JP5902112B2 - 骨組織修復材の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、骨組織修復材の製造方法に関する。

現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を計る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織において、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。
再生医療の分野では、細胞による組織の修復や再生を補うなどの目的で、生体親和性の高いコラーゲンやゼラチンを利用することがある。特に、骨や皮膚などの三次元構造を組織の再生に用いられることがあり、良好な組織の再生を目的として種々の改良が行われている。

例えば、特許文献１には、組換えゼラチンを含み、補填材担体自体で骨再生を促進できる骨再生剤及び骨補填製剤が開示されている。
また、特許文献２には、多数の空孔が存在するスポンジ状のコラーゲンマトリクスからなる細胞侵襲性コラーゲン製剤が開示されている。

国際公開第２０１１／０２７８５０号パンフレット 特開平８−１９６６１８号公報

しかしながら、上記の技術のいずれも、骨再生を促進する組織修復材を得るという観点から未だに改善の余地がある。

本発明は、良好な骨組織再生能を有する骨組織修復材を得ることができる骨組織修復材の製造方法を提供することを目的とする。

本発明は以下のとおりである。
［１］ （ａ）水性媒体に溶解したゼラチンを含むゼラチン溶液を用いて、前記ゼラチン溶液を攪拌して前記ゼラチン溶液中に気泡を発生させ、その後に該ゼラチン溶液を１℃〜２０℃に冷却してゲル化することにより、該ゼラチンを含み且つ、網目構造を有するゼラチン含有中間体を得ること、（ｂ）前記ゼラチン含有中間体の乾燥を行うこと、（ｃ）前記ゼラチン含有中間体の乾燥の前又は後に、前記ゼラチンの架橋を行うこと、を含み、前記ゼラチン含有中間体の乾燥の後に、前記ゼラチン含有中間体を粉砕して粉末化することを更に含む、骨組織修復材の製造方法。
［２］ 前記乾燥は、凍結乾燥である［１］記載の骨組織修復材の製造方法。
［３］ 前記ゼラチンが、組換えゼラチンである［１］又は［２］に記載の骨組織修復材の製造方法。
［４］ 前記ゼラチン含有中間体における網目の孔径が、少なくとも１０μｍ以上である［１］〜［３］のいずれかに記載の骨組織修復材の製造方法。
［５］ 前記ゼラチン含有中間体を、前記ゼラチン溶液を−１００℃〜−１０℃の温度下で凍結させることにより得ることを含む［１］〜［４］のいずれかに記載の骨組織修復材の製造方法。
［６］ 前記ゼラチンの架橋が、１００℃〜２００℃の条件による加熱により、前記乾燥の後に行われる［１］〜［５］のいずれかに記載の骨組織修復材の製造方法。
［７］ 前記ゼラチンの架橋が加熱により行われ、かつ、前記ゼラチンの架橋が、製造された組織修復材５ｍｇに１ｍｌの１モル／Ｌの塩酸を添加して３７℃で５時間処理したときの酸分解率が２０％以上となるように行われる、［１］〜［６］のいずれか１項記載の骨組織修復材の製造方法。
［８］ 前記ゼラチンが、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ及びＹは任意のアミノ酸残基を表す）で示される配列の繰り返し単位と、細胞接着シグナルと、を有する組換えゼラチンである［３］〜［７］のいずれかに記載の骨組織修復材の製造方法。
［９］ 前記組換えゼラチンが、Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_ｎ］_ｍ−Ｂ（Ｘ及びＹは任意のアミノ酸残基を表し、ｍは２から１０の整数を表し、ｎは３から１０の整数を表し、Ａ及びＢはそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基またはアミノ酸配列を表す）で示される配列と、細胞接着シグナルと、を有する［８］に記載の骨組織修復材の製造方法。
［１０］ 前記組換えゼラチンが、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_６３］_３−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、６３個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示す。なお、３個の（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_６３はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される配列と、細胞接着シグナルと、を有する［８］または［９］に記載の骨組織修復材の製造方法。
［１１］ 前記ゼラチンが、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの組換えゼラチンである［３］〜［１０］のいずれかに記載の骨組織修復材の製造方法：
（Ａ） 配列番号１で示されるポリペプチド、
（Ｂ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列中、第４番目〜第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を有すると共に、骨組織修復能を有するポリペプチド、
（Ｃ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、骨組織修復能を有するポリペプチド。
［１２］ 前記ゼラチン溶液中に気泡を発生させるための前記ゼラチン溶液の攪拌条件が、下記式（１）で表される攪拌フルード数Ｆｒが２．０以上、及び下記式（２）で表される攪拌レイノルズ数Ｒｅが６０００以下の攪拌条件である［１］〜［１１］のいずれかに記載の骨組織修復材の製造方法：
Ｆｒ＝ ｎ^２ｄ／ｇ ・・・・（１）
Ｒｅ＝ ρｎｄ^２／μ ・・・・（２）
両式において、ｎは撹拌数（／秒）、ｄは撹拌翼の直径（ｍ）を表し、式（１）において、ｇは重力加速度（ｍ／ｓ^２）を表し、式（２）において、ρは溶液密度（ｋｇ／ｍ^３）、μは溶液粘度（Ｐａ・ｓ）を表す。

本発明によれば、良好な骨組織再生能を有する骨組織修復材を得ることができる骨組織修復材の製造方法を提供することができる。

［組織修復材料の製造方法］
本発明において「組織修復材料」とは、生体内に埋植されることにより当該部位における組織の形成に寄与する材料のことであり、細胞を含んでいても含んでいなくてもよい。また、増殖因子や薬剤のような生体の反応を促す成分を含んでいても含んでいなくてもよい。さらに、ハイドロキシアパタイト等の無機材料と混合、ないしコンポジットを作成して適用してもよい。
本発明における「組織修復材料」とは、埋植部位に通常存在する正常組織の形成に寄与するものだけではなく、瘢痕組織等を含む非正常組織の形成を促進する材料も包含するものである。
本発明の組織修復材の製造方法は、（ａ）水性媒体に溶解したゼラチンを含むゼラチン溶液を用いて、該ゼラチンを含み且つ、網目構造を有するゼラチン含有中間体を得ること（以下、中間体製造工程という）、（ｂ）前記ゼラチン含有中間体の乾燥を行うこと（以下、乾燥工程という）、（ｃ）前記ゼラチン含有中間体の乾燥の前又は後に、前記ゼラチンの架橋を行うこと（以下、架橋工程という）、を含む、組織修復材の製造方法である。
本製造方法によれば、ゼラチンを含み且つ網目構造を有するゼラチン含有中間体を得てから、これを乾燥して組織修復材を得ているので、組織修復の良好な形状を保持した組織修復材を得ることができる。

本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本発明において、ポリペプチドを構成するアミノ酸配列を、当業界で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇｌｙ」）を用いて表現する場合がある。
また、本発明における組織修復材料とは、乾燥工程及び架橋工程を経たものを指し、ゼラチン含有中間体とは、乾燥工程及び架橋工程の少なくとも一方を経ていないものを指す。
以下、本発明について説明する。

（ａ）中間体製造工程
中間体製造工程では、水性媒体に溶解したゼラチンを含むゼラチン溶液を用いて、該ゼラチンを含み且つ、網目構造を有するゼラチン含有中間体を得る。
前記ゼラチンは、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列を連続して６以上含むポリペプチドを意味し、ポリペプチド中にＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列以外に他のアミノ酸残基を１以上有していてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列は、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列に相当する配列であり、この配列の繰り返しはコラーゲンに特徴的な配列を意味する。

複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、それぞれ同一であってもよく、異なってもよい。また、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列中ＸおよびＹは繰返し単位ごとに独立であり、同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−ＹにおいてＧｌｙはグリシン残基、Ｘ及びＹは、グリシン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。Ｘ及びＹとしては、イミノ酸残基、即ちプロリン残基又はオキシプロリン残基が多く含まれることが好ましい。このようなイミノ酸残基の含有率は、前記ゼラチン全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。前記ゼラチン中のＧｌｙ−Ｘ−Ｙの含有率としては、全体の８０％以上であることが好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。

前記ゼラチンとしては、天然型であっても、天然型とは少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる変異型であってもよい。また、前記ゼラチンとしては、前記Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列を連続して６以上有する前記コラーゲンをコードする遺伝子の塩基配列又はアミノ酸配列に対して、１つ以上の塩基又はアミノ酸残基の変更を加えた塩基配列又はアミノ酸配列を、常法により、適当な宿主に導入し発現させて得られた組換えゼラチンであることが好ましい。このような組換えゼラチンを用いることにより、組織修復能を高めると共に、天然のゼラチンを用いる場合と比較して種々の特性を発現させることができ、例えば、生体による拒絶反応などの不都合な影響を回避することができるなどの利点を有する。

前記組換えゼラチンとしては、例えば、ＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２、ＷＯ２００４／８５４７３、ＷＯ２００８／１０３０４１、特表２０１０−５１９２９３、特表２０１０−５１９２５２、特表２０１０−５１８８３３、特表２０１０−５１９２５１、ＷＯ２０１０／１２８６７２及びＷＯ２０１０／１４７１０９等に開示されているものを特に好ましく用いることができる。
また、前記組換えゼラチンは、２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下の分子量であることが好ましく、５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であることがより好ましく、１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であることがより好ましい。

前記組換えゼラチンは、生体親和性の点で、細胞接着シグナルを更に含むものであることが好ましく、前記組換えゼラチン中に存在する細胞接着シグナルが一分子中に２つ以上有することものであることが、より好ましい。このような細胞接着シグナルとしては、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の各配列を挙げることができ、好ましくは、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列を挙げることができ、ＲＧＤ配列であることが特に好ましい。ＲＧＤ配列のうち、ＥＲＧＤ配列であることが更に好ましい。

前記組換えゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸残基数が０〜１００であることが好ましく、２５〜６０であることが更に好ましい。また、ＲＧＤ配列は、このようなアミノ酸残基数の範囲内で不均一に配置されていることが好ましい。
また、前記組換えゼラチンにおけるアミノ酸残基の総数に対するＲＧＤ配列の割合は、少なくとも０．４％であることが好ましく、組換えゼラチンが３５０以上のアミノ酸残基を含む場合、３５０アミノ酸残基の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤ配列を含むことが好ましい。

前記組換えゼラチンは、２５０のアミノ酸残基あたり少なくとも２つのＲＧＤ配列を含むことが好ましく、少なくとも３つＲＧＤ配列を含むことがより好ましく、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含むことが更に好ましい。ただし、前記組換えゼラチンの配列は、以下の態様であることが好ましい：（１）セリン残基及びスレオニン残基を含まない、（２）セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、及びシステイン残基を含まない、（３）Asp-Arg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列を含まない。前記組換えゼラチンは、この好ましい配列の態様（１）〜（３）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものものであってもよい。
また、前記組換えゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。

前記組換えゼラチンは、Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_ｎ］_ｍ−Ｂの繰り返し構造を有することが好ましい。ｍは、２〜１０を表し、３〜５を表すことが好ましい。Ａ及びＢは、任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を表す。ｎは３〜１００を表し、１５〜７０を表すことが好ましく、５０〜６０を表すことがより好ましい。
好ましくは、組換えゼラチンは、式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_６３］_３−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸残基の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸残基の何れかを示す。なお、３個の（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_６３はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される。

前記組換えゼラチンの繰り返し単位には、天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとしては、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型及びＶ型が挙げられる。より好ましくは、Ｉ型、II型又はIII型とすることができる。コラーゲンの由来としては、好ましくは、ヒト、ウマ、ブタ、マウス、ラットを挙げることができ、ヒトであることがより好ましい。
前記組換えゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、更に好ましくは７〜９．５とすることができる。

前記組換えゼラチンの好ましい態様としては以下のものを挙げることができる：（１）脱アミン化されていない、（２）プロコラーゲンを有さない、（３）テロペプタイドを有さない、（４）天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。前記組換えゼラチンは、この好ましい態様（１）〜（４）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものものであってもよい。

前記組換えゼラチンは、組織修復能の高さから、好ましくは、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかとすることができる。
（Ａ） 下記配列番号１で示されるポリペプチド、
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)₃G（配列番号１）
（Ｂ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列中、第４番目〜第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を有すると共に、組織修復能を有するポリペプチド、
（Ｃ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、組織修復能を有するポリペプチド。

前記（Ｂ）における配列同一性としては、組換えゼラチンの組織修復能の観点から、より好ましくは９０％以上とすることができ、更に好ましくは９５％以上とすることができる。
なお、本発明における「配列同一性」とは、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一
残基数）／（アラインメント長）］×１００

前記（Ｂ）の配列における前記部分アミノ酸配列は、配列番号１で示される配列の繰り返し単位に相当する部分アミノ酸配列である。前記（Ｂ）のポリペプチドに前記繰り返し単位に相当する部分アミノ酸配列が複数存在する場合には、配列同一性が８０％以上となる繰り返し単位を１つ、好ましくは２つ以上含むポリペプチドとすることができる。
また、前記（Ｂ）で規定されるポリペプチドは、前記繰り返し単位に相当する部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を、合計のアミノ酸残基数として、全アミノ酸残基数の８０％以上含むことが好ましい。

前記（Ｂ）で規定されるポリペプチドの長さとしては、１５１個〜２２６０個のアミノ酸残基数とすることができ、架橋後の分解性の観点から、１９３個以上、安定性の観点から、９４４個以下のアミノ酸残基数であることが好ましく、３８０個〜７５６個のアミノ酸残基数であることがよりこのましい。

また、前記（Ｃ）で規定されるポリペプチドは、前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、組織修復能を有するポリペプチドであってもよい。
前記（Ｃ）で規定されるポリペプチドにおいて欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸残基数としては、１個又は数個であればよく、組換えゼラチンの総アミノ酸残基数によって異なるが、例えば、２個〜１５個、好ましくは２個〜５個とすることができる。

前記組換えゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２、ＷＯ２００４／８５４７３、ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定の組換えゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、組換えゼラチンが産生されるので、培養物から産生された組換えゼラチンを回収することにより、本発明で用いる組換えゼラチンを調製することができる。

ここで、組織修復能の評価は、前記組換えゼラチンを用いて得られた組織修復材料を用いて行えばよい。評価方法は、目的の組織により異なる。
例えば、骨組織の場合には、骨再生能により評価することができる。骨再生能は、ラットの頭頂骨に所定の大きさの骨欠損部を作製し、所定量の組織修復材料を骨欠損部へ充填後、皮膚を縫合し、手術後４週目にマイクロＣＴを用いて骨量を計測して、骨欠損部の体積に対する再生した骨体積の割合として評価することができる。
また、骨接着により評価してもよい。骨接着能は、骨再生能評価と同様にして、骨欠損部へ組織修復材料を充填後、皮膚を縫合し、手術後４週目に摘出された頭部をＨＥ染色して、充填した組織修復材料と新生骨とが線維性組織を介さずに接触している領域の大きさとして評価することができる。
いずれか一方の評価によって骨修復能が認められれば、前記組換えゼラチンについて、組織修復能を有すると評価することができる。

前記水性媒体としては、ゼラチンを溶解可能であり、生体組織に対して使用可能なものであれば特に制限はなく、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等、当分野で通常使用可能なものを挙げることができる。
ゼラチン溶液における前記ゼラチンの含有率については、ゼラチンが溶解可能な含有率であればよく、特に制限はない。例えば、ゼラチン溶液中の前記ゼラチンの含有率は、例えば、０．５質量％〜２０質量％とすることが好ましく、２質量％〜１６質量％であることがより好ましく、４質量％〜１２質量％であることが更に好ましい。前記０．５質量％以上とすることにより、強度がより高まる傾向があり、２０質量％以下とすることにより、均一性の高い網目構造をより形成しやすくなる傾向がある。

なお、中間体製造工程におけるゼラチン溶液は、調製済のものを準備して用いてもよく、ゼラチン含有中間体を得る前に別途ゼラチン溶液を調製する工程を設けてもよい。
ゼラチン溶液を調製する工程では、材料としての前記ゼラチンを準備し、前記水性媒体に溶解させることにより調製する。材料としての前記ゼラチンは、粉末状のものであってもよく、固体状のものであってもよい。

前記ゼラチン溶液を調製する際の温度については、特に制限はなく、通常用いられる温度、例えば、０℃〜６０℃、好ましくは、３℃〜３０℃程度であればよい。
またゼラチン溶液には、後述する各工程に必要な成分、例えば架橋剤や、前記組織修復材に所定の特性を付加するために有用な成分等が、必要に応じて含有されていてもよい。

前記ゼラチン含有中間体を得る方法としては、後述する所定の空隙が形成可能であればいずれの方法であってもよい。
具体的には、前記ゼラチン含有中間体は、前記ゼラチン溶液を攪拌して前記ゼラチン溶液中に気泡を発生させ（以下、気泡発生工程という）、その後に該ゼラチン溶液をゲル化する（以下、ゲル化工程という）ことを含む方法、又は、前記組換えゼラチン溶液を氷晶形成温度以下に冷却すること（以下、氷晶形成工程）を含む方法により得られることが好ましい。

気泡発生工程及びゲル化工程を含む方法を用いて前記ゼラチン含有中間体を形成した場合には、前記ゼラチン含有中間体の空隙の形状は球状になる傾向があり、一方、前記氷晶形成工程を含む方法を用いて前記ゼラチン含有中間体を形成した場合には、前記ゼラチン含有中間体の空隙の形状は柱状になる傾向がある。

前記気泡発生工程に適用される前記ゼラチン溶液の攪拌条件としては、気泡を発生可能な攪拌可能な条件であればよい。本発明において気泡を発生可能な攪拌条件とは、次の式（１）で表される攪拌フルード数Ｆｒが２．０以上、及び下記式（２）で表される攪拌レイノルズ数Ｒｅが６０００以下と定義する。
Ｆｒ＝ ｎ^２ｄ／ｇ ・・・・（１）
Ｒｅ＝ ρｎｄ^２／μ ・・・・（２）
両式において、ｎは撹拌数（／秒）、ｄは撹拌翼の直径（ｍ）を表す。式（１）において、ｇは重力加速度（ｍ／ｓ^２）を、式（２）において、ρは溶液密度（ｋｇ／ｍ^３）、μは溶液粘度（Ｐａ・ｓ）を表す。

攪拌フルード数Ｆｒが２．０以上及び攪拌レイノルズ数Ｒｅが６０００以下の攪拌が可能であれば、攪拌に用いる装置には特に制限はなく、ホモジナイザー、ディゾルバー、ホモミキサー等を挙げることができる。
上記の攪拌条件は、例えば、Ｔ．Ｋ．ホモディスパー２．５型（プライミクス製）を用いて、撹拌回転数１，４００ｒｐｍの条件による攪拌を挙げることができる。

攪拌時の温度は、流動性と気泡の保持の点で２℃〜５０℃であることが好ましく、５℃〜３０℃であることがより好ましい。

ゲル化工程では、気泡を発生させた前記ゼラチン溶液における気泡を維持した状態でゲル化を行う。ゲル化の条件としては、例えば、１℃〜２０℃の温度による冷却を行って固化することにより行えばよい。

前記氷晶形成工程を含む方法では、前記ゼラチン溶液を氷晶形成温度以下に冷却する。これにより、内部に適当な大きさの氷晶を有する前記ゼラチン含有中間体を得ることができる。形成された氷晶により前記組換えゼラチンのペプチド鎖の粗密が生じて前記ゼラチン含有中間体が固体化するため、氷晶が消失した後には、前記ゼラチン含有中間体の網目の空隙が形成される。氷晶の消失は、後段の乾燥工程により容易に行われる。前記ゼラチン含有中間体の網目の孔径は、氷晶温度、冷却時間又はこれらの組み合わせにより調整することができる。

氷晶形成温度は、前記ゼラチン溶液の少なくとも一部が凍結する温度を意味する。氷晶形成温度は、前記ゼラチン溶液中の前記組換えゼラチンを含む固形分濃度によって異なるが、一般に−１０℃以下とすることができる。
好ましくは、前記ゼラチン溶液を−１００℃〜−１０℃に冷却することができ、より好ましくは、−８０℃〜−２０℃に冷却する。−１００℃以上であれば、網目サイズが十分な大きさになる傾向があり、−１０℃以下であれば、前記ゼラチン含有中間体における網目の孔径の均一性が高く、良好な組織修復能を発揮できる傾向がある。

氷晶形性温度以下に維持する時間としては、均一性の観点から、１〜８時間とすることが好ましく、１〜６時間とすることがより好ましい。

前記氷晶形成工程の前に、前述した気泡発生工程を設けてもよい。これにより、気泡を発生させた後に氷晶の形成を行うため、より良好な形状のゼラチン含有中間体を生成可能であり、更に良好な組織修復能を有する組織修復材料を得ることができる傾向がある。前記氷晶形成工程の前に実施する気泡発生工程としては、前述した条件をそのまま適用することができる。

上述した中間体製造工程により、前記ゼラチンを含み且つ、網目構造を有するゼラチン含有中間体が得られる。
本明細書において「網目構造」との語は、内部に多量の空隙を含む構造を意味しており、平面的なものに限定されない。また、構造部が繊維状であるもののみでなく、壁状であるものも含むものとする。さらに、ゼラチンを含む材料によって構成された構造物の構造を意味しており、コラーゲン繊維等の分子レベルの構造は含まない。
「網目構造を有する」とは、前記ゼラチン含有中間体を構成する前記組換えゼラチンを含んで構成される壁状構造によりミクロンオーダー以上の空隙が形成されていること、即ち、１μｍ以上の孔径を有することを意味する。

前記ゼラチン含有中間体における網目の形状については、特に制限はなく、ハニカムのような二次元的な構造でも、海綿骨のような三次元的な構造でもよい。また網目の断面形状は多角形であっても、円又は楕円等であってもよい。また前記ゼラチン含有中間体における網目の三次元形状は、柱状であっても球状であってもよい。

また、前記ゼラチン含有中間体には、空隙が連続して形成される連通孔が存在していてもよい。連通孔が存在することによって、前記ゼラチン含有中間体の外部から深部に至るまで、空隙が連なる。このような空隙の繋がりは、前記ゼラチン含有中間体から得られた組織修復材の外部に、細胞が接触した場合に、多孔質体の内部へと分散・拡散可能となる。また、連通孔は、このような機能を発揮するため、１０μｍ以上であることが好ましい。

前記ゼラチン含有中間体の網目の孔径は、長軸方向の径（長径）の平均として評価する。長辺の平均は、次のようにして評価する。
まず、前記ゼラチン含有中間体を乾燥した後に得られる乾燥中間体を、水平および鉛直方向に切断する。次いで、各断面をスタンプ台に密着させることにより染色し、２．０ｍｍ×２．０ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察する。観察領域内における、染色された材料で囲まれた領域に外接する長方形のうち、長方形の対向する二辺の距離が最大となる外接長方形を選択する。この対向する二辺の距離が最大となる外接長方形の長辺の長さを、水平方向の断面及び鉛直方向の断面のそれぞれにおける観察領域内において、５０個ずつ計測し、その平均を当該ゼラチン含有中間体の網目の長径の平均値とする。

また、個々の網目について、前記と同様にして求めた水平方向の断面の長径の平均値と鉛直方向の断面の長径の平均値のうち小さい方をｄ１、他方をｄ２とし、この比率ｄ２／ｄ１を網目アスペクト比と呼ぶ。この網目アスペクト比が１〜３の場合を「球状」とし、この範囲外のものを「柱状」とする。
なお、網目の形状が柱状である場合（網目アスペクト比が１〜３の範囲外）の場合には、網目アスペクト比は、骨接着の観点から４又は５であることが好ましい。５以下であれば、骨接着が増加する傾向がある。
前記網目の形状としては、組織の修復能の観点から球状（網目アスペクト比が１〜３）であることが好ましい。

前記ゼラチン含有中間体における網目の孔径は、網目の形状が柱状の場合には、骨接着の観点から、１０μｍ以上であることが好ましく、５０μｍ以上であることがより好ましく、１００μｍ以上であることが更に好ましい。ゼラチン含有中間体における網目の孔径の上限については特に制限はないが、物質強度安定の点で２５００μｍ以下であることが好ましく、１０００μｍ以下であることがより好ましい。
前記長軸方向の径が２０μｍ以上であれば、網目構造の内部に細胞が侵入しやすくなる傾向があり、２５００μｍ以下であれば、生体との親和性を高める傾向がある。

前記ゼラチン含有中間体における網目の孔径は、網目の形状が球状の場合には、骨接着の観点から、１０μｍ以上であることが好ましく、５０μｍ以上であることがより好ましく、１００μｍ以上であることが更に好ましい。ゼラチン含有中間体における網目の孔径の上限については特に制限はないが、一般に２５００μｍ以下、骨接着の点で１０００μｍ以下であることが好ましい。網目の形状が球状の場合に、前記網目の孔径（アスペクト比が１を超える場合には長軸方向の径）が１０μｍ以上であれば、網目構造の内部に細胞が侵入しやすくなる傾向があり、２５００μｍ以下であれば、生体との親和性を高める傾向がある。

前記ゼラチン含有中間体の空隙率は、好ましくは８０％以上９９．９９％以下であり、さらに好ましくは９５．０１％以上９９．９％以下である。なお、空隙率は、嵩密度（ρ）と真密度（ρc）より、空隙率（Ｐ＝（１−ρ／ρｃ）×１００（％））として求めたものとする。嵩密度（ρ）は、乾燥質量と体積から算出し、真密度（ρc）は、ゲイリュクサック型形の比重瓶法により求めることができる。

（ｂ）乾燥工程
乾燥工程では、前記ゼラチン含有中間体の乾燥を行う。
乾燥方法としては、流動層乾燥法、薄膜乾燥法、スプレードライ法、凍結乾燥法等があるが、凍結乾燥法が好ましく用いられる。
凍結条件としては、タンパク質の凍結乾燥に通常用いられる条件をそのまま採用すればよい。凍結乾燥の期間としては、例えば、０．５時間〜３００時間とすることができる。使用可能な凍結乾燥器についても特に制限はない。

（ｃ）架橋工程
前記乾燥工程の前又は後に行われる架橋工程では、前記組換えゼラチンの架橋を行う。
架橋の方法としては、熱架橋、化学架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、ＵＶ架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用など公知の方法を用いることができる。

光架橋としては、光反応性基を導入した高分子への光照射、あるいは光増感剤の存在化での光照射によるものが挙げられる。光反応性基としては、例えば、シンナミル基、クマリン基、ジチオカルバミル基、キサンテン色素、カンファキノンが挙げられる。

酵素による架橋を行う場合、酵素としては、生分解性材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。
トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies，Inc.社）などが挙げられる。

本発明において、アルデヒド類又は縮合剤などの架橋剤で処理する際の前記ゼラチンとの混合温度は、溶液を均一に攪拌できる限り特に限定されないが、好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは０℃〜３０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃〜１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
架橋剤を混合して攪拌した後は、温度を上昇させることができる。反応温度としては架橋が進行する限りは特に限定はないが、前記ゼラチンの変性や分解を考慮すると実質的には０℃〜６０℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃〜１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。

架橋の方法としては、化学架橋剤を用いた架橋法又は熱架橋法であることが好ましい。化学架橋剤を用いた架橋法の場合には、グルタルアルデヒドを化学架橋剤として用いた架橋であることがより好ましい。
化学架橋剤を用いた架橋法を採用する場合には、化学架橋剤は、前記ゼラチン溶液に添加して、前記乾燥工程の前に架橋を行うことが好ましい。

熱架橋法に適用される架橋温度は、１００℃〜２００℃であることが好ましく、１１０℃〜１８０℃であることがより好ましく、１２０℃〜１６０℃であることがさらに好ましい。熱架橋法を採用することにより、架橋剤の使用を回避することができる。架橋温度を１００℃以上とすると、架橋を十分に進行させることができる。一方、架橋温度を２００℃以下とすると、架橋以外の副反応が生じないため好ましい。

上記熱架橋処理を行う雰囲気は、酸素および水蒸気の濃度が十分に低く保たれる限りにおいて限定されないが、不活性ガスないし５ｋＰａ以下の真空中で行うことが好ましい。不活性ガスの圧力に特に制限はないが、０．１５ＭＰａ以下の圧力で行うことが好ましい。また、不活性ガスの種類にも制限はないが、窒素を用いることが好ましい。

架橋時間は以下に述べる酸分解性を指標として、架橋に供されるゼラチンの性状、および対象となる組織に応じて、当業者が適切に選択することが可能である。架橋時間を長くすること、および／または架橋温度を低くすることにより酸分解性は低下する。
酸分解性は、例えば、骨組織を対象とする修復材の場合、１モル／Ｌ（リットル）の塩酸を用いた５時間の分解処理による質量基準で８０％以下の残存率を示すことが好ましく、３時間の処理での残存率が１０％乃至７０％であることがさらに好ましい。架橋に供するゼラチンとして上記配列番号１で示されるポリペプチドを用いた場合、前記残存率は真空（０ＭＰaを含む）乃至０．１５ＭＰａの不活性ガス中、１２０乃至１５０℃で４乃至２０時間の処理を行うことにより達成可能である。
また、熱架橋法を採用する場合には、得られる組織修復材の形状及び組織修復能の観点から前記乾燥工程の後に行われることが好ましい。

［酸分解性］
本発明の組織修復材の酸分解性は、以下のようにして測定される。酸分解性は、酸分解率として示すことができる。
測定用のマイクロチューブ（以下チューブ）の質量を測定する（Ａ）。組織修復材５．０（±０．２）ｍｇを秤量し（Ｂ）、測定用チューブに充填する。組織修復材入りのチューブに、１モル／ＬのＨＣｌを１．０ｍｌ添加し、３７℃に設定した振とう恒温器（ＨＢ−８０（タイテック）、１分間の振とう回数：６０回）で所定の時間振とうさせる。規定時間後、チューブを氷上に立て反応を止め、あらかじめ４℃に設定した遠心器で１０，０００×ｇ、１分遠心する。組織修復材が沈殿していることを確認し、上清を吸い取り、あらかじめ氷上で冷やしておいた超純水を１ｍｌ添加して、上記と同一の条件で再度、遠心する。上清を吸い取り、再度超純水を加え、上記と同一の条件で再度遠心する。上清を吸い取ったのち、凍結乾燥する。乾燥終了後、凍結乾燥機から取り出し、空気中の水分を組織修復材が吸い取るのを防ぐためすばやくチューブのキャップを閉める。チューブごと質量を測定し（Ｃ）、下記計算式（３）を用いて残存率を算出する。酸分解性は下記計算式（４）を用いて算出される。
残存率＝（Ｃ−Ａ）／Ｂ×１００（％）・・・・（３）
酸分解率 ＝ １００−残存率（％）・・・・（４）

本発明の組織修復材においては、５時間の分解処理において上記残存率が８０％以下であることが好ましい。５時間での残存率が８０％より高い場合は、組織再生速度が低下する傾向にある。本発明の組織修復材においては、残存率は、欠損部位のスペース維持、再生骨との置換の観点から、３時間処理で７０質量％以下であることがより好ましく、６０質量％以下であることが更に好ましい。また、本発明の組織修復材においては、残存率の下限値は、埋植部位のスペース維持の観点から、３時間処理で１０質量％以上であることが好ましく、３０質量％以上であることがさらに好ましい。

［組織修復材料］
本発明の製造方法により得られた組織修復材は、架橋された前記組換えゼラチンを含有し、吸水率が質量基準で１００％以上の多孔質の組織修復材である。このような組織修復材とすることにより、良好な組織修復能を奏することができる。
前記組織修復材の吸水率は、２５℃において、３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、組織修復材を約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させたときの、下記式（５）で計算される比を意味する。
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０・・・・（５）
式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。

前記吸水率は、組織の修復能の観点から、１００％以上であることが好ましく、２００％以上であることがより好ましく、４００％以上であることが更に好ましい。前記吸水率の上限については特に制限はないが、一般に９９００％以下であり、好ましくは５０００％以下である。吸水率が１００％以上であれば、例えば、骨再生率が良好となる傾向がある。

前記組織修復材は、前記ゼラチン含有中間体における所定の網目構造に由来する空隙を備えた多孔質体である。
本明細書において「多孔質」とは、本体内部に複数の空孔を有する材料、または、そのような材料を解砕して得られる材料を示す。これらの材料において、前述した内部の空孔は、互いに連通していてもよく、一部もしくは全部の空孔が材料表面に開口していてもよい。

前記ゼラチン含有中間体における所定の網目構造は、前記乾燥工程の後（場合により、架橋工程の後）であっても、良好に維持されるため、前記組織修復材料の構造上の特性は、ほぼ前記ゼラチン含有中間体の特性と同様となる。
前記組織修復材の空隙率は、前記ゼラチン含有中間体と同様に、好ましくは８０％以上９９．９９％以下であり、さらに好ましくは９５．０１％以上９９．９％以下である。なお、空隙率は、嵩密度（ρ）と真密度（ρc）より、空隙率（Ｐ＝（１−ρ／ρｃ）×１００（％））として求めたものとする。嵩密度（ρ）は、乾燥重量と体積から算出し、真密度（ρc）は、ハバード型形の比重瓶法により求めることができる。

また、前記組織修復材料には、前記ゼラチン含有中間体と同様に、連通孔が存在していてもよい。連通孔が存在することによって、前記組織修復材料の外部から深部に至るまで、空隙が連なることにより、組織修復材の外部に接触した細胞が、多孔質体の内部へと分散・拡散可能となる。また、連通孔の孔径は、上記機能を発揮するため、１０μｍ以上であることが好ましい。

得られた組織修復材は、その後に、更に破砕して粉末化してもよい。これにより、利便性に優れた粉末形態の組織修復材を得ることができる。破砕に適用される破砕方法としては特に制限はなく、凍結乾燥物を粉末化するために通常用いられる方法をそのまま適用することができる。

本発明の組織修復材料は、例えば、上述した骨再生率、骨接着、又はこれらの組み合わせにより特定することができる。
骨再生率としては、前述した骨再生率をそのまま適用することができる。骨再生率は、２２％以上であれば組織の修復としては充分であり、２５％以上であることが好ましい。
また、骨接着としては、２０％以上であれば組織の修復としては充分であり、２５％以上であることが好ましい。

本発明の組織修復材により修復可能な組織としては、歯、骨等の硬組織であることが好ましい。特に、前記組織修復材料は、骨再生用として、組織の修復材、又は治療剤等として用いることができる。本発明の組織修復材は単独で骨再生治療剤として用いることができる。骨再生、骨新生が必要な治療である限り、疾患は限定されるものではない。加えて、本発明の組織修復材は、移植細胞や骨誘導薬剤と併用することによっても骨再生治療剤として用いることが出来る。骨誘導薬剤としては、例えばＢＭＰ（骨形成因子）やｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）が挙げられるが、特に限定はされない。

また、本発明は、上述の組織修復能が良好な組織修復材を提供することができるので、組織の修復方法や、組織の損傷を伴う疾患等の治療方法も本願発明に包含される。
具体的には、本発明における組織の修復方法は、対象組織が欠損又は損傷した部位に、前記組織修復材を適用することを含み、必要に応じて他の工程を含む。

また、本発明における損傷組織の治療方法は、対象組織が欠損又は損傷した部位に、前記組織修復材、又は対象組織が骨である場合には前記骨再生治療剤を適用することを含み、必要に応じて他の工程、を含む。他の工程としては、例えば、移植細胞及び／又は前記骨誘導剤を組織修復材の適用の前後、又は同時に組織修復材を適用する部位へ適用することが挙げられる。
前記治療方法又は修復方法は、顎顔面領域における 歯周組織欠損（periodontal defect）、インプラント欠損（implant defect）等；インプラント埋入時の予備的処置としてのＧＢＲ法、歯肉増大術（Ｒｉｄｇｅ Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）法、サイナスリフト法、またはソケットリザベーション法などに好ましく適用することができる。

以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。以下の実施例１、実施例２、実施例４、及び実施例５は、いずれも参考例と読み替えるものとする。

［実施例１］
組換えゼラチンとしてリコンビナントペプチドＣＢＥ３を用いて、実施例１にかかる組織修復材料を製造した。
ＣＢＥ３としては、以下記載のものを用いた（ＷＯ２００８−１０３０４１に記載）。
ＣＢＥ３
分子量：５１．６ｋＤ
構造： ＧＡＰ［（ＧＸＹ）_６３］_３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。
ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、チロシン残基及びシステイン残基は含まれていない。
ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
アミノ酸配列（配列番号１）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)₃G

前記組換えゼラチンを１２質量％で含むゼラチン水溶液を、アルミ製バットに流し込んだ後、−２０℃冷凍庫内で終夜静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥し、乾燥中間体１を得た。該乾燥中間体１を粉砕機によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、減圧下１６０℃で１５時間処理し、試料１とした。
乾燥中間体１における網目構造の形状観察及び長軸方向の径（長径）の平均値、試料１における吸水率、骨再生及び骨接着を、それぞれ以下のように評価した。

（１）乾燥中間体１における網目の形状、長径の平均値
乾燥中間体１を、水平および鉛直方向に切断する。次いで、各断面をスタンプ台に密着させることにより染色し、２．０ｍｍ×２．０ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した。観察領域内における、染色された材料で囲まれた領域に外接する長方形のうち、長方形の対向する二辺の距離が最大となる外接長方形を選択した。この対向する二辺の距離が最大となる外接長方形の長辺の長さを、水平方向の断面及び鉛直方向の断面のそれぞれにおける観察領域内において、５０個ずつ計測し、その平均を当該乾燥中間体１の網目の長径の平均値とした。
また、このときの個々の網目について、水平方向の断面の長径（平均値）と鉛直方向の断面の長径（平均値）のうち小さい方をｄ１、他方をｄ２として得られた比率ｄ２／ｄ１（網目アスペクト比）を求め、この網目アスペクト比が１〜３の場合を「球状」とし、この範囲外のものを「柱状」として、網目の形状を評価した。結果を表１に示す。

（２）吸水率
２５℃において、３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、試料１を約１５ｍｇ充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、式（５）に従って、吸水率を求めた。結果を表１に示す。
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０・・・・（５）
式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。

（３）骨再生評価
ＳＤラット（雄、１０〜１２週齢、０．３ｋｇ〜０．５ｋｇ）の頭頂骨に、直径５ｍｍの円形の骨欠損部を作製し、約３．６ｍｇの試料１を、作製した骨欠損部へ充填した後、皮膚を縫合した。手術後４週目に、ラットの頭頂骨についてマイクロＣＴを用いて骨量を計測し、欠損部体積に対する欠損部内部の骨体積を骨再生率（％）とした。結果を表１に示す。

（４）骨接着評価
ＳＤラット（雄、１０〜１２週齢、０．３ｋｇ〜０．５ｋｇ）の頭頂骨に、直径５ｍｍの円形の骨欠損部を作製し、約３．６ｍｇの試料１を、作製した骨欠損部へ充填した後、皮膚を縫合した。手術後４週目にペントバルビタール麻酔下で放血致死させて頭部を摘出した。埋入部を含む頭頂骨に対してＨＥ染色を行い、組織学的観察を行った。埋設した試料１と新生骨が線維性の組織を介さずに接触している部位を数え、埋設した試料１の１箇所平均の接触箇所数（骨接着率）に応じて、以下のように評価を行った。結果を表１に示す。
骨接着率３０％以上の場合：良（Ａ）
骨接着率が２０％以上３０％未満の場合：可（Ｂ）
骨接着率が２０％未満の場合：不良（Ｃ）

［実施例２］
実施例１で用いたＣＢＥ３を１２質量％含むゼラチン水溶液をステンレス製バットに流し込んだ後、−５０℃の冷蔵庫で８時間静置して、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥し、乾燥中間体２を得た。該乾燥中間体２を粉砕機によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、減圧下１６０℃で１９時間処理して、試料２を得た。
乾燥中間体２における網目構造の形状観察及び長軸方向の径（長径）の平均値、試料２における吸水率、骨再生及び骨接着を、実施例１と同様にして評価した。

［実施例３］
実施例１で用いたＣＢＥ３を１２質量％含むゼラチン水溶液を９℃で冷却したポット内でＴ．Ｋ．ホモディスパー２．５型を用い１４００ｒｐｍにて撹拌した後、−５０℃の冷凍庫内で８時間静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。なお、本条件での攪拌は、攪拌フルード数Ｆｒが２．２２、及び攪拌レイノルズ数が３，７００の攪拌条件に相当する。このゼラチンブロックを凍結乾燥して、乾燥中間体３を得た。該乾燥中間体３を粉砕機によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、減圧下１６０℃で１９時間処理して、試料３を得た。
乾燥中間体３における網目構造の形状観察及び長軸方向の径（長径）の平均値、試料３における吸水率、骨再生及び骨接着を、実施例１と同様にして評価した。

［実施例４］
実施例１で用いたＣＢＥ３を最終濃度７．５質量％としてゼラチン水溶液を調製し、このゼラチン水溶液をステンレス製バットに流し込んだ後、−８０℃冷凍庫内で８時間静置することによって凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥して、乾燥中間体４を得た。該乾燥中間体４を粉砕機によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、減圧下１６０℃で１９時間処理して、試料４を得た。
乾燥中間体４における網目構造の形状観察及び長軸方向の径（長径）の平均値、試料４における吸水率、骨再生及び骨接着を、実施例１と同様にして評価した。

[実施例５]
実施例１で用いたＣＢＥ３を最終濃度７．５質量％としてゼラチン水溶液を調製し、このゼラチン水溶液をアルミ製容器に流し込んだ後、−４０℃冷凍庫内で予冷したジュラルミンブロック上に断熱材を介して設置し、１時間静置することによって凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥して、乾燥中間体５を得た。該乾燥中間体５を粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、０．０８ＭＰａ窒素雰囲気下１３７℃で７時間処理して、試料５を得た。
乾燥中間体５における網目構造の形状観察及び長軸方向の径（長径）の平均値、試料５における吸水率、骨再生及び骨接着を、実施例１と同様にして評価した

［比較例１］
実施例１で用いたＣＢＥ３を１２質量％含むゼラチン水溶液を、ポリプロピレン製バットに流し込んだ後、冷蔵庫（４℃）内で１週間静置することによって、乾燥したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥して、乾燥中間体６を得た。該乾燥中間体６を粉砕機によって粉砕し、目開き７１０μｍのふるい下、且つ、目開き５００μｍのふるい上の画分を回収したのち、減圧下１６０℃で１９時間処理して、試料６を得た。
乾燥中間体６における網目構造の形状観察及び長軸方向の径（長径）の平均値、試料６における吸水率、骨再生及び骨接着を、実施例１と同様にして評価した。

このように本発明の実施例にかかる組織修復材は、所定の網目構造を有するゼラチン中間体を凍結乾燥させて得られたものであるので、高い吸水率と高い骨再生率を有し、良好な骨接着を誘導可能な組織修復材料であった。
従って、本発明によれば、良好な組織再生能を有する組織修復材を得ることができる組織修復材の製造方法を提供するができる。

Claims (12)

1. （ａ）水性媒体に溶解したゼラチンを含むゼラチン溶液を用いて、前記ゼラチン溶液を攪拌して前記ゼラチン溶液中に気泡を発生させ、その後に該ゼラチン溶液を１℃〜２０℃に冷却してゲル化することにより、該ゼラチンを含み且つ、網目構造を有するゼラチン含有中間体を得ること、
   （ｂ）前記ゼラチン含有中間体の乾燥を行うこと、
   （ｃ）前記ゼラチン含有中間体の乾燥の前又は後に、前記ゼラチンの架橋を行うこと、
   を含み、
   前記ゼラチン含有中間体の乾燥の後に、前記ゼラチン含有中間体を粉砕して粉末化することを更に含む、骨組織修復材の製造方法。
2. 前記乾燥は、凍結乾燥である請求項１記載の骨組織修復材の製造方法。
3. 前記ゼラチンが、組換えゼラチンである請求項１又は請求項２記載の骨組織修復材の製造方法。
4. 前記ゼラチン含有中間体における網目の孔径が、少なくとも１０μｍ以上である請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の骨組織修復材の製造方法。
5. 前記ゼラチン含有中間体を、前記ゼラチン溶液を−１００℃〜−１０℃の温度下で凍結させることにより得ることを含む請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の組織修復材の製造方法。
6. 前記ゼラチンの架橋が、１００℃〜２００℃の条件による加熱により、前記乾燥の後に行われる請求項１〜請求項５のいずれか１項記載の骨組織修復材の製造方法。
7. 前記ゼラチンの架橋が加熱により行われ、かつ、前記ゼラチンの架橋が、製造された組織修復材５ｍｇに１ｍｌの１モル／Ｌの塩酸を添加して３７℃で５時間処理したときの酸分解率が２０％以上となるように行われる、請求項１〜請求項６のいずれか１項記載の骨組織修復材の製造方法。
8. 前記ゼラチンが、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ及びＹは任意のアミノ酸残基を表す）で示される配列の繰り返し単位と、細胞接着シグナルと、を有する組換えゼラチンである請求項３〜請求項７のいずれか１項記載の骨組織修復材の製造方法。
9. 前記組換えゼラチンが、Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_ｎ］_ｍ−Ｂ（Ｘ及びＹは任意のアミノ酸残基を表し、ｍは２から１０の整数を表し、ｎは３から１０の整数を表し、Ａ及びＢはそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基またはアミノ酸配列を表す）で示される配列と、細胞接着シグナルと、を有する請求項８に記載の骨組織修復材の製造方法。
10. 前記組換えゼラチンが、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_６３］_３−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、６３個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示す。なお、３個の（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_６３はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される配列と、細胞接着シグナルと、を有する請求項８または請求項９に記載の骨組織修復材の製造方法。
11. 前記ゼラチンが、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの組換えゼラチンである請求項３〜請求項１０のいずれか１項記載の骨組織修復材の製造方法：
    （Ａ） 配列番号１で示されるポリペプチド、
    （Ｂ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列中、第４番目〜第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を有すると共に、骨組織修復能を有するポリペプチド、
    （Ｃ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、骨組織修復能を有するポリペプチド。
12. 前記ゼラチン溶液中に気泡を発生させるための前記ゼラチン溶液の攪拌条件が、下記式（１）で表される攪拌フルード数Ｆｒが２．０以上、及び下記式（２）で表される攪拌レイノルズ数Ｒｅが６０００以下の攪拌条件である請求項１〜請求項１１のいずれか１項記載の骨組織修復材の製造方法：
    Ｆｒ＝ ｎ^２ｄ／ｇ ・・・・（１）
    Ｒｅ＝ ρｎｄ^２／μ ・・・・（２）
    両式において、ｎは撹拌数（／秒）、ｄは撹拌翼の直径（ｍ）を表し、式（１）において、ｇは重力加速度（ｍ／ｓ^２）を表し、式（２）において、ρは溶液密度（ｋｇ／ｍ^３）、μは溶液粘度（Ｐａ・ｓ）を表す。