，在溶液内液温最低的部分的温度为溶剂的熔点-5℃以下，更优选为溶剂的熔点-5℃以下且溶剂的熔点-20℃以上，更优选为溶剂的熔点-6℃以下且溶剂的熔点-16℃以上。另外，“溶剂的熔点”的溶剂是指，生物相容性高分子的溶液的溶剂。

工序(b)中，对在工序(a)中得到的未冷冻状态的生物相容性高分子的溶液进行冷冻。在工序(b)中用于冷冻的冷却温度并无特别限制，根据进行冷却的设备而不同，但优选为比在溶液内液温最低的部分的温度低3℃～30℃的温度，更优选为低5℃～25℃的温度，进一步优选为低10℃～20℃的温度。

工序(c)中，对在工序(b)中得到的已冷冻的生物相容性高分子的溶液进行冷冻干燥。冷冻干燥能够通过常规方法进行，例如以比溶剂的熔点低的温度进行真空干燥，还能够在室温(20℃)下通过进行真空干燥来进行冷冻干燥。

生物相容性高分子的多孔体的形状及大小并无特别限定，能够根据使用目的使用适当的形状及大小的多孔体。作为形状，例如能够列举圆柱或长方体等，但并不限定于此，能够设为与作为患部的缺损部的形状对应的形状。作为圆柱的大小，优选直径为2mm～2cm，且高度(厚度)为1mm～2cm。作为长方体的大小，优选纵长及横长为2mm～2cm，且高度(厚度)为1mm～2cm。

生物相容性高分子的多孔体的平均空孔尺寸并无特别限定，优选为10～400μm，更优选为20～200μm，进一步优选为30～100μm，尤其优选为40～90μm。多孔体的平均空孔尺寸能够按照实施例“[8]重组肽多孔体的空孔尺寸的评价”中所记载的方法来测定。

(2)软骨细胞及软骨基质

本发明中所使用的软骨细胞只要能够进行细胞移植，并能够发挥软骨再生能力，则能够使用任意的软骨细胞，其种类并无特别限定。并且，所使用的软骨细胞可以为一种，也可以组合多种软骨细胞来使用。并且，作为所使用的软骨细胞，优选为动物细胞，更优选为源自脊椎动物的细胞，尤其优选源自人类的细胞。作为软骨细胞，能够使用选自包括源自关节软骨的软骨细胞、源自耳廓软骨的软骨细胞、源自鼻软骨的软骨细胞、源自诱导性多能干细胞(iPS细胞)的软骨细胞、源自胚胎干细胞(ES细胞)的软骨细胞、源自间充质干细胞(MSC)的软骨细胞及通过直接重新编程法得到的软骨细胞的组中的至少一种软骨细胞。直接重新编程法为使从皮肤提取的成纤维细胞等的细胞等直接变化成软骨细胞的方法。并且，细胞的来源可以为自体细胞或异体细胞中的任一个。

软骨基质是指产生软骨细胞的成分，主要为细胞外基质。软骨基质以糖胺聚糖(GAG)、硫酸软骨素及蛋白聚糖为主成分，且根据情况包括胶原纤维及弹性纤维。软骨基质能够通过藏红O染色确认是否存在。

对生物相容性高分子的多孔体的软骨细胞的使用量并无特别限定，但以生物相容性高分子的多孔体的每一体积计优选为1.0×10⁵个细胞/cm³～1.0×10⁸个细胞/cm³，更优选为1.0×10⁶个细胞/cm³～5.0×10⁷个细胞/cm³，进一步优选为2.0×10⁶个细胞/cm³～1.0×10⁷个细胞/cm³。通过将下限设为上述范围，能够在使用于移植用途时有效地发挥细胞的效果，通过将上限设为上述范围，能够向细胞供给任意存在的生物相容性高分子的多孔体中的成分。在此，生物相容性高分子的多孔体中的成分并无特别限制，可列举后述的培养基中所含有的成分。

(3)生物相容性高分子薄膜

本发明的软骨再生材料包括生物相容性高分子的多孔体及生物相容性高分子薄膜。即，本发明中，组合使用包括软骨细胞及软骨基质的生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜。

生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜可以以分别不同的套件的形态提供，也可以以将生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜贴合在一起的形态来提供。优选生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜为分别不同的套件的形态。

当以分别不同的套件的形态提供生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜时，使用者能够在将生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜贴合在一起之后进行移植。或者，使用者可以在将生物相容性高分子薄膜移植之后移植生物相容性高分子的多孔体。

生物相容性高分子薄膜优选用作用于将生物相容性高分子的多孔体的移植面的一部分或全部与移植部位隔离的薄膜。例如，优选首先将生物相容性高分子薄膜移植到移植部位，然后将生物相容性高分子的多孔体移植到生物相容性高分子薄膜的上表面(与和移植部位相接的面相反一侧的面)。或者，当将生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜贴合在一起之后进行移植时，优选以生物相容性高分子薄膜与移植部位直接接触的方式进行移植。

关于构成生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子的具体例及优选的范围，与构成生物相容性高分子的多孔体的生物相容性高分子的情况相同，具体而言，与本说明书中的上述(1-1)生物相容性高分子、(1-2)交联及(1-3)重组明胶中所记载的内容相同。另外，构成生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子可以与构成生物相容性高分子的多孔体的生物相容性高分子相同，也可以不同。

生物相容性高分子薄膜的制造方法并无特别限定，能够通过常规方法来实施。例如，将生物相容性高分子的水溶液浇注到塑料托盘，并通过在低温下(例如，冰箱中等)进行干燥而能够制造生物相容性高分子薄膜。

生物相容性高分子薄膜能够进行交联。当进行交联时，交联度并无特别限定，通常为4～15，更优选为6～13，进一步优选为4～8，尤其优选为5～7。交联度为每一分子的交联数。交联度的测定能够利用实施例的[10]交联度测定方法中所记载的TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法来实施。

生物相容性高分子薄膜的降解速度根据交联度而变动。生物相容性高分子薄膜的降解速度能够通过后述实施例的[11]降解速度的测定方法中所记载的方法来进行测定及评价。

具体而言，向预先测定了质量的管添加5mg的试样(薄膜)，并记录实际添加量。将2.5mg的源自放线菌的胶原酶溶解于50ml的磷酸缓冲生理盐水(PBS)，从而得到胶原酶溶液。将1ml的该胶原酶溶液添加于添加有试样的管中，并通过涡流混合后，在37℃下震荡规定时间(＝T)。然后，将管以10000G离心1分钟，并通过吸液管去除上清液。进而，将1ml的超纯水添加到管中，涡流后，将管以10000G离心1分钟，并通过吸液管去除上清液。将该操作再重复一次。然后，冷冻干燥试样，并记录添加有试样的管的质量。薄膜的降解速度根据以下的式(式4)计算。

(式4)降解速度＝((W-We)-wo)/wo/T

式4中，W表示冻结干燥后记录的添加有试样的管的质量，We表示预先记录的管的空质量。wo表示试样的实际添加量。T表示在胶原酶溶液中的振荡时间。

通过上述方法测定的生物相容性高分子薄膜的降解速度并无特别限定，通常为0.1～20[质量％/小时]，优选为0.5～20[质量％/小时]，更优选为1～10[质量％/小时]，尤其优选为5～10[质量％/小时]。

(4)软骨再生材料的制造方法

本发明还提供上述的本发明的软骨再生材料的制造方法。

上述制造方法包括：

工序C，提供生物相容性高分子薄膜。

工序A能够如本说明书中的上述“(1-4)生物相容性高分子的多孔体的制造方法”中所记载的那样实施。工序A中，优选能够在将包括生物相容性高分子的水溶液搅拌之后进行冷冻干燥来得到多孔体。

工序B为对多孔体接种软骨细胞而进行培养的工序。针对多孔体的软骨细胞的接种及培养能够通过常规方法进行。

通过调节软骨细胞的相对于多孔体的使用量及培养时间，能够调节多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的软骨基质所存在的区域的比例(移植面侧的软骨基质填充比例)及多孔体的关节腔面的表面至150μm的厚度的区域中的软骨基质所存在的区域的比例(关节腔面侧的软骨基质填充比例)。

工序C为提供生物相容性高分子薄膜的工序。如本说明书中的上述“(3)生物相容性高分子薄膜”中所记载，能够提供生物相容性高分子薄膜。

(5)软骨再生材料的使用方法

本发明的软骨再生材料能够以对软骨缺损的疾病部位移植细胞的目的使用。作为伴随软骨缺损的疾病，能够列举变形性关节炎、骨软骨缺损、剥脱性骨软骨炎、外伤性软骨损伤、骨头关节炎、复发性多发软骨炎、软骨发育不全症、椎间盘损伤或椎间盘突出等，但并无特别限定。

作为移植方法，可列举使用了切割、注射、关节镜、内窥镜等的方法。本发明的软骨再生材料与细胞片等细胞移植物不同，并能够缩小软骨再生材料的尺寸，因此能够实现所谓基于注射的移植的微创移植方法。

并且，如实施例的“[19]有软骨基质的(软骨基质填充比例充分的)海绵的分割移植的有效性评价”中所记载，实际证实了即使将本发明的软骨再生材料分割移植的情况下也观察到软骨再生。因此，还能够在将包括软骨细胞及软骨基质的多孔体分割一次之后移植到缺损部位。

而且，如实施例的“[20]针对缺损部位的固定是否稳妥的验证”中所记载，本发明的软骨再生材料在移植后能够通过销将软骨再生材料固定于缺损部位。销的原材料并无特别限定，但优选使用生物相容性高分子。关于构成销的生物相容性高分子的具体例及优选范围，与构成生物相容性高分子的多孔体的生物相容性高分子的情况相同，具体而言，如本说明书中的上述(1-1)生物相容性高分子、(1-2)交联及(1-3)重组明胶中所记载。另外，构成销的生物相容性高分子可以与构成生物相容性高分子的多孔体的生物相容性高分子相同，也可以不同。

将本发明的软骨再生材料进行移植时的量能够根据疾病的状态等适当选择，但作为移植的细胞数优选1.0×10⁴个细胞/cm³～2.0×10⁷个细胞/cm³，更优选2.5×10⁵个细胞/cm³～5.0×10⁶个细胞/cm³。

作为本发明的软骨再生材料的移植次数，可以仅移植一次，且能够根据需要进行两次以上的移植。

(6)用途及软骨再生方法

根据本发明，可提供一种用于软骨再生的治疗的软骨再生材料，该软骨再生材料包括生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜，上述多孔体含有软骨细胞及软骨基质，且在上述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在上述软骨基质。各构成成分的优选范围与本说明书中的在以上叙述的内容相同。

根据本发明，可提供一种软骨再生方法，该软骨再生方法包括将上述的本发明的软骨再生材料移植到需要软骨再生的患者的工序。软骨再生材料的各构成成分的优选范围与本说明书中的在以上叙述的内容相同。

进而根据本发明，可提供一种用于制造软骨再生材料的生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜的使用，其中，上述多孔体含有软骨细胞及软骨基质，且在上述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在上述软骨基质。关于生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜的优选范围与本说明书中的在以上叙述的内容相同。

通过以下实施例对本发明进行进一步具体的说明，但本发明并不限定于以下实施例。

实施例

[1]重组肽(重组明胶)

作为重组肽(重组明胶)准备了以下CBE3(记载于国际公开WO2008/103041号公报中)。

CBE3：

分子量：51.6kD

结构：GAP[(GXY)₆₃]₃G

氨基酸数：571个

RGD序列：12个

亚氨基酸含量：33％

大致100％的氨基酸为GXY的重复结构。CBE3的氨基酸序列中不含有丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。

等电点：9.34

GRAVY值：-0.682

1/IOB值：0.323

氨基酸序列(序列表的序列号1)(与国际公开WO2008/103041号公报的序列号3相同。但是将末尾的X修改成“P”)

GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G

并且，本说明书中的多孔体与海绵的定义相同。

[2]重组肽多孔体的制作

[PTFE厚度/圆筒形容器]

准备了底面厚度3mm、直径51mm、侧面厚度8mm、高度25mm的聚四氟乙烯(PTFE)制圆筒杯状容器。将圆筒杯的曲面作为侧面时，侧面被8mm的PTFE密封，底面(平板的圆形)也被3mmPTFE密封。另一方面，上表面呈开放形状。由此，圆筒杯的内径为43mm。以下，将该容器称作PTFE厚度/圆筒形容器。

[铝玻璃板/円筒形容器]

准备了厚度1mm、直径47mm的铝制圆筒杯状容器。将圆筒杯的曲面作为侧面时，侧面被1mm的铝密封，且底面(平板圆形)也被1mm的铝密封。另一方面，上表面呈开放形状。并且，仅对侧面的内部均匀铺满壁厚1mm的特氟龙(注册商标)，其结果圆筒杯的内径为45mm。并且，将该圆筒杯状容器设为在该容器的底面除了铝以外还接合有2.2mm的玻璃板的状态。以下，将该容器称作铝玻璃/圆筒形容器。

[温度差较小的冷冻工序及干燥工序]

对PTFE厚度/圆筒形容器及铝玻璃板/圆筒形容器分别浇注CBE3水溶液，并在真空冷冻干燥机(TF5-85ATNNN：TAKARA.Co.Ltd)内使用冷却棚板从底面冷却了CBE3水溶液。

此时的容器、CBE3水溶液的最终浓度、液量及棚板温度的设定如以下所记载。

条件A：

PTFE厚度/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于棚板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行了1小时的冷冻，之后在-20℃下进行了2小时的冷冻，进而在-40℃下进行了3小时的冷冻，最后在-50℃下进行了1小时的冷冻。关于本冷冻品，在之后将棚板温度返回到-20℃设定而在-20℃下进行24小时的真空干燥，并在24小时后直接在持续进行真空干燥的状态下将棚板温度上升至20℃，且直至真空度充分下降(1.9×10⁵Pa)为止，进一步在20℃下实施了48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。

条件B：

铝玻璃板/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于棚板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行了1小时的冷冻，之后在-20℃下进行了2小时的冷冻，进而在-40℃下进行了3小时的冷冻，最后在-50℃下进行1小时的冷冻。关于本冷冻品，在之后将棚板温度返回到-20℃设定而在-20℃下进行24小时的真空干燥，并在24小时后直接在持续进行真空干燥的状态下将棚板温度上升至20℃，且直至真空度充分下降(1.9×10⁵Pa)为止，进一步在20℃下实施了48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。

条件C：

PTFE厚度/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量10mL。关于棚板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行了1小时的冷冻，之后在-20℃下进行了2小时的冷冻，进而在-40℃下进行了3小时的冷冻，最后在-50℃下进行了1小时的冷冻。关于本冷冻品，在之后将棚板温度返回到-20℃设定而在-20℃下进行24小时的真空干燥，并在24小时后直接在持续进行真空干燥的状态下将棚板温度上升至20℃，且直至真空度充分下降(1.9×10⁵Pa)为止，进一步在20℃下实施了48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。

[3]各冷冻工序中的温度差测定

关于条件A～条件C的每一个，作为在溶液内距离冷却侧最远的部位的液温(非冷却面液温)测定了容器内的圆中心部的液面的液温，并且，作为在溶液内距离冷却侧最近的液温(冷却面液温)测定了容器内的底部的液温。

其结果，各自的温度和其温度差的特性曲线如图1～图3。

根据该图1、图2、图3得知在条件A、条件B、条件C下为如下状态，即在棚板温度-10℃设定区间(降低到-20℃度之前)液温低于作为熔点的0℃，且在该状态下未发生冷冻(未冷冻/过冷却)。并且，在该状态下，冷却面液温与非冷却面液温的温度差为2.5℃以下。然后，将棚板温度进一步降低至-20℃，由此确认到液温急速上升至0℃附近的时刻，在此得知产生凝固热且开始冷冻。并且，还确认到在该时刻实际开始形成冰。然后，温度在0℃附近经过了一定时间。在此，呈存在水和冰的混合物的状态。最后，温度再次从0℃开始降低，但此时无液体部分而成为冰。因此，所测定的温度为冰内部的固体温度，即并非液温。

以下，关于条件A、条件B、条件C，记载非冷却面的液温成为熔点(0℃)时的温度差、将棚板温度从-10℃降低至-20℃紧前的温度差、产生凝固热紧前的温度差。另外，本说明书中所述的“紧前的温度差”表示在本次活动的1秒钟前至20秒钟前的期间能够检测的温度差内最大的温度差。

条件A

非冷却面的液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.1℃

从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.2℃

产生凝固热紧前的温度差：1.1℃

条件B

非冷却面的液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.0℃

从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.1℃

产生凝固热紧前的温度差：0.9℃

条件C

非冷却面的液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.8℃

从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：1.1℃

产生凝固热紧前的温度差：2.1℃

以下，将这些称作“温度差较小的冷冻工序/多孔体”。

[4]含1质量％乙醇的溶液中的温度差较小的冷冻工序及干燥工序

对PTFE厚度/圆筒形容器及铝玻璃板/圆筒形容器分别浇注含1质量％(w/w)乙醇的CBE3水溶液，在真空冷冻干燥机(TF5-85ATNNN：TAKARA.Co.Ltd)内使用冷却棚板从底面冷却了CBE3水溶液。通过设为含最终浓度为1质量％的乙醇的水溶液，熔点成为-0.4℃。乙醇/水浓度中的熔点变化根据文献“Picke ring S.U.：A Study of the Properties ofsome Strong Solutions.J.Chem.Soc.London 63(1893)998-1027”计算出。

条件AA：

PTFE厚度/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、乙醇最终浓度1质量％、水溶液量4mL。关于棚板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行1小时的冷冻，之后在-20℃下进行了2小时的冷冻，进而在-40℃下进行了3小时的冷冻，最后在-50℃下进行了1小时的冷冻。关于本冷冻品，在之后将棚板温度返回到-20℃设定而在-20℃下进行24小时的真空干燥，并在24小时后直接在持续进行真空干燥的状态下将棚板温度上升至20℃，且直至真空度充分下降为止，进一步在20℃下实施了48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。

条件BB：

铝玻璃板/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、乙醇最终浓度1质量％、水溶液量4mL。关于棚板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行1小时的冷冻，之后在-20℃下进行了2小时的冷冻，进而在-40℃下进行了3小时的冷冻，最后在-50℃下进行了1小时的冷冻。关于本冷冻品，在之后将棚板温度返回到-20℃设定而在-20℃下进行24小时的真空干燥，并在24小时后直接在持续进行真空干燥的状态下将棚板温度上升至20℃，且直至真空度充分下降为止，进一步在20℃下实施48了小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。

[含1质量％乙醇溶液的冷冻工序中的温度差测定]

关于条件AA及条件BB，作为在溶液内距离冷却侧最远的部位的液温(非冷却面液温)测定了容器内的圆中心部的液面的液温，并且，作为在溶液内距离冷却侧最近的液温(冷却面液温)测定了容器内的底部的液温。另外，在此1质量％乙醇成为溶剂，因此溶剂熔点成为-0.4℃。乙醇/水浓度比中的熔点变化根据文献“Pickering S.U.：A Study of theProperties of some Strong Solutions.J.Chem.Soc.London 63(1893)998-1027”计算出。

其结果，各自的温度和该温度差的特性曲线如图4及图5。从图4及图5得知在条件AA及条件BB下为如下状态，即在棚板温度-10℃的设定区间液温低于作为熔点的-0.4℃，且在该状态下未发生冷冻(未冷冻/过冷却)。并且，在该状态下，冷却面液温与非冷却面液温的温度差为2℃以下。然后，将棚板温度进一步降低至-20℃，由此确认到液温急速上升至-0.4℃附近的时刻，在此得知产生凝固热且开始冷冻。并且，还确认到在该时刻实际开始形成冰。然后，温度在-0.4℃附近经过了一定时间。在此，呈存在水和冰的混合物的状态。最后，温度再次从0℃开始降低，但此时无液体部分而成为冰。因此，所测定的温度为冰内部的固体温度，即并非液温。

以下，关于条件AA、条件BB，记载非冷却面的液温为熔点(-0.4℃)时的温度差、将棚板温度从-10℃降低至-20℃紧前的温度差、产生凝固热紧前的温度差。

条件AA

非冷却面的液温成为熔点(-0.4℃)时的温度差：0.8℃

从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.3℃

产生凝固热紧前的温度差：0.8℃

条件BB

非冷却面的液温成为熔点(-0.4℃)时的温度差：1.3℃

从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.0℃

产生凝固热紧前的温度差：1.3℃

从这些结果得知即使在条件AA及条件BB下也与条件A及条件B相同，能够作为“温度差较小的冷冻工序/多孔体”而制作。

[5]重组肽薄层冷冻多孔体的制作

准备了厚度1mm、直径47mm的铝制圆筒杯状容器。圆筒杯在将曲面作为侧面时，侧面被1mm的铝密封，底面(平板的圆形状)也被1mm的铝密封。另一方面，上表面呈开放的形状。并且，仅在侧面的内部均匀地铺满壁厚1mm的特氟龙(注册商标)，其结果圆筒杯的内径为45mm。以下，将该容器称作圆筒形容器。

制备CBE3水溶液，并将该CBE3水溶液浇注到圆筒形容器。在冷冻库内使用冷却棚板从底面冷却了CBE3水溶液。此时，冷却棚板的温度、夹在棚板与圆筒形容器之间的隔热板(玻璃板)的厚度、所添加的CBE3水溶液的最终浓度及水溶液量如以下所记载。棚板温度为-40℃，玻璃板的厚度为2.2mm，CBE3水溶液的最终浓度为4.0％，水溶液量为4mL。将如此得到的冷冻CBE3块体冷冻干燥而得到了CBE3多孔体。以下，将如此得到的多孔体称作薄层冷冻多孔体。

[6]基于搅拌的重组肽多孔体的制作

使用重组肽CBE3制作了搅拌法多孔体。本例中，以以下组成制备溶液，并在4℃下通过均料器(AM-11、NIHONSEIKI制)以17，000rpm搅拌30秒钟，移到铝制杯容器而在-80℃下淬冷3小时。然后，通过冷冻干燥机进行3天的冷冻干燥，从而得到了多孔体。以下，将如此得到的多孔体称作搅拌法多孔体。

组成：10质量％的多孔体10mL份(CBE3：1000mg、超纯水：9895μL、1摩尔/L HCl：105μL)

[7]重组肽多孔体的交联

关于在上述[2]及[3]中得到的温度差较小的冷冻工序/多孔体、在上述[4]中得到的温度差较小的含乙醇冷冻工序/多孔体、在上述[5]中得到的薄层冷冻多孔体及在上述[6]中得到的搅拌法多孔体，对各个多孔体在减压下以160℃实施了20小时的热交联。

[8]重组肽多孔体的空孔尺寸的评价

使在上述[7]中得到的各种多孔体在生理盐水中溶胀了充分时间。然后，通过切片机制作冷冻组织切片，并制作了HE(苏木素-伊红)染色标本。根据标本准备实际尺寸1.5mm大小的截面像，并测量每一个空孔面积，之后，求出将上述面积换算成圆时的圆直径而作为空孔尺寸。将该空孔的20处以上的平均值作为平均空孔尺寸。其结果，源自上述[2]及[3]的温度差较小的冷冻工序/多孔体的平均空孔尺寸为59μm，源自上述[4]的温度差较小的含乙醇的冷冻工序/多孔体为72μm，源自上述[6]的搅拌法多孔体为82μm，源自上述[5]的薄层冷冻多孔体为45μm。

[9]重组肽薄膜的制作方法

制备4质量％浓度的CBE3水溶液，将该CBE3水溶液5.4ml浇注到设置有硅框架(8cm×3.5cm)的塑料托盘。将该塑料托盘移到冷藏库内，且进行干燥直至无水分而得到了重组肽薄膜。从塑料托盘/硅制框取出上述重组肽薄膜，并在减压下并在160℃下实施热交联(交联小时为48小时、72小时)，从而得到了动物实验。

[10]交联度的测定方法

计算出上述[9]中所制作的薄膜的交联度(每一分子的交联数)。测定时利用了TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法。

＜样品制备＞

向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4质量％NaHCO₃水溶液(1mL)及1质量％TNBS水溶液(2mL)，并在37℃下将混合物振荡3小时。然后，添加37质量％盐酸(10mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上而制成样品。

＜空白调整＞

向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4质量％NaHCO₃水溶液(1mL)及1质量％TNBS水溶液(2mL)，紧接着添加37质量％盐酸(3mL)，并在37℃下将混合物振荡了3小时。然后，添加37质量％盐酸(7mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上而制成空白。

测定用纯水稀释10倍的样品及空白的吸光度(345nm)，并根据以下(式2)及(式3)计算出交联度(每一分子的交联数)。

(式2)(As-Ab)/14600×V/w

(式2)表示每1g重组肽的赖氨酸量(摩尔当量)。

式2中，As表示样品吸光度，Ab表示空白吸光度，V表示反应液量(g)，w表示重组肽质量(mg)。

(式3)1-(样品(式1)/未交联重组肽(式1))×34

(式3)表示每一分子的交联数。

其结果，上述[9]的进行了48小时交联的薄膜的交联度为6，且上述[6]的进行了72小时交联的薄膜的交联度为13。以同样的方式测定的上述[7]的多孔体的交联度为9。

[11]降解速度的测定方法

对上述[9]中制作的薄膜的降解速度进行评价。

对预先测定了质量的塑料制管添加在上述[9]中制作的5mg的式样，并记录了实际添加量。

将2.5mg的源自放线菌的胶原酶溶解于50ml的磷酸缓冲生理盐水(PBS)而得到了胶原酶溶液。将1ml的该胶原酶溶液添加到已添加式样的管中，并通过涡流混合后，在37℃下振荡了5小时。然后，将管以10000G离心1分钟，并利用吸液管去除了上清液。而且，将1ml的超纯水添加到管，并通过涡流混合后，将管以10000G离心1分钟，并利用吸液管去除了上清液。将该操作再次反复进行一次。然后，将试样冷冻干燥，并记录了添加有试样的管的质量。

根据以下的式(式4)计算出薄膜的降解速度。

(式4)降解速度＝((W-We)-wo)/wo/T

式4中，W表示在冷冻干燥后记录的添加有试样的管的质量，We表示预先记录的管的空质量。wo表示试样的实际添加量。T表示在胶原酶溶液中的振荡时间，且本次试验中为5小时。

其结果，上述[9]的薄膜中，在48小时的交联中降解速度为6.9[质量％/小时]，在72小时的交联中降解速度为0.5[质量％/小时]。

[12]兔子软骨细胞的提取方法

通过戊巴比妥(Somnopentyl)静脉注射屠宰3～4周龄的日本白色家兔，并从大腿骨、胫骨(上脘骨)提取了软骨组织。利用聚乙烯吡咯酮碘(isodine)稀释液进行消毒，并利用Dulbecco磷酸缓冲生理盐水(DPBS)进行清洗，且添加0.25质量％的胰蛋白酶而在37℃下反应约1小时之后，并利用3000单位/mL的胶原酶类型IX溶液反应约3小时，使消化物通过细胞滤网，从而去除了残渣。然后，添加培养基，并为了去除胶原酶而进行离心，去除上清液之后添加了培养基。在该工序中得到了兔子软骨细胞。

另外，上述中所使用的培养基均为软骨细胞培养用培养基，且为由Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)、10体积％的胎牛血清(FBS)、20mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、50μg/mL的磷酸L-抗坏血酸镁、0.25μg/mL的两性霉素B、50μg/mL的庆大霉素构成的培养基。以下记载为培养基时也都使用这些。

[13]软骨基质填充比例不同的兔子软骨细胞培养海绵的制作

将上述[6]中准备的搅拌法多孔体(空孔尺寸82μm)切取成直径5mm、厚度2mm，而且将在上述[12]中准备的兔子软骨细胞以5.0×10⁶个细胞/cm³浓度接种，并实施了培养。由此，得到了有软骨基质的海绵。并且，在此还准备没有接种兔子软骨细胞的物体，并将其作为无软骨基质的海绵而准备。另外，使用了在上述[7]及[8]中准备的温度差较小的含乙醇的冷冻工序/多孔体(空孔尺寸为72μm)的情况下，以下结果也得到了相同的结果，因此以下作为代表例而提示了源自上述[6]的搅拌法多孔体的数据。

[14]对底面的软骨基质填充比例不同的情况的评价

在上述[13]中接种细胞并培养的有软骨基质的海绵能够随着培养经过(3天、7天、14天、21天、28天)而制作底面的软骨基质填充比例不同的有软骨基质的海绵。关于该底面的软骨基质填充比例的测定，通过制作有软骨基质的海绵的组织切片(甲醛固定、石蜡包埋)，并进行藏红O染色而将截面可视化来进行了评价(图8～图10)。

尤其，着眼于如此制作的组织染色切片的底面部分的150μm的厚度区域，关于该150μm的厚度的区域，存在软骨基质，因此测定了因藏红O染色而呈阳性的区域的面积。并且，求出藏红O染色阳性区域的面积相对于150μm的厚度的整个区域的面积体的比例而作为“150μm层中的软骨基质填充比例”。其结果，在上述[13]中制作的有软骨基质的海绵的“150μm层中的软骨基质填充比例”为2.9％、5.4％、20％、33％、90％。

在上述[13]及[14]中制作的“150μm层中的软骨基质填充比例”为2.9％、5.4％、20％、33％、90％的所有海绵中，在关节腔面的表面至150μm的厚度的区域中的30％以上的区域存在软骨基质。

[15]兔子软骨缺损模型的制作

在22周龄的日本白色家兔(KITAYAMA LABES Co.,Ltd.，、SPF)的雄性兔子的膝关节部位制作了直径5mm、深度2mm左右的骨软骨缺损。

[16]兔子软骨缺损模型中的样品移植评价(一个月)(软骨基质填充比例的影响)

对在上述[15]制作的兔子软骨缺损部位移植各种评价对象的样品，在移植后一个月的时点进行剖检，从而制作了移植部位周边的骨软骨组织切片。将组织进行甲醛固定之后，进行石蜡包埋，从而制作了包含移植物的组织切片。关于切片染色，进行了HE染色(苏木素-伊红染色)或藏红O染色或藏红O及固绿染色。

另外，在此使用薄膜的情况下的薄膜使用将在上述[9]中准备的薄膜(因通过交联度6和13而得到相同的结果，因此在该实施例中不进行区分)切取成缺损的底面积大小(直径5mm)的薄膜。并且，使用薄膜的情况下，以薄膜存在于移植面(下骨侧)的形态进行了移植。关于对兔子骨软骨缺损部位移植时的海绵与薄膜的位置关系，示于图19。

将已评价的样品和其结果示于图6～12。并且，以以下基准评价了软骨再生及纤维性软组织的浸润抑制。将评价结果的总结示于表1。

软骨再生

A：观察到良好的软骨再生。

B：在一部分观察到少许软骨再生。

C：未观察到软骨再生。

纤维性软组织的浸润抑制

A：观察到纤维性软组织的浸润抑制。

B：观察到一些纤维性软组织的浸润抑制。

C：未观察到纤维性软组织的浸润抑制。

D：无法抑制炎症浸润，且纤维性软组织的浸润抑制不良。

[表1]

从上述结果得知在“150μm层中的软骨基质填充比例”充分的情况(20％、33％、90％)，并且将薄膜设置在底面(移植面)的情况下，带来了良好的纤维性软组织的浸润抑制及良好的软骨再生。

[17]兔子软骨缺损模型中的样品移植评价(长期6个月)(薄膜交联度的影响)

以与上述[16]相同的方式，对在上述[15]中制作的兔子软骨缺损部位移植了相同的软骨基质填充比例(33％)的有软骨基质的海绵(上述[13]及[14])和交联度不同的薄膜(上述[9]及[10]的交联度6及13)。以薄膜存在于移植面(下骨侧)的方式进行了移植。在移植后6个月的时点进行剖检，从而制作了移植部位周边的骨软骨组织切片。将组织进行甲醛固定之后，进行石蜡包埋，从而制作了包含移植物的组织切片。关于切片染色，进行了HE染色(苏木素-伊红染色)或藏红O染色或藏红O及固绿染色。

另外，在此使用了薄膜的情况下的薄膜是指使用了将在上述[9]中准备的薄膜的两个交联度(在上述[10]测定)的薄膜(交联度6和13)分别切取成缺损的底面积大小(直径5mm)的薄膜。

将其结果示于图13。如图13所示，不管是在移植了有软骨基质的(软骨基质填充比例33％)海绵和交联度6的薄膜的情况下，还是在移植了有软骨基质的(软骨基质填充比例33％)海绵和交联度13的薄膜的情况下，均表示了良好的纤维性软组织的浸润抑制(评价A)和充分良好的软骨再生(评价A以上)。而且，明确可知在使用了交联度6的薄膜的情况下，与使用了交联度13的薄膜的情况相比，更明显观察到良好的软骨再生(评价AA)，且意外得知在使用了交联度6的薄膜的情况下产生更加良好结果。

[18]薄膜的生物降解性

将在上述[9]、[10]中制作的交联度13的薄膜留置于在上述[15]中制作的兔子软骨缺损部位，并在经过一个月后和两个月后进行剖检，从而制作了移植部位周边的骨软骨组织切片。将组织进行甲醛固定之后，进行石蜡包埋，从而制作了包含移植物的组织切片。关于切片染色，进行了HE染色(苏木素-伊红染色)。

将其结果示于图14。如图14所示，在移植后一个月中还几乎未降解的交联度13的薄膜也在两个月后明确显示明显从薄膜的端部进行降解。从而，证实了所使用的薄膜具有生物降解性。

[19]有软骨基质的(软骨基质填充比例充分的)海绵的分割移植的有效性评价

还希望在实际医疗现场能够使用关节镜进行移植治疗。为了能够以关节镜进行移植，需要能够通过关节镜入口。因此，即使在以所分割的移植物填满骨软骨缺损的情况下，关键在于确认与未分割的情况相同的软骨再生。作为对其进行评价的方法，将具有充分的软骨基质填充比例的有软骨基质的海绵分割一次之后移植到缺损部位的情况下，评价是否在分割部分观察到软骨再生。

将在上述[13]及[14]中制作的有软骨基质的海绵(软骨基质填充比例90％)如图15那样进行分割之后，与在上述[9]及[10]制作的交联度13的薄膜一同移植到在上述[15]制作的兔子软骨缺损部位。移植以薄膜存在于移植面(下骨侧)的方式进行。在移植后一个月的时点进行剖检，从而制作了移植部位周边的骨软骨组织切片。将组织进行甲醛固定之后，进行石蜡包埋，从而制作了包含移植物的组织切片。关于切片染色，进行了HE染色(苏木素-伊红染色)或藏红O染色或藏红O及固绿染色。

另外，在此使用薄膜的情况下的薄膜是指，使用了将在上述[9]中准备的交联度13(在上述[10]测定)的薄膜切取成缺损的底面积大(直径5mm)的薄膜。

将其结果示于图15。如图15所示，在所分割的部位也观察到良好的软骨再生。从该结果可知即使在进行分割而移植的情况下，也具有充分的软骨基质填充比例和薄膜，因此表示充分的软骨再生(评价A)和充分的纤维性软组织的浸润抑制(评价A)。由此，观察到为了通过关节镜的入口，即使分割一次之后进行移植也不会影响有效性。

[20]针对缺损部位的固定是否稳妥的验证

在实际医疗现场，在移植后，产生欲利用销将移植物固定在缺损部位的需求的情况较多。关于是否能够进行该固定，需要即使利用销在移植物打孔的情况下，也不会对软骨再生赋予重大的负面影响。作为对其进行评价的方法，将具有充分的软骨基质填充比例的有软骨基质的海绵留置于骨软骨缺损部位之后，实施例利用固定销打穿孔的验证。即使在打贯穿至有软骨基质的海绵及薄膜以及缺损底面部的骨头的穿孔的情况下，也验证不会对软骨再生产生坏影响。

将在上述[13]及[14]中制作的有软骨基质的海绵(软骨基质填充比例90％)和在上述[9]及[10]中制作的交联度13的薄膜移植到在上述[15]制作的兔子软骨缺损部位，之后，利用直径0.8mm或直径1.5mm的克氏针，打至海绵、薄膜及下骨的穿孔。在存在该穿孔的状态下，直接在一个月的时点进行剖检，从而制作了移植部位周边的骨软骨组织切片。将组织进行甲醛固定之后，进行石蜡包埋，从而制作了包含移植物的组织切片。关于切片染色，进行了HE染色(苏木素-伊红染色)或藏红O染色或藏红O及固绿染色。

另外，在此使用薄膜的情况下的薄膜为将在上述[9]中准备的交联度13(在上述[10]测定)的薄膜切取成缺损的底面积大小(直径5mm)的薄膜，且以薄膜存在于移植面(下骨侧)的形态设置。

将其结果示于图16。如图16所示，明确可知即使打直径0.8mm、直径1.5mm的穿孔的情况下，也不影响一个月后的软骨再生(评价A)、纤维性软组织的浸润抑制(评价A)，且显示良好的再生效果。由此，示出能够利用固定销扎刺移植物而将其固定的情况。

[21]基于重组肽的销的制作

作为如上述[19]那样进行固定的固定销，要求具有在扎刺于在骨头上制作的穿孔之后，不会脱落的能力。同时，还要求具有生物吸收性。已有的产品中例如能够使用利用聚-L-乳酸制作的GRANDFIX(GUNZE LIMITED.制)等。

而且，通过使用上述[1]的CBE3而能够制作重组肽制销。使用上述[1]的CBE3制备了10质量％的CBE3水溶液。然后，对图17及图18所示的特氟龙(注册商标)制模型浇注上述水溶液，并使其干燥之后，在减压下并在160℃下进行20小时的热处理，由此实施热交联而制作了CBE3制销(直径1mm、长度5mm)。

另一方面，作为骨头的替代物，准备松质骨试验材料，利用直径0.8mm的克氏针(K-wire)在该松质骨试验材料上制作了穿孔。对在松质骨试验材料上制成的直径0.8mm的孔扎入上述的CBE3制销，并使其在水中充分溶胀。该CBE3制销在留置一天之后也未脱落而维持其形状，从而观察到其为能够使用于固定的销(图18)。

序列表

<110> 富士胶片公司

<120> 软骨再生材料及其制造方法

<130> 15F02955

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 571

<212> PRT

<213> 重组体()

<400> 1

Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly

1 5 10 15

Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu

20 25 30

Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro

35 40 45

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly

50 55 60

Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala

65 70 75 80

Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro

85 90 95

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly

100 105 110

Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val

115 120 125

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro

130 135 140

Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly

145 150 155 160

Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala

165 170 175

Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro

180 185 190

Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly

195 200 205

Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp

210 215 220

Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln

225 230 235 240

Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly

245 250 255

Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys

260 265 270

Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg

275 280 285

Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly

290 295 300

Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu

305 310 315 320

Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro

325 330 335

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly

340 345 350

Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala

355 360 365

Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro

370 375 380

Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly

385 390 395 400

Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro

405 410 415

Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro

420 425 430

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly

435 440 445

Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val

450 455 460

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala

465 470 475 480

Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly

485 490 495

Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro

500 505 510

Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln

515 520 525

Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly

530 535 540

Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys

545 550 555 560

Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly

565 570

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> 人工序列描述: 接头序列

<400> 2

Arg Glu Asp Val

1

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> 人工序列描述: 接头序列

<400> 3

Tyr Ile Gly Ser Arg

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> 人工序列描述: 接头序列

<400> 4

Pro Asp Ser Gly Arg

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> 人工序列描述: 接头序列

<400> 5

Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> 人工序列描述: 接头序列

<400> 6

Leu Gly Thr Ile Pro Gly

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> 人工序列描述: 接头序列

<400> 7

Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile

1 5 10

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> 人工序列描述: 接头序列

<400> 8

Ile Lys Val Ala Val

1 5

<210> 9

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> 人工序列描述: 接头序列

<400> 9

Asp Gly Glu Ala

1

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> 人工序列描述: 接头序列

<400> 10

Glu Arg Gly Asp

1

Claims

1.一种软骨再生材料，其包括生物相容性高分子的多孔体和生物相容性高分子薄膜，其中，

所述多孔体含有软骨细胞及软骨基质，且在所述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在所述软骨基质。

2.根据权利要求1所述的软骨再生材料，其中，

在所述多孔体的移植面的表面至150μm的厚度的区域中的20％以上的区域存在所述软骨基质。

3.根据权利要求1或2所述的软骨再生材料，其中，

所述多孔体的生物相容性高分子为重组肽或化学合成肽。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述多孔体的生物相容性高分子为重组明胶或化学合成明胶。

5.根据权利要求4所述的软骨再生材料，其中，

所述重组明胶或化学合成明胶由下述式1表示，

式1：A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B

6.根据权利要求4或5所述的软骨再生材料，其中，

所述重组明胶或化学合成明胶为如下肽中的任一个：

包括序列号1中所记载的氨基酸序列的肽；

包括与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有生物相容性的肽。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述多孔体通过冷冻干燥包括生物相容性高分子的水溶液而得到。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子薄膜为用于将所述多孔体的移植面的一部分或全部与移植部位隔离的薄膜。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子为重组明胶或化学合成明胶。

10.根据权利要求9所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子由下述式1表示，

式1：A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B

11.根据权利要求9或10所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子为如下肽中的任一个：

包括序列号1中所记载的氨基酸序列的肽；

12.根据权利要求1至11中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子的交联度为4～15。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子的交联度为4～8。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子的由下述式4表示的降解速度为0.1～20质量％/小时，

式4：降解速度＝((W-We)-wo)/wo/T

15.根据权利要求1至14中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子的由下述式4表示的降解速度为5～10质量％/小时，

式4：降解速度＝((W-We)-wo)/wo/T

16.根据权利要求1至15中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述软骨细胞为选自包括源自关节软骨的软骨细胞、源自耳廓软骨的软骨细胞、源自鼻软骨的软骨细胞、源自iPS细胞的软骨细胞、源自ES细胞的软骨细胞、源自间充质干细胞的软骨细胞及通过直接重新编程法得到的软骨细胞的组中的至少一种软骨细胞。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的软骨再生材料，其中，

在所述多孔体的关节腔面的表面至150μm的厚度的区域中的10％以上的区域存在所述软骨基质。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的软骨再生材料，其还包括生物相容性高分子的销。

19.一种权利要求1至17中任一项所述的软骨再生材料的制造方法，其包括：

工序B，对在所述工序A中得到的多孔体接种软骨细胞而进行培养；及

工序C，提供生物相容性高分子薄膜。

20.根据权利要求19所述的软骨再生材料的制造方法，其中，

在所述工序A中，在搅拌包括生物相容性高分子的水溶液之后，进行冷冻干燥而得到多孔体。