TWI687222B - 多孔質複合體、及含有磷酸八鈣及副甲狀腺素的多孔質複合體的製造方法 - Google Patents

多孔質複合體、及含有磷酸八鈣及副甲狀腺素的多孔質複合體的製造方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種對於骨再生或骨增量有效之手段。
一種多孔質複合體，其含有磷酸八鈣及副甲狀腺素。

Description

多孔質複合體、及含有磷酸八鈣及副甲狀腺素的多孔質複合體的製造方法
本發明揭示一種含有磷酸鈣的多孔質複合體及副甲狀腺素(parathyroid hormone；PTH)的組合、及其利用等。
業界目前使用羥基磷灰石、β-磷酸三鈣(β-TCP；β-tricalcium phosphate)、及磷酸八鈣(Octacalcium phosphate；以下稱為「OCP」)等磷酸鈣作為骨再生材料(例如專利文獻1至專利文獻5)。另外，為了對OCP賦予保形性，而提出有使利用膠原蛋白所形成的多孔質體含有OCP(專利文獻5)。另外，非專利文獻1中報告有：含有OCP的膠原蛋白多孔質體的骨再生作用優於單獨使用OCP。
非專利文獻2中報告有：藉由皮下投予副甲狀腺素，會顯著地促進局部之骨形成。非專利文獻2中報告有：利用β-TCP所為的骨形成受到限定，藉由與β-TCP加以組合，利用PTH所為的骨形成作用亦受到抑制。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：日本專利特開2010-273847號公報。
專利文獻2：日本專利特開2003-260124號公報。
專利文獻3：日本專利特開2009-132601號公報。
專利文獻4：日本專利特開2005-279078號公報。
專利文獻5：日本專利特開2006-167445號公報。
專利文獻6：日本專利特開平5-070113號公報。
[非專利文獻]
非專利文獻1： J Biomed Mater Res B Appl Biomater 79: 210-217. 2006。
非專利文獻2： J. Clin. Periodontol, 37: 419-426, 2010。
本發明的課題之一在於提供一種對於骨再生或骨增量(bone augmentation)有效之新穎手段。
確認到藉由將含有磷酸鈣的多孔質複合體與PTH併用，能夠實現更有效之骨再生或骨增量。基於如此知識見解，而提供下述所代表的發明。
A：骨再生或骨增量的方法。
A1.
一種用以進行骨再生或骨增量的方法，包括：對需要骨再生或骨增量的部位移植含有磷酸鈣的多孔質複合體；及對需要骨再生或骨增量的患者投予副甲狀腺素。
A2.
如A1所記載之方法，係移植該多孔質複合體，繼而投予副甲狀腺素。
A3.
如A1或A2所記載之方法，係對需要骨再生或骨增量的部位局部投予副甲狀腺素。
A4.
如A1至A3中任一項所記載之方法，係對移植有該多孔質複合體的部位局部投予副甲狀腺素。
A5.
如A1或A2所記載之方法，係皮下投予副甲狀腺素。
A6.
如A1及A3至A5中任一項所記載之方法，係對患者投予副甲狀腺素，繼而移植該多孔質複合體。
A7.
如A6所記載之方法，係對需要骨再生或骨增量的部位局部投予副甲狀腺素。
A8.
如A6所記載之方法，係皮下投予副甲狀腺素。
A9.
如A1至A8中任一項所記載之方法，其中需要骨再生或骨增量的部位為需要骨再生的部位。
A10.
如A9所記載之方法，其中需要骨再生的部位為骨缺損部位。
A11.
如A1至A8中任一項所記載之方法，其中需要骨再生或骨增量的部位為需要骨增量的部位。
A12.
如A11所記載之方法，其中需要骨增量的部位為需要選自由上顎竇骨增高術(sinus lift)、骨移植(bone graft)、及齒槽骨擴張術(ridge expansion)所組成的群組中的至少1種的部位。
A13.
如A1至A12中任一項所記載之方法，其中該多孔質複合體進而含有膠原蛋白。
A14.
如A1至A13中任一項所記載之方法，其中該磷酸鈣為選自由磷酸八鈣(OCP)、β型磷酸三鈣(β-TCP)、羥基磷灰石(HAP；hydroxylapatite)、及非晶質磷酸鈣(amorphous calcium phosphate)所組成的群組中的至少1種。
A15.
如A1至A14中任一項所記載之方法，其中該副甲狀腺素為特立帕肽(Teriparatide)。
B：骨再生或骨增量的方法。
B1.
一種用以進行骨再生或骨增量的方法，包括對需要骨再生或骨增量的部位移植含有磷酸鈣及副甲狀腺素的多孔質複合體。
B2.
如B1所記載之方法，其中需要骨再生或骨增量的部位為需要骨再生的部位。
B3.
如B2所記載之方法，其中需要骨再生的部位為骨缺損部位。
B4.
如B1所記載之方法，其中需要骨再生或骨增量的部位為需要骨增量的部位。
B5.
如B4所記載之方法，其中需要骨增量的部位為需要選自由上顎竇骨增高術、骨移植、及齒槽骨擴張術所組成的群組中的至少1種的部位。
B6.
如B1至B5中任一項所記載之方法，其中該多孔質複合體進而含有膠原蛋白。
B7.
如B1至B6中任一項所記載之方法，其中該磷酸鈣為選自由磷酸八鈣、β型磷酸三鈣、羥基磷灰石、及非晶質磷酸鈣所組成的群組中的至少1種。
B8.
如B1至B7中任一項所記載之方法，其中該副甲狀腺素為特立帕肽。
C：含有副甲狀腺素的複合體。
C1.
一種用於骨再生或骨增量的多孔質複合體，其含有磷酸鈣及副甲狀腺素。
C2.
如C1所記載之多孔質複合體，其中進而含有膠原蛋白。
C3.
如C1或C2所記載之多孔質複合體，其中該磷酸鈣為選自由磷酸八鈣、β型磷酸三鈣、羥基磷灰石、及非晶質磷酸鈣所組成的群組中的至少1種。
C4.
如C1至C3中任一項所記載之多孔質複合體，其中該副甲狀腺素為特立帕肽。
D：多孔質複合體的製造方法。
D1.
一種製造用於骨再生或骨增量的多孔質複合體的方法，包括對含有磷酸鈣的多孔質複合體添加副甲狀腺素。
D2.
如D1所記載之方法，其中該磷酸鈣為選自由磷酸八鈣、β型磷酸三鈣、羥基磷灰石、及非晶質磷酸鈣所組成的群組中的至少1種。
D3.
如D2所記載之方法，其中該多孔質複合體進而含有膠原蛋白。
D4.
如D1至D3中任一項所記載之方法，其中副甲狀腺 素為特立帕肽。
E.套組。
E1.
一種用於骨再生或骨增量的套組，其含有包含磷酸鈣的多孔質複合體、及副甲狀腺素。
E2.
如E1所記載之套組，其中該磷酸鈣為選自由磷酸八鈣、β型磷酸三鈣、羥基磷灰石、及非晶質磷酸鈣所組成的群組中的至少1種。
E3.
如E1或E2所記載之套組，其中該多孔質複合體進而含有膠原蛋白。
E4.
如E1至E3中任一項所記載之套組，其中副甲狀腺素為特立帕肽。
F：多孔質複合體。
F1.
一種多孔質複合體，其含有磷酸八鈣及副甲狀腺素。
F2.
如F1所記載之多孔質複合體，其中水分含量為5重量%以下。
F3.
如F1或F2所記載之多孔質複合體，係骨再生用或骨增量用。
F4.
如F1至F3中任一項所記載之多孔質複合體，其中進而含有膠原蛋白。
F5.
如F1至F4中任一項所記載之多孔質複合體，其中 副甲狀腺素為特立帕肽。
G：多孔質複合體的製造方法。
G1.
一種多孔質複合體的製造方法，該多孔質複合體係含有磷酸八鈣及副甲狀腺素的第二多孔質複合體，該製造方法包括對含有磷酸八鈣的第一多孔質複合體添加副甲狀腺素。
G2.
如G1所記載之製造方法，其中進而包括將第二多孔質複合體加以冷凍乾燥。
G3.
如G1或G2所記載之製造方法，其中第一多孔質複合體進而含有膠原蛋白。
G4.
如G1至G3中任一項所記載之製造方法，其中副甲狀腺素為特立帕肽。
本發明提供有效之骨再生及/或骨增量手段。
圖1係自上方拍攝皮下投予的PTH對於骨缺損部位的處置所產生的影響的結果的X射線照片，該處置係利用含OCP的多孔質複合體或含β-TCP的多孔質複合體而進行。
圖2係表示調查皮下投予的PTH對於骨缺損部位的處置所產生的影響的結果(剖面)的X射線照片，該處置係利用含OCP的多孔質複合體或含β-TCP的多孔質複合體而進行。
圖3係表示利用經染色的病理組織標本調查皮下投 予的PTH對於骨缺損部位的處置所產生的影響的結果，該處置係利用含OCP的多孔質複合體或含β-TCP的多孔質複合體而進行。上方為皮膚側，下方為硬腦膜側。(▼)表示缺損邊緣。圖3係低倍率(×1.25)圖像。
圖4係表示利用經染色的病理組織標本調查皮下投予的PTH對於骨缺損部位的處置所產生的影響的結果，該處置係利用含OCP的多孔質複合體或含β-TCP的多孔質複合體而進行。上方為皮膚側，下方為硬腦膜側。圖4係高倍率(×20)圖像。
圖5係表示根據新生骨比率(n-Bone%)調查皮下投予的PTH對於骨缺損部位的處置所產生的影響的結果，該處置係利用含OCP的多孔質複合體或含β-TCP的多孔質複合體而進行。
圖6係自上方拍攝調查PTH的影響的結果的X射線照片，該PTH係滴加至利用含OCP的多孔質複合體或含β-TCP的多孔質複合體進行處置的骨缺損部位。
圖7係表示調查PTH的影響的結果(剖面)的X射線照片，該PTH係滴加至利用含OCP的多孔質複合體或含β-TCP的多孔質複合體進行處置的骨缺損部位。
圖8表示利用經染色的病理組織標本來調查PTH的影響的結果，該PTH係滴加至利用含OCP的多孔質複合體進行處置的骨缺損部位。上方為皮膚側，下方為硬腦膜側。上段為低倍率(×1.25)圖像，下段為高倍率(×20)圖像。
圖9表示對PTH的影響進行組織形態計測的結果，該PTH係滴加至利用含OCP的多孔質複合體進行處置的骨缺損部位。
圖10表示單獨利用OCP或利用OCP與FGF-2的組合對骨缺損部位進行處置的結果。
圖11係術後12週後所拍攝的摘取標本的弱穿X射線(soft X-ray)照片。A群：OCP/Col/PTH1.0(每1個OCP/Col含有1.0μg的PTH的冷凍乾燥複合體)、B群： OCP/Col/PTH0.1(每1個OCP/Col含有0.1μg的PTH的冷凍乾燥複合體)、C群：OCP/Col、D群：β-TCP/Col/PTH1.0(每1個β-TCP/Col含有1.0μg的PTH的冷凍乾燥複合體)、E群：β-TCP/Col/PTH0.1(每1個β-TCP/Col含有0.1μg的PTH的冷凍乾燥複合體)、F群：β-TCP/Col。
圖12係術後4週後及12週後進行斷層拍攝(Computed Tomography；CT)而獲得的CT照片。A群：OCP/Col/PTH1.0、B群：OCP/Col/PTH0.1、C群：OCP/Col、D群：β-TCP/Col/PTH1.0、E群：β-TCP/Col/PTH0.1、F群：β-TCP/Col。
圖13係術後12週後進行摘取、染色的病理組織標本。A群：OCP/Col/PTH1.0、B群：OCP/Col/PTH0.1、C群：OCP/Col、D群：β-TCP/Col/PTH1.0、E群：β-TCP/Col/PTH0.1、F群：β-TCP/Col。
圖14係術後4週後及12週後進行斷層拍攝而獲得的CT照片。A群：OCP/Col/PTH0.01(每1個OCP/Col含有0.01μg的PTH的冷凍乾燥複合體)、B群：OCP/Col/PTH0.001(每1個OCP/Col含有0.001μg的PTH的冷凍乾燥複合體)。
於一實施形態中，骨再生或骨增量(bone augmentation)的方法較佳為包括如下步驟：步驟(I)，對需要骨再生或骨增量的部位移植含有磷酸鈣的多孔質複合體；及步驟(II)，對需要骨再生或骨增量的被檢體投予副甲狀腺素(PTH)。步驟(I)及步驟(II)可先進行其中任一步驟，亦可同時進行。於一實施形態中，骨再生或骨增量的方法較佳為於步驟(I)之後進行步驟(II)。例如，可於對需要骨再生或骨增量的部位埋入多孔質複合體後，投予PTH。於另一實施形態中，骨再生或骨增量的方法較佳為 於步驟(II)之後進行步驟(I)。例如，可對需要骨再生或骨增量的部位投予(例如滴加)PTH，然後將多孔質複合體埋入該部位。於另一適宜實施形態中，PTH係預先含有於多孔質複合體。
一般而言，PTH被稱為甲狀旁腺激素、副甲狀腺素、或上皮小體激素，係由副甲狀腺(上皮小體)分泌的由84個胺基酸構成的源自人類(Homo sapiens)的多肽激素。於本說明書中，所謂PTH，不僅指此種野生型的PTH，亦包括保持有與野生型的PTH相同的生理作用的衍生物及其藥學上所許容的鹽。作為此種衍生物，例如可列舉相當於野生型PTH的N末端的34個胺基酸區域的特立帕肽(teriparatide)。特立帕肽係以骨穩(Forteo)及Teribone的藥品名作為骨質疏鬆症的治療藥而銷售，具有序列編號1的胺基酸序列。於一實施形態中，PTH較佳為特立帕肽。此處，特立帕肽亦包括其藥學上所許容的鹽。
多孔質複合體較佳為含有磷酸鈣。磷酸鈣較佳為具有骨再生或骨增量作用。作為磷酸鈣，例如可列舉：磷酸八鈣(OCP)、β型磷酸三鈣(β-TCP)、羥基磷灰石(HAP)、非晶質磷酸鈣(amorphous calcium phosphate)無水磷酸氫鈣(DCPA；dicalcium phosphate anhydrous)、及磷酸氫鈣二水合物(DCPD；dicalcium phosphate dihydrate)等。於一實施形態中，磷酸鈣較佳為選自由OCP、β-TCP、及HAP所組成的群組中的一種以上，更佳為OCP。該等磷酸鈣可藉由任意方法而製備，亦可購買市售品並使用。
OCP可藉由各種公知方法而製備。例如，可藉由滴加法(LeGeros RZ,Calcif Tissue Int 37：194-197,1985)、或使用專利文獻6中所揭示的合成裝置(三歧管)的方法等而製備。另外，亦可藉由如下混合法而製備，該混合法係 藉由將磷酸二氫鈉水溶液與乙酸鈣水溶液於適當條件下加以混合，並回收所生成的沈澱物而進行。對於自沈澱物獲得的OCP，較佳為加以乾燥，使用電動粉碎機等加以粉碎，製成粒子狀的粉體而使用。粒徑較佳為製備為10μm至1000μm的範圍，更佳為100μm至500μm，進而較佳為300μm至500μm。粒徑可藉由篩分法並根據篩子的網眼尺寸進行分級。
β-TCP可藉由各種公知方法而製備。例如可例示下述的方法。首先，將氫氧化鈣粉體與磷酸氫鈣粉體以鈣相對於磷的莫耳比(Ca/P)成為1.45至1.72的方式加以調配，而製備原料體。對所獲得的原料體進行混合粉碎處理，藉由軟機械化學複合化反應(soft mechanochemical complexation reaction)而製備磷酸鈣前驅物，並將所獲得的前驅物於600℃以上的溫度下進行熱處理，藉此可獲得β-TCP。作為其他方法，利用球磨機將含有磷酸氫鈣與碳酸鈣的混合漿料加以粉碎、反應24小時後，將漿料加以乾燥，其後於750℃下煆燒1小時，藉此可獲得β-TCP粉末。
HAP可藉由各種公知方法而製備。例如可藉由水熱合成法、乾式合成法、或濕式合成法而製備。水熱合成法如下所述。利用磷酸[H3PO4]將無水磷酸氫鈣[CaHPO4]的水懸浮液調整為pH值4。繼而，使該水懸浮液於水熱反應合成裝置中於350℃、8800Ib/in2氣壓的條件下反應48小時，藉此可獲得HAP。乾式合成法如下所述。可藉由使作為難溶性磷酸鈣的焦磷酸鈣(Ca2P2O7)、或者磷酸三鈣[Ca3(PO4)2]與碳酸鈣(CaCO3)於水蒸汽環境中於900℃至1300℃下反應1小時至24小時，而獲得HAP。濕式合成法如下所述。可藉由一邊將可溶性磷酸鹽或者磷酸的水溶液與可溶性鈣鹽的水溶液於70℃至100℃下保持鹼 性，一邊反應24小時至48小時，而獲得HAP。作為濕式合成法的另一方法，可藉由使不溶於水的磷酸鈣鹽懸浮於水中，向懸浮液添加不溶於水的碳酸鈣(CaCO3)，將懸浮液於攪拌下加熱而使之反應，從而獲得HAP。作為濕式合成法的又一方法，可藉由將碳酸鈣粉末與磷酸氫鈣或其二水合物的粉末以鈣原子相對於磷酸的原子比成為1.5至1.67的範圍的方式加以調整，並一邊利用濕式粉碎機進行粉碎混合，一邊獲得HAP。
多孔質複合體的材料只要適合於骨再生或骨增量，則為任意，並無特別限制。例如，多孔質複合體亦可為形成為多孔質狀的磷酸鈣。於一實施形態中，於多孔質複合體由磷酸鈣所形成的情況下，磷酸鈣較佳為β-TCP或HAP。於一實施形態中，多孔質複合體較佳為由膠原蛋白與磷酸鈣所形成。
構成多孔質複合體的膠原蛋白只要適合作為骨再生或骨增量用的材料，則來源及性狀等並無特別限定，可使用任意的膠原蛋白。於一實施形態中，膠原蛋白較佳為利用蛋白分解酶(例如胃蛋白酶、或鏈蛋白酶等)進行可溶化而除去了端肽的酶可溶化膠原蛋白。此種膠原蛋白的過敏原性低。另外，膠原蛋白較佳為作為纖維性膠原蛋白的I型、II型、III型或IV型的膠原蛋白。於一實施形態中，膠原蛋白較佳為於生物體內大量含有的I型膠原蛋白、或I型及III型膠原蛋白的混合物。膠原蛋白的原料例如可使用豬或牛等的皮膚、骨、或者肌腱等、以及魚鱗等。膠原蛋白由於係源自生物體的成分，故而安全性高。作為前述的膠原蛋白，亦可使用市售的製品。
於多孔質複合體由膠原蛋白所形成的情況下，磷酸鈣與膠原蛋白的調配比可考慮所需的保形性、操作性、及生 物體親和性等而適當調整。例如，相對於膠原蛋白1重量份的磷酸鈣的調配比為0.5重量份至35重量份，較佳為1重量份至20重量份，更佳為2重量份至10重量份。若相對於膠原蛋白1重量份，磷酸鈣小於0.5重量份，則有所獲得的複合體的骨再生功能差之虞，若超過35重量份，則有保形性降低之虞。此處，磷酸鈣較佳為OCP。
於一實施形態中，多孔質複合體較佳為具有3μm至90μm的細孔徑。於細孔徑超過90μm的情況下，有多孔質複合體的強度降低的傾向。另一方面，於細孔徑小於3μm的情況下，有變得難以引起骨芽細胞等骨代謝系細胞的侵入，導致骨再生的促進作用降低之虞。多孔質複合體的細孔徑更佳為5μm至40μm，進而較佳為7μm至36μm。
多孔質複合體的細孔徑係使用利用水銀測孔儀(Mercury porosimeter)的細孔分佈測定而進行測定。具體而言，藉由以下的方法進行測定。(細孔徑測定)作為前處理，將樣品(多孔質複合體)於120℃下恆溫乾燥4小時。針對前處理後的各樣品，藉由使用下述測定裝置的水銀壓入法，於下述條件下求出細孔徑(pore size)為0.0018μm至200μm的細孔分佈。
測定裝置：AutoPore IV9520(micromeritics公司製造)。
測定條件：樣品與水銀的接觸角：140度。
水銀的表面張力：0.48N/m(以1dyne=10-5N進行換算)。
於藉由前述水銀壓入法所獲得的細孔分佈曲線中，具有最大面積的波峰的顯示極大值的細孔徑(直徑)的值為本說明書中之細孔徑(pore size)的值。
於一實施形態中，多孔質複合體於藉由前述水銀壓入法所測得的細孔分佈中，大小為71μm至200μm的細孔於大小為200μm以下的全部細孔中所佔的比率較佳為8%以下，更佳為3%至8%。細孔比率係使用利用水銀測孔儀所測得的累積細孔容積及總細孔容積，根據下式表示。
細孔比率(%)=累積細孔容積/總細孔容積×100
多孔質複合體的細孔率(空隙率)較佳為80%至98%，更佳為85%至95%，進而較佳為85%至90%。細孔率係使用藉由水銀壓入法所測得的總細孔容積與視密度並根據下述的式而求出。
細孔率(%)=總細孔容積/{(1/視密度)+總細孔容積}×100
多孔質複合體的形狀可考慮欲填充該多孔質複合體的患部的形狀及大小等而任意地設定。例如，多孔質複合體較佳為長方體(方塊體)、立方體、圓柱體、小片狀、或顆粒。於一實施形態中，長方體的多孔質複合體的大小較佳為5mm×5mm×5mm以上，一般而言，上限較佳為100mm×100mm×100mm。於為圓柱狀的情況下的大小較佳為直徑為5mm至50mm，較佳為高度為1mm至50mm的範圍。於為顆粒狀的情況下，形狀不限於球體，亦可為不定形，直徑較佳為0.1mm至10mm。顆粒狀的多孔質複合體的直徑係藉由篩分試驗法而求出。
移植多孔質複合體的方法(manner)為任意，並無特別限制。例如，多孔質複合體的移植可藉由對需要骨再生或骨增量的部位填補適當尺寸的多孔質複合體而進行。於需要骨再生或骨增量的部位(例如骨缺損部)存在充分的血液或者體液的情況下，可直接填補多孔質複合體，或者將多孔質複合體切斷為適當形狀再填補。於該部位未見充分 的血液等、或無法將多孔質複合體以原形狀加以填補的情況下，可將多孔質複合體浸漬於血液或者生理食鹽水等中，待確認到多孔質複合體顯示出海綿狀的彈力性後填補至骨缺損部。
投予PTH的方法(manner)為任意，並無特別限制。例如，PTH係藉由任意方法進行局部投予或全身投予。於一實施形態中，PTH較佳為局部投予至需要骨再生或骨增量的部位(例如骨缺損部)。局部投予例如可藉由對該部位滴加含有PTH的溶液而進行。於移植多孔質複合體後局部投予PTH的情況下，例如可對需要骨再生或骨增量的部位埋入多孔質複合體，再於該多孔質複合體上(或其中)投予PTH。關於對該部位局部投予PTH，例如可藉由在骨再生或骨增量手術中以外科方式使該部位露出，並向該部位滴加含有PTH的溶液而進行。另外，關於對該部位局部投予PTH，亦可將注射針插入至該部位，再注入含有PTH的溶液而進行。於一實施形態中，PTH係藉由注射而進行全身投予。例如，PTH係藉由皮下注射、肌肉注射或靜脈注射而進行投予。於一實施形態中，PTH較佳為藉由皮下注射而進行全身投予。
所投予的PTH的量為任意，並無特別限制。例如，PTH的量可根據骨缺損的程度、被檢體的體重、及年齡等而適當設定。於對需要骨再生或骨增量的部位滴加含有PTH的液體的情況下，該液體中的PTH的濃度例如可調整為0.01μg/ml至500μg/ml。另外，滴加至該部位的含PTH的溶液的量例如可自0.01ml至500ml的範圍內選擇。含PTH的溶液例如可藉由將市售的PTH(例如特立帕肽)添加至生理食鹽水中而製備。於藉由注射而全身投予PTH的情況下，該PTH的投予量例如可設定為0.01μg/kg/天至50μg/kg/天。PTH的投予可為單次投予亦可為多次投 予。於一實施形態中，於全身投予PTH的情況下，較佳為於一定期間多次投予PTH。例如，投予頻率例如可設為1次/天、1次/週、2次至6次/週、或1次至3次/月。投予期間例如可設為1週、1個月、2個月至11個月、1年、1年半、或2年至5年。
需要骨再生的部位例如包括骨缺損部位。骨缺損可因各種要因而產生。作為要因，例如對於骨缺損，可列舉：與骨折、外傷後的骨缺損(post traumatic bone loss)、骨的外科手術、先天性骨缺損、感染後的骨缺損(post infectious bone loss)、骨的化學療法處置(bone chemotherapy treatment)、同種異體移植片的融合(allograft incorporation)、骨的放射線療法處置(bone radiotherapy treatment)相關的骨缺損疾病(bone deficit condition)、及牙周病等。作為骨的外科手術，例如可列舉：脊椎固定術、包括四肢關節固定術等的關節固定、及外傷後的骨手術(post-traumatic bone surgery)、修復後的關節手術(post-prosthetic joint surgery)、整形後的骨手術(post-plastic bone surgery)、及牙科手術(dental surgery)等。作為一實施形態中的骨缺損部位，例如可列舉：胞囊腔、萎縮齒槽骨、裂頜部、及齒槽窩等。
需要骨增量的部位並無特別限定，例如為需要選自由上顎竇骨增高術(sinus lift)、骨移植(bone graft)、及齒槽骨擴張術(ridge expansion)所組成的群組中的一種以上處置的部位。於一實施形態中，需要骨增量的部位可為顯示出骨質疏鬆症、變形性脊椎病、慢性類風濕性關節炎、惡性腫瘤、外傷等所伴隨的骨鹽量減少症狀的部位。於另一實施形態中，需要骨增量的部位可列舉伴有發音困難咀嚼困難及/或審美障害的口腔外科症狀。
被檢體並無特別限制，例如可列舉：人、狗、貓、猴、及大鼠等動物。於一實施形態中，較佳的被檢體為人。
於一實施形態中，前述多孔質複合體較佳為含有磷酸鈣及PTH。換言之，於一實施形態中，PTH較佳為於被引入至多孔質複合體中的狀態下進行投予。含有PTH的多孔質複合體可藉由任意方法而製作。例如，可藉由準備不含PTH的多孔質複合體，並對該多孔質複合體滴加含PTH的溶液，或者將不含PTH的多孔質複合體浸漬於含PTH的溶液中，而獲得含PTH的多孔質複合體。此種含PTH的多孔質複合體可於即將移植多孔質複合體之前準備，亦可預先製作並保存至使用為止。於一實施形態中，含有磷酸鈣及PTH的多孔質複合體的磷酸鈣較佳為OCP。
於一實施形態中，含有磷酸鈣及PTH的多孔質複合體較佳為水分含量為5重量%以下、4重量%以下、3.5重量%以下、或3重量%以下。此處，所謂水分含量為5重量%以下，意指將1g的含有PTH的多孔質複合體於2.0kPa以下的減壓下於105℃下乾燥3小時之時的減量為50mg以下(亦即，藉由乾燥原料試驗法所測得的值)。如此水分含量低的含PTH的多孔質複合體就操作性及保存穩定性的觀點而言較佳。
水分含量為5重量%以下的含有磷酸鈣及PTH的多孔質複合體可藉由任意方法而獲得。例如，可藉由使含有磷酸鈣的多孔質複合體含浸含PTH的溶液，並加以乾燥，而獲得水分含量低的多孔質複合體。乾燥法可使用各種公知方法，例如使用恆溫乾燥、紅外線乾燥、吹風乾燥、熱風乾燥、減壓乾燥、真空乾燥、抽氣乾燥、旋轉乾燥、及/或冷凍乾燥。於一實施形態中，乾燥法較佳為冷凍乾燥。冷凍乾燥的條件並無特別限制，可根據樣品的大小及 形狀等而適當設定。例如，可於-20℃至-90℃下將多孔質複合體冷凍，其後利用冷凍乾燥機於25℃至-40℃下乾燥12小時至72小時。冷凍乾燥時的溫度除了保持恆溫以外，亦可階段性地升降。另外，較佳為於冷凍乾燥後照射電子束，而將多孔質複合體進行滅菌。
多孔質複合體所含的PTH的量為任意，並無特別限制。例如，多孔質複合體可含有0.1ng/g至25mg/g的PTH，較佳為1ng/g至1mg/g，更佳為5ng/g至100μg/g。
於一實施形態中，提供一種含有前述多孔質複合體及PTH的用於骨再生或骨增量的套組。套組可含有前述的任意多孔質複合體。另外，套組除了多孔質複合體及PTH以外，亦可含有任意的成分、試劑、及說明書等。
多孔質複合體可藉由任意方法而製造。例如，多孔質複合體可藉由下述的(a)至(c)的方法而製造。下述方法中使用OCP作為磷酸鈣而加以說明，但使用其他磷酸鈣的情況下亦可同樣地獲得多孔質複合體。於使用β-TCP作為磷酸鈣的情況下，較佳為(a)或(b)的方法。
(a)將OCP與膠原蛋白加以混合而進行複合化的方法
對濃度及pH值等被調整為能夠進行凝膠化的範圍的膠原蛋白溶液添加OCP，並充分地混練而製作OCP與膠原蛋白的混合物。繼而，將該混合物加入至適當的模具中進行成型，進行冷凍，並加以冷凍乾燥，藉此獲得複合體。所獲得的複合體較佳為實施熱脫水交聯處理，並藉由慣用的滅菌法(例如γ射線照射、電子束照射、環氧乙烷氣體等)加以滅菌。
(b)將OCP懸浮液加以混合而進行複合化的方法
利用適當的緩衝液(例如磷酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、乙酸鈉緩衝液等)，將適當濃度的膠原蛋白酸性溶液於無菌條件下調整至pH值5.5至pH值7.5。於膠原蛋白發生凝膠化之前，向該溶液中添加OCP，而製備膠原蛋白與OCP的懸浮液。其後，於將pH值自中性保持為弱鹼性的狀態下流入模具，而賦予形狀後，於適當的溫度(例如37℃)下使之凝膠化，反復進行水洗淨而除去緩衝液的鹽等，從而可獲得複合體。其後，較佳為與前述(a)同樣地實施冷凍乾燥及滅菌處理。
(c)使OCP析出至膠原蛋白中而進行複合化的方法
利用適當的緩衝液(例如磷酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、乙酸鈉緩衝液等)，將適當濃度的膠原蛋白酸性溶液於無菌條件下調整為pH值5.5至pH值7.5。於膠原蛋白發生凝膠化之前，向該溶液中添加鈣溶液及磷酸溶液，使OCP析出至膠原蛋白上。其後，將析出的OCP的pH值自中性保持為弱鹼性，並流入模具中，而賦予形狀。於適當溫度(例如37℃)下進行凝膠化之後，反復進行水洗淨而除去緩衝液等的鹽，從而可獲得複合體。其後，較佳為與前述(a)同樣地實施冷凍乾燥及滅菌處理。
並且，OCP的析出係基於取決於Ca2+及PO4 3-的濃度、以及pH值等的過飽和度(離子積/溶解度積)。因此，關於OCP可於成為過飽和的條件下將Ca2+溶液及PO4 3-溶液注入調節過pH值的膠原蛋白溶液中，而使OCP析出。OCP係自發地析出至膠原蛋白間隙，或以膠原蛋白纖維的表面作為核而析出。
於一實施形態中，獲得多孔質複合體的方法較佳為包括將含有OCP與膠原蛋白的凝膠、溶膠或液體浸漬於液體冷媒中加以冷凍之後，進行冷凍乾燥的步驟。所謂「將 凝膠、溶膠或液體浸漬於液體冷媒中加以冷凍」例如亦包括如下態樣：於將容納有凝膠、溶膠或液體的容器加以密閉後，將該容器浸漬於液體冷媒中，而使凝膠、溶膠或液體冷凍。
液體冷媒溫度低於含有OCP與膠原蛋白的凝膠、溶膠或液體的冷凍溫度的液體，例如可列舉：甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、及液態氮等。該液體冷媒的溫度較佳為-20℃以下，更佳為-40℃以下，進而較佳為-80℃以下。認為藉由將含有OCP與膠原蛋白的凝膠、溶膠或液體浸漬於液體冷媒中而急速地使之冷凍，可減小所獲得的多孔質複合體的細孔徑。
於一實施形態中，多孔質複合體較佳為實施有熱處理。藉由熱處理，OCP分子構造的一部分變形，變得容易侵入骨形成系細胞，而促進骨再生，並且使膠原蛋白交聯而提高形狀保持力。
熱處理的溫度較佳為50℃至200℃，更佳為60℃至180℃。另外，熱處理較佳為於減壓條件下進行。壓力較佳為0Pa至3000Pa，更佳為0Pa至300Pa。熱處理的處理時間較佳為0.1天至10天，更佳為0.5天至5天。
使用有HAP的多孔質複合體例如可藉由如下方法而獲得。首先，製備磷酸(鹽)水溶液及鈣鹽水溶液或懸浮液。膠原蛋白/磷酸鹽水溶液係使用膠原蛋白、與磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀這些磷酸鹽而製備。鈣鹽水溶液或懸浮液係使用碳酸鈣、乙酸鈣或氫氧化鈣等而製備。預先將與欲添加的鈣鹽水溶液或懸浮液的量大致等量的水加入至反應容器中，並加熱至40℃左右。於室溫下向該反應容器中同時滴加膠原蛋白/ 磷酸鹽水溶液與鈣鹽水溶液或懸浮液，藉此生成纖維狀HAP/膠原蛋白複合體。滴加完畢後，將成為漿料狀的水與HAP/膠原蛋白複合體的混合物加以冷凍乾燥。冷凍乾燥係藉由如下方式進行：在-10℃以下進行冷凍的狀態下抽真空，而急速地進行乾燥。其後，進行交聯處理，而可獲得含有HAP與膠原蛋白的多孔質複合體。
於一實施形態中，多孔質複合體可含有前述的各成分以外的任意成分。作為此種調配成分，例如可列舉：生物可吸收性高分子(聚羥乙酸、聚乳酸、聚乳酸-聚乙二醇共聚物等)。
前述的多孔質複合體可用作骨再生材料。骨再生材料對於牙科口腔外科領域、整形外科領域的骨缺損修復、以及開顱、及開胸術後的骨缺損修復等有用。例如，於牙科口腔外科領域，對於因牙周病、胞囊腔、萎縮齒槽骨、裂頜部、齒槽窩等而產生的骨缺損，藉由填補由多孔質複合體構成的骨再生材料，可於數週至數個月確認到優異的骨再生效果。於整形外科領域，例如對於骨腫瘤切除後的骨缺損、因骨折等外傷而產生的骨缺損，可對骨缺損部填補本骨再生材料，而促進骨再生。
[實施例]
以下，藉由實施例更詳細地說明本發明，但本發明不受該等實施例所限制。
製造例1：OCP的製備
藉由如下方式製備OCP製備用的一液及二液。將磷酸二氫鈉二水合物31.2g溶解至蒸餾水2500g中，而製備一液。將乙酸鈣一水合物35.2g溶解至蒸餾水2500g中，而製備二液。將一液加入至可分離式燒瓶中，利用加熱包 升溫至70℃。於攪拌機(東京理化器械公司製造、MAZELA Z)中安裝攪拌葉片(葉片直徑12cm)，一邊將一液以250rpm的速度加以攪拌，一邊以約28mL/min的速度滴加二液。滴加完畢後，將一液與二液的混合液於70℃、250rpm的條件下進一步攪拌2小時。
將前述的混合液中所生成的沈澱物使用薄膜過濾器(孔徑3μm、Advantec Toyo公司製造、A300A293C)加以過濾，並回收。將過濾物分散至蒸餾水1500mL中，攪拌15分鐘並洗淨。進一步重複進行3次該過濾及洗淨的步驟。將洗淨的沈澱物使用恆溫乾燥機於30℃下乾燥24小時。將乾燥後的沈澱物利用電動粉碎機加以粉碎後，使用篩子將粒徑分級為300μm至500μm，而獲得粉體。最後，於120℃下對所獲得的粉體進行2小時的乾熱滅菌，而獲得OCP。
製造例2：OCP/Col多孔質複合體的製備
將含有I型及III型膠原蛋白的源自豬真皮的膠原蛋白(Nippon Ham公司製造、NMP膠原蛋白PS)1重量份溶解於冷卻至4℃的蒸餾水200重量份中，而獲得約0.5重量%的膠原蛋白溶液。一邊將液溫保持於4℃，一邊向膠原蛋白水溶液中加入氫氧化鈉水溶液，將pH值調整為約7.4，而獲得膠原蛋白懸浮液。此時，膠原蛋白懸浮液的離子強度為約0.01。向膠原蛋白懸浮液中以OCP與膠原蛋白以重量比計成為77：23的方式加入製造例1中所獲得的OCP(粒徑300μm至500μm)，並於室溫下進行攪拌，而獲得OCP/膠原蛋白懸浮液。
將OCP/膠原蛋白懸浮液加入至離心瓶中，使用離心分離機(Tomy Seiko公司製造、GRX-250)以7000×g的離心力進行20分鐘離心。以OCP/膠原蛋白懸浮液中的膠原 蛋白成為3重量%的方式廢棄上清液後，利用藥匙將內容物混合約2分鐘，而獲得OCP/膠原蛋白複合凝膠。將該複合凝膠放入具有圓柱狀的內部空間的塑膠容器(內徑9.0mm、容積約3.0cm3)中，以230×g的離心力離心1分鐘而進行脫泡。
將密閉狀態的塑膠容器浸漬於遠大於該塑膠容器的容積的被冷卻至-80℃的甲醇中，而進行急速冷凍。打開容器後，將冷凍體利用冷凍乾燥機加以乾燥(-10℃、48小時)而進行成形。繼而，將所獲得的成形體於減壓下，於150℃下加熱24小時，而進行熱脫水交聯。將所獲得的交聯體利用手術刀切割為厚度1.0mm(於試驗例1中使用)或1.5mm(於試驗例2、試驗例4及製造例7中使用)的盤狀。對該等照射電子束加以滅菌，而獲得OCP/Col多孔質複合體(OCP/Col)。
製造例3：β-TCP/Col多孔質複合體的製備
使用將β-TCP(OSferion：Olympus Terumo Biomaterials公司)整粒為粒徑300μm至500μm而獲得的顆粒以代替OCP，除此以外，與製造例2同樣地進行而獲得β-TCP/Col多孔質複合體(β-TCP/Col)。
製造例4：滴加用特立帕肽的製備
向56.5μg的Teribone皮下注射用(Asahi Kasei Pharma公司製造)中加入生理食鹽水1.13ml，而獲得50μg/ml的特立帕肽(PTH)溶解液。取該溶解液20μl置於PCR管(0.5ml)中，加入生理食鹽水80μl，而獲得1.0μg/0.1ml(10μg/ml)的特立帕肽溶解液。另外，將該溶液利用生理食鹽水進一步稀釋10倍，而獲得0.1μg/0.1ml(1.0μg/ml)的特立帕肽溶解液。於使用之前，將該等保存於-20℃的冷凍庫中。
製造例5：皮下注射用特立帕肽的製備
向56.5μg的Teribone皮下注射用(Asahi Kasei Pharma公司製造)中加入生理食鹽水1.13ml，而獲得50μg/ml的特立帕肽溶解液。取該溶解液70μl置於PCR管(0.5ml)中，加入生理食鹽水280μl，而獲得3.5μg/0.35ml(10μg/ml)的特立帕肽溶解液。於使用之前，將該溶解液保存於-20℃的冷凍庫中。
製造例6：OCP/FGF-2複合體(OCP/FGF-2)製作
將經冷凍乾燥的基因重組人纖維芽細胞生長因子2(recombinant human Fibroblast growth factor-2，以下稱為FGF-2，R & D Systems公司製造)溶解於0.01M磷酸緩衝液(含有0.1%以上的牛血清白蛋白(bovine serum albumin)及1mM的DTT(dithiothreitol；二硫蘇糖醇))中。對於經乾熱滅菌的OCP顆粒(粒徑300μm至500μm)15mg，以三種不同濃度(10ng、100ng、1μg)添加FGF-2，於-20℃下浸漬20分鐘後，加以冷凍乾燥，而製作OCP/FGF-2顆粒。使用不添加FGF-2的OCP顆粒作為對照試樣。
製造例7：OCP/Col/PTH多孔質複合體的製備
向56.5μg的Teribone皮下注射用(Asahi Kasei Pharma公司製造)中加入注射用水1.0mL，而獲得56.5μg/mL的特立帕肽(PTH)溶解液。向48孔培養盤中逐孔添加排列製造例2中所製作的OCP/Col，對每1孔添加17.7μL的PTH溶解液。將該等利用-78℃的低溫冷凍器加以冷凍後，將冷凍體利用冷凍乾燥機加以乾燥(-10℃、24小時)。最後藉由照射電子束進行滅菌，而獲得每1個OCP/Col含有1.0μg的PTH的複合體(OCP/Col/PTH1.0(乾燥))。另外，將56.5μg/mL的PTH溶解液利用注射用水稀釋至10倍，使用所獲得的溶液進行與前述相同的操作，藉此獲得每1 個OCP/Col含有0.1μg的PTH的複合體(OCP/Col/PTH0.1(乾燥))。另外，藉由變更PTH溶解液的稀釋倍率，而製備每1個OCP/Col含有PTH0.01μg或0.001μg的「OCP/Col/PTH0.01(乾燥)」及「OCP/Col/PTH0.001(乾燥)」。
製造例8：β-TCP/Col/PTH多孔質複合體的製備
使用β-TCP/Col代替OCP/Col，除此以外，與製造例7同樣地進行，而獲得每1個β-TCP/Col含有1.0μg的PTH的複合體(β-TCP/Col/PTH1.0(乾燥))及每1個β-TCP/Col含有0.1μg的PTH的複合體(β-TCP/Col/PTH0.1(乾燥))。
試驗例1：OCP或β-TCP+特立帕肽(皮下注射)
將雄性Wistar系大鼠(12週齡)進行腹腔內麻醉，對顱頂部實施皮膚切開及骨膜切開，明示顱頂，而製作無望自然治癒的直徑約9mm的規格化的全層的骨缺損。於該處埋入1塊製造例2中所製作的盤狀的OCP/Col或1塊製造例3中所製作的盤狀的β-TCP/Col。作為對照，製作僅有骨缺損，而準備不埋入試樣的大鼠(未處置群)。埋入試樣後，進行骨膜及皮膚縫合而結束手術。將OCP/Col群、β-TCP/Col群、及未處置群各自分為特立帕肽皮下注射群(皮下注射群)與不進行特立帕肽皮下注射的群(非注射群)，而分成合計6個群。對於特立帕肽皮下注射群的大鼠，於剛手術後及其後每天以10μg/kg的比率皮下注射製造例5中所製備的特立帕肽。皮下注射係藉由如下方式進行：將解凍的特立帕肽溶液吸入1ml注射器(27G注射針)中，利用希必定稀釋液(Hibitane diluent)對背部皮膚加以消毒後，於背部皮下注射相當量的特立帕肽溶液。關於術後的觀察期間，各群設為8週，各期間使用5隻大鼠。
於術後4週、及8週後，以低X射線管電壓使用實 驗動物用X射線CT裝置(Latheta LCT-200；Hitachi-Aloka Medical公司製造)，於存活狀態下拍攝斷層，而詳查骨缺損部的新生骨形成狀況。同樣地，於術後8週後的CT拍攝後，於戊巴比妥過量麻醉下處死大鼠，並採集顱頂及周圍組織，於0.1M磷酸緩衝4%多聚甲醛(pH值7.4)中進行浸漬固定。摘取標本係使用弱穿X射線照相裝置(CMBW-2；Softex公司製造)進行拍攝(20KV，5mA)後，利用10%EDTA(Ethylene diamine tetraacetic acid；乙二胺四乙酸)進行脫鈣而製作石蠟標本後，藉由前額切口而製作厚度6μm的組織切片，藉由蘇木精-曙紅染色而進行組織學檢查。進而，使用各標本的相當於缺損中央的部位(複數個)的組織切片，藉由組織定量學方法而研究所製作的缺損內的新生骨比率(n-Bone%)。使用各群的n-Bone%的平均值、標凖偏差進行分散分析等，而進行顯著差異檢驗。顯著差異水準係設定為5%。
將結果示於圖1至圖5。於圖1至圖4中，所謂PTH(+)表示皮下投予特立帕肽，所謂PTH(-)表示特立帕肽非投予群。圖1係所摘取的骨缺損部的X射線照片。於OCP/Col/皮下PTH(+)群中，於缺損全域可見塊狀的不透過影像，與OCP/Col/皮下PTH(-)群相比，缺損內不透過影像所佔的範圍更大。於β-TCP/Col/皮下PTH(+)群中，亦同樣地與β-TCP/Col/皮下PTH(-)群相比，缺損內不透過影像所佔的範圍更大。另一方面，關於未處置/皮下PTH(+)群及未處置/皮下(-)群，缺損內以相同程度缺乏不透過影像。
圖2係於存活狀態下拍攝顱頂及周圍組織所獲得的X射線照片。OCP/Col/皮下PTH(+)群與OCP/Col/皮下PTH(-)群相比，缺損內的更大區域被與現存骨相同程度的不透過影像所佔據。β-TCP/Col/皮下PTH(+)群亦與β-TCP/Col/ 皮下PTH(-)群相比，缺損內的更大範圍被與現存骨相同程度的不透過影像所佔據。對於不透過度高於現存骨的β-TCP，可見於缺損內分散存在，可見被不透過影像所包圍的β-TCP、或孤立的β-TCP。對於未處置/皮下(+)群及未處置群/皮下PTH(-)，可見自缺損邊緣(▼)延伸的不透過影像，但與現存骨相比，這些的厚度更薄。
圖3及圖4係經染色的病理組織標本。病理組織標本的上方為皮膚側，下方為硬腦膜側。於作為低倍率(×1.25)圖像的圖3中，OCP/Col/皮下PTH(+)群的缺損內大部分被染色為紅色的新生骨所填滿，厚度亦得到保持。OCP/Col/皮下PTH(-)群、β-TCP/Col/皮下PTH(+)群、β-TCP/Col/皮下PTH(-)群的缺損內，新生骨與移植體混合存在。於未處置/皮下PTH(+)群、未處置/皮下PTH(-)群中，缺損內係由自缺損邊緣(▼)延伸出的較薄的骨組織與圍繞該骨組織的結締組織所構成。於高倍率(×10)的圖4中，關於OCP/Col/皮下PTH(+)群及OCP/Col/皮下PTH(-)群，與所埋入的OCP/Col形成一體的新生骨呈現馬賽克狀，顯示出旺盛的骨改造，並且亦見到向這些的血管侵入。另外，所埋入的OCP顆粒逐漸減小。關於β-TCP/Col/皮下PTH(+)群及β-TCP/Col/皮下PTH(-)群，新生骨包圍β-TCP顆粒的周圍，一部分包含於新生骨中。其中，認為殘存的β-TCP顆粒的大小大於OCP顆粒。關於未處置/皮下PTH(+)群及未處置/皮下PTH(-)群，較薄的新生骨自缺損邊緣部延伸出。
使用前述各標本的相當於缺損中央的部位(複數個)的組織切片，藉由組織定量學方法求出缺損內的新生骨比率(n-Bone%)(圖5)。OCP/Col/皮下PTH(+)群為49.3±8.4，OCP/Col/皮下PTH(-)群為38.8±14.7，β-TCP/Col/皮下PTH(+)群為39.0±17.6，β-TCP/Col/皮下PTH(-)群為 41.0±11.9，未處置/皮下PTH(+)群為31.1±10.2，未處置/皮下PTH(-)群為31.6±11.9，OCP/Col/皮下PTH(+)群與OCP/Col/皮下PTH(-)群相比，顯示出更高值。另一方面，β-TCP/Col/皮下PTH(+)群、未處置/皮下PTH(+)群分別顯示出與β-TCP/Col/皮下PTH(-)群、未處置/皮下PTH(-)群相同程度的新生骨比率。
如上所述，根據圖1至圖5的結果確認到，單獨使用特立帕肽時雖然未見到形成新生骨，但藉由將特立帕肽與OCP或β-TCP組合，與單獨利用OCP或β-TCP進行處置的情形相比，顯著地促進新生骨形成。尤其是，於將特立帕肽與OCP組合的情況下，與單獨使用OCP時的差異顯著。
試驗例2：OCP或β-TCP+特立帕肽(滴加)
將雄性Wistar系大鼠(12週齡)進行腹腔內麻醉後，對顱頂部實施皮膚切開、骨膜切開，明示顱頂，而製作無望自然治癒的直徑約9mm的規格化的全層的骨缺損。向該處埋入1塊製造例2中所製作的盤狀的OCP/Col或1塊製造例3中所製作的盤狀的β-TCP/Col。此時，對於OCP/Col，每1塊試樣滴加0.1ml的製造例4中所製備的特立帕肽溶液(1.0μg/0.1ml或0.1μg/0.1ml)，對於β-TCP/Col，每1塊試樣滴加相同的特立帕肽溶液(1.0μg/0.1ml)。準備不對OCP/Col或β-TCP/Col滴加特立帕肽溶液的群作為對照。埋入試樣後，進行骨膜及皮膚縫合而結束手術。關於術後的觀察期間，各群設為12週，各期間使用6隻大鼠。於術後4週及12週後，進行與試驗例1相同的分析。
將結果示於圖6至圖9。於圖6至圖9中，所謂PTH1.0μg及PTH0.1μg分別表示每1塊試樣滴加特立帕肽 溶液1.0μg及0.1μg(滴加PTH(1.0μg)群及滴加PTH(0.1μg)群)，所謂PTH(0)表示未滴加特立帕肽溶液(PTH(-)群)。圖6係所摘取的骨缺損部的X射線照片。於OCP/Col/滴加PTH(1.0μg)群、及OCP/Col/滴加PTH(0.1μg)中，缺損全域被板狀的不透過影像所佔據。關於OCP/Col/滴加PTH(-)群，缺損的大部分被塊狀的不透過影像所佔據，一部分亦存在透過影像。根據該等結果確認到，藉由滴加PTH，顯著地促進由OCP引起的新生骨形成。於β-TCP/Col/滴加PTH(1.0μg)群、及β-TCP/Col/滴加PTH(0.1μg)群中，亦確認到缺損全域被板狀的不透過影像所佔據。
圖7係於存活狀態下拍攝顱頂及周圍組織所獲得的X射線照片。上段為OCP/Col/滴加PTH(1.0μg)群、OCP/Col/滴加PTH(0.1μg)群、及OCP/Col/滴加PTH(-)群的結果。下段為β-TCP/Col/滴加PTH(1.0μg)群、β-TCP/Col/滴加PTH(0.1μg)群、及β-TCP/Col/滴加PTH(-)群的結果。於OCP/Col/滴加PTH(1.0μg)群、及OCP/Col/滴加PTH(0.1μg)群中，埋入後4週起，於缺損的大部分見到不透過影像，這些隨時間經過使不透過度增大，確認到缺損得到修復。另一方面，於OCP/Col/滴加PTH(-)群(PTH非投予群)中，埋入後4週起，缺損全域被較小的分散存在的不透過影像的集合體所佔據，這些隨時間經過使不透過度增大並且發生融合，而使佔據缺損內的不透過影像增大。此情況意味著，PTH非投予群與PTH投予群相比，缺損內的不透過性的亢進更慢。
圖8係經染色的病理組織標本(埋入後12週)。病理組織標本的上方為皮膚側，下方為硬腦膜側。於作為低倍率(×1.25)圖像(上段)的OCP/Col/滴加PTH(1.0μg)群及OCP/Col/滴加PTH(0.1μg)群中，缺損內幾乎被染色為紅色 的新生骨填滿，新生骨的厚度保持為與現存骨相同程度，無法區分缺損邊緣與新生骨的接縫。關於作為高倍率(×20)圖像(下段)的OCP/Col/滴加PTH(1.0μg)群，缺損部幾乎被顯示出旺盛的骨改造的新生骨所佔據，一部分發生皮質骨化。另外，所埋入的OCP顆粒基本上變得不明顯。於OCP/Col/滴加PTH(0.1μg)群中，缺損部基本上顯示出旺盛的骨改造，被與所埋入的OCP/Col形成一體的新生骨所佔據，一部分發生皮質骨化。另外，所埋入的OCP顆粒變得相當小。OCP/Col/滴加PTH(-)群與OCP/Col/滴加PTH群相比，新生骨量更少。與所埋入的OCP/Col形成一體的新生骨呈現馬賽克狀，所埋入的OCP顆粒變小。
圖9表示組織形態計測結果(新生骨比率)。關於佔據缺損內的新生骨比率(n-Bone%)，OCP/Col/滴加PTH(1.0μg)群為53.6±4.3，OCP/Col/滴加PTH(0.1μg)群為52.2±7.4，OCP/Col/滴加PTH(-)群為40.1±8.4，藉由將PTH與OCP併用，與單獨使用OCP時相比，確認到新生骨比率顯著提高(p=0.008)。
如上所述，根據圖6至圖9所示的結果確認到，藉由將PTH與OCP併用，由OCP引起的新生骨形成顯著地得到促進。於試驗例1的皮下注射群(10μg/kg/day：8週)中確認到，雖然對各個體(體重250g至350g左右)分別投予了超過150μg的PTH，但以與這些相比為數百至數千分之一的投予量能夠實現超過這些的骨再生效果。
試驗例3：OCP+FGF-2
將雄性Wistar系大鼠(12週齡)進行腹腔內麻醉後，對大鼠顱頂部實施皮膚切開及骨膜切開，明示顱頂，而製作無望自然治癒的直徑約9mm的規格化的全層的骨缺損。於該處埋入製造例6中所獲得的OCP/FGF-2顆粒 (15mg)或OCP顆粒(15mg)。埋入試樣後，進行骨膜及皮膚縫合而結束手術。各群由4隻至5隻大鼠構成，術後4週進行評價。另外，對於OCP/FGF-2 100ng投予群及OCP投予群(各群5隻)，術後8週研究骨再生能力。
經過觀察期間後，於戊巴比妥過量麻醉下處死大鼠，並採集顱頂及周圍組織，於0.1M磷酸緩衝4%多聚甲醛(pH值7.4)中進行浸漬固定。摘取標本係使用弱穿X射線照相裝置(CMBW-2；Softex公司製造)進行拍攝(20KV，5mA)後，利用10%EDTA進行脫鈣而製作石蠟標本後，藉由前額切口而製作厚度6μm的組織切片，並藉由蘇木精-曙紅染色而進行組織學檢查。進而，使用各標本的相當於缺損中央的部位(複數個)的組織切片，藉由組織定量學方法而研究所製作的缺損內的新生骨比率(n-Bone%)。使用各群的n-Bone%的平均值、標凖偏差進行分散分析等，而進行顯著差異檢驗。顯著差異水準係設定為5%。
於所獲得的弱穿X射線照片(圖10)中，可見埋入至缺損內的與OCP/FGF-2或OCP對應的顆粒狀的不透過影像，於組織學上對於OCP/FGF-2投予群及OCP投予群均見到以缺損邊緣及所埋入的OCP/FGF-2或OCP作為核的骨形成。於組織定量學上，關於術後4週的缺損內的新生骨比率(n-Bone%：平均值±標凖偏差)，OCP/FGF-2 10ng投予群為14.5±6.9%，OCP/FGF-2 100ng投予群為16.7±19.3%，OCP/FGF-2 1μg投予群為9.7±3.9%，各群間未見顯著差異。另外，關於術後8週的缺損內的新生骨比率(n-Bone%：平均值±標凖偏差)，OCP/FGF-2 100ng投予群為12.8±5.8%，OCP投予群為10.4±10.4%，兩群間未見顯著差異。由此種結果確認，即使將OCP與FGF-2組合，亦無法獲得由OCP引起的新生骨形成的促進作用。
試驗例4：OCP或β-TCP+特立帕肽(冷凍乾燥多孔質複合體)
使用雄性Wistar系大鼠(12週齡)，分為以下的6個群(各群5隻)。
Figure 106109969-A0202-12-0032-3
「OCP/Col/PTH1.0(乾燥)」及「OCP/Col/PTH0.1(乾燥)」係於製造例7中所製作。「β-TCP/Col/PTH1.0(乾燥)」及「β-TCP/Col/PTH0.1(乾燥)」係於製造例8中所製作。「OCP/Col」係於製造例2中所製作。「β-TCP/Col」係於製造例3中所製作。
於腹腔內麻醉後，對大鼠顱頂部實施皮膚切開、骨膜切開，明示顱頂，而製作無望自然治癒的直徑約9mm的規格化的全層的骨缺損，將表1所示的任一埋入物埋入相同的缺損部。其後，進行骨膜及皮膚縫合而結束手術。關於術後的觀察期間，各群設為12週。
於術後4週及12週後，以低X射線管電壓使用實驗動物用X射線CT裝置(Latheta LCT-200；Hitachi-Aloka Medical公司製造)，於存活狀態下拍攝斷層，而詳查骨缺損部的新生骨形成狀況。同樣地，於術後12週後進行CT拍攝，於戊巴比妥過量麻醉下處死大鼠，並採集顱頂及周 圍組織，於0.1M磷酸緩衝4%多聚甲醛(pH值7.4)中進行浸漬固定。摘取標本係使用弱穿X射線照相裝置(CMBW-2；Softex公司製造)進行拍攝(20KV，5mA)後，利用10%EDTA進行脫鈣而製作石蠟標本後，藉由前額切口而製作厚度6μm的組織切片，並藉由蘇木精-曙紅染色而進行組織學檢查。進而，使用各標本的相當於缺損中央的部位(複數個)的組織切片，藉由組織定量學方法而研究所製作的缺損內的新生骨比率(n-Bone%)。使用各群的新生骨比率的平均值、標凖偏差進行統計學分析，而進行顯著差異檢驗。顯著差異水準係設定為5%。
將術後12週後所拍攝的摘取標本的弱穿X射線照片示於圖11。於A群及B群中，缺損全域相對均勻地被板狀的不透過影像所佔據。C群中，缺損的大部分被塊狀的不透過影像所佔據，一部分亦存在透過影像。D群中，缺損內混合存在顆粒狀的不透過影像與塊狀的不透過影像，一部分亦存在透過影像。E群中，顆粒狀的不透過影像佔優勢，F群中，混合存在顆粒狀的不透過影像與塊狀的不透過影像。該等結果提示，含PTH及OCP的多孔質複合體與不含PTH且含OCP的多孔質複合體、含PTH及β-TCP的多孔質複合體、以及不含PTH且含β-TCP的多孔質複合體相比，更進一步促進骨再生。
將於術後4週後及12週後進行斷層拍攝而獲得的CT照片示於圖12。於A群及B群中，術後4週起，於缺損的大部分見到與母骨層連續的相對均勻且板狀的不透過影像，這些於術後12週進一步增加不透過度，而覆蓋缺損的大部分。C群中，埋入4週起，缺損全域被較小的分散存在的不透過影像的集合體所佔據，這些於埋入12週增大不透過度並且融合，使佔據缺損內的不透過影像增大。D群中，於術後4週，顆粒狀的不透過影像佔優勢， 但於術後12週亦變得混合存在與母骨層連續的板狀的不透過影像。但是，這些不透過影像距離缺損中央部尚遠。E群中，於術後4週及12週，顆粒狀的不透過影像均佔優勢。F群中，於術後4週，混合存在顆粒狀的不透過影像與塊狀的不透過影像，這些於術後12週增大不透過度。該等結果亦提示，含PTH及OCP的多孔質複合體與不含PTH且含OCP的多孔質複合體、含PTH及β-TCP的多孔質複合體、以及不含PTH且含β-TCP的多孔質複合體相比，骨再生促進作用更優異。
將經染色的病理組織標本示於圖13。上方為皮膚側，下方為硬腦膜側。A群及B群中，缺損內幾乎被染色為紅色的新生骨填滿，新生骨的厚度保持為與現存骨相同的程度，無法區分缺損邊緣與新生骨的接縫。另外，一部分發生皮質骨化，新生骨內亦未見血管的侵入及骨髓形成。C群中，缺損內的多數部分被新生骨填滿。A群至C群中，硬腦膜側的骨再生均更旺盛。D群及F群中，缺損內被大量新生骨所佔據，但自骨斷端起的新生骨形成明顯，於缺損中央部缺乏新生骨形成。E群中，缺損內多數被β-TCP顆粒與纖維性結締組織所佔據，未見明顯的新生骨形成。於D至F的全部群中，硬腦膜側的骨再生均更旺盛。
將各群的新生骨比率示於下述表2。如表2所示，確認到A群及B群與其他所有群相比，新生骨比率顯著更高。
Figure 106109969-A0202-12-0034-4
Figure 106109969-A0202-12-0035-5
試驗例5：OCP+特立帕肽(冷凍乾燥多孔質複合體)
依據試驗例4，將雄性Wistar系大鼠(12週齡)分為以下的2個群。
Figure 106109969-A0202-12-0035-6
「OCP/Col/PTH0.01(乾燥)」及「OCP/Col/PTH0.001(乾燥)」係於製造例7中所製作。
於腹腔內麻醉後，對大鼠顱頂部實施皮膚切開、骨膜切開，明示顱頂，而製作無望自然治癒的直徑約9mm的規格化的全層的骨缺損，將表1所示的任一埋入物埋入相同的缺損部。其後，進行骨膜及皮膚縫合而結束手術。關於術後的觀察期間，各群設為12週。
於術後4週及12週後，以低X射線管電壓使用實驗動物用X射線CT裝置(Latheta LCT-200；Hitachi-Aloka Medical公司製造)，於存活狀態下拍攝斷層，而詳查骨缺損部的新生骨形成狀況。同樣地，於術後12週後進行CT拍攝。
將於術後4週後及12週後進行斷層拍攝而獲得的CT 照片示於圖14。A群及B群中，術後4週起，於缺損的大部分見到與母骨層連續的相對均勻且板狀的不透過影像，這些於術後12週進一步增大不透過度，而覆蓋缺損的大部分。該等結果提示，含PTH及OCP的多孔質複合體即便PTH的添加量為低濃度，與圖7及圖12所示的不含PTH且含OCP的多孔質複合體相比，亦可實現顯著的骨再生，這些於骨再生促進作用方面優異。
根據以上的結果確認，含PTH及OCP的多孔質複合體與不含PTH且含OCP的多孔質複合體、含PTH及β-TCP的多孔質複合體、以及不含PTH且含β-TCP的多孔質複合體相比，可實現顯著的骨再生。
<110> 東洋紡股份有限公司
<120> 多孔質複合體、及含有磷酸八鈣及副甲狀腺素的多孔質複合體的製造方法
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> 人類
<400> 1
Figure 106109969-A0202-12-0037-7

Claims (8)

  1. 一種多孔質複合體，係含有磷酸八鈣及副甲狀腺素；前述副甲狀腺素為特立帕肽。
  2. 如請求項1所記載之多孔質複合體，其中水分含量為5重量%以下。
  3. 如請求項1或2所記載之多孔質複合體，係骨再生用或骨增量用。
  4. 如請求項1或2所記載之多孔質複合體，其中進而含有膠原蛋白。
  5. 如請求項4所記載之多孔質複合體，其中相對於前述膠原蛋白1重量份的前述磷酸八鈣的調配比為0.5重量份至35重量份。
  6. 一種含有磷酸八鈣及副甲狀腺素的第二多孔質複合體的製造方法，係包括對含有磷酸八鈣的第一多孔質複合體添加副甲狀腺素；前述副甲狀腺素為特立帕肽。
  7. 如請求項6所記載之含有磷酸八鈣及副甲狀腺素的第二多孔質複合體的製造方法，其中進而包括將第二多孔質複合體加以冷凍乾燥。
  8. 如請求項6或7所記載之含有磷酸八鈣及副甲狀腺素的第二多孔質複合體的製造方法，其中第一多孔質複合體進而含有膠原蛋白。
TW106109969A 2016-04-08 2017-03-24 多孔質複合體、及含有磷酸八鈣及副甲狀腺素的多孔質複合體的製造方法 TWI687222B (zh)

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