JP5981025B2 - 組織修復材 - Google Patents
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Description
このうち、整形外科領域又は歯科領域の骨再生は、再生医療領域において非常に注目を集めている領域である。骨疾患が足や腰の場合は、疾患に起因して発生した骨欠損により、歩行不能となり、骨疾患が歯周組織の場合は食事摂取が困難となることから、骨疾患は著しいQOLの低下を引き起こす。
再生医療の分野では、生体親和性の高いコラーゲン又はゼラチンが基材として用いられている。
特開平8−196618号公報には、多数の空孔が存在するスポンジ状のコラーゲンマトリクスからなる細胞侵襲性コラーゲン製剤が開示されている。
一方、顆粒状の骨補填剤として、特開2001−212105号公報及び特開2010−046249号公報には、バイオセラミックの顆粒を用いた骨補填剤が開示されている。
[1] ゼラチン顆粒を含み、質量基準で800%以上の吸水率と、1モル/Lの塩酸を用いた3時間の分解処理による質量基準で60%以下の残存率と、を示す組織修復材。
[2] ゼラチン顆粒が1400μmの目開きのふるいを通過する顆粒状のゼラチンである[1]に記載の組織修復材。
[3] ゼラチン顆粒が、ゼラチンの架橋物を含む[1]又は[2]に記載の組織修復材。
[4] ゼラチン顆粒が、ゼラチンの熱架橋物を含む[1]〜[3]のいずれか1つに記載の組織修復材。
[5] 組織修復材が顆粒状である[1]〜[4]のいずれか1つに記載の組織修復材。
[6] 骨再生用基材である[1]〜[5]のいずれか1つに記載の組織修復材。
[7] ゼラチンを含み、質量基準で800%以上の吸水率と、1モル/Lの塩酸を用いた3時間の分解処理による質量基準で60%以下の残存率と、を示すブロック状組織修復材。
[8] 真皮再生用である[7]に記載のブロック状組織修復材。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を示す。
本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本発明において、対比される2種のポリペプチドのアミノ酸配列に関する「同一性」とは、以下の式で計算される値を指す。なお、複数のポリペプチドの対比(アライメント)は、同一となるアミノ酸残基の数が最も多くなるように常法に従って行うものとする。
同一性(%)
={(同一となるアミノ酸残基の数)/(アラインメント長)}×100
上記の残存率は換言すると、1モル/Lの塩酸を用いた3時間の分解処理による質量基準で40%以上の分解率を意味する。
以下、上記の残存率を酸残存率と称する場合がある。
本発明における「組織修復材」とは、埋植部位に通常存在する正常組織の形成に必ずしも寄与するものではなく、瘢痕組織等を含む非正常組織の形成を促進する材料も包含するものである。
ゼラチンは、天然型のゼラチンであっても、天然型とは少なくとも1つのアミノ酸残基が異なる変異型又は組換え体であってもよい。天然型のゼラチンとは、天然で生じたコラーゲンを原料とするゼラチン、又は天然で生じたコラーゲンを原料とするゼラチンと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。特に断らない限り、本明細書では変異型又は組換え体のゼラチンを総称して、組換えゼラチンと称する。天然型のゼラチン又はその組換えゼラチンは、例えば、魚類、哺乳類等の動物に由来するものが挙げられるが、哺乳類の動物の天然型ゼラチン又はその組換えゼラチンであることが好ましい。哺乳類の動物としては、例えば、ヒト、ウマ、ブタ、マウス、ラット等が挙げられ、ヒト又はブタであることがより好ましい。天然型ゼラチンとしてはブタ又はヒトに由来するものであることが好ましく、組換えゼラチンとしてはヒト由来組換えゼラチンであることが好ましい。
組換えゼラチンにおけるアミノ酸残基の総数に対するRGD配列の割合(RGD配列の合計アミノ酸残基数/アミノ酸残基の総数×100)は、少なくとも1.2%であることが好ましく、組換えゼラチンが250以上のアミノ酸残基を含む場合、250アミノ酸残基の各ストレッチが少なくとも1つのRGD配列を含むことが好ましい。
組換えゼラチンは、250のアミノ酸残基あたり少なくとも2つのRGD配列を含むことがより好ましく、少なくとも3つRGD配列を含むことがより好ましく、少なくとも4つのRGD配列を含むことが更に好ましい。
(A) 下記配列番号1で示されるポリペプチド。
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G(配列番号1)
(B) (A)のアミノ酸配列中、第4番目〜第192番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有する部分配列を有し、且つ、組織再生能を有するポリペプチド。
(C) (A)のアミノ酸配列に対して1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、組織再生能を有するポリペプチド。
また、(B)で規定されるポリペプチドは、繰り返し単位に相当する部分アミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有する部分配列を、合計のアミノ酸残基数として、全アミノ酸残基数の80%以上含むことが好ましい。
例えば、骨再生能は、ラットの頭頂骨に所定の大きさの骨欠損部を作製し、組織修復材を骨欠損部へ充填後、皮膚を縫合し、手術後4週目にマイクロCTを用いて骨量を計測して、骨欠損部の容積に対する再生した骨体積の割合として評価することができる。
組織修復材に含まれるゼラチン顆粒は、4mmの目開きのふるいを通過する粒子である。ゼラチン顆粒は、細胞侵入性の観点から、1400μmの目開きのふるいを通過する粒子群であることが好ましく、1000μmの目開きのふるいを通過する粒子群であることがより好ましく、710μmの目開きのふるいを通過する粒子群であることが更に好ましい。また、製剤層の弾性確保の観点より、ゼラチン顆粒は目開き75μmのふるいに残留する粒子群であることが好ましく、300μmのふるいに残留する粒子群であることがさらに好ましい。
なお、ゼラチン顆粒のふるい分けにはISO3310規格の試験ふるいを使用し、ふるい分けの方法は、第16改正日本薬局方3.04節の第2法に記載のふるい分け法に準じる。すなわち、5分間の振とうを断続的に複数回行い、振とう後にふるい上に残った粒子群の質量が、振とう前のふるい上の粒子群の質量に対して5%以下となったとき、終了する。
本発明において「通過する」との語は、上記終点時にふるい上に残る粒子がふるい前の全質量の10質量%以下であることを意味し、「残留する」との語は、上記終点時にふるい上に残る粒子がふるい前の全質量の95質量%以上であることを意味する。
タップ密度は、ある体積にどれくらいの顆粒を密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、顆粒の構造がより複雑になる傾向があり、また、サイズ分布が広くなる傾向があり、また、粗に充填される傾向がある。凍結時につくられるゼラチンの構造の相違から粉砕後に得られる顆粒の形状が異なること、及び、粉砕により様々なサイズの顆粒が得られることから、本明細書でいうタップ密度は、好ましくは10mg/cm3以上500mg/cm3以下、より好ましくは30mg/cm3以上450mg/cm3以下、更に好ましくは50mg/cm3以上420mg/cm3以下、更により好ましくは140mg/cm3以上280mg/cm3以下である。タップ密度が10mg/cm3以上であれば、製剤層の弾性を高くしやすく、欠損部の容積を維持しやすい傾向がある。一方、タップ密度が500mg/cm3以下であれば、細胞の侵入性の低下を抑制しやすく十分な治癒効果を得られやすい傾向がある。
タップ密度:ρt=(wg−wt)/0.616
組織修復材は、質量基準で800%以上の吸水率を示す。吸水率が800%未満では、良好な組織再生能が得られない。組織修復材の吸水率は、組織修復時の血餅保持の観点で900%以上であることが好ましく、1200%以上であることがより好ましく、1400%以上であることが更に好ましい。組織修復材の吸水率の上限値は、特に制限はないが、好ましくは9900%以下、より好ましく5000%以下、更に好ましくは3000%以下である。組織修復材の吸水率は、組織修復材がゼラチン顆粒のみを含む場合、ゼラチン顆粒の吸水率とする。
メッシュ150本/2.54cm/線径6μm、オープニング108μm相当、オープニングエリア41%、厚さ106μm、3cm×3cmの測定用のナイロン製メッシュ袋(以下メッシュ袋)の質量を測定する(A)。顆粒状の組織修復材については組織欠損部に配置させる形態のまま加工せず15.0(±1.0)mgを秤量、ブロック状の組織修復材については約1.5mm×約2mm×約12mmの直方体の検体を作製し、質量を測定し(B)、測定用のメッシュ袋に入れる。組織修復材を入れず空の状態の測定用のメッシュ袋をブランク用メッシュ袋として使用し、質量を測定する(C)。双方のメッシュ袋の上面をクリップで挟み、超純水80ml入りの100mlビーカーに吊るす。メッシュ袋内の組織修復材が全て水に浸かる位置に、双方のメッシュ袋を保持させて2時間以上放置する。2時間以上経過した後、ビーカー内の水を捨て双方のメッシュ袋を取出し、それぞれ、同一の角度で斜めに吊るし、10分間静置して余分な水分を切る。その後、ブランクメッシュ袋の質量(D)、及び、組織修復材入りメッシュ袋の質量(E)を測定し、下記計算式(1)及び(2)を用いて吸水率を算出する。
ブランク吸水率(F)=D/C・・・(1)
吸水率=(E−A×F)/B×100(%)・・・(2)
組織修復材は、1モル/L(リットル)の塩酸を用いた3時間の分解処理による質量基準で60%以下の残存率を示す。1モル/Lの塩酸を用いた3時間の分解処理による質量基準での残存率が60%より高い場合は、組織再生能が充分とは言えない。組織修復材の酸残存率は、欠損部位での製剤層の体積の維持、再生する組織との置換の観点から、5質量%以上であることが好ましく、20質量%以上であることがより好ましく、40質量%以上であることが更に好ましい。組織修復材の酸残存率は、組織修復材がゼラチン顆粒のみを含む場合、ゼラチン顆粒の酸残存率とする。
酸残存率=(C−A)/B×100(%)・・・・(3)
組織修復材は、ゼラチン顆粒に加えて、組織の修復又は再生に寄与しうる他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、骨誘導薬剤等の骨再生又は骨新生に関する成分を挙げることができる。骨誘導薬剤としては、例えばBMP(骨形成因子)やbFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)が挙げられるが、特に限定はされない。
組織修復材は、ゼラチン顆粒を含み、上述した所定の吸水率及び酸残存率を示すものであれば、製造方法は特に制限されないが、例えば、以下の方法により得ることができる。
組織修復材の一の製造方法は、(a)水性媒体に溶解したゼラチンを含むゼラチン溶液を準備すること(以下、ゼラチン溶液調製工程という)、(b)ゼラチン溶液を凍結乾燥に供して凍結乾燥体を得ること(以下、凍結乾燥工程という)、(c)ゼラチンの凍結乾燥体を粉砕して粉砕物を得ること(以下、粉砕工程という)、及び、(d)粉砕物を架橋して基材を得ること(以下、架橋工程という)を含む。
またゼラチン溶液には、後述する各工程に必要な成分、例えば架橋剤や、組織修復材に所定の特性を付加するために有用な成分等が、必要に応じて含有されていてもよい。
これにより、内部に適当な大きさの氷晶を有するゼラチン含有中間体を得ることができる。形成された氷晶によりゼラチンのペプチド鎖の粗密が生じてゼラチン含有中間体が固体化するため、氷晶が消失した後には、ゼラチン含有中間体の網目の空隙が形成される。氷晶の消失は、後段の乾燥工程により容易に行われる。ゼラチン含有中間体の網目の孔径は、氷晶温度、冷却時間又はこれらの組み合わせにより調整することができる。
「網目構造を有する」とは、ゼラチンを含む材料で構成される壁状構造によりミクロンオーダー以上の空隙が形成されていること、即ち、1μm以上の孔径を有することを意味する。
まず、ゼラチン含有中間体を乾燥した後に得られる乾燥中間体を、水平及び鉛直方向に切断する。次いで、各断面をスタンプ台に密着させることにより染色し、2.0mm×2.0mmの領域を光学顕微鏡で観察する。観察領域内における、染色された材料で囲まれた領域(1個の網目)に外接する長方形のうち、長方形の対向する二辺の距離が最大となる外接長方形を選択する。この対向する二辺の距離が最大となる外接長方形の長辺の長さを、水平方向の断面及び鉛直方向の断面のそれぞれにおける観察領域内において、50個ずつ計測し、その平均を当該ゼラチン含有中間体の網目の長径の平均値とする。
網目の形状が柱状である場合(網目アスペクト比が1〜3の範囲外の場合)には、網目アスペクト比は、骨接着の観点から4又は5であることが好ましい。5以下であれば、骨接着が増加する傾向がある。
網目の形状としては、組織の修復能の観点から球状(網目アスペクト比が1〜3)であることが好ましい。
長軸方向の径が10μm以上であれば、網目構造の内部に細胞が侵入しやすくなる傾向があり、2500μm以下であれば、生体との親和性を高める傾向がある。
凍結条件としては、タンパク質の凍結乾燥に通常用いられる条件をそのまま採用すればよい。凍結乾燥の期間としては、例えば、0.5時間〜300時間とすることができる。使用可能な凍結乾燥器についても特に制限はない。
熱架橋の処理時間としては、架橋温度、ゼラチンの種類やどの程度の分解性を保持させるかによって異なる。例えば、ヒト由来組換えゼラチンとして後述する実施例で使用のCBE3を用いた場合の熱架橋条件は、次のとおりである。実温約136℃のとき、2時間〜20時間であることが好ましく、3時間〜18時間であることがより好ましく、5時間〜8時間であることが更に好ましい。熱架橋の処理は、酸化防止の点で減圧又は真空下又は不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。減圧度としては、4hPa以下とすることが好ましい。不活性ガスとしては窒素が好ましく、均一な加熱の観点より真空下より不活性ガス雰囲気下での架橋が好ましい。加熱手段としては特に制限はなく、例えばヤマト科学製DP−43のような真空オーブン等を挙げることができる。
本発明は、組織再生能が良好な組織修復材を提供することができるので、組織の修復方法や、組織の損傷を伴う疾患等の治療方法も本発明に包含される。
具体的には、本発明における組織の修復方法は、対象組織が欠損又は損傷した部位に、組織修復材を適用することを含み、必要に応じて他の工程を含む。
治療方法又は修復方法は、顎顔面領域における歯周組織欠損(periodontal defect)、インプラント欠損(implant defect)等;インプラント埋入時の予備的処置としてのGBR法、歯肉増大術(Ridge Augmentation)法、サイナスリフト法、又はソケットリザベーション法;などに好ましく適用することができる。
本発明のブロック状組織修復材は、ゼラチンを含み、質量基準で800%以上の吸水率と、1モル/Lの塩酸を用いた3時間の分解処理による質量基準で60%以下の残存率と、を示す組織修復材である。本組織修復材によれば、組織の中でも特に真皮を良好に再生することができる。
したがって、本発明のブロック状組織修復材は、真皮再生用であることが好ましい。
本ブロック状組織修復材は、粉砕工程を行わない以外は、ゼラチン顆粒を含む組織修復材の製造方法と同様にして製造すればよい。
組換えゼラチンとしてリコンビナントペプチドCBE3を用いて、実施例1にかかる骨再生用基材を製造した。
CBE3としては、以下記載のものを用いた(WO2008/103041A1に記載)。
CBE3
分子量:51.6kD
構造:GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。
CBE3のアミノ酸配列には、セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、チロシン残基及びシステイン残基は含まれていない。
CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
アミノ酸配列(配列番号1)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
厚さ1mm、直径47mmのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は1mmのアルミで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も1mmのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚1mmのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は45mmになっている。以後、この容器のことを円筒形容器と呼称する。
試料1における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、それぞれ以下のように評価した。
25℃、相対湿度30%において、以下の実験を行った。
メッシュ150本/2.54cm/線径6μm、オープニング108μm相当、オープニングエリア41%、厚さ106μm、3cm×3cmの測定用のナイロン製メッシュ袋(以下メッシュ袋)の質量を測定した(A)。試料1を15.0(±1.0)mg秤量し(B)、測定用のメッシュ袋に入れた。試料1を入れず空の状態の測定用のメッシュ袋をブランク用メッシュ袋として使用し、質量を測定した(C)。双方のメッシュ袋の上面をクリップで挟み、超純水80ml入りの100mlビーカーに吊るした。メッシュ袋内の試料1が全て水に浸かる位置に、双方のメッシュ袋を保持させて2時間以上放置した。2時間以上経過した後、ビーカー内の水を捨て双方のメッシュ袋を取り出し、それぞれ、同一の角度で斜めに吊るし、10分間静置して余分な水分を切った。その後、ブランクメッシュ袋の質量(D),及び、試料1入りメッシュ袋の質量(E)を測定し、下記計算式(1)及び(2)を用いて吸水率を算出した。結果を表1に示す。
ブランク吸水率(F)=D/C・・・(1)
吸水率=(E−A×F)/B×100(%)・・・(2)
25℃、相対湿度30%において、以下の実験を行った。測定用のマイクロチューブ(以下チューブ)の質量を測定した(A)。試料1を5.0(±0.2)mg秤量し(B)、測定用チューブに充填した。試料1入りのチューブに1モル/LのHClを1.0ml添加し、37℃振とう恒温器(HB−80(タイテック)、シーソー、1分間の往復回数:60回)で3時間振とうさせた。規定時間後、チューブを氷上に立て反応を止め、あらかじめ4℃に設定した遠心機で10,000×g、1分遠心した。試料1が沈殿していることを確認し、上清を吸い取り、あらかじめ氷上で冷やしておいた超純水を1ml添加して、上記と同一の条件で再度、遠心した。上清を吸い取り、再度超純水を加え、上記と同一の条件で再度遠心した。上清を吸い取ったのち、凍結乾燥した。凍結乾燥後から取り出した後、空気中の水分を試料1が吸い取るのを防ぐためすばやくチューブのキャップを閉めた。チューブごと質量を測定し(C)、下記計算式(3)を用いて酸残存率を算出した。結果を表1に示す。
酸残存率=(C−A)/B×100(%)・・・(3)
SDラット(雄、10〜12週齢、0.3〜0.5kg)の頭頂骨に、直径5mmの円形の骨欠損部を作製し、約3.6mgの試料1を、作製した骨欠損部へ充填した後、縫合した。手術後2週目及び4週目にラットの頭頂骨についてマイクロCTを用いて骨量を計測し、欠損部体積に対する欠損部内部の骨体積を骨再生率とした。結果を表1に示す。
7.5質量%の実施例1に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約4ml流し込んだ後、−40℃の冷凍庫(日立、超低温フリーザーRS−U30T)に1時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥(タカラ、TF5−85ATNNN)し、粉砕機(クワドロ、コーミルU5)によって粉砕し、目開き1400μmのふるい下、且つ、目開き300μmのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下130℃(ヤマト科学、DP−43)で6時間処理し、試料2とした。
試料2における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例1と同様にして評価した。結果を表1に示す。
8質量%の実施例1に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約4ml流し込んだ後、−50℃の冷凍庫(日立、超低温フリーザーRS−U30T)に1時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥(タカラ、TF5−85ATNNN)し、粉砕機(クワドロ、コーミルU5)によって粉砕し、目開き710μmのふるい下、且つ、目開き500μmのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下130℃(ヤマト科学、DP−43)で7時間処理し、試料3とした。
試料3における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例1と同様にして評価した。結果を表1に示す。
7.5質量%のブタゼラチン(ニッピ、ニッピハイグレードゼラチン(r)APAT)を含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約4ml流し込んだ後、−40℃の冷凍庫(日立、超低温フリーザーRS−U30T)に1時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥(タカラ、TF5−85ATNNN)し、粉砕機(クワドロ、コーミルU5)によって粉砕し、目開き710μmのふるい下、且つ、目開き500μmのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下130℃(ヤマト科学、DP−43)で72時間処理し、試料4とした。
試料4における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例1と同様にして評価した。結果を表1に示す。
7.5質量%の実施例1に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約4ml流し込んだ後、−40℃の冷凍庫(日立、超低温フリーザーRS−U30T)に1時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥(タカラ、TF5−85ATNNN)したのち、4hPa以下142℃(ヤマト科学、DP−43)で5時間処理し、試料5とした。
試料5は各試験用に形をそれぞれ成形(下記参照)し、得られた試験用試料を用いて、吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例1と同様にして評価した。結果を表1に示す。
吸水率:約1.5mm×約2mm×約12mmの直方体
分解性:(直径)約6mm×(厚み)約1mmの円柱
骨再生率:(直径)約5mm×(厚み)約1mmの円柱
7.5質量%のブタゼラチン(ニッピ、ニッピハイグレードゼラチン(r)APAT)を含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約4ml流し込んだ後、−40℃の冷凍庫(日立、超低温フリーザーRS−U30T)に1時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥(タカラ、TF5−85ATNNN)したのち、4hPa以下142℃(ヤマト科学、DP−43)で33時間処理し、試料6とした。
試料6は各試験用に形をそれぞれ成形(下記参照)し、得られた試験用試料を用いて、吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例1と同様にして評価した。結果を表1に示す。
吸水率:約1.5mm×約2mm×約12mmの直方体
分解性:(直径)約6mm×(厚み)約1mmの円柱
骨再生率:(直径)約5mm×(厚み)約1mmの円柱
8質量%の実施例1に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約4ml流し込んだ後、−50℃の冷凍庫(日立、超低温フリーザーRS−U30T)に1時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥(タカラ、TF5−85ATNNN)し、粉砕機(クワドロ、コーミルU5)によって粉砕し、目開き710μmのふるい下、且つ、目開き500μmのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下130℃(ヤマト科学、DP−43)で18時間処理し、試料7とした。
試料7における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例1と同様にして評価した。結果を表1に示す。
8質量%の実施例1に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約4ml流し込んだ後、−50℃の冷凍庫(日立、超低温フリーザーRS−U30T)に1時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥(タカラ、TF5−85ATNNN)し、粉砕機(クワドロ、コーミルU5)によって粉砕し、目開き710μmのふるい下、且つ、目開き500μmのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下130℃(ヤマト科学、DP−43)で15時間処理し、試料8とした。
試料8における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例1と同様にして評価した。結果を表1に示す。
12質量%のブタゼラチン(ニッピ、ニッピハイグレードゼラチン(r)APAT)を含むゼラチン水溶液を9℃で冷却したポット内でT.K.ホモディスパー2.5型を用い1400rpmにて攪拌した後、−50℃の冷凍庫内で8時間静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。なお、本条件での攪拌は、攪拌フルード数Frが2.22、及び攪拌レイノズル数が3,700の攪拌条件に相当する。このゼラチンブロックを凍結乾燥して、粉砕機(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)によって粉砕し、目開き710μmのふるい下、且つ、目開き500μmのふるい上の画分を回収したのち、4hPa以下160℃(ヤマト科学、DP−43)で19時間処理し、試料9とした。
試料9における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例1と同様にして評価した。結果を表1に示す。
7.5質量%の実施例1に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約20ml流し込み、−2℃で静置した後、−30℃まで冷やし、氷核ができたことを確認した後、−4.5℃まで戻した。その後、0.3℃/分の速度で冷却することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥し、粉砕機(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)によって粉砕し、目開き710μmのふるい下、且つ、目開き500μmのふるい上の画分を回収したのち、4hPa以下142℃(ヤマト科学、DP−43)で3.5時間処理し、試料10とした。
試料10における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例1と同様にして評価した。結果を表1に示す。
7.5質量%の実施例1に記載の組換えゼラチンを含むゼラチン水溶液を、円筒型容器に約20ml流し込み、−2℃で静置した後、−30℃まで冷やし、氷核が出来たことを確認した後、−6℃まで戻した。その後、0.5℃/分の速度で冷却することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥し、粉砕機(クワドロ、コーミルU5)によって粉砕し、目開き710μmのふるい下、且つ、目開き500μmのふるい上の画分を回収したのち、窒素雰囲気下130℃(ヤマト科学、DP−43)で18時間処理し、試料11とした。
試料11における吸水率、酸残存率、及び骨再生率を、実施例1と同様にして評価した。結果を表1に示す。
これは、例えば架橋時間を調整して、欠損部のスペースを維持するための強度を持たせた場合、ブロック状の基材を用いると、細胞は基材を分解しながら増殖しなければならず、欠損部内部に細胞が到達しにくいが、顆粒状の基材を用いると、細胞が粒子間を通って欠損部内部まで容易に到達することができるようになるため、スムーズな骨再生が行われることに起因すると考えられた。このことから、骨再生基材の良好な骨再生率、欠損部容積維持の調整には、顆粒状の基材が寄与していることがわかる。
(試料の調製)
実施例1に記載の組換えゼラチンを用い、3%組換えゼラチン水溶液を作製し、その水溶液を円筒型容器に流し込んだ。その後−80℃の冷凍庫内で、1時間静置した。その後凍結乾燥し、4hPa以下160℃で3時間熱架橋することにより、吸水率2600%、酸残存率50%のゼラチンブロックを得た。
Wistarラット(雄、10週齢以降)を用い、塩酸ケタミンと塩酸キシラジンをそれぞれ90mg/kgと10mg/kgを腹腔内に投与することより麻酔した。ラットの背部を脱毛後に直径19mmの円形の真皮欠損を作製した。直径19mm、厚み約1.5mmの上記ゼラチンブロックを真皮欠損部へ貼付後、ワセリン付ガーゼ(アダプティック(登録商標)、ジョンソン・エンド・ジョンソン)、ウェットコットン、ガーゼをのせ、固定した。固定後、2週目に麻酔下で、創傷被覆材を含む背部組織を摘出した。
その摘出組織をHE染色して組織学的観察を行った結果、真皮様組織(肉芽様組織)の形成が認められた。
このことから、本試料は、特に真皮の再生に好適であることがわかった。
従って、本発明によれば、良好な組織再生能を有する組織修復材を提供することができる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (8)
- ゼラチン顆粒を含み、
質量基準で800%以上の吸水率と、
1モル/Lの塩酸を用いた3時間の分解処理による質量基準で60%以下の残存率と、
を示す組織修復材。 - 前記ゼラチン顆粒が1400μmの目開きのふるいを通過する顆粒状のゼラチンである請求項1に記載の組織修復材。
- 前記ゼラチン顆粒が、ゼラチンの架橋物を含む請求項1又は請求項2に記載の組織修復材。
- 前記ゼラチン顆粒が、ゼラチンの熱架橋物を含む請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の組織修復材。
- 前記組織修復材が顆粒状である請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の組織修復材。
- 骨再生用基材である請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の組織修復材。
- ゼラチンを含み、
質量基準で800%以上の吸水率と、
1モル/Lの塩酸を用いた3時間の分解処理による質量基準で60%以下の残存率と、
を示すブロック状組織修復材。 - 真皮再生用である請求項7に記載のブロック状組織修復材。
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