CN104244999A

CN104244999A - 组织修复材料的制造方法

Info

Publication number: CN104244999A
Application number: CN201380013634.4A
Authority: CN
Inventors: 大屋章二; 酒井秀一; 川上爱; 平塚崇浩; 伏见英生; 山口雄大; 西村一郎; 大野由尊; 小椋泉
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-03-12
Also published as: JP5902112B2; KR101638834B1; EP2826494A1; WO2013137268A1; US20140378662A1; JP2013215562A; EP2826494B1; EP2826494A4; KR20140122761A; CN104244999B

Abstract

本发明涉及一种组织修复材料的制造方法，其包含下述(a)～(c)的工序：(a)使用含有溶解于水性介质的明胶的明胶溶液来获得含有该明胶且具有网眼结构的含明胶中间体，(b)进行所述含明胶中间体的干燥，(c)在所述含明胶中间体的干燥之前或之后进行所述明胶的交联。

Description

组织修复材料的制造方法

技术领域

本发明涉及组织修复材料的制造方法。

背景技术

目前，试图进行陷于功能障碍或功能衰竭的生物体组织/脏器的再生的再生医疗的实用化有所发展。再生医疗是对仅靠生物体所具有的自然治愈能力无法恢复的生物体组织使用细胞、支架及生长因子这三种因子而再次制造出与原来的组织具有相同形态或功能的新型医疗技术。

在再生医疗领域中，为了补充利用细胞进行的组织修复或者再生等，有利用生物体亲和性高的胶原或明胶的情况。特别是，有将骨或皮肤等三维结构用于组织再生的情况，以良好的组织再生为目的，进行了各种改良。

例如，在国际公开第2011/027850号小册子中公开了含有重组明胶且利用补填材料载体本身可促进骨再生的骨再生剂及骨补填制剂。

另外，日本特开平8-196618号公报中公开了由存在多个空孔的海绵状胶原基质构成的细胞介入性胶原制剂。

发明内容

发明欲解决的技术问题

但是，上述技术从获得促进骨再生的组织修复材料的观点出发，均有改善的余地。

本发明的目的在于提供可获得具有良好的组织再生能力的组织修复材料的组织修复材料的制造方法。

用于解决技术问题的手段

本发明如下所述。

[1]一种组织修复材料的制造方法，其包含下述工序(a)～(c)：

(a)使用含有溶解于水性介质的明胶的明胶溶液来获得含有该明胶且具有网眼结构的含明胶中间体，(b)进行所述含明胶中间体的干燥，(c)在所述含明胶中间体的干燥之前或之后进行所述明胶的交联。

[2]上述[1]所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述干燥为冷冻干燥。

[3]上述[1]或[2]所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述明胶为重组明胶。

[4]上述[1]～[3]中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述含明胶中间体的网眼的孔径至少为10μm以上。

[5]上述[1]～[4]中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其包含下述工序：对所述明胶溶液进行搅拌，使所述明胶溶液中产生气泡，之后对该明胶溶液进行凝胶化，从而获得所述含明胶中间体。

[6]上述[1]～[4]中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其包含下述工序：通过在－100℃～－10℃的温度下对所述明胶溶液进行冷冻，从而获得所述含明胶中间体。

[7]上述[1]～[6]中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述明胶的交联为使用交联剂、在所述干燥之前进行。

[8]上述[1]～[6]中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述明胶的交联通过100℃～200℃条件下的加热、在所述干燥之后进行。

[9]上述[1]～[8]中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述明胶的交联通过加热进行，并且所述明胶的交联按照在所制造的组织修复材料5mg中添加1ml的1摩尔/L的盐酸并在37℃下处理5小时时的酸分解率达到20％以上的方式进行。

[10]上述[3]～[9]中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述重组明胶具有Gly-X-Y(X及Y表示任意的氨基酸残基)所示的序列的重复单元和细胞粘附信号。

[11]上述[10]所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述重组明胶具有A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B(X及Y表示任意的氨基酸残基、m表示2～10的整数、n表示3～10的整数、A及B各自独立地表示任意的氨基酸残基或氨基酸序列)所示的序列和细胞粘附信号。

[12]上述[11]或[12]所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述重组明胶具有Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)₆₃]₃-Gly(式中，63个X各自独立地表示任意的氨基酸残基、63个Y各自独立地表示任意的氨基酸残基。其中，3个(Gly-X-Y)₆₃可分别相同也可不同)所示的序列和细胞粘附信号。

[13]上述[3]～[12]中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述重组明胶为以下(A)～(C)中的任一者：

(A)序列号1所示的多肽，

(B)具有与由所述(A)的氨基酸序列中的第4个～第192个氨基酸残基构成的部分氨基酸序列具有80％以上序列同源性的部分序列、并且具有组织修复能力的多肽，

(C)由相对于所述(A)的氨基酸序列缺失、替换或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成且具有组织修复能力的多肽。

[14]上述[1]～[13]中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述组织为骨。

[15]通过上述[1]～[14]中任一项所述的组织修复材料的制造方法获得的组织修复材料，其为含有经交联的所述明胶且吸水率以质量基准计为100％以上的多孔质。

发明效果

通过本发明，可以提供能够获得具有良好的组织再生能力的组织修复材料的组织修复材料制造方法

具体实施方式

[组织修复材料的制造方法]

本发明中，“组织修复材料”是指通过植入到生物体内而有助于该部位的组织形成的材料，可以含有细胞也可不含细胞。另外，可以含有也可不含生长因子或药剂等促进生物体的反应的成分。此外，还可以与羟磷灰石等无机材料混合或者制成复合物后应用。

本发明的“组织修复材料”不仅包含有助于植入部位中通常存在的正常组织的形成的材料，还包含促进包括瘢痕组织等在内的非正常组织的形成的材料。

本发明的组织修复材料的制造方法包含下述(a)～(c)的工序：(a)使用含有溶解于水性介质的明胶的明胶溶液来获得含有该明胶且具有网眼结构的含明胶中间体(以下称作中间体制造工序)，(b)进行所述含明胶中间体的干燥(以下称作干燥工序)，(c)在所述含明胶中间体的干燥之前或之后进行所述明胶的交联(以下称作交联工序)。

通过本制造方法，由于在获得含有明胶且具有网眼结构的含明胶中间体之后对其进行干燥，从而获得组织修复材料，因此可获得保持了组织修复的良好形状的组织修复材料。

本说明书中“工序”的用语不仅包含独立的工序，在与其他工序无法明确地区别时只要能够达成本工序所期待的作用，则也包含在本用语中。

另外，本说明书中使用“～”表示的数值范围表示将“～”前后所记载的数值分别作为下限值及上限值并包含在内的范围。

另外，本发明中，关于组合物中的各成分的量，当在组合物中存在多个相当于各成分的物质时，只要没有特别说明，则是指组合物中存在的该多个物质的总量。

本发明中，有时使用本领域公知的单字母表述(例如甘氨酸残基时为“G”)或三字母表述(例如甘氨酸残基时为“Gly”)来表述构成多肽的氨基酸序列。

另外，本发明中的组织修复材料是指经过了干燥工序及交联工序的材料，含明胶中间体是指未经过干燥工序及交联工序中的至少一者的材料。

以下对本发明进行说明。

(a)中间体制造工序

中间体制造工序中，使用含有溶解于水性介质的明胶的明胶溶液来获得含有该明胶且具有网眼结构的含明胶中间体。

所述明胶是指连续含有6个以上Gly-X-Y所示的序列的多肽，多肽中除了Gly-X-Y所示的序列以外，还可以具有1个以上其他氨基酸残基。Gly-X-Y所示的序列是相当于胶原的部分氨基酸序列来源的氨基酸序列的序列，该序列的重复意味着胶原的特征性序列。

多个Gly-X-Y可分别相同也可不同。另外，Gly-X-Y序列中X和Y在各个重复单元中是独立的，可以相同也可不同。Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸残基、X及Y表示除甘氨酸残基以外的任意的氨基酸残基。作为X及Y，优选大量含有亚氨基酸残基，即脯氨酸残基或羟基脯氨酸残基。这种亚氨基酸残基的含有率优选占所述明胶整体的10％～45％。作为所述明胶中的Gly-X-Y的含有率，优选为整体的80％以上、更优选为95％以上、最优选为99％以上。

作为所述明胶，可以是天然型的，天然型可以是至少1个氨基酸残基不同的突变型。另外，作为所述明胶，优选是通过常规方法将碱基序列或氨基酸序列导入到适当的宿主中并使其表达所获得的重组明胶，所述碱基序列或氨基酸序列相对于编码连续具有6个以上所述Gly-X-Y所示的序列的所述胶原的基因的碱基序列或氨基酸序列施有1个以上碱基或氨基酸残基的变更。通过使用这种重组明胶，在提高组织修复能力的同时，与使用天然明胶的情况相比，可以表现出各种特性，例如具有可以避免生物体的排斥反应等不良影响等的优点。

作为所述重组明胶，例如可特别优选地使用EP1014176A2、US6992172、WO2004/85473、WO2008/103041、日本特表2010-519293、日本特表2010-519252、日本特表2010-518833、日本特表2010-519251、WO2010/128672及WO2010/147109等所公开的重组明胶。

另外，所述重组明胶的分子量优选为2kDa以上且100kDa以下、更优选为5kDa以上且90kDa以下、进一步优选为10kDa以上且90kDa以下。

所述重组明胶从生物体亲和性的角度出发，优选进一步含有细胞粘附信号，更优选在一个分子中具有2个以上存在于所述重组明胶的细胞粘附信号。作为这种细胞粘附信号，可以举出RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列的各序列，优选地可以举出RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，特别优选RGD序列。RGD序列中，进一步优选为ERGD序列。

作为所述重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD之间的氨基酸残基数为0～100个、更优选为25～60个。另外，RGD序列优选在这种氨基酸残基数的范围内不均匀地配置。

另外，RGD序列相对于所述重组明胶中的氨基酸残基总数的比例优选至少为0.4％，当重组明胶含有350个以上的氨基酸残基时，优选350个氨基酸残基的各延伸段含有至少1个RGD序列。

所述重组明胶优选每250个氨基酸残基含有至少2个RGD序列、更优选含有至少3个RGD序列、进一步优选含有至少4个RGD序列。但是，所述重组明胶的序列优选为以下方式：(1)不含丝氨酸残基及苏氨酸残基、(2)不含丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、酪氨酸残基及半胱氨酸残基，(3)不含Asp-Arg-Gly-Asp所示的氨基酸序列。所述重组明胶可单独具备该优选序列的方式(1)～(3)，也可组合具备2个以上的方式。

另外，所述重组明胶还可被部分地水解。

所述重组明胶优选具有A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B的重复结构。m表示2～10、优选表示3～5。A及B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。n表示3～100、优选表示15～70、更优选表示50～60。

优选重组明胶用式：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)₆₃]₃-Gly(式中、63个X各自独立地表示氨基酸残基中的任一种，63个Y各自独立地表示氨基酸残基中的任一种。其中，3个(Gly-X-Y)₆₃可分别相同也可不同。)表示。

所述重组明胶的重复单元中优选结合有多个天然存在的胶原的序列单元。作为这里所说的天然存在的胶原，优选地可以举出I型、II型、III型、IV型及V型。更优选地可以举出I型、II型或III型。作为胶原的来源，优选地可以举出人、马、猪、小鼠、大鼠，更优选为人。

所述重组明胶的等电点优选为5～10、更优选为6～10、进一步优选为7～9.5。

作为所述重组明胶的优选方式，可以举出以下方式：(1)未经脱胺化、(2)没有前胶原、(3)没有端肽、(4)利用编码天然胶原的核酸制备的实质上纯粹的胶原用材料。所述重组明胶可以单独具有该优选的方式(1)～(4)、也可组合具备2个以上的方式。

所述重组明胶从组织修复能力高低的角度出发，优选可以为以下(A)～(C)中的任一者。

(A)下述序列号1所示的多肽、

GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)₃G(序列号1)

(B)具有与由所述(A)的氨基酸序列中的第4个～第192个氨基酸残基构成的部分氨基酸序列具有80％以上序列同源性的部分序列，并且具有组织修复能力的多肽、

(C)由相对于所述(A)氨基酸序列缺失、替换或者添加有1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列构成且具有组织修复能力的多肽。

作为所述(B)中的序列同源性，从重组明胶的组织修复能力的观点出发，更优选可以为90％以上、进一步优选可以为95％以上。

其中，本发明中的“序列同源性”是指用下式计算的值。

％序列同源性＝[(相同残基数)/(排列长度)]×100

所述(B)序列中的所述部分氨基酸序列是相当于序列号1所示的序列的重复单元的部分氨基酸序列。所述(B)的多肽中存在多个相当于所述重复单元的部分氨基酸序列时，可以是含有1个以上、优选含有2个以上的序列同源性达到80％以上的重复单元的多肽。

另外，所述(B)中规定的多肽以总的氨基酸残基数计优选含有总氨基酸残基数的80％以上的、与相当于所述重复单元的部分氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的部分序列。

作为所述(B)中规定的多肽的长度，可以为151个～2260个的氨基酸残基数，从交联后的分解性的观点出发，优选为193个以上的氨基酸残基数，从稳定性的观点出发，优选为944个以下的氨基酸残基数，更优选为380个～756个的氨基酸残基数。

另外，所述(C)中规定的多肽也可以是由相对于所述(A)的氨基酸序列缺失、替换或添加有1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列构成且具有组织修复能力的多肽。

作为所述(C)规定的多肽中缺失、替换或添加的氨基酸残基数，可以为1个或数个，虽然根据重组明胶的总氨基酸残基数的不同而不同，但例如可以为2个～15个、优选为2个～5个。

所述重组明胶可通过本领域技术人员公知的基因重组技术来制造，例如可根据EP1014176A2、US6992172、WO2004/85473、WO2008/103041等记载的方法来制造。具体而言，获得编码规定重组明胶的氨基酸序列的基因，将其组装到表达载体中，制作重组表达载体，将其导入至适当的宿主中，制作转化体。通过适当的培养基培养所得转化体，由此生产重组明胶，因此通过将自培养物生产的重组明胶回收，可以制备本发明中使用的重组明胶。

这里，组织修复能力的评价可以使用利用所述重组明胶获得的组织修复材料来进行。评价方法根据目标组织的不同而不同。

例如，为骨组织时，可以通过骨再生能力进行评价。骨再生能力可如下评价：在大鼠的头盖骨上制作规定大小的骨缺损部，将规定量的组织修复材料填充到骨缺损部中后，将皮肤缝合，在手术后的第4周使用微型CT测量骨量，用再生的骨体积与骨缺损部的体积的比例进行评价。

另外，还可利用骨粘接来进行评价。骨粘接能力与骨再生能力评价同样，可如下评价：在骨缺损部中填充组织修复材料之后，将皮肤缝合，在手术后的第4周将所摘取的头部进行HE染色，用所填充的组织修复材料与新生骨不介由纤维性组织而接触的区域的大小进行评价。

当通过任一种评价确认到骨修复能力时，可以将所述重组明胶评价为具有组织修复能力。

作为所述水性介质，只要可将明胶溶解并可用于生物体组织，则无特别限定，例如可以举出水、生理盐水、磷酸缓冲液等在本领域中通常使用的物质。

对于明胶溶液中的所述明胶的含有率，只要是明胶能够溶解的含有率则无特别限定。例如，明胶溶液中的所述明胶的含有率例如优选为0.5质量％～20质量％、更优选为2质量％～16质量％、进一步优选为4质量％～12质量％。通过为所述0.5质量％以上，有强度进一步增高的倾向，通过为20质量％以下，有更易形成均匀性高的网眼结构的倾向。

其中，中间体制造工序中的明胶溶液可以准备已制备品来使用，也可在获得含明胶中间体之前，另外设置制备明胶溶液的工序。

在制备明胶溶液的工序中，通过准备作为材料的所述明胶并使其溶解在所述水性介质中来制备。作为材料的所述明胶可以是粉末状的，也可以是固体状的。

对于制备所述明胶溶液时的温度而言，并无特别限定，可以是通常使用的温度、例如0℃～60℃，优选为3℃～30℃左右。

另外，明胶溶液中还可根据需要含有后述各工序所需的成分，例如交联剂、对于用于对所述组织修复材料赋予所需特性而言有用的成分等。

作为获得所述含明胶中间体的方法，只要是能够形成后述的规定空隙，则可以是任何一种方法。

具体而言，所述含明胶中间体优选通过包含以下工序的方法获得：对所述明胶溶液进行搅拌，使所述明胶溶液中产生气泡(以下称作气泡产生工序)，之后将该明胶溶液凝胶化(以下称作凝胶化工序)；或者通过包含将所述重组明胶溶液冷却至冰晶形成温度以下(以下为冰晶形成工序)的方法获得。

使用包含气泡产生工序及凝胶化工序的方法来形成所述含明胶中间体时，所述含明胶中间体的空隙的形状有变为球状的倾向，而使用包含所述冰晶形成工序的方法来形成所述含明胶中间体时，所述含明胶中间体的空隙的形状有变为柱状的倾向。

作为适用于所述气泡产生工序的所述明胶溶液的搅拌条件，只要是能够产生气泡的能够搅拌的条件即可。本发明中能够产生气泡的搅拌条件定义为用下式(1)表示的搅拌弗劳德数Fr为2.0以上及用下述式(2)表示的搅拌雷诺数Re为6000以下。

Fr＝n²d/g (1)

Re＝ρnd²/μ (2)

两式中，n表示搅拌数(/秒)、d表示搅拌翼的直径(m)。式(1)中，g表示重力加速度(m/s²)；式(2)中，ρ表示溶液密度(kg/m³)、μ表示溶液粘度(Pa·s)。

只要能够进行搅拌弗劳德数Fr为2.0以上及搅拌雷诺数Re为6000以下的搅拌，则对搅拌所用的装置并无特别限定，可以举出匀浆机、溶解器、高速搅拌机等。

关于上述搅拌条件，例如可以举出使用T.K.Homodisper 2.5型(PRIMIX制)且搅拌转速为1400rpm条件下的搅拌。

搅拌时的温度从流动性和保持气泡的角度出发优选为2℃～50℃、更优选为5℃～30℃。

在凝胶化工序中，以维持产生了气泡的所述明胶溶液中的气泡的状态进行凝胶化。作为凝胶化的条件，例如可以在进行1℃～20℃温度下的冷却之后实施固化来进行。

在包含所述冰晶形成工序的方法中，将所述明胶溶液冷却至冰晶形成温度以下。由此，可获得内部具有适当大小的冰晶的所述含明胶中间体。由于所形成的冰晶，所述重组明胶的肽链的密度变得不规则，所述含明胶中间体发生固体化，因此在冰晶消失之后，形成所述含明胶中间体的网眼的空隙。冰晶的消失可以通过后段的干燥工序来容易地进行。所述含明胶中间体的网眼的孔径可以通过冰晶温度、冷却时间或它们的组合来进行调整。

冰晶形成温度是指所述明胶溶液的至少一部分冷冻的温度。冰晶形成温度根据所述明胶溶液中含有所述重组明胶的固体成分浓度的不同而不同，但一般可以为－10℃以下。

优选可以将所述明胶溶液冷却至－100℃～－10℃、更优选冷却至－80℃～－20℃。当冷却至－100℃以上时，有网眼尺寸变得足够大的倾向，当冷却至－10℃以下时，有所述含明胶中间体的网眼孔径的均匀性高、可发挥良好的组织修复能力的倾向。

作为维持于冰晶形成温度以下的时间，从均匀性的观点出发，优选为1～8小时、更优选为1～6小时。

在所述冰晶形成工序之前，还可设置所述的气泡产生工序。由此，由于在产生气泡之后进行冰晶的形成，因此可以生成更为良好的形状的含明胶中间体，进而有可以获得具有良好组织修复能力的组织修复材料的倾向。作为在所述冰晶形成工序之前实施的气泡产生工序，可以直接适用前述条件。

通过上述中间体制造工序，可获得含有所述明胶且具有网眼结构的含明胶中间体。

本说明书中“网眼结构”的用语是指内部含有大量空隙的结构，并不限定于平面结构。另外，结构部不仅包括纤维状的结构，还包括壁状的结构。此外，是指利用含有明胶的材料构成的结构物的结构，不包括胶原纤维等分子水平的结构。

“具有网眼结构”是指通过含有构成所述含明胶中间体的所述重组明胶而构成的壁状结构而形成微米级以上的空隙，即具有1μm以上的孔径。

对于所述含明胶中间体的网眼的形状并无特别限定，可以是蜂窝等二维的结构、也可以是松质骨等三维的结构。另外，网眼的截面形状可以是多边形、也可以是圆或椭圆等。另外，所述含明胶中间体中的网眼的三维形状可以是柱状、也可以是球状。

另外，所述含明胶中间体中还可存在连续形成有空隙的连通孔。通过存在连通孔，空隙从所述含明胶中间体的外部连续至深部。这种空隙的连接在细胞与由所述含明胶中间体获得的组织修复材料的外部接触时，能够分散/扩散到多孔质体的内部。另外，连通孔由于发挥这种功能，因此优选为10μm以上。

所述含明胶中间体的网眼的孔径用长轴方向的直径(长径)的平均值来进行评价。长边的平均值如下评价。

首先，将所述含明胶中间体干燥后获得的干燥中间体沿水平和垂直方向截断。接着，使各截面密合在印台(ink pad)上进行染色，利用光学显微镜观察2.0mm×2.0mm的区域。从观察区域内的与被染色的材料包围的区域外接的长方形中，选择长方形相对两边的距离达到最大的外接长方形。在水平方向的各截面及垂直方向的各截面的观察区域内，分别测量50个该相对两边的距离达到最大的外接长方形的长边长度，将其平均值作为该含明胶中间体的网眼的长径的平均值。

另外，对于各个网眼，将与上文同样地求得的水平方向的截面的长径平均值和垂直方向的截面的长径平均值中的较小者记为d1、将另一者记为d2，将该比率d2/d1作为网眼长宽比。将该网眼长宽比为1～3的情况记为“球状”、该范围外的情况记为“柱状”。

其中，网眼的形状为柱状时(网眼长宽比在1～3的范围外)，网眼长宽比从骨粘接的观点出发优选为4或5。为5以下时，有骨粘接增加的倾向。

作为所述网眼的形状，从组织修复能力的观点出发，优选为球状(网眼长宽比为1～3)。

所述含明胶中间体的网眼的孔径在网眼的形状为柱状时，从骨粘接的观点出发，优选为10μm以上、更优选为50μm以上、进一步优选为100μm以上。对含明胶中间体的网眼的孔径上限并无特别限定，从物质强度稳定的角度出发，优选为2500μm以下、更优选为1000μm以下。

所述长轴方向的直径为20μm以上时，有细胞易于侵入网眼结构的内部的倾向，为2500μm以下时，有提高与生物体的亲和性的倾向。

所述含明胶中间体的网眼的孔径在网眼的形状为球状时，从骨粘接的观点出发，优选为10μm以上、更优选为50μm以上、进一步优选为100μm以上。对含明胶中间体的网眼的孔径上限并无特别限定，通常为2500μm以下，从骨粘接的角度出发，优选为1000μm以下。网眼的形状为球状时，所述网眼的孔径(长宽比超过1时为长轴方向的直径)为10μm以上时，有细胞易于侵入网眼结构的内部的倾向，为2500μm以下时，有提高与生物体的亲和性的倾向。

所述含明胶中间体的空隙率优选为80％以上且99.99％以下、更优选为95.01％以上且99.9％以下。其中，空隙率利用体积密度(ρ)和真密度(ρc)用空隙率(P＝(1－ρ/ρc)×100(％))求得。体积密度(ρ)由干燥质量和体积算出，真密度(ρc)可利用Gay-Lussac型比重瓶法求得。

(b)干燥工序

干燥工序中，进行所述含明胶中间体的干燥。

作为干燥方法，有流化床干燥法、薄膜干燥法、喷雾干燥法、冷冻干燥法等，优选使用冷冻干燥法。

作为冷冻条件，可以直接采用蛋白质的冷冻干燥中通常使用的条件。作为冷冻干燥的期间，例如可以为0.5小时～300小时。对于能够使用的冷冻干燥器也无特别限定。

(c)交联工序

在所述干燥工序之前或之后进行的交联工序中，进行所述重组明胶的交联。

作为交联的方法，可以使用热交联、化学交联、利用醛类(例如甲醛、戊二醛等)的交联、利用缩合剂(碳化二亚胺、氨腈等)的交联、酶交联、光交联、UV交联、疏水性相互作用、氢键、离子性相互作用等公知的方法。

作为光交联，可以举出利用对导入有光反应性基团的高分子进行光照射或者在光敏剂的存在下进行光照射的方法。作为光反应性基团，例如可以举出肉桂基、香豆素基、二硫代氨基甲酰基、呫吨染料、樟脑醌。

进行利用酶的交联时，作为酶，只要是具有生物降解性材料间的交联作用则无特别限定，优选可以使用转谷氨酰胺酶和漆酶进行交联，最优选使用转谷氨酰胺酶进行交联。

转谷氨酰胺酶可以是哺乳类来源，也可以是微生物来源，具体而言可以举出味之素株式会社制ACTIVA系列，作为试剂出售的哺乳类来源的转谷氨酰胺酶、例如Oriental酵母工业株式会社制、Upstate USA Inc.制、Biodesign International制等的豚鼠肝脏来源的转谷氨酰胺酶、山羊来源的转谷氨酰胺酶、兔来源的转谷氨酰胺酶等、人类来源的血液凝固因子(FactorXIIIa、Haematologic Technologies，Inc.公司)等。

本发明中，利用醛类或缩合剂等交联剂进行处理时的与所述明胶的混合温度只要是能够均匀地搅拌溶液，则无特别限定，优选为0℃～40℃、更优选为0℃～30℃、更优选为3℃～25℃、更优选为3℃～15℃、进一步优选为3℃～10℃、特别优选为3℃～7℃。

混合搅拌交联剂之后，可以提高温度。作为反应温度，只要交联进行，则无特别限定，考虑到所述明胶的变性或分解时，实质上为0℃～60℃、更优选为0℃～40℃、更优选为3℃～25℃、更优选为3℃～15℃、进一步优选为3℃～10℃、特别优选为3℃～7℃。

作为交联的方法，优选为使用化学交联剂的交联法或热交联法。使用了化学交联剂的交联法的情况下，更优选使用了戊二醛作为化学交联剂的交联。

采用使用了化学交联剂的交联法时，优选化学交联剂添加在所述明胶溶液中并在所述干燥工序之前进行交联。

热交联法中所适用的交联温度优选为100℃～200℃、更优选为110℃～180℃、进一步优选为120℃～160℃。通过采用热交联法，可以避免使用交联剂。当使交联温度为100℃以上时，可以使交联充分地进行。而使交联温度为200℃以下时，由于不发生除交联以外的副反应，因此优选。

进行上述热交联处理的环境气体只要氧和氢气的浓度保持为足够低，则无特别限定，优选在不活泼性气体或5kPa以下的真空中进行。对不活泼性气体的压力并无特别限定，优选在0.15MPa以下的压力下进行。另外，对不活泼性气体的种类也无限定，优选使用氮气。

关于交联时间，以下述酸分解性为指标，本领域技术人员可根据供于交联的明胶的性状以及成为对象的组织来适当地选择。通过延长交联时间和/或降低交联温度，酸分解性降低。

酸分解性例如在为以骨组织为对象的修复材料时，优选显示通过使用了1摩尔/L(升)盐酸的5小时分解处理获得的以质量基准计为80％以下的残留率，进一步优选3小时处理时的残留率为10％～70％。使用上述序列号1所示的多肽作为供于交联的明胶时，所述残留率可通过在真空(包括0MPa)～0.15MPa的不活泼性气体中、在120～150℃下进行4～20小时的处理来实现。

另外，采用热交联法时，从所得组织修复材料的形状及组织修复能力的观点出发，优选在所述干燥工序之后进行。

[酸分解性]

本发明的组织修复材料的酸分解性如下测定。酸分解性可用酸分解率表示。

对测定用的微型管(以下称为管)的质量进行测定(A)。称量组织修复材料5.0(±0.2)mg(B)，填充到测定用管中。在装有组织修复材料的管中添加1.0ml的1摩尔/L的HCl，利用设定为37℃的振荡恒温器(HB-80(Taitec)、1分钟的振荡次数：60次)振荡规定的时间。规定时间后，将管立在冰上，停止反应，利用预先设定为4℃的离心器离心10000×g、1分钟。确认组织修复材料沉淀后，吸取上清，添加预先在冰上冷却了的超纯水1ml，在与上述相同的条件下再次离心。吸取上清，再次添加超纯水，在与上述相同的条件下再次进行离心。吸取上清之后，进行冷冻干燥。干燥结束后，从冷冻干燥机中取出，为了防止组织修复材料吸取空气中的水分，迅速地将管的盖子盖上。测定各个管子的质量(C)、使用下述计算式(3)计算残留率。酸分解性使用下述计算式(4)算出。

残留率＝(C－A)/B×100(％) (3)

酸分解率＝100－残留率(％) (4)

本发明的组织修复材料中，优选5小时的分解处理下上述残留率为80％以下。当5小时下的残留率超过80％时，有组织再生速度降低的倾向。本发明的组织修复材料中，从缺损部位的空间维持、与再生骨的替换的观点出发，残留率更优选在3小时处理下为70质量％以下、进一步优选为60质量％以下。另外，在本发明的组织修复材料中，从植入部位的空间维持的观点出发，残留率的下限值优选在3小时处理下为10质量％以上、进一步优选为30质量％以上。

[组织修复材料]

通过本发明的制造方法获得的组织修复材料是含有经交联的所述重组明胶、吸水率以质量基准计为100％以上的多孔质的组织修复材料。通过制成这种组织修复材料，可以发挥良好的组织修复能力。

所述组织修复材料的吸水率是指在25℃下将约15mg的组织修复材料填充在3cm×3cm的尼龙网制的袋中，利用离子交换水使其膨润2小时后，风干10分钟时利用下述式(5)计算的比。

吸水率＝(w2－w1－w0)/w0 (5)

式中，w0表示吸水前的材料的质量、w1表示吸水后的空袋的质量、w2表示包括吸水后的材料在内的袋整体的质量。

所述吸水率从组织的修复能力的观点出发，优选为100％以上、更优选为200％以上、进一步优选为400％以上。对所述吸水率的上限并无特别限定，通常为9900％以下、优选为5000％以下。吸水率为100％以上时，例如有骨再生率变得良好的倾向。

所述组织修复材料是具备所述含明胶中间体的规定的网眼结构来源的空隙的多孔质体。

本说明书中“多孔质”是指在主体内部具有多个空孔的材料或对这种材料进行粉碎所获得的材料。在这些材料中，所述内部的空孔可以相互连通、也可以部分或全部空孔开口至材料表面上。

所述含明胶中间体的规定的网眼结构即便是在所述干燥工序之后(根据不同情况为交联工序之后)也能够良好地维持，因此所述组织修复材料在结构上的特性与所述含明胶中间体的特性基本相同。

所述组织修复材料的空隙率与所述含明胶中间体同样地优选为80％以上且99.99％以下、进一步优选为95.01％以上且99.9％以下。其中，空隙率为利用体积密度(ρ)和真密度(ρc)用空隙率(P＝(1－ρ/ρc)×100(％))求得的值。体积密度(ρ)由干燥重量和体积算出，真密度(ρc)可利用Hubbard型比重瓶法求得。

另外，所述组织修复材料中与所述含明胶中间体同样地也可存在连通孔。通过存在连通孔，空隙从所述组织修复材料的外部连续至深部，由此与组织修复材料的外部接触的细胞能够分散/扩散至多孔质体的内部。另外，连通孔的孔径为了发挥上述功能，优选为10μm以上。

所得的组织修复材料还可在之后进一步进行粉碎、粉末化。由此，可以获得便利性优异的粉末形态的组织修复材料。作为适于粉碎的粉碎方法，并无特别限定，可以直接适用为了将冷冻干燥物粉末化而通常使用的方法。

本发明的组织修复材料例如可利用上述的骨再生率、骨粘接或它们的组合进行特别规定。

作为骨再生率，可以直接适用前述的骨再生率。骨再生率只要为22％以上，则作为组织的修复充分，优选为25％以上。

另外，作为骨粘接，只要为20％以上，则作为组织的修复充分，优选为25％以上。

作为能够利用本发明的组织修复材料进行修复的组织，优选为牙齿、骨等硬组织。所述组织修复材料特别是可作为骨再生用、组织的修复材料或治疗剂等使用。本发明的组织修复材料可单独作为骨再生治疗剂使用。只要是骨再生、骨新生所需要的治疗，则对疾病并无限定。此外，本发明的组织修复材料通过与移植细胞、骨诱导药剂并用，也可作为骨再生治疗剂使用。作为骨诱导药剂，例如可以举出BMP(骨形成因子)或bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，并无特别限定。

另外，本发明由于能够提供上述组织修复能力良好的组织修复材料，因此组织的修复方法、伴随有组织损伤的疾病等的治疗方法也包含在本申请发明内。

具体而言，本发明的组织的修复方法包含对对象组织发生缺损或损伤的部位应用所述组织修复材料，并包含根据需要的其他工序。

另外，本发明的损伤组织的治疗方法包括对对象组织发生缺损或损伤的部位应用所述组织修复材料或在对象组织为骨时应用所述骨再生治疗剂的工序，并包含根据需要的其他工序。作为其他工序，例如可以举出在将移植细胞和/或所述骨诱导剂应用于组织修复材料的前后或者同时，将组织修复材料应用于所要应用的部位。

所述治疗方法或修复方法可优选用于颌面部区域的牙周组织缺损(periodontal defect)、植入物缺损(implant defect)等；作为植入物埋入时的预备处置的GBR法、牙槽嵴增高术(Ridge Augmentation)、窦底提升术(sinus lift method)或牙槽骨保留术(socket reservation method)等。

实施例

以下使用实施例对本发明进行更详细地说明。但是，本发明并不受这些实施例的任何限定。其中，只要无特别说明，则“％”为质量基准。

[实施例1]

使用重组多肽CBE3作为重组明胶来制造实施例1中的组织修复材料。

作为CBE3，使用以下记载的物质(记载于WO2008-103041中)。

CBE3

分子量：51.6kD

结构：GAP[(GXY)₆₃]₃G

氨基酸数：571个

RGD序列：12个

亚氨基酸含量：33％

几乎100％的氨基酸为GXY的重复结构。

CBE3的氨基酸序列不含丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、酪氨酸残基及半胱氨酸残基。

CBE3具有ERGD序列。

等电点：9.34

氨基酸序列(序列号1)

GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)₃G

使含有12质量％的所述重组明胶的明胶水溶液流入铝制盘中后，在－20℃冰箱内静置过夜，从而获得冷冻的明胶块。对该明胶块进行冷冻干燥，获得干燥中间体1。利用粉碎机粉碎该干燥中间体1，回收通过筛孔为710μm的筛子且不通过筛孔为500μm的筛子的级分，然后在减压下、160℃下处理15小时，作为试样1。

分别如下评价干燥中间体1的网眼结构的形状观察及长轴方向的直径(长径)的平均值、试样1的吸水率、骨再生及骨粘接。

(1)干燥中间体1的网眼的形状、长径的平均值

将干燥中间体1沿水平和垂直方向截断。接着，使各截面密合在印台上进行染色，利用光学显微镜观察2.0mm×2.0mm的区域。从观察区域内的与被染色的材料包围的区域外接的长方形中，选择长方形相对两边的距离达到最大的外接长方形。在水平方向的各截面及垂直方向的各截面的观察区域内，分别测量50个该相对两边的距离达到最大的外接长方形的长边长度，将其平均值作为该干燥中间体1的网眼的长径的平均值。

另外，对于此时的各个网眼，将水平方向的截面的长径(平均值)和垂直方向的截面的长径(平均值)中的较小者记为d1、另一者记为d2，求出所得的比率d2/d1(网眼长宽比)，将该网眼长宽比为1～3的情况记为“球状”、该范围外的情况记为“柱状”，评价网眼的形状。将结果示于表1。

(2)吸水率

在25℃下将约15mg的试样1填充到3cm×3cm的尼龙网制的袋中，利用离子交换水使其膨润2小时，然后风干10分钟。在各个阶段测定质量，根据式(5)求出吸水率。将结果示于表1。

吸水率＝(w2－w1－w0)/w0 (5)

(3)骨再生评价

在SD大鼠(雄性、10～12周龄、0.3kg～0.5kg)的头盖骨上制作直径为5mm的圆形的骨缺损部，将约3.6mg的试样1填充到所制作的骨缺损部中，然后将皮肤缝合。在手术后的第4周，使用微型CT测量大鼠的头盖骨的骨量，将相对于缺损部体积的缺损部内部的骨体积作为骨再生率(％)。将结果示于表1。

(4)骨粘接评价

在SD大鼠(雄性、10～12周龄、0.3kg～0.5kg)的头盖骨上制作直径为5mm的圆形的骨缺损部，将约3.6mg的试样1填充到所制作的骨缺损部中，然后将皮肤缝合。在手术后的第4周，在戊巴比妥麻醉下将其放血致死，摘出头部。对包括埋入部在内的头盖骨进行HE染色，进行组织学观察。计数所埋设的试样1与新生骨不介由纤维性组织而接触的部位，根据所埋设的试样1的平均1处的接触位置数(骨粘接率)，如下进行评价。将结果示于表1。

骨粘接率为30％以上时：良(A)

骨粘接率为20％以上且小于30％时：尚可(B)

骨粘接率小于20％时：不良(C)

[实施例2]

使含有12质量％的实施例1中所用CBE3的明胶水溶液流入不锈钢制盘中后，在－50℃冰箱内静置8小时，从而获得冷冻的明胶块。对该明胶块进行冷冻干燥，获得干燥中间体2。利用粉碎机粉碎该干燥中间体2，回收通过筛孔为710μm的筛子且不通过筛孔为500μm的筛子的级分，然后在减压下、160℃下处理19小时，获得试样2。

与实施例1同样地评价干燥中间体2的网眼结构的形状观察及长轴方向的直径(长径)的平均值、试样2的吸水率、骨再生及骨粘接。

[实施例3]

在于9℃下冷却了的壶内、使用T.K.Homodisper 2.5型、以1400rpm对含有12质量％的实施例1中所用CBE3的明胶水溶液进行搅拌，然后在－50℃冰箱内静置8小时，从而获得冷冻的明胶块。其中，本条件下的搅拌相当于搅拌弗劳德数Fr为2.22及搅拌雷诺数为3700的搅拌条件。对该明胶块进行冷冻干燥，获得干燥中间体3。利用粉碎机粉碎该干燥中间体3，回收通过筛孔为710μm的筛子且不通过筛孔为500μm的筛子的级分，然后在减压下、160℃下处理19小时，获得试样3。

与实施例1同样地评价干燥中间体3的网眼结构的形状观察及长轴方向的直径(长径)的平均值、试样2的吸水率、骨再生及骨粘接。

[实施例4]

使实施例1中所用CBE3的最终浓度为7.5质量％，制备明胶水溶液，使该明胶水溶液流入不锈钢制盘中后，在－80℃冰箱内静置8小时，从而获得冷冻的明胶块。对该明胶块进行冷冻干燥，获得干燥中间体4。利用粉碎机粉碎该干燥中间体4，回收通过筛孔710μm的筛子且不通过筛孔为500μm的筛子的级分，然后在减压下、160℃下处理19小时，获得试样4。

与实施例1同样地评价干燥中间体4的网眼结构的形状观察及长轴方向的直径(长径)的平均值、试样4的吸水率、骨再生及骨粘接。

[实施例5]

使实施例1中所用CBE3的最终浓度为7.5质量％，制备明胶水溶液，使该明胶水溶液流入铝制容器中后，在－40℃冰箱内介由隔热材料设置在经过预冷的硬铝合金(duralumin)块上，静置1小时，从而获得冷冻的明胶块。对该明胶块进行冷冻干燥，获得干燥中间体5。利用粉碎机粉碎该干燥中间体5，回收通过筛孔为710μm的筛子且不通过筛孔为500μm的筛子的级分，然后在0.08MPa氮气气氛下、137℃下处理7小时，获得试样5。

与实施例1同样地评价干燥中间体5的网眼结构的形状观察及长轴方向的直径(长径)的平均值、试样5的吸水率、骨再生及骨粘接。

[比较例1]

使含有12质量％的实施例1中所用CBE3的明胶水溶液流入聚丙烯制盘中后，在冰箱(4℃)内静置1周，从而获得干燥的明胶块。对该明胶块进行冷冻干燥，获得干燥中间体6。利用粉碎机粉碎该干燥中间体6，回收通过筛孔为710μm的筛子且不通过筛孔为500μm的筛子的级分，然后在减压下、160℃下处理19小时，获得试样6。

与实施例1同样地评价干燥中间体6的网眼结构的形状观察及长轴方向的直径(长径)的平均值、试样6的吸水率、骨再生及骨粘接。

表1

如此，由于本发明实施例的组织修复材料是对具有特定网眼结构的明胶中间体进行冷冻干燥而获得的，因此是具有高吸水率和高骨再生率且可诱导良好的骨粘接的组织修复材料。

因此，通过本发明，可提供能够获得具有良好组织再生能力的组织修复材料的组织修复材料的制造方法。

通过参照将2012年3月12日申请的日本专利申请2012-055020公开内容的全部纳入本说明书中。本说明书中记载的全部文献、专利申请和技术标准通过参照纳入的情况与具体地且分别地记载有各个文献、专利申请和技术标准的情况同等程度地通过参照纳入本说明书中。关于本发明示例的实施方式的上述记载是为了示例和说明，并非是为了进行全部罗列或者将本发明限定为公开的方式本身。如已清楚的，大量的改变或变更对于本领域技术人员而言是显而易见的。上述实施方式很好地说明了发明的原理和实际应用，并为了适于所设想的特定用途的各种实施方式、各种改变且使其他领域技术人员能够理解而进行了选择、记载。本发明的范围由以下的权利要求书或其等同物来确定。

Claims

1.一种组织修复材料的制造方法，其包含下述(a)～(c)的工序：(a)使用含有溶解于水性介质的明胶的明胶溶液来获得含有该明胶且具有网眼结构的含明胶中间体，(b)进行所述含明胶中间体的干燥，(c)在所述含明胶中间体的干燥之前或之后进行所述明胶的交联。

2.根据权利要求1所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述干燥为冷冻干燥。

3.根据权利要求1或2所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述明胶为重组明胶。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述含明胶中间体的网眼的孔径至少为10μm以上。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其包含下述工序：对所述明胶溶液进行搅拌，使所述明胶溶液中产生气泡，之后对该明胶溶液进行凝胶化，从而获得所述含明胶中间体。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其包含下述工序：通过在－100℃～－10℃的温度下对所述明胶溶液进行冷冻，从而获得所述含明胶中间体。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述明胶的交联使用交联剂、在所述干燥之前进行。

8.根据权利要求1～6中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述明胶的交联通过100℃～200℃条件下的加热、在所述干燥之后进行。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述明胶的交联通过加热进行，并且所述明胶的交联按照在所制造的组织修复材料5mg中添加1ml的1摩尔/L的盐酸并在37℃下处理5小时时的酸分解率达到20％以上的方式进行。

10.根据权利要求3～9中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述重组明胶具有Gly-X-Y所示的序列的重复单元和细胞粘附信号；其中，X及Y表示任意的氨基酸残基。

11.根据权利要求10所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述重组明胶具有A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B所示的序列和细胞粘附信号；其中，X及Y表示任意的氨基酸残基、m表示2～10的整数、n表示3～10的整数、A及B各自独立地表示任意的氨基酸残基或氨基酸序列。

12.根据权利要求10或11所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述重组明胶具有Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)₆₃]₃-Gly所示的序列和细胞粘附信号；式中，63个X各自独立地表示任意的氨基酸残基、63个Y各自独立地表示任意的氨基酸残基，其中，3个(Gly-X-Y)₆₃可分别相同也可不同。

13.根据权利要求3～12中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述重组明胶为以下(A)～(C)中的任一者：

(A)序列号1所示的多肽，

14.根据权利要求1～13中任一项所述的组织修复材料的制造方法，其中，所述组织为骨。

15.通过权利要求1～14中任一项所述的组织修复材料的制造方法获得的组织修复材料，其为含有经交联的所述明胶且吸水率以质量基准计为100％以上的多孔质。