KR101574646B1 - 나노 하이드록시아파타이트 표면처리 기술을 이용하여 세포부착 및 골형성 능력이 우수한 이종골 이식재를 제조하는 방법 및 이에 의하여 제조된 이종골 이식재 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나노 하이드록시아파타이트 표면처리 기술을 이용하여 세포부착 및 골형성 능력이 우수한 이종골 이식재를 제조하는 방법 및 이에 의하여 제조된 이종골 이식재에 관한 것이다. 본 발명은 동물뼈 분말의 입자의 표면에 하이드록시아파타이트 층을 형성하는 특징으로 한다. 본 발명에 의하면 세포 부착 및 골 형성 능력이 우수한 돼지 유래 골 이식재를 제조할 수 있다.

Description

나노 하이드록시아파타이트 표면처리 기술을 이용하여 세포부착 및 골형성 능력이 우수한 이종골 이식재를 제조하는 방법 및 이에 의하여 제조된 이종골 이식재{a method for preparing a porcine bone graft with an excellent performance in cell adhesion and bone formation using nano hydroxyapatite surface modification technology, and a porcine bone graft prepared thereby}

본 발명은 나노 하이드록시아파타이트 표면처리 기술을 이용하여 세포부착 및 골형성 능력이 우수한 이종골 이식재를 제조하는 방법 및 이에 의하여 제조된 이종골 이식재에 관한 것이다.

치아의 상실은 저작기능의 손상뿐 아니라 치조골과 잇몸을 점진적으로 흡수시켜 임플란트 식립과 보철물 제작을 어렵게 한다. 염증, 외상, 신생물 등으로 인해 치조골이 파괴되거나 흡수되는 경우에는 신체의 다른 부위에 존재하는 골과는 다르게 원래의 형태로 재생시키는 것은 거의 불가능하다.

이를 회복하기 위해서 흡수된 치조제와 골내낭을 평가하여 골의 재생이 어려운 경우에는 골을 형성하는 능력이 우수한 골 이식재를 사용하거나 자가골을 혼합하고, 골 재생이 비교적 쉬울 것으로 판단되는 경우에는 골전도능을 지닌 비자가골 골 이식재를 이식하기도 한다.

또한 이식부의 평가뿐만 아니라 환자마다 골치유 능력이 상이하므로, 고령 혹은 골성 치유를 방해하는 전신조건이나 질환이 있는 경우에는 골 이식술을 회피하거나, 골 이식재와 수술방법의 선택에 있어 신중을 기한다.

최근 연구에서는 자가골과 이종골을 혼합하여 사용하는 경우 자가골의 비율이 높으면 신생골 형성을 더 유도하지 않는다는 보고가 있어, 임상영역에서 자가골은 빠르게 대체 이식재로 변화하고 있다.

현재 임상에서 널리 사용되는 골 이식재의 원료는 소 유래 골 이식재이지만 대체물질로 말과 돼지의 골이 사용이 시도되고 있다. 소 유래 골 이식재는 탈단백과 항원제거 과정을 거쳐 안정성이 입증되었지만, 광우병에 대한 일반인들의 인식으로 다른 이종골의 대한 요구가 지속적으로 제기되어 왔다. 그 중 돼지는 인간과 신체조직이 유사하여 돼지의 장기와 조직을 원료로 하는 이식재가 활발하게 사용되고 있다.

최근의 연구에서 돼지의 유전체는 완전하게 해독되어 인간의 유전체와 매우 유사하다고 보고되었으며, 비만이나 당뇨, 알츠하이머병 등 질병을 일으키는 유전자 변이도 돼지와 인간이 112개나 공유하고 있어 교원질의 추출, 차폐막의 원료, 인공피부와 이식재의 원료뿐만 아니라 사람 대신 돼지를 대상으로 여러 실험이 진행되고 있다.

또한 소와 말에 비해 세대가 짧고 청결한 사육환경에서 사육할 수 있고, 광우병과 같은 인수 공통 감염질환이 없거나 이를 제거할 수 있다는 것은 조직공학의 원료동물로서의 돼지의 또 다른 장점이다. 조직공학의 여러 영역에서 원료로서의 돼지 조직과 장기의 사용은 소 유래 골 이식재의 안전한 대안이 될 수 있다.

이상적인 골 이식재는 얻기 쉽고, 생체 내에서 거부반응 없이 골 전도와 골 유도 능력을 보이며, 골이 형성된 후에는 골 이식재가 흡수되어 골 주위의 다양한 생리적 작용에 반응할 수 있는 원래의 골조직으로 대체되어야 하지만, 실제로 이와 같은 골 이식재는 존재하지 않는다.

골조직은 경조직이지만 계속적인 개조를 통해 주위환경에 반응하고 우리 몸의 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 하므로 골 이식재를 통해 단순하게 골의 구조를 유사하게 만드는 것을 넘어 궁극의 골조직을 재생시키는 이식재에 대한 개발은 계속되고 있다.

이를 위해 골을 구성하고 있는 유기질, 무기질을 분석하여 골 이식재를 고안하거나, 직접 골 형성을 유도하는 신호전달물질을 적용하는 여러 조직공학적 노력이 있다.

현재 무기질 성분으로 가장 활발하게 연구되고 있는 것은 치아와 골의 중요한 무기질 성분인 수산화인회석으로 많은 골 이식재의 주성분으로 사용되고 있다.

골 이식재는 기원에 따라 합성골, 동종골, 이종골, 자가골로 구분되는데, 대부분의 합성골과 이종골은 수산화인회석을 주성분으로 하고 이식재의 크기와 미세구조가 다르기 때문에 골형성 능력을 향상시키기 위하여 여러 성분을 함께 사용하고 있다.

특히, 수산화 인회석은 생체 내에서 흡수가 거의 일어나지 않거나 일부 이식재에서는 골을 유도하지 않고 충전물로만 존재하는 경우가 있어 흡수속도를 조절하고 신생골을 유도하기 위해 구조, 조성, 결정형 등을 변화시키기 위한 다양한 처리방법이 연구되고 있다.

합성골의 경우 수산화인회석의 흡수속도를 조절하기 위해 수산화칼슘을 첨가하거나 골구조에 관찰되는 골소주와 다공성의 구조를 부여하기 위한 과정을 추가하고 있다.

골 이식재는 기원이 같더라도 제조사마다 다른 온도에서 소성을 하거나 부가적인 과정을 첨가한다면, 이식재의 골 형성 능력과 반응은 완전히 달라지며 골 이식재의 재생능력 또한 달라질 수 있다.

이종골의 고온처리는 항원을 지니고 있는 단백성분을 제거하기 위해 처음 고안되었으며, 300℃ 근처에서의 열처리를 함으로써 이종골의 유기질 성분을 제거하되 원래 골이 가지고 있던 무기질 성분의 비율과 구조를 유지하는 장점을 가진다.

그러나 더 높은 고온에서의 이식재의 처리는 쉽게 유기물을 제거할 수 있지만 골 자체의 칼슘과 인의 비율 변화 및 구조의 변화가 발생할 수 있기 때문에 소성온도와 소성시간이 핵심이다.

또 다른 노력으로는, 이식재의 표면 형태를 변화시켜 골 관련세포의 부착을 촉진시키고자 하고 있는데, 산을 이용하여 표면거칠기(조도)를 증가시키는 방법은 임플란트에서 흔히 사용된다.

표면 거칠기는 산의 종류, 농도, 온도 그리고 시간에 영향을 받는데, 일반적으로 너무 강한 산처리는 골의 강도를 약화시키고, 표면에 산성 물질이 잔류하여 조직재생에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.

최근에는 플라즈마를 이용한 이식재의 표면처리가 연구되고 있는데, 플라즈마는 이온상태의 매우 높은 온도의 기체로 그 온도 하에서는 물질이 중성 상태로 존재하는 것이 불안정하게 되어 이온을 만들게 된다.

이때 많은 양의 빛 에너지와 열 에너지를 방출하게 되고 또한 지속적인 화학 반응을 일으킨다.

공업적으로 활발하게 이용되고 있는 플라즈마는 저온 글로우 방전 플라즈마로 에칭, 금속과 고분자물질의 표면처리, 신물질의 합성에 이용되고 있다.

플라즈마 에칭은 재료의 성질을 제거, 증발시켜 표면영역을 확장시키는 것으로 물질의 접착력을 증가시키는데 응용되고 있다. 산을 이용하는 에칭과 달리 생체에 독성을 일으키는 물질이 잔존하지 않는다.

대한민국 공개특허공보 제10-2012-0109882호(2012.10.09)

본 발명은 나노 하이드록시아파타이트 표면처리 기술을 이용하여 세포부착 및 골형성 능력이 우수한 이종골 이식재를 제조하는 방법 및 이에 의하여 제조된 이종골 이식재를 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면은, 동물뼈 분말을 마련하는 단계 및 동물뼈 분말의 입자 표면에 하이드록시아파타이트 층을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이종골 이식재를 제조하는 방법일 수 있다.

본 측면에서, 동물뼈로는 돈골(豚骨,pig bone)을 사용할 수 있다.

본 측면에서, 동물뼈 분말의 입자 표면에 하이드록시아파타이트 층을 형성하는 단계는, 유동층 코팅법에 의하여 수행될 수 있다.

본 측면에서, 유동층 코팅법은, 동물뼈 분말의 입자에 하이드록시아파타이트 나노입자가 함유된 수용액을 분무하는 공정을 포함할 수 있다.

본 측면에서, 동물뼈 분말의 입자는 평균입경이 0.25~1.0mm 인 것을 사용할 수 있다.

본 측면에서, 하이드록시아파타이트 나노입자는 평균입경이 10~100nm 인 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 방법에 따라 제조된 이종골 이식재일 수 있다.

본 발명에 의하면, 세포부착 및 골형성 능력이 우수한 이종골 이식재를 제조할 수 있다.

본 발명에 의하면, 동물뼈 분말의 입자에 하이드록시아파타이트 나노입자를 물리적으로 부착하는데 있어 유동층 코팅법을 이용함으로써 플라즈마 에칭법을 사용하는 경우보다 부착 수율 및 커버리지 밀도에 높다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 이종골 이식재의 제조공정을 개략적으로 나타낸 공정도이다.
도 2는 실시예 1 및 비교예에 따른 골 이식재에 대한 젖음성(wettability) 시험 결과이다.
도 3은 실시예 1 및 비교예에 따른 골 이식재에 대한 투과전자현미경 사진이다(도 3a: 실시예 1, 도 3b: 비교예).
도 4는 실시예 1 및 비교예에 따른 골 이식재에 대한 2차원 AFM 이미지이다(도 4a: 비교예, 도 4b: 실시예 1).
도 5는 실시예 1 및 비교예에 따른 골 이식재에 대한 3차원 AFM 이미지이다(도 4a: 비교예, 도 4b: 실시예 1).
도 6은 실시예 1 및 비교예에 따른 골 이식재에 대한 인비트로(in-vitro) 시험결과이다.
도 7은 실시예 1 및 비교예에 따른 골 이식재에 대한 세포 부착력 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 비교예의 소 유래 골 이식재를 이식한 경우의 조직사진이다(도 8a: 4주 경과, 도 8b: 8주 경과).
도 9는 실시예 1의 돼지 유래 골 이식재를 이식한 경우의 조직사진이다(도 9a: 4주 경과, 도 9b: 8주 경과).
도 10은 실시예 2의 돼지 유래 골 이식재를 이식한 경우의 조직사진이다(도 10a: 4주 경과, 도 10b: 8주 경과).
도 11은 실시예 3의 돼지 유래 골 이식재를 이식한 경우의 조직사진이다(도 11a: 4주 경과, 도 11b: 8주 경과).

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 측면들에 대하여 설명한다. 다만, 본 발명의 측면들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 도면에서의 요소들의 형상 및 크기 등은 보다 명확한 설명을 위해 과장될 수 있으며, 도면상의 동일한 부호로 표시되는 요소는 동일한 요소이다.

본 발명은 세포부착 및 골형성 능력이 우수한 이종골 이식재의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 이종골 이식재에 관한 것이다. 도 1에는 본 발명에 따른 이종골 이식재의 제조공정을 개략적으로 나타내었다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 일 측면은, 동물뼈 분말을 마련하는 단계(S1), 및 동물뼈 분말의 입자의 표면에 하이드록시아파타이트(hydroxy apatite) 층을 형성하는 단계(S2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 이종골 이식재의 제조방법일 수 있다.

먼저, 동물뼈 분말을 마련할 수 있다(S1). 동물뼈로는 돈골(豚骨,pig bone)을 사용하는 것이 바람직하다. 돈골은 광우병의 전염위험이 없으며, 우골과 동일한 가공 과정을 거쳐 골 이식재로 사용할 수 있다.

예를 들어, 돈골을 강알칼리 처리 후, 300℃에서 15시간 이상 열처리 과정과 유기용매를 이용한 부가적인 처리과정 후 감마선 멸균 처리한 후에 골 이식재로 사용할 수 있다.

돈골을 절단한 후 혈액을 제거하고 이어서 돈골을 분쇄하고, 분쇄된 돈골에서 지방질과 단백질을 유기용매를 이용하여 제거하고, 이를 열처리하여 지질과 단백질을 완전히 제거한 후, 체로 선별하여 돈골 분말을 얻을 수 있다. 돈골 분말의 입자의 평균입경은 0.25~1.0mm 인 것이 바람직하다.

다음으로, 동물뼈 분말의 입자의 표면에 하이드록시아파타이트 층을 형성할 수 있다(S2). 예를 들어, 돈골 분말의 입자의 표면에 하이드록시아파타이트 나노입자를 코팅하여 하이드록시아파타이트 층을 형성할 수 있다.

돈골 분말의 입자의 표면에 하이드록시아파타이트 나노입자를 코팅하는 방법으로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 유동층 코팅법을 이용할 수 있다.

유동층 코팅법은 열 및 물질 전달 특성이 우수하고, 온도 균질성이 우수하며, 또한 혼합 특성이 우수하기 때문에 많은 산업분야에서 널리 사용된다. 입자의 크기가 다르면 그에 따라 유동화 거동도 현저하게 달라지며, 특히 나노 입자의 경우에는 특이한 흐름성 및 분산성을 가진다.

코팅 유동층 반응기(CFBR; coated fluidized bed reactor)는 화학적 약학, 음식, 화장품 등 많은 분야에 응용할 수 있다. 기존 유동층 반응기는 높은 가스 속도에서 작동하기 어렵고, 높은 가스 속도에서의 작동시키면 거대한 버블 또는 슬러그가 형성될 수도 있으며, 입자들을 균일하게 유동화시키기 어렵다는 점 등 몇 가지 제한이 있었다.

유동층 반응기 내에 동물뼈, 바람직하게는 돈골 분말의 입자들에 의하여 형성된 유동층에 하이드록시아파타이트 나노입자를 포함하는 수용액을 분무함으로써, 동물뼈 분말의 입자의 표면에 하이드록시아파타이트 나노입자 층을 형성할 수 있다.

동물뼈 분말의 입자의 표면에 하이드록시아파타이트 층이 형성되면 표면 조도(roughness)가 증가하고, 표면 조도가 증가하면 세포가 더욱 쉽게 부착할 수 있어, 세포 부착 능력이 향상된다.

하이드록시아파타이트 나노입자로는 평균입경이 10~100nm 인 것을 사용할 수 있다. 나노입자는 나노미터 스케일의 크기를 가지는 입자를 의미한다. 나노입자는 부피 대비 표면적 비율이 매우 높다. 또한 나노입자는 특이한 흐름성 및 분산성을 가진다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 방법에 따라 제조된 이종골 이식재일 수 있다. 골 이식재의 입자크기는 0.25-1.0mm 가 바람직하다. 이는 치주질환의 골 결손부와 임플란트를 위한 골 이식재로 가장 많이 사용되는 입자크기이다.

입자형 이식재는 다양한 골 결손부에 대응할 수 있어 사용이 활발한데, 상기 범위보다 크면 골화와 이식재 흡수에 부정적인 영향을 미치며, 상기 범위보다 작으면 골을 형성시키지 못하고 빠르게 흡수되거나, 골을 형성하기 위한 공간을 부여할 수 없다는 단점이 있다.

이하에서는 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

<실시예 1>

먼저, 한국산 돈골을 정부로부터 승인 받은 도축장과 가공 공장을 통해서 구입해 15 x 15mm 정도의 크기로 절단 후 11 시간 동안 80 % 의 에틸 알코올과 40 % 과산화수소를 처리하여 유기물을 제거하였다.

유기물을 제거한 돈골 조각은 증류수로 5회 세척하고, 120 ℃ 에서 20 시간 동안 건조시킨 다음, 남아 있는 콜라겐과 유기물을 제거하기 위하여 산소 분위기 로(oxygen atmosphere box furnace)를 이용하여 600℃ 에서 열처리한 후 돈골 조각을 분쇄기로 분쇄하여 평균 입경이 0.6 mm 인 돈골 분말을 준비하였다.

다음으로, 농도가 5% 인 하이드록시아파타이트 나노입자 수용액을 준비하였다. 여기서 하이드록시아파타이트 나노입자(SHAp, SofSera INC., Japan)의 평균 입경은 50 nm 이었다.

다음으로, 돈골 분말을 유동층 반응기의 원통형 공기분배기(air distributor)에 투입하였다.

다음으로, 공기분배기를 회전시켜 유동화 공기(fluidization air)를 공급하였다. 고체 부피 분율 0.0077 에서 최소 유동화 속도는 약 0.0115 m/s 로 하였다.

상기 파라미터는 코팅 유동층 반응기(CFBR, coated fluidized bed reactor, Incotek INC)를 이용하여 흄 나노하이드록시아파타이트(fumed hydroxy appatite nanoparticles)를 가지는 유동층 반응기의 유체역학을 모델링하여 결정하였다. 유동화 공정에서는 거대 버블이 발생하지 않았다.

다음으로, 이원 노즐을 이용하여 상기 하이드록시아파타이트 나노입자 수용액을 돈골 분말로 형성된 유동층에 분무하였다.

다음으로, 분무 후 80℃ 에서 1시간 동안 건조하여 하이드록시아파타이트 나노입자로 코팅된 돼지 유래 골 이식재를 얻었다.

<실시예 2>

실시예 1에 따라 제작한 돼지 유래 골 이식재를 10℃/min의 승온율로 가열하여 800℃에서 20시간 동안 유지하여 열처리하였다.

<실시예 3>

실시예 1에 따라 제작한 돼지 유래 골 이식재를 100W의 RF전력으로 O₂가스를 80~120 sccm 흘려주면서30분간 플라즈마 에칭 처리하였다.

<비교예>

우골(소뼈)을 강알칼리 처리하고, 350 ℃에서 15시간 열처리한 후 유기용매를 이용하여 처리하고, 그 다음 감마선 멸균 처리하여 소 유래 골 이식재를 준비하였다.

<젖음성(wettability)>

실시예1에 따른 돼지 유래 골 이식재와 비교예에 따른 소 유래 골 이식재에 대하여 젖음성을 평가하였다. 구체적으로는 각 이식재 분말을 agarose gel slot 에 1.0g씩 충진하고 1000배로 희석된 Methylene Blue trihydrate 용액에 담근 후 용액이 스며드는 속도를 비교하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서, 시편의 좌측 칼럼은 비교예의 골 이식재를 충진한 것이고, 우측 칼럼에는 실시예 1의 골 이식재를 충진한 것이다. 도 2를 참조하면, 실시예1 에 따른 돼지 유래 골 이식재의 젖음성이 더 우수함을 확인할 수 있다.

<미세조직 관찰>

실시예 1에 따른 돼지 유래 골 이식재와 비교예에 따른 소 유래 골 이식재에 대하여 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다(도 3a: 실시예 1, 도 3b: 비교예).

도 3을 참조하면, 실시예 1에 따른 돼지 유래 골 이식재와 비교예에 따른 소 유래 골 이식재의 표면에는 별다른 차이가 없음을 확인할 수 있다. 즉 실시예 1의 돼지 유래 골 이식재는 비교예의 소 유래 골 이식재와 비교하여 표면 상태가 전혀 뒤떨어지지 않는다는 점을 확인할 수 있다.

<조도(roughness)>

실시예 1에 따른 돼지 유래 골 이식재와 비교예에 따른 소 유래 골 이식재에 대하여 AFM(Atomic Force Microscope)을 이용하여 표면조도를 측정하였다.

비교예의 소 유래 골 이식재의 경우 조도(Rz)가 1.365 ㎛ 이고, 실시예 1의 돼지 유래 골 이식재의 경우 조도(Rz)가 4.47 ㎛ 로서, 실시예 1의 경우 표면조도가 현저하게 컸다.

또한, 입자 표면의 거칠기 분석을 위한 3D nanotomography 이미지를 도 5에 나타내었다(도 5a: 비교예, 도 5b: 실시예 1). 도 5를 참조하면, 비교예의 소 유래 골 이식재보다 실시예 1의 돼지 유래 골 이식재가 표면이 더 거칠다는 점을 확인할 수 있다.

또한, Ultramicrotome을 이용하여 절단한 microparticle borders의 2D AFM 이미지를 도 4에 나타내었는데(도 4a: 비교예, 도 4b: 실시예 1), 실시예 1이 비교예보다 입자의 표면이 더 거칠다는 점을 다시 한번 확인할 수 있다.

<인 비트로(in-vitro) 시험>

비교예의 소 유래 골 이식재와 실시예 1의 돼지 유래 골 이식재를 각각 3일, 7일, 14일 동안 인체유사체액(SBF; stimulated body fluid)에 침지한 후 질량 변화량을 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 14일 경과 후의 질량 증가율이 비교예의 소 유래 골 이식재의 경우 13.43 % 이고, 실시예 1의 돼지 유래 골 이식재의 경우 23.61 % 이었다. 실시예 1의 돼지 유래 골 이식재의 경우가 질량 증가율이 높고, 세포 증식 특성이 더 우수하다는 점을 확인할 수 있다.

<세포 부착 시험 (cell adhesion test)>

실시예 1의 돼지 유래 골 이식재, 비교예의 소 유래 골 이식재에 대하여 세포 부착 시험(MC4 adhesion Test)을 실시하였다. 시험 결과를 도 7에 나타내었다(A: 비교예의 소 유래 골 이식재, B: 플라즈마 에칭 처리한 돼지 유래 골 이식재, C: 실시예 1의 돼지 유래 골 이식재).

도 7을 참조하면, A 와 B를 비교하면 유의한 차이가 있으나, A 와 C를 비교하면 유의한 차이가 없으며, B 와 C를 비교하면 유의한 차이가 있다.

<동물실험>

1) 골 결손부 형성과 골 이식재의 적용

뉴질랜드 백토 31마리를 무작위로 선택하여 경골 근위부의 내측에 골 결손부를 형성한 후, 비교예, 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3에 따른 돼지 유래 골 이식재를 결손부에 각각 주입하였다.

구체적으로, 마취제인 졸레틸(Zoletil®)을 근육주사하여 마취를 유도한 후 두개골 골정에 통증조절과 출혈조절을 위해 에피네프린이 함유된 리도카인을 주사하였다.

두개골정은 제모 후 소독제를 노출된 피부를 소독하여 멸균된 공포로 수술부위를 격리하였다. 15번 수술도로 두개골정을 덮고 있는 피부와 골막을 좌우로 나누고 골막이 손상되지 않게 박리한 후 전층판막을 두개관이 넓게 노출될 수 있도록 확장하였으며, 노출된 두개관은 탈수되지 않도록 생리식염수로 적용하였다.

두개관에 원통형 모양의 관통형 골 결손부를 형성하기 위해 직경 4mm 원통형 회전 절삭바를 사용하였다. 회전기구는 치과용 저속핸드피스 이용하여 냉각수를 주수하면서 사용하였다.

골 결손부는 두개정 골정봉합을 중심으로 좌우에 각각 2개씩 형성하였으며, 치유과정 중에 서로 영향을 받지 않게 위해 결손부 간의 거리는 최대한 이격하였다.

관통형 골 결손부 형성 도중 두개골의 뇌경막이 손상되지 않도록 하였으며, 출혈이 지속되는 경우 압박하여 지혈을 확인한 후 골 이식재를 삽입하였다.

골 이식재는 골 결손부 내부로 한정하여 과충전되지 않도록 이식하였으며, 골막이 골 결손부를 덮게 하여 5-0 Monosof(Covidien Syneture, USA)으로 봉합하였다. 실험동물은 수술 후 감염을 예방하기 위해 2일 동안 Enrofloxacin(Baytril, Bayer) 0.2ml/kg 을 하루 1회 근주하였다.

2) 조직학적 분석

골 이식 수술 후 4주, 8주 후 골 이식부가 포함된 두개관을 채취하여 중성 포르말린 용액에 고정한 후 formic acid-sodium citrate 방법으로 탈회하여 조직 절편을 준비하고, Masson Trichrome 염색하여 광학현미경(CX21, Olympus, Japan)으로 관찰하였다.

도 8에는 비교예의 소 유래 골 이식재를 이식한 경우(도 8a: 4주 경과, 도 8b: 8주 경과), 도 9에는 실시예 1의 돼지 유래 골 이식재를 이식한 경우(도 9a: 4주 경과, 도 9b: 8주 경과), 도 10에는 실시예 2의 돼지 유래 골 이식재를 이식한 경우(도 10a: 4주 경과, 도 10b: 8주 경과), 도 11에는 실시예 3의 돼지 유래 골 이식재를 이식한 경우(도 11a: 4주 경과, 도 11b: 8주 경과)에 대한 조직사진을 각각 나타내었다.

도 8내지 도 11을 참조하면, 모든 실험군에서 이식골이나 신생골 이식 후 이식재 주변에 뚜렷한 염증세포의 침윤이나 이물 거대세포가 형성되지 않아 우골과 돈골 모두 생물학적 적합성을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 골 결손부 내의 이식재의 분포는 모든 이식재에서 골 결손부 내에 비교적 균일하게 분포되었지만, 이식재의 크기와 밀도가 각기 상이하였다. 실시예 3에 따른 골 이식재를 이식한 경우 다른 3가지 경우와 비하여 이식재 단일입자의 크기가 작아 결손부에 보다 치밀하게 배열되어 있으며, 이식재 사이의 간극도 좁아 얇은 결체조직의 섬유가 이식재를 감싸고 있음을 확인할 수 있다.

또한, 4주와 8주 조직소견에서 골 이식재마다 입자의 크기는 다양하지만, 골 결손부내의 공간과 형태는 적절하게 유지하고 있으며, 신생골 형성을 위한 공간을 충분하게 부여하고 있음을 확인할 수 있다.

3) 조직계측학적 분석

광학현미경으로 촬영한 조직사진을 영상분석 프로그램(imageJ, USA)을 이용하여, 4mm 골 결손부의 변연을 기준으로 내부 결손부의 광화조직의 양과 성숙골과 미성숙골의 비율을 측정하였다. 표 1에는 4주 경과 후, 표2 에는 8주 경과 후에 측정한 결과를 나타내었다.

[표 1]

[표 2]

표 1 및 표 2를 참조하면, 골 결손부 내의 골량 및 층판골/미성숙골의 비율을 구하여 분석한 결과 골양은 플라즈마 표면처리를 한 돈골을 이식한 군에서 4주째 골양(44.26 ± 7.15)이 가장 많았으며, 8주째까지 골양은 증가하였다.

반면, 열처리를 추가한 실시예 2의 경우 골양이 나머지에 비하여 적었지만, 플라즈마 표면처리를 한 실시예 3의 골 이식재를 제외하고는 통계학적으로 유의할 만한 차이는 없었다.

또한, 층판골과 미성숙골의 비율은 골이 성숙될수록 높게 나타났는데, 4주 경과한 경우에는 플라즈마 표면처리한 실시예 3의 골 이식재가 가장 우수하였으며, 8주 경과한 경우에는 실시예 1의 골 이식재가 가장 증가하였고 통계학적으로 유의한 차이를 보였다.

또한, 비교적 입자 크기가 작은 플라즈마 표면처리된 실시예 3의 골 이식재의 경우, 골양이 충분하게 형성되어 있어 골 이식재의 평균입자 크기가 0.25-1.0mm 정도라면 골 이식재로 적합하다는 것을 뒷받침해 주고 있다.

동물실험에 의하면, 모든 실험군에서 골 이식부의 염증반응은 관찰되지 않았는바 생물학적 적합성이 확인되었다. 또한, 골 결손부 내의 골양은 플라즈마 처리된 돈골을 이식한 경우가 가장 높았다. 또한, 골 결손부의 변연에서 결손부 중앙으로 신생골이 전도되는 골전도 성질을 지니고 있음을 확인할 수 있다.

상기 결과를 종합해 보면, 돈골 분말에 하이드록시아파타이트 나노입자를 코팅한 돼지 유래 골 이식재를 사용하면 골 결손부 재생에 매우 효과적임을 확인할 수 있다.

본 발명은 상술한 실시 형태 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니며, 첨부된 청구범위에 의해 한정하고자 한다. 따라서, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 인간의 뼈를 제외한 동물뼈 분말을 마련하는 단계; 및
   상기 동물뼈 분말의 입자 표면에 하이드록시아파타이트 층을 형성하는 단계를 포함하며,
   상기 인간의 뼈를 제외한 동물뼈 분말을 마련하는 단계는,
   분쇄된 동물뼈에서 지질과 단백질을 유기용매를 이용하여 제거하는 단계; 및
   상기 동물뼈를 열처리하여 지질과 단백질을 제거하는 단계를 포함하며,
   상기 동물뼈 분말의 입자 표면에 하이드록시아파타이트 층을 형성하는 단계는,
   유동층 코팅법에 의하여 수행되되,
   상기 유동층 코팅법은,
   상기 동물뼈 분말의 입자에 하이드록시아파타이트 나노입자가 함유된 수용액을 분무하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 이종골 이식재를 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 동물뼈는 돈골을 포함하는 것을 특징으로 하는 이종골 이식재를 제조하는 방법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 동물뼈 분말의 입자는 평균입경이 0.25~1.0mm 인 것을 특징으로 하는 이종골 이식재를 제조하는 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 하이드록시아파타이트 나노입자는 평균입경이 10~100nm 인 것을 특징으로 하는 이종골 이식재를 제조하는 방법.
7. 제1항의 방법에 따라 제조된 이종골 이식재.

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