MX2011007193A - Armazon solido hecho de polvo oseo y pegamento de fibrina. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un armazón de regeneración ósea, y de forma más particular, con un armazón de regeneración ósea que está hecho de una mezcla de pegamento de fibrina y polvo óseo, el interior del cual tiene una pluralidad de poros para acomodar los factores de crecimiento óseo, y los cuales tienen una forma concreta predeterminada. La presente invención también se relaciona con un método de fabricación del armazón.

Description

ARMAZÓN SÓLIDO HECHO DE POLVO ÓSEO Y PEGAMENTO DE FIBRINA CAMPO DE IA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un armazón para la regeneración ósea, y de forma más particular, a un armazón para la regeneración ósea que incluye pegamento de fibrina, polvo óseo mezclado con el pegamento de fibrina, y una variedad de poros formados para acomodar un factor promotor del crecimiento óseo, donde el armazón tiene una forma concreta predeterminada, y un método de preparación del armazón.

TÉCNICA ANTERIOR La ingeniería de tejido óseo pretende inducir la regeneración ósea al injertar células osteogénicas cultivadas con ayuda de ingeniería en un sitio que requiere hueso, y desarrollar tejidos óseos. Ésta ingeniería tisular requiere de células osteogénicas, un armazón al cual se unen las células osteogénicas para sobrevivir, y un factor de crecimiento configurado para promover la inducción de la diferenciación ósea para la regeneración ósea. Los respectivos componentes pueden formar un tejido óseo cuando un estímulo es dado a los componentes mientras se mantienen las condiciones adecuadas de tiempo y ambiente. Por lo tanto, existen muchas investigaciones con la intención de 7393.1 encontrar el factor ideal para cada componente.

En particular, un material osteoconductivo como un armazón configurado para formar hueso es importante para permitir que las células osteogénicas sobrevivan en él. El material osteoconductivo es similar a aquél que permite la mineralización del hueso: debe ser biocompartible y aportar una superficie reactiva y soporte físico asociado estrechamente con los alrededores del hueso. Se han estudiado varios materiales osteoconductibles como la cerámica, el colágeno, un polímero biodegradable y otros.

Takahashi y cois. reportaron sinostosis utilizando hidroxiapatita (HA) porosa y una proteína morfogénica de hueso (BMP, por sus siglas en inglés) (Takahashi K et al. J Biomed Master Res A12: 117-123, 2007), Asahina y cois, reportaron el uso de HA, colágeno, BMP bovina y otros (Asahina I et al. J Med dent Sci. 44:63-69, 1997), Ohgushi y cois, reportaron el uso de un armazón de cerámica (Ohgushi H et al. J Biomed Mat Res 26: 885-95, 1992; Ohgushi H et al. J Biomed Mat Res 32: 341-8, 1996), y Caplan y cois, reportaron el uso de fosfato de calcio poroso y otros. (Caplan AI. J Cell Physiol 213(2): 341-347, 2007) .

Por otra parte, la patente europea No. 1231947 expone un material sustituto de hueso que comprende (a) una matriz suave que consiste de fibrina o fibrinógeno, (b) células vivas, y (c) una matriz fija que consiste en una base de hidroxiapatita no cerámica.

Además, la patente japonesa de publicación No. 1999-513590 propone una matriz de injerto óseo biodegradable, porosa y tridimensional (3D) que incluye partículas de fosfato de calcio formadas de colágeno mineralizado y que tiene un tamaño de partículas de 5 µ?t? o menos, las partículas de fosfato de calcio son fijadas en la matriz.

Adicionalmente, la patente estadounidense de publicación No. 2008-0213229 expone un método para producir una composición semi-sólida de osteoblastos que contienen fibrina, para el tratamiento de las fracturas óseas. El método incluye el aislamiento de osteoblastos a partir de tejido óseo animal, el cultivo y proliferación de los osteoblastos aislados en Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o Medio mínimamente esencial con modificaciones Alfa (a-MEM) para preparar una suspensión de osteoblastos, y la mezcla de la suspensión de osteoblastos resultante con un factor de coagulación semi-sólido de osteoblastos .

Sin embargo, los armazones convencionales no funcionan como medios en los cuales los osteoblastos vivos pueden crecer. Por otra parte, cuando los armazones son injertados en áreas con defectos óseos, sus formas e intensidades no se mantienen y tampoco se sostienen de forma estable en el área asignada durante el tratamiento, lo que deriva en una pobre eficiencia de regeneración ósea.

Descripción Problema técnico El inventor de la presente ha hecho un gran esfuerzo para desarrollar un armazón que pueda superar los problemas descritos previamente, y descubrió que un armazón sólido obtenido al mezclar pegamento de fibrina con polvo óseo y al someter a un proceso de liofilización, la mezcla resultante es estable in vivo, manteniendo un espacio en el cual las células pueden ser colocadas de forma continua durante la reconstrucción ósea, y mantiene su adecuada forma e intensidad aun en un ambiente in vivo, por lo tanto, induciendo una rápida regeneración ósea. Por eso, la presente invención se ha completado con base en éstos factores. Por otra parte, mediante el proceso de liofilización posterior a la realización de la mezcla del pegamento de fibrina con el polvo óseo, se permite la formación de un gran número de poros en la mezcla, mejorando la absorción y el mantenimiento del factor que promueve la regeneración ósea.

Además, el armazón de la presente invención puede ser liofilizado formando una pieza colada que tenga la forma deseada predeterminada, para tener la forma deseada al final. Esta ventaja hace posible aportar un armazón apropiado para su uso en el área del defecto óseo. Con ayuda de la más novedosa tecnología de escaneo en 3D, es posible determinar de forma exacta el área del defecto óseo en un paciente y generar la forma del armazón, permitiendo el mejoramiento de la presente invención.

Por tanto, el objetivo de la presente invención es aportar un armazón sólido para la regeneración ósea, en el cual se mezcla polvo óseo con pegamento de fibrina que incluye fibrinógeno y trombina como los componentes principales .

De forma más particular, otro objetivo de la presente invención es aportar un armazón concreto para la regeneración ósea, en el cual una variedad de poros son formados para acomodar el factor promotor del crecimiento óseo al mezclar el polvo óseo con pegamento de fibrina incluyendo fibrinógeno y trombina como componentes principales y sometiendo a liofilización la mezcla resultante .

Otro objetivo de la presente invención es el de aportar un armazón que tenga la forma apropiada, la cual es obtenida al poner la mezcla del pegamento de fibrina y el polvo óseo en una pieza colada que tiene la forma predeterminada y sometiendo la mezcla a un proceso de liofilización .

Aun otro objetivo de la presente invención es el de aportar un armazón diseñado para un paciente especifico que se obtiene al preparar la pieza vaciada correspondiente a un área del defecto óseo del paciente utilizando técnicas de escaneo digitales 3D, colocando la mezcla del pegamento de fibrina y el polvo óseo en la pieza colada y permitiendo la liofilización de la mezcla.

Soluciones técnicas Para cumplir con los objetivos mencionados, un aspecto de la presente invención es aportar un armazón concreto para la regeneración ósea, en el cual se mezcla polvo óseo con pegamento de fibrina incluyendo fibrinógeno y trombina como los componentes principales. Esto es, el armazón de la presente invención se caracteriza porque el polvo óseo es agregado a un pegamento de fibrina.

Por otra parte, el armazón acorde con la presente invención puede permanecer en un estado sólido y concreto. Para éste propósito, el pegamento de fibrina y el polvo óseo pueden ser mezclados, y la mezcla resultante puede ser sometida a un proceso de liofilización . También, el armazón acorde con la presente invención puede ser tratado para tener una forma predeterminada antes de someterse al procedimiento de liofilización, o puede someterse a dicho procedimiento en la pieza colada predeterminada. En un aspecto, la forma y la pieza colada pueden corresponder a un área de la mandíbula o de una pieza dental del paciente. De forma más particular, la pieza colada puede ser diseñada mediante (a) la preparación de un molde 3D utilizando tomografía computarizada 3D y (b) la preparación de una la pieza colada para la preparación del armazón apropiado para el área del defecto óseo en un molde 3D utilizando resina dental .

En la presente invención, el término "polvo óseo" se refiere a un compuesto óseo, de preferencia inorgánico, a partir del cual se retiran los osteoblastos . El polvo óseo puede derivar de por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de: hueso autógeno, hueso alógeno, hueso xenógeno y hueso sintético (por ejemplo, hidroxiapatita) . En la presente invención, el polvo óseo está disponible de forma comercial, por ejemplo, de Dynagraft (Austem Co. Ltd.), Biocera (Oscotec Inc.), Bio-Oss (Jungsan Biomed Co. Ltd.), ICB (Purgo), MBCP (Purgo), etc.

En la presente invención, el término "pegamento de fibrina" se refiere a un producto biocompatible y biodegradable que incluye fibrinógeno y trombina como sus componentes principales. El pegamento de fibrina se ha utilizado en una variedad de aplicaciones. En Europa, por ejemplo, el pegamento de fibrina se ha utilizando clínicamente para la sustitución o reforzamiento de las suturas al aplicar fibrinógeno, trombina, cloruro de calcio, o un inhibidor de enzima fibrinolítica como un adhesivo tisular para suturar nervios periféricos y vasos sanguíneos pequeños a través de la aglutinación tisular de fibrina. Además, en Japón, el pegamento de fibrina se ha utilizado como un adhesivo quirúrgico para la cirugía de nervios cerebrales incluyendo un campo de cirugía vascular, en cirugías ortopédicas para la adhesión ósea, y la detención del sangrado en pacientes que sufren de heridas lacerantes, etc. Por ejemplo, Greenplast (Green Cross Corp.), Beriplast-P (Aventis), Tisseel (Baxter), etc. están disponibles comercialmente .

El pegamento de fibrina acorde con la presente invención incluye de forma preferente fibrinógeno y trombina. El fibrinógeno puede ser utilizado en una concentración de 10 a 1000 mg/ml, preferentemente de 10 a 100 mg/ml. La trombina puede ser utilizada en una concentración de 0.1 a 1000 Ul/ml, preferentemente de 1 a 100 Ul/ml.

El pegamento de fibrina acorde con la presente invención puede incluir también aprotinina o cloruro de calcio. Además, el pegamento de fibrina acorde con la presente invención puede incluir además un recubrimiento hidrosoluble . El recubrimiento hidrosoluble puede ser medio de cultivo celular, agua destilada o sangre.

En la presente invención, cuando el polvo óseo y el pegamento de fibrina son mezclados, un incremento en la cantidad de pegamento de fibrina puede incrementar la posibilidad de toxicidad, y por lo tanto se prefiere a ustar apropiadamente el contenido del pegamento de fibrina. Por otra parte, cuando el tamaño del armazón es mayor, se prefiere incrementar el contenido del polvo óseo para mantener la intensidad y la forma del armazón. En vista de éstos factores, el pegamento de fibrina y el polvo óseo puede ser mezclado en una proporción de volumen de 1:1 a 10, preferentemente 1:1 a 5, y aun con mayor preferencia 1:1 a 3 en la presente invención.

El factor promotor del crecimiento óseo acorde con la presente invención incluye una variedad de factores para promover el crecimiento óseo. Por ejemplo, el factor promotor de crecimiento óseo podría incluir una hormona, una citocina, una célula troncal, etc. De forma más particular, el factor promotor de crecimiento óseo puede ser un factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) o el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) .

Dado que se forman un gran número de poros en la mezcla del pegamento de fibrina y polvo óseo mientras la mezcla es sometida al proceso de liofilización, el armazón acorde a la presente invención puede mejorar la absorción y el mantenimiento del factor promotor del crecimiento óseo. El armazón previamente liofilizado absorbe fácilmente el medio que contiene el factor promotor de crecimiento óseo y transfiere el medio hacia los poros.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método de preparación del armazón sólido con una forma predeterminada, el método incluye mezclar el polvo óseo con pegamento de fibrina y liofilizar la mezcla resultante formando una pieza colada que tenga la forma predeterminada .

El proceso de liofilización puede realizarse de la manera convencional, lo que significa que la humedad residual esté presente en una cantidad de 2% p/p o menos durante el proceso de liofilización . Por otra parte, el proceso de liofilización acorde con la presente invención puede realizarse utilizando un liofilizador disponible comercialmente .

Aun otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método de preparación de un armazón diseñado para un paciente especifico, apropiado para el área del defecto óseo de dicho paciente, para promover la regeneración ósea, al colocar el armazón en el área del defecto óseo. En particular, el método de preparación del armazón diseñado para un paciente especifico acorde con la presente invención incluye (a) preparar un molde 3D utilizando tomografia computarizada 3D, (b) preparar una pieza colada para la preparación del armazón apropiado para el área del defecto óseo en un molde 3D utilizando resina dental, y (c) colocar la mezcla de pegamento de fibrina y polvo óseo en la pieza y someter la mezcla al proceso de liofilización .

Efectos ventajosos El armazón sólido para la regeneración ósea acorde con la presente invención es estable in vivo y mejora de manera continua la absorción y el mantenimiento del factor promotor del crecimiento óseo como una célula o una citocina durante la regeneración ósea. Además, el armazón sólido de la presente invención puede inducir la regeneración ósea en una forma adecuada dado que el armazón sólido tiene la forma apropiada para el área del defecto óseo, puede mantener el espacio en el cual son colocados varios materiales necesarios para la regeneración ósea, y puede mantener su adecuada forma e intensidad aun en un ambiente in vivo, po lo tanto induciendo un rápida regeneración ósea.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIG. 1 Muestra una configuración del equipo de pegamento de fibrina utilizado en la presente invención.

FIG. 2 Muestra un bloque de Biocera/fibrina liofilizado acorde con la presente invención.

FIG. 3 Muestra el proceso de preparación del bloque de Biocera/fibrina liofilizado acorde con la presente invención (A: Mezcla de MBCP y pegamento de fibrina, B: estado gelatinoso previo al proceso de liofilización, C: proceso de liofilización, D: estado sólido posterior al proceso de liofilización) .

FIG. 4A Muestra la mezcla de MBCP y pegamento de fibrina y la FIG. 4B muestra un estado del bloque de MBCP/fibrina obtenido al liofilizar la mezcla.

FIG. 5 Muestra la inducción de la anestesia en un cerdo miniatura como animal experimental, la extracción de los dientes y los dientes extraídos, respectivamente.

FIG. 6 Muestra las posiciones en que el material del injerto óseo acorde con la presente invención es injertado en un área defectuosa del alveolo del cerdo miniatura .

FIG. 7 Muestra el proceso de injerción del material de injerto óseo acorde con la presente invención (A: Exposición del área trasplantada por reflexión de las ondulaciones de la cresta residual alveolar en la mandíbula inferior, B: Formación de sólo un área de defecto ósea en forma de silla, y C: Injerto de la mezcla de MBCP y pegamento de fibrina o un bloque de MBCP/fibrina ) .

FIGS. 8A a 8D muestran un análisis de densidad ósea utilizando el programa visualizador Dicom (FIG. 8A: Ajuste de lineas, FIG. 8B: Ajuste de espesor, FIG. 8C: Medición de la densidad, y FIG. 8D: Medición de la densidad dividida por 3 fragmentos (tamaño de los pixeles de 10x10, espesor de 3 mm) ) .

FIG. 9 Muestra el resultado de la tomografia computarizada 3D con respecto a las áreas en las cuales es injertado el material de injerto óseo acorde con la presente invención.

FIG. 10 Muestra los resultados de la tinción inmunohistoquimica con respecto a las áreas en las cuales se injertó el material de injerto óseo acorde con la presente invención.

MODALIDADES DE LA INVENCIÓN De aquí en adelante, las modalidades preferidas de la presente invención serán descritas en detalle con referencia a los dibujos acompañantes.

De aquí en adelante, las modalidades de ejemplo de la presente invención serán descritas en detalle con referencia a los dibujos acompañantes de manera que aquellos con habilidades en el campo técnico al cual la presente invención pertenece, puedan fácilmente practicar la presente invención.

Ejemplo 1: Preparación del armazón de la invención . 1-1. Preparación del pegamento de fibrina.

El pegamento de fibrina fue preparado utilizando el equipo Greenplast® (Greenplast kit, Green Cross Corp., Korea) (FIG. 1). La preparación del pegamento de fibrina fue realizada como se indica a continuación. 1) Preparación de la solución del Vial-1: 5 mi. Primero, la concentración de proteina en el vial- 1 se determinó de 97.6 mg/ml. Para ajustar la concentración de proteínas a 40 mg/ml, la solución fue diluida 2.5 veces. Se adicionó una solución de 2.5 mi del vial-2 a la solución de un vial-1 para disolver la concentración de proteínas, y 2.5 mi de solución salina fisiológica se adicionó a otra solución de un vial-1 para disolver la concentración de proteínas. Posteriormente, las dos soluciones completamente diluidas de los viales-1 fueron colectadas en un tubo de ensayo . 2) Preparación de la solución del Vial-3 La titulación de trombina en el vial-3 fue determinada de 557 Ul/ml. Para ajustar la titulación de trombina a 20 Ul/ml, la solución se diluyó 28 veces. Una solución de 2.5 mi del vial-4 se adicionó a la solución de un vial-3 para diluir la concentración de proteínas, y se tomó 1 mi de la solución del vial-4 que se adicionó a 10 mi de solución salina fisiológica, y se mezclo con fuerza. 1-2. Mezcla del pegamento de fibrina y el polvo óseo 1) Bloque de hueso tipo disco.

Se pesó y colocó 0.25 gr de polvo óseo (Biocera) en cada pozo de una placa de 24 pozos. Se colocaron 0.2 mi de la solución del vial-1 en cada pozo y se mezcló con el polvo óseo de manera que el polvo óseo pudiera sumergirse suficientemente en la solución del vial-1. Posteriormente, se colocó en cada pozo 0.1 mi de la solución contenida en el vial-3 y se mezcló con rapidez utilizando una espátula, y la mezcla resultante se mantuvo estática. 2) Bloque semicircular de hueso tipo bastón.

Una pieza preparada fue utilizada con una pipeta de 10 mi. Se pesaron y colocaron 1.25 gr de polvo óseo (Biocera) en cada línea. Se colocaron 2 mi de la solución del vial-1 en cada orificio y se mezcló de manera que el polvo óseo pudiera sumergirse suficientemente en la solución del vial-1. Se colocaron 0.5 mi de la solución del vial-3 en cada orificio y fueron rápidamente mezclados utilizando una espátula, y la mezcla resultante se mantuvo a temperatura ambiente por una hora. 1-3. Liofilización La temperatura del estante del liofilizador se ajustó a -45 °C y el liofilizador se puso en marcha. Como resultado, se obtuvo un bloque de hueso semicircular liofilizado tipo bastón (FIG. 2).

Ejemplo 2: Materiales y Métodos experimentales. 2-1. Materiales y animales experimentales.

Cuatro cerdos miniatura machos de 30 kg (PWG, Korea) fueron utilizados como animales experimentales. Los cerdos fueron criados con comida animal blanda y agua a temperatura ambiente en facilidades de criadero certificadas, por un periodo predeterminado de tiempo. 1) Extracción dental Los dientes desde el premolar hasta el primer molar fueron extraídos de la mandíbula inferior derecha e izquierda de un cerdo miniatura. Posterior a la extracción dental, las heridas fueron suturadas. Una semana después del proceso de sutura, se realizó una inyección, y las heridas se dejaron sanar por un mes. Durante el proceso de recuperación, se realizó la extracción adicional de dientes impactados mediante cirugía. 2) Preparación del bloque de MBCP/Fibrina (1) Preparación del pegamento de fibrina.

El pegamento de fibrina fue preparado utilizando el kit Greenplast® (Greenplast kit, Green Cross Corp., Korea) . El kit Greenplast de 1 mi incluye fibrinógeno humano concentrado, aprotinina, trombina sérica humana, y a-MEM (como medio de solución) . La aprotinina fue mezclada con el fibrinógeno humano concentrado para preparar una solución de fibrinógeno, y el a-MEM fue mezclado con la trombina sérica humana para preparar una solución de trombina . (2) Preparación del complejo MBCP/Fibrina (de aquí en adelante referido como "pegamento MBCP+fibrina") .

El pegamento de fibrina previamente preparado (que contiene la solución de fibrinógeno y la solución de trombina) fue mezclado con MBCP a una proporción de volumen de 1:1 y la mezcla resultante se vació en un molde previamente preparado. Posteriormente, la mezcla fue sometida al proceso de liofilización para preparar el bloque de MBCP/fibrina (por ejemplo, un armazón de la presente invención) (FIGS. 3 y 4). 2-2. Métodos experimentales 1) Inducción de la anestesia.

Para colocar el injerto óseo al cerdo miniatura, se inyectó anestésico animal (Rompun® 3 mg/kg, Bayer Korea Co . , Ltd., Korea) y ketamina de forma intravenosa en el cerdo miniatura para inducir la anestesia general. La intubación oral se realizó para inducir la anestesia general utilizando N20 + 02.

Para proporcionar un adecuado campo visual, los dientes de las mandíbulas superior e inferior fueron atados con una venda para permitir el grado máximo de apertura. La cavidad oral fue esterilizada con Potadine, y se inyectó lidocaína al 2% (Yuhan Co, Ltd., Korea) la cual contenía epinefrina a una proporción de volumen 1:100,000 en el hueso alveolar residual de la mandíbula inferior para inducir anestesia local y detención del sangrado (FIG. 5). 2) Exposición del hueso alveolar EL hueso alveolar residual del cerdo miniatura fue sujeto a incisión tanto horizontal como vertical, y el periostio fue removido para exponer al máximo los lados bucal y lingual de la mandíbula inferior. 3) Formación de los grupos control y experimentales .

Fueron formados defectos tipo 2 en la pared ósea con una profundidad de 4 a 5 mm, una longitud de 8mm, y una amplitud de la base de 6 a 7 mm utilizando una micro sierra con un radio de 3mm. Las regiones ásperas fueron limadas a la forma deseada utilizando ya fuera una sonda redonda guirúrgica, un cincel o un mazo.

Primero, el MBCP que servía como control fue mezclado con pegamento de fibrina, y la mezcla resultante fue coagulada y colocada en el área del defecto óseo que se encontraba sobre la mandíbula derecha. Posteriormente, el bloque de MBCP/fibrina que servía como grupo experimental fue colocado en el frente del defecto óseo sobre la mandíbula izquierda (FIG. 6) .

Se realizó una incisión en la herida para liberar la tensión, y se utilizó una sutura Nylon 4-0 para realizar una sutura de cierre continuo. Se inyectó Amoxicilina (Tiramox®, SAMJIN Pharmaceutical Co., Ltd., Korea) y diclofenaco sódico (Kinpoin®, SAMJIN Pharmaceutical Co., Ltd., Korea) de forma intramuscular a todos los animales experimentales por tres días para prevenir la presencia de infecciones posterior a la cirugía, y los animales experimentales fueron alimentados con dieta blanda con leche con alta proteína por una semana. La desinfección se realizó utilizando clorhexidina (Hexamedin®, Bukwang Pharmaceutical Co., Ltd., Korea) por una semana (FIG. 7). 2-3. Inspección Visual Posterior a la cirugía, la desinfección de los alimentos dados a los cerdos miniatura fue realizada de forma continua, y los cerdos miniatura fueron mantenidos bajo condiciones saludables. A las 2, 4 y 8 semanas posteriores a la cirugía, los cerdos miniatura fueron sacrificados, y se apreció a simple vista el nivel de recuperación del área del injerto óseo, las condiciones inflamatorias, y la dehiscencia de la herida, antes de que las muestras de tejido óseo fueran inmovilizadas con formalina . 2-4. Inspección mediante Tomografia Computarizada.

Subsecuentemente, cada área de injerto óseo fue examinada utilizando radiografías digitales estándar y sometidas a tomografia computarizada dental. Después, se realizaron cortes óseos verticales y horizontales entre las áreas del injerto óseo con respecto al centro del área de injerto óseo. 1) Tomografia Computarizada 3D La mandíbula inferior del cerdo miniatura que contenía cada material injertado fue observada utilizando una TC de rayo cónico (Alphard vega, Asahi Roentgen Ind. Co . , Japan) . Las imágenes fueron realizadas a un voltaje de tubo de 80 KVp y a una corriente de tubo de 8 mA por 15 segundos. La resolución espacial de todos los especímenes fue fijada a 0.2 mm x 0.2 mm, y se obtuvieron aproximadamente 512 imágenes por espécimen. Las imágenes obtenidas fueron almacenadas en formato " . dcm", y estos archivos fueron analizados utilizando el programa visualizador DICOM (Aplicación 3 a demanda, Cybermed, Korea) , y todas las imágenes fueron identificadas y analizadas en un monitor diagnóstico (WIDE, Korea) . 2) Análisis de la densidad ósea Los ejes del plano coronal, el plano sagital y el plano transverso fueron ajustados con respecto al centro del área de defecto óseo en el programa visualizador DICOM. Se midió la opacidad radiográfica de cinco regiones como lo son las regiones del centro, arriba, abajo, izquierda y derecha del área de defecto óseo en el plano transverso con respecto a la región de interés (ROI) de 10 pixeles x 10 pixeles. Se midieron tres regiones de cada área de defecto óseo como lo son las regiones frontal, media y posterior, y se realizó el mismo análisis en cada cerdo miniatura por 2, 4 y 8 semanas. Posteriormente, se realizó análisis estadístico de la opacidad radiográfica a través del tiempo. Por otra parte, un cambio en la opacidad radiográfica entre los grupos experimentales a través del tiempo fue analizado estadísticamente basados en los resultados de los análisis. Aquí, los valores numéricos en este programa fueron valores relativos que representaban las opacidades en un rango de -1023 a 3071, y fue medida la opacidad radiográfica del hueso cortical y el hueso esponjoso del cerdo miniatura de aproximadamente 500 a 1300 y -100 a 600, respectivamente (FIG. 8) . 2-5. Inspección Histopatológica .

Los cerdos miniatura fueron sacrificados a las 2, 4 y 8 semanas posteriores a la cirugía para obtener las muestras tisulares respectivas. Posteriormente, las muestras tisulares fueron fijadas en una solución de formalina neutra al 10% por dos días, desmineralizadas con EDTA al 10%, y deshidratadas y embebidas en resina mediante el método típico. Después, se colocaron en portaobjetos recubiertos con poli-L-Lisina las muestras cortadas al microtomo de 4 a 6 µp? de tamaño para preparar las muestras. Las secciones tisulares fueron preparadas de manera que tanto el área con el injerto óseo como el área normal fueran incluidas en las secciones tisulares. Para observar las formas del hueso nuevo y el tejido fibroso y examinar los cambios en las formas de hueso nuevo y el tejido fibroso, las muestras fueron teñidas con hematoxilina & eosina y la tinción de tricromo de Masson y examinadas bajo el microscopio.

Ejemplo 3: Resultados Experimentales 3-1. Características Clínicas.

Cada uno de los tres cerdos miniatura de cada grupo fue analizado a periodos de tiempo de 2, 4 y 8 semanas. Puede observarse en los resultados de la evaluación clínica que la dehiscencia de la herida se presentaba junto con inflamación severa en los controles a las 2 semanas. Sin embargo, en los grupos experimentales, no aparecieron ni la dehiscencia de herida ni la presencia de inflamación tampoco a las 4 ni a las 8 semanas del experimento, y se observó una excelente regeneración ósea (Tabla 1) .

Tabla 1 Inflamación causada por la mezcla de MBCP + Pegamento de Fibrina y el bloque de MBCP/Fibrina (-: negativo, ±: raro, +: leve, ++: moderado, y +++: severo) 3-2. Características radiológicas. 1) Evaluación mediante Tomografia Computarizada 3D.

A las 4 semanas, la mezcla de MBCP y pegamento de fibrina del control, se había absorbido discretamente en el lado bucal y el lado lingual, mientras que el peso con respecto a todas las formas estaba discretamente reducido. Además, la amplitud normal del material alveolar estaba en un rango de aproximadamente 2 a 3 mm, pero los defectos óseos en el lado bucal aparecieron discretamente en el grupo experimental (bloque de MBCP/fibrina) y el material alveolar mostró una forma superior y más amplia (FIG. 9) . 2) Evaluación de la densidad ósea En las características radiológicas, la densidad ósea se incrementó tanto en el control como en el grupo experimental durante el proceso de osificación. Aquí, la densidad ósea se incremento de forma significativa en el grupo experimental, comparado con el grupo control. Especialmente, se observó una mayor densidad ósea a las 2 y 8 semanas en el grupo del bloque MCBP/fibrina sometidos a liofilización, comparados con el grupo control. Esto indica que las partículas del injerto inicial fueron estabilizadas al bloquear el hueso sintético y la fibrina a las dos semanas, y la maduración ósea por osificación prematura se observó a las 8 semanas (Tabla 2) .

Tabla 2 * p < 0.05 3-3. Características Histológicas Como resultado, en el control en el cual se mezcló y coaguló el MBCP con el pegamento de fibrina, las características clínicas como la actividad osteoclástica y la angiogénesis periférica al injerto óseo se observaron a las 2 semanas, que derivó en la observación de regeneración ósea parcial. Además, el remodelamiento óseo progresó a las 4 semanas, y también la regeneración de huesos nuevos. En el grupo experimental en el cual el bloque de MBCP/fibrina fue injertado en el área del defecto óseo, el MBCP fue dispersado en la estructura de fibrina a las 2 semanas, pero nuevos vasos sanguíneos aparecieron mientas la estructura de fibrina estaba parcialmente destruida. Por otro lado, se observó la absorción del MBCP dispersado y la regeneración de hueso nuevo alrededor del hueso injertado. Además, la actividad de los osteoblastos se observó con mayor claridad a las 4 semanas, y por lo tanto la periferia del área de defecto óseo fue remplazada con hueso maduro ( FIG . 10) .

En conclusión, se formaron áreas de defectos óseas silla tipo 2 en la mandíbula inferior del cerdo miniatura, y la mezcla de MBCP/fibrina o el bloque de MBCP/fibrina liofilizado fueron injertados en el área del defecto óseo para comparación visual, radiológica e histológica de los efectos osteogénicos a las 2, A y 8 semanas posteriores a la cirugía, obteniéndose los siguientes resultados comparativos. 1. En la inspección visual y la inspección por tomografia computarizada 3D, se observó una excelente regeneración ósea y se mantuvo una adecuada forma del hueso en el grupo de injerto del bloque de MBCP/fibrina, comparado con el grupo de injerto de MBCP/pegamento de fibrina . 2. En la inspección radiológica de la densidad ósea, se midió una mayor densidad ósea en el grupo del injerto del bloque de MBCP/fibrina, comparado con el grupo del injerto de MBCP/pegamento de fibrina, lo que mostró una mejora de la regeneración ósea. 3. En la inspección histológica, la nueva regeneración ósea fue excelente y el remodelamiento óseo progresó con mayor rapidez en el grupo del injerto del bloque de MBCP/fibrina, en comparación con el grupo del injerto de MBCP/pegamento de fibrina.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL Como se ha descrito, cuando el bloque liofilizado de MBCP/fibrina es injertado en el área de defecto óseo, tiene la propiedad de mantener una adecuada forma y la regeneración ósea mejora de forma importante, comparado con el armazón convencional (MBCP/pegamento de fibrina) .

Claims (28)

REIVINDICACIONES

1. Un armazón para la regeneración ósea que comprende: pegamento de fibrina, polvo óseo mezclado con el pegamento de fibrina y una variedad de poros formados para acomodar el factor promotor del crecimiento óseo, en donde el armazón tiene una forma concreta predeterminada.

2. El armazón acorde con la reivindicación 1, en donde el armazón es tratado para tener una forma predeterminada antes de ser liofilizado.

3. El armazón acorde con la reivindicación 1, en donde el armazón es liofilizado formando una pieza colada predeterminada.

4. El armazón acorde con la reivindicación 3, en donde la pieza colada es preparada mediante (a) la preparación de un molde tridimensional (3D) del cráneo utilizando tomografia computarizada (TC) 3D y (b) la preparación de una pieza colada para la preparación del armazón apropiado para el área del defecto óseo utilizando resina dental en el molde 3D del cráneo.

5. El armazón acorde con la reivindicación 1, en donde el polvo óseo es un polvo óseo del cual se remueven los osteoblastos .

6. El armazón acorde con la reivindicación 5, en donde el polvo óseo es derivado de por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste en: hueso autógeno, hueso alógeno, hueso xenógeno y hueso sintético.

7. El armazón acorde con la reivindicación 1, en donde el pegamento de fibrina comprende fibrinógeno y trombina .

8. El armazón acorde con la reivindicación ? , en donde el fibrinógeno está presente a una concentración de 10 a 1000 mg/ml.

9. El armazón acorde con la reivindicación 7, en donde la trombina está presente a una concentración de 0.1 a 1000 ül/ml.

10. El armazón acorde a la reivindicación 1, en donde el pegamento de fibrina también comprende aprotinina o cloruro de calcio.

11. El armazón acorde con la reivindicación 1, en donde el pegamento de fibrina comprende un recubrimiento hidrosoluble .

12. El armazón acorde con la reivindicación 11, en donde el recubrimiento hidrosoluble es un medio de cultivo celular, agua destilada o sangre.

13. El armazón acorde con la reivindicación 1, en donde el polvo óseo y el pegamento de fibrina se mezclan en una proporción de volumen de 1 a 10:1.

14. El armazón acorde con la reivindicación 1, en donde el factor promotor del crecimiento óseo es una hormona, una citocina o una célula troncal.

15. Un método de preparación del armazón para la regeneración ósea, el método comprende: mezclar el polvo óseo y el pegamento de fibrina y a liofilizar la mezcla resultante, en donde el armazón comprende una variedad de poros formados para acomodar el factor promotor de crecimiento óseo y tiene una forma concreta predeterminada.

16 El método acorde con la reivindicación 15, en donde el armazón es tratado para tener una forma predeterminada antes de ser sometido al procedimiento de liofilización.

17. El método acorde con la reivindicación 15, en donde el procedimiento de liofilización es realizado en una pieza colada predeterminada.

18. El método acorde con la reivindicación 17, en donde la pieza colada es preparada por: (a) preparar un molde 3D del cráneo utilizando TC 3D y (b) preparar una pieza colada para la preparación de un armazón apropiado para el área del defecto óseo utilizando resina dental en un molde 3D del cráneo.

19. El método acorde con la reivindicación 15, en donde el polvo óseo es un polvo óseo de crecimiento del cual se remueven los osteoblastos .

20. El método acorde con la reivindicación 19, en donde el polvo óseo es derivado de por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste en: un hueso autógeno, un hueso alógeno, un hueso xenógeno, y un hueso sintético.

21. El método acorde con la reivindicación 15, en donde el pegamento de fibrina comprende fibrinógeno y trombina .

22. El método acorde con la reivindicación 21, en donde el fibrinógeno está presente en una concentración de 10 a 1000 mg/ml .

23. El método acorde con la reivindicación 21, en donde la trombina está presente en una concentración de 0.1 a 1000 ül/ml.

24. El método acorde con la reivindicación 15, en donde el pegamento de fibrina también comprende aprotinina y cloruro de calcio.

25. El método acorde con la reivindicación 15, en donde el pegamento de fibrina también comprende un recubrimiento hidrosoluble .

26. El método acorde con la reivindicación 25, en donde el recubrimiento hidrosoluble es un medio de cultivo, agua destilada o sangre.

27. El método acorde con la reivindicación 15, en donde el polvo óseo y el pegamento de fibrina son mezclados en una proporción de volumen de 1 a 10:1.

28. El método acorde con la reivindicación 15, en donde el factor promotor de crecimiento óseo es una hormona, una citocina o una célula troncal.