KR101456642B1 - 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 포함하는 골 재생용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 포함하는 골 재생용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 포함하는 골 재생용 조성물은 세포 표면에 균일성 있게 흡착되며, 세포의 부착 및 성장을 촉진시키고, 생체에 이식하였을 때 일반 골 이식재에 비하여 골 결손 경계부에서부터 중앙부에 이르기까지 골 재형성을 현저하게 증가시키는 우수한 효과를 가지고 있으며, 골 이식재 충진시 혈액과 반응하여 자가응집 반응이 일어남으로써 보다 빠르고 편리하게 충진할 수 있어, 골 이식재 및 골 충진재 등으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

피브리노겐이 코팅된 골 분말을 포함하는 골 재생용 조성물 및 이의 제조 방법{Composition comprising fibrinogen-coated bone powder for reproduction of bone and method for preparing the same}

본 발명은 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 포함하는 골 재생용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

근래에 들어, 외상성 상해, 암, 뼈의 골절과 같은 여러 이유에서 야기되는 뼈 결손부가 발생하여 이의 치료를 위해 뼈 이식을 필요로 하는 환자가 급증하고 있다. 이러한 뼈 결손부의 재건을 위하여 자가골, 동종골, 이종골 등이 이식재로서 사용되고 있다. 자가골이식은 골전도성, 골유도성 그리고 무면역반응 등의 특성을 가지고 있어 최상의 이식재로서 여겨지고 있으나, 공여부량의 한계와 추가 부위의 수술이 필요하고 그에 따르는 동반통증 및 수술부 감염에 대한 문제가 있다. 또한 동종골의 경우 비교적 양호한 골전도능과 유도능을 가지고 있지만, 사체로부터 골 조직을 확보하여야 하기 때문에 많은 어려움이 있고, 이종골은 소 또는 돼지 등으로부터 유래되는 이식재이기 때문에 면역반응 등의 위험요소와 공여개체로부터 전염될 수 있는 질병 감염 등과 윤리적인 문제점이 남아 있다. 이에 수산화아파타이트(hydroxyapatite, HAp)와 같은 합성골은 비교적 저렴한 가격과, 합성골 양산에 의한 확보가 용이하고 생체적합능이 뛰어나 최근 골이식재로서 많이 사용되고 있다. 수산화아파타이트는 Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂의 화학적 구조를 가지고 있어, 이는 인체 뼈의 구성성분과 비슷하기 때문에 매우 뛰어난 생체적합성 특징을 가지고 있다.

수산화아파타이트와 같은 합성골이식재 및 지지체의 합성에 있어 다공성은 이식부위에서 뼈 세포의 이동과 혈관의 생성, 영양분의 이동 등에 관여하기 때문에 성공적인 뼈 재생을 위해서 필수적인 요소이다. 다공성의 형성을 위하여 쾌속 조형(rapid prototyping) 또는 발포법(foaming method)을 이용하려는 시도가 있지만 이러한 방법은 실제 시제품을 제작하기에 비싸고 구조체의 내부적 다공 형성 등에 대한 조건이 완전하지 못한 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하고자 조개 껍질, 산호, 갑오징어 뼈(cuttlefish bone, CB) 등과 같은 자연적 구조물을 이용하여 수산화아파타이트로 변환하여 이식재 및 지지체로서 사용하려는 시도가 있었다.

이러한 시도들은 그들의 주 성분이 탄산칼슘으로 구성되어 있어 수산화아파타이트가 쉽게 변환할 수 있기 때문이다. 이러한 자연 구조물 중 갑오징어 뼈 또한 주 성분이 탄산칼슘으로 구성되어 있으며, 특히 그 내측면 구조는 자연적으로 다공 구조를 가지고 있기 때문에 이를 이용하여 골이식재 및 지지체로 이용하기 위해 수열화 반응을 통한 다공성이 유지되는 수산화아파타이트로 변환하려는 연구가 진행되었다.

일반적으로 수산화아파타이트 등을 이용한 합성골의 임상적 응용은 블록(block), 고체 매트릭스(solid matrix) 및 과립 형태로 사용되고 있다. 이 중 과립 형태의 이식재는 수술부위의 복잡한 형태에 맞춰 조절이 가능하기 때문에 자주 이용되는 이식재의 형태이나 뼈 결손 부에 채워 넣기에 취급이 쉽지 않고 특히 수술부위에 이식된 과립이 주위의 연 조직 등으로 이동하여 염증을 유발할 수도 있다는 단점이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 과립 형태의 이식재는 가끔 환자의 혈액 또는 피브린 접착제와 혼합하여 응고체를 형성하게 한 뒤 수술부위에 이식하는 방법이 사용되고 있다.

피브린 접착제는 그 주요구성이 피브린과 트롬빈으로 구성되어 있다. 피브린은 트롬빈에 의하여 단량체인 피브리노겐으로 변환되는데 이는 생체 접착력을 가지기 때문에 상처부위를 위한 접착제로서 여러 수술분야에 널리 쓰여지고 있다. 그러나 과립 형태의 이식재 시술에서 위와 같은 피브린 접착제 또는 환자의 혈액이 사용되고 있으나, 이러한 방법은 응고 형태를 제조를 위해 외부에서의 이식재와 혼합작업이 필요하고 이로 인한 시술시간의 연장과 세균감염 등의 문제점이 해결해야 할 과제로 남아있다.

본 발명의 목적은 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 포함하는 골 재생용 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 골 재생용 조성물을 포함하는 골 이식재 또는 골 충진재를 제공하는 것이다.

본 발명은 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 포함하는 골 재생용 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 골 재생용 조성물을 포함하는 골 이식재 또는 골 충진재를 제공한다.

본 발명에 따른 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 포함하는 골 재생용 조성물은 세포 표면에 균일성 있게 흡착되며, 세포의 부착 및 성장을 촉진시키고, 생체에 이식하였을 때 일반 골 이식재에 비하여 골 결손 경계부에서부터 중앙부에 이르기까지 골 재형성을 현저하게 증가시키는 우수한 효과를 가지고 있으며, 골 이식재 충진시 혈액과 반응하여 자가응집 반응이 일어남으로써 보다 빠르고 편리하게 충진할 수 있어, 골 이식재 및 골 충진재 등으로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 갑오징어 뼈로부터 형성된 수산화아파타이트의 성분 x-선 회절 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 갑오징어 뼈로부터 형성된 수산화아파타이트의 표면을 전자 주사 현미경(SEM)을 사용하여 관찰한 도이다.
도 3은 피브리노겐(FNG)이 코팅된 갑 오징어 뼈 유래 수산화아파타이트(cuttlefish bone-derived hydroxyapatite, CB HAp)의 표면을 전자 주사 현미경(SEM)을 사용하여 관찰한 도이다.
도 4는 CB HAp에 대한 피브리노겐(FNG)의 코팅율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 원편광 이색성 분광 측정법(circular dichroism, CD) 분석을 통한 피브리노겐(FNG)의 코팅에 따른 단백질의 안정성 평가를 나타낸 도이다.
도 6은 전기 영동을 통한 피브리노겐(FNG)의 코팅에 따른 단백질의 안정성 평가를 나타낸 도이다.
도 7은 피브리노겐(FNG)이 코팅된 수산화아파타이트 과립의 자가 응집 시험의 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 피브리노겐(FNG)이 코팅된 수산화아파타이트 골 이식재가 세포 부착력 및 세포 증식에 미치는 영향 검증을 위한 SEM 관찰의 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 피브리노겐(FNG)이 코팅된 수산화아파타이트 골 이식재가 세포 부착력 및 세포 증식에 미치는 영향 검증을 위한 MTS 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 피브리노겐(FNG)이 코팅된 수산화아파타이트 골 이식재를 실험동물에 이식한 결과를 나타낸 도이다(A : 음성대조군, B : CB HAp, C: 피브리노겐이 코팅된 CB HAp).
도 11은 피브리노겐이 코팅된 수산화아파타이트 골 이식재를 실험 동물에 이식한 뒤 2주 후, 조직학적 생체 융합 및 골형성 관찰 결과를 나타낸 도이다(A : 음성대조군, B : CB HAp, C: 피브리노겐이 코팅된 CB HAp).
도 12는 피브리노겐이 코팅된 수산화아파타이트 골 이식재를 실험 동물에 이식 2주 후, 골결손 경계부에서 조직학적 골형성 관찰 결과를 나타낸 도이다(A : 음성대조군, B : CB HAp, C: 피브리노겐이 코팅된 CB HAp).
도 13은 피브리노겐이 코팅된 수산화아파타이트 골 이식재를 실험 동물에 이식 2주 후, 골결손 중앙부에서 조직학적 골형성 관찰 결과를 나타낸 도이다(A : 음성대조군, B : CB HAp, C: 피브리노겐이 코팅된 CB HAp).
도 14는 피브리노겐이 코팅된 수산화아파타이트 골 이식재를 실험 동물에 이식 2주 후, 골결손 경계부에서 조직학적 골형성 관찰 결과를 나타낸 도이다(A : HAp, B : CB HAp).
도 15는 피브리노겐이 코팅된 수산화아파타이트 골 이식재를 실험 동물에 이식 2주 후, 골결손 중앙부에서 조직학적 골형성 관찰 결과를 나타낸 도이다(A : HAp, B : CB HAp).

본 발명은 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 유효성분으로 포함하는 골 재생용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은

1) 갑오징어 뼈를 절단한 후, 염기성 용매에 가하고 20 내지 30시간 동안 150 내지 300℃에서 수열화 반응을 수행하는 단계;

2) 상기 1)단계의 수열화 반응된 갑오징어 뼈를 1차 열처리 및 2차 열처리를 수행한 뒤, 분쇄하여 골 분말 과립을 제조하는 단계; 및

3) 상기 2)단계에서 제조된 골 분말 과립을 피브리노겐 단백질이 용해된 PBS 용액과 혼합하여 반응시키고 동결건조하여 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 제조하는 단계;

를 포함하는 피브리노겐이 코팅된 수산화아파타이트를 유효성분으로 포함하는 골 재생용 조성물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명의 골 재생용 조성물은 피브리노겐이 골 분말에 코팅된 것을 특징으로 한다.

상기 골 분말은 뼈의 재료로 사용될 수 있는 분말형 재료를 의미하며, 그 입수방법에 제한되지 않으며, 의료 부산물, 산업 부산물일 수 있고, 상업적으로 입수할 수 있다. 상기 골 분말은 예를 들어, 인간의 사체에서 유래된 골 분말(동종골), 인간을 제외한 동물에서 유래된 골 분말(이종골), 합성 골분말, 및 이들의 혼합 골 분말일 수 있으며, 바람직하게는 합성골 분말일수 있다. 상기 합성골 분말은 수산화아파타이트(HAp), BCP(biphasic calcium phosphate) 또는 TCP(tri calcium phosphate) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 본 발명에서는 수산화아파타이트가 가장 바람직하다.

상기 수산화아파타이트는 갑 오징어 뼈로부터 형성된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 골 재생용 조성물의 제조방법에 대해 하기에 단계별로 상세히 설명한다.

상기 1)단계 및 2)단계는 갑오징어 뼈로부터 골 분말을 형성하는 단계로, 먼저 갑오징어 뼈를 절단한 후, 0.3 내지 0.9M, 바람직하게는 0.6M의 염기성 용매에 가하고, 20시간 내지 30시간, 바람직하게는 24시간 동안 150 내지 300℃, 바람직하게는 180 내지 250℃에서 수열화 반응을 수행한 뒤, 증류수로 세척 및 건조한다. 상기 건조된 시료를 승온속도 1℃/분으로 500 내지 700℃, 바람직하게는 600℃까지 올린 뒤, 1 내지 2시간 동안 유지하고, 이를 다시 승온속도 1 내지 5℃/분으로 800 내지 1400℃, 바람직하게는 900 내지 1200℃까지 가열한다. 이후 1 내지 2시간 동안 유지한 뒤 서서히 온도를 낮추고 분쇄하여 골 분말 과립을 수득한다.

상기 염기성 용매는 수산화 암모늄 수용액 또는 H₃PO₄를 포함하며, 이에 한정되지 않는다.

상기 3)단계는 상기 2)단계에서 수득한 골 분말 과립에 피브리노겐을 코팅하는 단계로, 먼저 PBS 완충액(pH 7.2)에 0.01 내지 1000mg/mL, 바람직하게는 0.01 내지 100mg/mL, 더욱 바람직하게는, 0.01 내지 40mg/mL의 농도로 피브리노겐 단백질을 용해한 뒤, 골 분말 과립을 1g 당 피브리노겐 단백질이 용해된 PBS 용액 0.1 내지 5mL, 바람직하게는 0.5 내지 2mL의 비율로 혼합한다.이후 충분한 코팅을 위하여 10분 내지 24시간, 바람직하게는 4시간 동안 2 내지 8℃, 바람직하게는 4℃에서 반응 후, 1 내지 5일간 바람직하게는, 3일간 동결건조하여 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 얻는다.

상기 방법으로 제조된 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 포함하는 골 재생용 조성물은 세포 표면에 균일성 있게 흡착되며, 세포의 부착 및 성장을 촉진시키고, 생체에 이식하였을 때 일반 골 이식재에 비하여 골 결손 경계부에서부터 중앙부에 이르기까지 골 재형성을 현저하게 증가시키는 우수한 효과를 가지고 있으며, 골 이식재 충진시 혈액과 반응하여 자가응집 반응이 일어남으로써 보다 빠르고 편리하게 충진할 수 있어, 골 이식재 및 골 충진재 등으로 유용하게 이용할 수 있다.

이에, 본 발명은 상기 골 재생용 조성물을 포함하는 골 이식재 또는 골 충진재를 제공한다.

본 발명의 골 이식재 또는 골 충진재는 압착, 압축, 가압접촉, 패킹, 압박, 굳힘 등의 방법을 사용하여, 퍼티, 페이스트, 주형 가능한 스트립, 블록, 칩 등의 형태로 성형하여 사용할 수 있으며, 분말 형태 그대로 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 골 이식재 또는 골 충진재가 적용될 수 있는 뼈 부위는 특별히 한정되지는 않으며, 바람직하게는 치과용으로 이용될 수 있다.

본 발명의 골 이식재 또는 골 충진재는 임플란트(implant) 주위의 빈 공간에 충진하거나 임플란트 표면을 상술한 본 발명의 골 이식재 또는 골 충진재로 표면 처리한 상태로 골 손상 부위에 삽입하여, 뼈의 신생을 촉진함으로써 임플란트의 보다 견고한 고정을 유도할 수 있다.

또한, 본 발명의 골 이식재 또는 골 충진재는 약리학적 또는 생리학적 활성물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 활성물질은 항생제, 항염증제, 항암제, 펩티드, 또는 성장 인자 등의 단백질 등을 포함한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 피브리노겐이 코팅된 갑오징어 뼈 유래 수산화아파타이트 (cuttlefish bone-derived hydroxyapatite, CB HAp) 골이식재의 제조

1-1. 갑오징어 뼈의 준비

갑오징어 뼈는 수산물 시장에서 구입하였으며, 이후 조 단백 등의 기타 성분을 제거하기 위하여 NaOH로 세척한 뒤, 흐르는 물로 세척 및 건조하였다. 건조된 갑오징어 뼈의 외측면을 제거하고 내측면 부분을 가로 세로 높이 각 1cm로 절단하였다.

1-2. 갑오징어 뼈를 수산화아파타이트(HAp)로 변환

갑오징어 뼈를 수산화아파타이트(hydroxyapatite, HAp)로 변환하기 위해 0.6M 수산화암모늄을 이용하여 수열화 반응을 실시하였다. 테프론 라인 스테인레스 용기(Teflon lined stainless vessel)에 1×1×1cm 로 준비된 갑오징어 뼈와 0.6M 수산화 암모늄 용액을 넣고, 24시간 동안 180 내지 250℃에서 수열반응을 수행한 뒤, 1차 증류수로 세척 및 건조하였다. 건조된 시료를 승온속도 1℃/분으로 600℃까지 올린 뒤, 1 내지 2시간 동안 유지하고, 이를 다시 승온속도 1 내지 5℃/분으로 900 내지 1200℃까지 가열하였다. 이후 1 내지 2시간 동안 유지한 뒤 서서히 온도를 낮추었다.

1-3. 수산화아파타이트(HAp)에 피브리노겐 코팅

수산화아파타이트로 변환된 갑오징어 뼈를 과립 크기로 분쇄 후, 100μm와 500μm의 구멍 크기를 가진 체를 이용하여 100 내지 500μm 입자 크기의 과립을 선별하였다. 피브리노겐을 코팅하기 위하여 PBS 완충액(pH 7.2)에 0.01 내지 40mg/mL의 농도별로 피브리노겐 단백질을 용해한 뒤, 갑오징어뼈 유래 수산화아파타이트 과립을 1g 당 피브리노겐 단백질이 용해된 PBS 용액 1 mL의 비율로 혼합하였다. 이후 충분한 코팅을 위하여 4시간 동안 4℃에서 반응 후, 동결건조기를 이용하여 3일간 건조하여, 최종 피브리노겐이 코팅된 갑오징어 뼈 유래 수산화아파타이트(cuttlefish bone-derived hydroxyapatite, CB HAp) 골이식재를 완성하였다.

실험예 1. 갑오징어 뼈로부터 형성된 수산화아파타이트의 성분 x-선 회절 분석 및 SEM을 이용한 표면 관찰

1-1. XRD 분석

수열화 반응을 통하여 수산화아파타이트로 변환된 시료를 곱게 갈아 x-선 회절분석기를 이용하여 성분분석을 수행하였다. 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 분석된 갑오징어 뼈 유래 수산화아파타이트의 피크를 순수 수산화아파타이트의 피크 데이터와 비교하였으며, 대부분의 피크가 수산화아파타이트와 일치함을 확인 하였다.

1-2. 전자 주사 현미경(SEM) 관찰

수열화 반응을 통하여 수산화아파타이트로 변환된 시료의 표면을 전자 주사 현미경(SEM)을 이용하여 관찰하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, CB HAp의 표면에는 균일한 민들레 모양과 같은 미세구조가 많이 형성되어 있음을 확인하였으며, 이러한 미세구조의 형성은 도 1의 x-선 회절분석 결과와 마찬가지로 갑오징어 뼈의 수열화 반응을 통한 수산화아파타이트로의 변환이 성공적으로 이루어졌음을 나타낸다.

실험예 2. SEM을 이용한 피브리노겐이 코팅된 CB HAp의 표면 관찰

상기 실시예 1에서 제조한 피브리노겐이 코팅된 갑오징어 뼈 유래 수산화아파타이트(CB HAp)의 표면을 전자 주사 현미경(SEM)을 사용하여 관찰하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 피브리노겐 단백질이 과립 표면에 흡착되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 고배율 관찰(도 3d)에 나타난 바와 같이 피브리노겐 단백질은 약간 거친 파편 형태로 입자의 표면에 흡착되어 있었다. 단백질 코팅이 동결건조 과정을 거쳐 수행되었기 때문에 흡착 단백질 형태가 거친 파편의 형태로 관찰 된 것으로 생각된다.

실험예 3. 피브리노겐의 코팅율 측정

피브리노겐의 코팅 효율을 측정하기 위하여, 먼저 갑오징어 뼈 유래 수산화아파타이트 과립에 10, 20 및 40 mg/mL의 3가지 피브리노겐 농도로 코팅하여 시료를 준비하였다. 그 다음 준비된 시료 10mg을 0.1 mL 5% SDS, 0.2M NaOH 용액과 혼합한 뒤 24시간 동안 진탕하여 시료로부터 코팅된 단백질을 용출하고, 원심분리한 다음 상층액을 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 정량법을 이용하여 농도를 측정하였으며, 시료의 각 농도에 따른 피브리노겐의 코팅효율(%)을 하기 수학식 1로 산출하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.

[수학식 1]

코팅효율(%) = (측정 단백질 농도/초기 단백질 사용량) × 100

도 4에 나타난 바와 같이, 초기 피브리노겐 농도에 따른 코팅효율은 큰 차이를 보이지 않았다. 이는 코팅을 위한 피브리노겐의 농도에 상관없이 각 과립의 표면에 피브리노겐이 잘 흡착되어 코팅되어 있음을 나타낸다.

실험예 4. 원편광 이색성 분광 측정법(circular dichroism, CD) 분석을 통한 피브리노겐의 코팅에 따른 단백질의 안정성 평가

입자의 표면에 코팅한 피브리노겐에 대한 단백질 안정성을 평가하기 위하여 BCP(biphasic calcium phosphate) 과립을 이용하여, 원편광 이색성 분광 측정법 분석을 수행하였다. CD 분석을 위하여 피브리노겐이 코팅된 입자를 24시간 동안 4℃에서 진탕하여 단백질을 탈착시키고, 0.01 mg/mL 농도에서 CD 194 nm 내지 250 nm 파장에서 패턴을 분석하고, 천연 피브리노겐과 비교하여 구조 변형을 분석하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 이식재에 코팅 후 용출한 피브리노겐 단백질의 곡선은 천연 피브리노겐의 곡선과 비교하여 전반적으로 약간의 곡선 변화를 나타냈으며, 특히 α-helix 구조를 나타내는 220 내지 280nm 범위에서 천연 피브리노겐의 곡선에 비하여 약간 감소하였다. 상기에 나타난 약간의 곡선패턴 변화는 이식재로부터 코팅된 단백질의 용출과정에서의 조건과 용출 후 단백질의 리폴딩 과정에서 야기되는 것이라 생각된다.

실험예 5. 전기영동을 통한 단백질 안정성

입자의 표면에 코팅한 피브리노겐에 대한 단백질 안정성을 평가하기 위하여, BCP(biphasic calcium phosphate) 과립을 이용하여, SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다. SDS-PAGE를 통한 단백질이 분해된 정도를 평가하여 안정성을 분석하기 위해, 피브리노겐이 코팅된 입자를 0.1mL 의 SDS 및 0.2M의 NaOH 용액과 섞어 4시간 동안 진탕하여 단백질을 용출하고, 이를 12 % SDS-PAGE 겔에서 전기영동을 수행하였다. 이를 쿠마시 블루(coomassie blue)로 밴드를 염색하고, 천연 피브리노겐에 대해 밴드의 양상을 비교하여 코팅된 단백질의 안정성을 평가하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 추가적인 SDS PAGE 전기영동의 결과에서 65 kDa, 50 kDa 및 45 kDa 크기 근처에서 주요 3개의 밴드가 관찰되었으며, 이러한 양상은 이식재에 코팅된 피브리노겐 레인에서도 비슷한 양상을 보였다. 인간 유래 피브리노겐은 66 kDa, 52 kDa 및 46 kDa 의 α, β 및 γ 서브유닛으로 구성되었다. 피브리노겐이 분해되면 α, β 및 γ 서브유닛으로부터 잘린 밴드가 보여지며 이러한 분해의 결과로서 그 응집력이 감소한다. 그러나 천연 피브리노겐과 입자표면에 코팅된 피브리노겐이 비슷한 양상을 보이고 있으며, 이러한 결과는 이식재에 코팅된 피브리노겐이 안정적임을 나타낸다.

실험예 6. 피브리노겐의 코팅에 따른 과립의 자가 응집 시험

피브리노겐이 코팅된 갑오징어 뼈 유래 수산화아파타이트 과립의 자가 응집을 시험하기 위하여 트롬빈 용액을 사용하였다. 피브리노겐을 코팅한 과립을 반응 튜브에 넣고 1U/mL 농도의 트롬빈 용액과 혼합 후 자가 응집 현상을 관찰하였다. 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 0 mg/mL의 피브리노겐 농도로 코팅한 입자들은 전혀 응집현상을 보이지 않았으며, 10 mg/mL의 피브리노겐 농도로 코팅한 입자들은 부분 덩어리진 응집 결과를 보였다. 반면 20 mg/mL의 피브리노겐 농도로 코팅한 입자들은 완전한 한 개의 응집체를 형성하였으며, 40 mg/mL의 피브리노겐 농도 역시 20 mg/mL의 피브리노겐 농도의 경우에 비해 큰 차이를 보이지 않았다.

피브리노겐은 트롬빈에 의하여 생체 접착능력을 가진 피브린 단량체로 변환되기 때문에 응집현상을 초래한다. 따라서 CB HAp 과립에 코팅된 피브리노겐이 생체 내에서 자가 응집이 가능한지 알아보기 위하여, 간접적으로 트롬빈을 사용하여 in vitro에서 시료의 응집현상을 관찰하였다. 트롬빈에 의한 각 이식재 입자들은 모두 수십 초 내 에서 응집이 형성되었으며 이러한 결과는 피브리노겐이 코팅된 CB HAp 과립이 환자의 골 결손부에서 스며나오는 혈액과 반응하여 결손부 내에서 응결될 수 있음을 나타낸다. 또한 20 mg/mL 및 40 mg/mL에서는 비슷한 응집 현상이 관찰되었음은 입자의 코팅을 위한 농도로서 20mg/mL의 농도가 입자의 자가 응집을 유도하는데 충분하다는 것을 보여준다. 물론 40mg/mL에서도 충분한 응집이 형성되기는 하지만, 높은 농도의 피브리노겐으로 인한 피브린 겔의 형성은 세포의 이동을 저해하며 세포의 형태에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이 후 피브리노겐의 코팅 효과에 대한 세포의 부착 및 증식 등의 실험에서는 20 mg/mL의 농도로 제조된 실험군을 사용하여 비교 평가하였다.

실험예 7. 피브리노겐이 코팅된 CB HAp 골 이식재가 세포 부착력 및 세포 증식에 미치는 영향 검증

7-1. 세포 부착력 실험

상기 실시예 1에서 제조한 피브리노겐이 코팅된 CB HAp 골이식재의 세포 적합성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

세포 적합성을 평가하기 위하여 조골 세포 주(MG63)를 사용하였다. 세포는 한국 세포주 은행으로부터 구입하여 사용하였다. 배양은 10% FBS(fetal bovine serum)과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

SEM 이미지 촬영을 위해 세포가 배양된 이식재 시료를 PBS 로 3회 세척 후 2.5% 글루타르알데히드 용액(pH 7.4)에서 고정한 후 다시 0.1 % OsO₄ 용액 에서 1시간 반응하여 고정하였다. 이후 시료의 탈수과정을 농도별 에탄올(25%, 50%, 75%, 95% 및 100%)에서 반응하였으며, 건조된 시료를 백금을 이용하여 코팅하고 SEM (JOM-6360, JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, CB HAp의 표면에 몇몇의 세포가 부착되어 자라고 있으며, 그 형태는 세포 본연의 섬유아세포-유사 형태(fibroblastic like morphology)를 보여주고 있다. 이에 반하여 상기 실시예 1에서 제조한 20mg/mL의 농도로 피브리노겐이 코팅된 CB HAp의 표면에서는, 세포가 과립의 거의 모든 표면을 덮고 있으며 세포 본연의 섬유아세포-유사 형태가 관찰되었다. 또한 세포가 코팅된 피브리노겐 단백질과 서로 얽혀 자라고 있었으며, 이러한 세포는 피브리노겐이 코팅되지 않은 CB HAp에 비하여 현저하게 많이 증식되어 있음을 확인하였다.

7-2. 세포 증식 실험 - MTS 어세이

세포의 성장을 측정하기 위하여, 상기 조골 세포(MG63)에 각 시간에 따라 20 ul의 MTS 용액(CellTiter96 ® Aqueous solution kit, Promega)을 첨가한 후, 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 4시간 동안 반응시킨 다음, ELISA leader(SpectraMAX M3, Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 성장율을 측정하였다. 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 피브리노겐 코팅에 따른 CB HAp과립에서의 시간에 따른 세포의 성장은 미토콘드리아 활성에 기초하는 MTS 어세이를 통하여 관찰하였다. 초기 1일째 흡광도는 피브리노겐이 코팅된 입자에서 약간 더 높게 관찰되었으나 P < 0.05 수준에서의 큰 차이는 보이지 않았다. 그러나 배양 5일 후부터 피브리노겐 코팅에 따라 세포의 성장이 유의성 있게 증가함을 보이고 있다. MTS 어세이에 의한 세포의 성장은 배양 1일째에, 비록 현저한 차이는 보이지 않았으나 피브리노겐의 코팅에 의해 약간 높게 나타내고 있다. 이러한 결과는 CB HAp 보다 피브리노겐이 코팅된 CB HAp에서 초기 세포의 부착이 더 높을 수 있음을 제시한다.

바이오소재(Biomaterial)의 표면 거칠기는 세포의 부착 및 증식 등을 유도한다. 따라서 피브리노겐의 코팅에 의한 세포의 부착과 성장의 증가는 아마도 단백질 코팅에 의한 표면적의 증가와 흡착 단백질의 거친 형태 등에 기인된 것이라 생각한다. 또한 Dejana et al의 보고에 의하면, 피브리노겐이 세포의 부착과 퍼짐을 유도한다고 보고하였다. 이는 피브리노겐 코팅에 의한 표면적의 확대와 표면의 거칠기 이외에 피브리노겐 자체의 생물학적 효과로서 세포의 부착과 증식이 증가된 것으로 생각된다.

실험예 8. 피브리노겐이 코팅된 CB HAp 골 이식재가 토끼 두개골 결손부 이식을 통한 뼈 형성능에 미치는 영향 검증

본 발명의 피브리노겐이 코팅된 CB HAp 골 이식재가 토끼 두개골 결손부 이식을 통한 뼈 형성능에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험동물로는 수컷 토끼(New Zealand White male rabbit, 무게: 생후 3개월 이상 된 2.5~3.0 kg)를 사용하였다. 실험동물에 케타민(Ketamine)-HCl (35 mg/kg; Yuhan, Seoul, Korea)과 자일라진(Xylazine) (5mg/kg; Bayer Korea, Seoul, Korea)을 근육주사 하여 전신 마취를 유도한 후, 조심스럽게 두개골 부위의 털을 제거한 뒤 두개부 수술 부위를 포비돈 요오드(povidone iodine)로 소독하였다. 2% 리도카인(lidocaine)으로 침윤 마취한 후, 전두골의 전방에서 후방부에 이르기까지 중앙부를 따라 약 5cm의 두피를 절개한 후 골막(periosteum)을 박리하여 전두골과 두정골을 노출시켰다. 두개골에 8 mm 골편 채취기(trephine bur)를 이용하여 뇌경막에 손상을 주지 않도록 주의하면서 3개의 원형 골 결손부를 형성하였다. 각 두개골 결손부에 각 이식재를 이식하였다. 결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, 이식 과정에서 CB HAp는 취급이 쉽지 않아 일부의 이식재가 이탈되었다. 반면 피브리노겐이 코팅된 CB HAp는 이식된 결손부에서 자가혈액과 반응하여 수십 초 내에 응집이 형성되어 비교적 쉽게 이식이 행하여졌다.

이식 후 골막과 피하조직은 흡수성 봉합사 (5-0 Vicryl TM, Ethicon, Somerville, NJ, USA)로 봉합하고, 두피는 4-0 Nylon (4-0 Ethilon TM, Johnson & Johnson, Edinburgh, UK)으로 봉합하였다. 수술 후 일주일 간 항상제 Gentamicin (0.1 mg/kg, Dae Sung MIcrob, Korea)를 근육 내로 주사하였으며, 수술 2주 후에 펜토바비탈(phentobarbital) 100 mg/kg을 정맥 내 주사하여 희생시킨 다음 결손부를 포함한 두개골 절편을 획득하였다. 모든 조직 절편은 분석 수행 전에 4% 파라포름알데히드 인산염 완충액(pH 7.2)으로 일주일 동안 고정하였다.

고정이 끝난 시편들은 8% 염산/포름산 (8% HCl: 8% Formic acid = 1:1) 혼합 용액에서 5일간 탈회시킨 후 통상적인 방법에 따라 파라핀 조직 포매하였다. 표본을 5㎛(HM 315; Microme, Walldorf, Germany) 두께로 절삭하였고, 시편의 정중앙 부위를 선택하여 매 5장마다 1장씩 무작위로 취하여 H&E(Hematoxylin and eosin) 염색 후 광학현미경으로 조직학적 관찰을 수행하였다.

이하, 실험예 8-1 내지 8-3의 경우, (1) 음성대조군(empty): 이식재를 넣지 않은 군, (2) CB HAp군: 갑오징어 뼈 유래 수산화아파타이트군, (3) 피브리노겐이 코팅된 CB HAp군: 피브리노겐이 코팅된 갑오징어 뼈 유래 수산화아파타이트군을 이식하였으며, 실험예 8-4 내지 8-5의 경우, (1) HAp군: 기존 HAp군(Dio Co., Korea), (2) CB HAp군: 갑오징어 뼈 유래 수산화아파타이트군을 이식하였다.

8-1. 조직학적 생체 융합 및 골형성 관찰 (음성대조군, CB HAp군 및 피브리노겐이 코팅된 CB HAp군)

이식 2주 후, 조직학적 생체 융합 및 골형성 관찰 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, 이식 2주 후 음성대조군의 결손 경계부에서 미약한 신생골이 관찰되었으며, 성긴 결합 조직과 함께 만성 침윤성 염증세포가 관찰되었다. CB HAp군의 결손 경계부에서 음성대조군에 비해 발달된 신생골이 관찰되었으나, 결손부 경계부와 이식재간의 불완전한 밀착으로 신생골을 포함한 결손부 경계부와 이식재간의 이격된 공간(arrow)이 관찰되었다. 그러나 골 결손부의 중앙부에서 CB HAp 과립 주위를 중심으로 현저하게 발달된 신생골을 관찰할 수 있었다. 피브리노겐이 코팅된 CB HAp군의 골결손 경계부와 이식재간의 이격없이 밀착된 결손부 경계부에서 신생골이 가장 현저하게 발달되었으며, 중앙부 역시 CB HAp 과립 주위에서 골이 형성되는 것을 관찰할 수 있었다.

8-2. 골결손 경계부에서 조직학적 골형성 관찰 (음성대조군, CB HAp군 및 피브리노겐이 코팅된 CB HAp군)

이식 2주 후, 골결손 경계부에서 조직학적 골형성 관찰 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타난 바와 같이, 음성대조군에서 많은 만성 염증성 세포의 침윤이 관찰되었으나, 이식재를 이식한 모든 군의 결손 경계부위에서 특이 염증세포의 과발현 없이 풍부한 신생혈관과 함께 CB HAp 과립 주위에 뚜렷한 신생골이 관찰되었다. 피브리노겐이 코팅된 CB HAp 군에서 가장 발달된 신생골이 관찰되었으며, 결손 경계부와의 골융합이 활발하게 진행되고 있음을 볼 수 있다. 또한, CB HAp 이식재 주변을 완전하게 둘러싸고 있는 신생골이 보여지며 일부 골수강의 형태를 보이고 있는 성숙골이 관찰되었다.

8-3. 골결손 중앙부에서 조직학적 골형성 관찰 (음성대조군, CB HAp군 및 피브리노겐이 코팅된 CB HAp군)

이식 2주 후, 골결손 중앙부에서 조직학적 골형성 관찰 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타난 바와 같이, 모든 이식재군의 결손부 중앙부위에서 결손 경계부와 마찬가지로 음성대조군에 비하여 특이 염증소견 없이 CB HAp 입자 주위의 1 내지 2층의 입방 형태 또는 타원 형태의 세포가 더욱 뚜렷하게 관찰되었고, 풍부한 신생 혈관과 규칙적으로 배열된 섬유성 결합조직의 발달을 관찰할 수 있었다. 특히, 피브리노겐이 코팅된 CB HAp 군에서 가장 조밀한 섬유성 결합조직이 관찰되었고, CB HAp 과립 주위의 미약한 미성숙 신생골과 그 주위의 조골세포(osteoblast)를 볼 수 있었다. CB HAp군에서 가장 발달된 미성숙 또는 일부 성숙 신생골이 관찰되었다.

8-4. 골결손 경계부에서 조직학적 골형성 관찰 (단독 HAp군 및 CB HAp군)

이식 2주 후, 골결손 경계부에서 조직학적 골형성 관찰 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타난 바와 같이, 단독 HAp (DIo Co., Kore) 대조군에서 결손 경계부에서 신생골은 이식재 주위에서 미약하게 관찰되었으며 성긴결합조직 내에 신생혈관이 만성 염증성 세포의 침윤과 함께 관찰되었다. 그러나, CB HAp 실험군에서는 특이 염증세포의 과발현 없이 풍부한 신생혈관과 함께 결손 경계부의 CB HAp 과립 주위에 뚜렷한 신생골이 관찰되었다.

8-5. 골결손 중앙부에서 조직학적 골형성 관찰 (단독 HAp군 및 CB HAp군)

이식 2주 후, 골결손 중앙부에서 조직학적 골형성 관찰 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타난 바와 같이, 모든 CB HAp 실험군의 결손부 중앙부위에서 결손 경계부와 마찬가지로 단독 HAp(DIo Co., Kore) 대조군에 비하여 특이 염증소견 없이 CB HAp 입자 주위의 1 내지 2층의 입방 형태 또는 타원 형태의 세포가 더욱 뚜렷하게 관찰되었고, 규칙적으로 배열된 섬유성 결합조직 내 풍부한 신생 혈관과 CB HAp 과립 주위의 많은 미성숙 신생골을 볼 수 있었다. 단독 HAp 대조군에서는 이식재 주위의 미약한 신생골과 섬유성결합조직이 이식재를 둘러싼 형태를 보이고 있으며 골모세포가 이식재 주위에서 드물게 관찰되었다.

이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 피브리노겐이 코팅된 골 재생용 조성물은 세포 표면에 균일성 있게 흡착되며, 세포의 부착 및 성장을 촉진하고, 생체에 이식하였을 때, 일반 골 이식재에 비하여, 염증반응 없이 골 결손 경계부에서부터 중앙부에 이르기까지 골 재형성을 현저하게 증가시키는 우수한 효과를 가지고 있어, 골 이식재, 골 충진재 등으로 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.

Claims (13)

1. 피브리노겐이 코팅된, 갑오징어 뼈로부터 형성된 수산화아파타이트(HAp) 골분말을 유효성분으로 포함하는 골 재생용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 1) 갑오징어 뼈를 절단한 후, 염기성 용매에 가하고 20 내지 30시간 동안 150 내지 300℃에서 수열화 반응을 수행하는 단계;
   2) 상기 1)단계의 수열화 반응된 갑오징어 뼈를 1차 열처리 및 2차 열처리를 수행한 뒤, 분쇄하여 골 분말 과립을 제조하는 단계; 및
   3) 상기 2)단계에서 제조된 골 분말 과립을 피브리노겐 단백질이 용해된 PBS 용액과 혼합하여 반응시키고 동결건조하여 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 제조하는 단계;
   를 포함하는, 피브리노겐이 코팅된 골 분말을 유효성분으로 포함하는 골 재생용 조성물의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 1)단계에서 염기성 용매는 수산화 암모늄 용액 또는 H₃PO₄인 것을 특징으로 하는, 골 재생용 조성물의 제조방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 2)단계에서 1차 열처리는 승온속도 1℃/분으로 500 내지 700℃까지 올린 후, 1 내지 2시간 동안 유지하는 것을 특징으로 하는, 골 재생용 조성물의 제조방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 2)단계에서 2차 열처리는 승온속도 1 내지 5℃/분으로 800 내지 1400℃까지 올린 후, 1 내지 2시간 동안 유지하는 것을 특징으로 하는, 골 재생용 조성물의 제조방법.
10. 제6항에 있어서, 상기 3)단계에서 피브리노겐 단백질이 용해된 PBS 용액은 피브리노겐 단백질을 PBS 완충액에 0.01 내지 1000mg/ml의 농도로 용해시켜 제조된 것을 특징으로 하는, 골 재생용 조성물의 제조방법.
11. 제6항에 있어서, 상기 3)단계에서 골 분말 과립 1g당, 피브리노겐 단백질이 용해된 PBS 용액을 0.1 내지 5ml의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 골 재생용 조성물의 제조방법.
12. 제1항의 골 재생용 조성물을 포함하는 골 이식재.
13. 제1항의 골 재생용 조성물을 포함하는 골 충진재.
    
    
    
    

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