CN105154397A - Cik的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CIK的制备方法，包括如下步骤，(1)从血液中将单个核细胞分离出来；(2)将单个核细胞悬液与纤维蛋白凝胶混合置于CD3？McAb和RetroNectin预包被的培养瓶中，并加入含PPP和IFN-γ的培养基；(3)第2天，添加IL-1α和IL-2继续培养至单个核细胞转化成CIK。本发明的优点是，采用的纤维蛋白凝胶是一种高分子网络体系，能吸收大量的水份，其结构上也与细胞外基质极为相似，能够模拟体内细胞的生长微环境，从而为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，显著增加细胞的扩增倍数，获得的细胞活性更强。

Description

CIK的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CIK的制备方法。

背景技术

CIK(cytokine-inducedkiller，中文名：[自体细胞免疫疗法]多种细胞因子诱导的杀伤细胞)是单个核细胞在抗CD3单克隆抗体和多种细胞因子的作用下培养获得的一群异质细胞群，其中CD3+，CD56+淋巴细胞是主要效应细胞。CIK可直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞；诱导肿瘤细胞凋亡；通过释放大量炎性细胞因子抑制或杀伤肿瘤细胞。CIK具有杀瘤活性高、杀瘤谱广、对正常组织毒性低、体外可高度扩增等特点，在临床细胞免疫疗法中是常用的细胞。

然而，现有的CIK制备方法是在培养瓶等2D环境下联合使用多种细胞因子诱导培养，该培养方法存在细胞增殖效果不佳、细胞活性不足的缺陷。

发明内容

为解决现有CIK制备方法存在细胞增殖效果不佳、细胞活性不足的缺陷，本发明公开了一种CIK的制备方法，在CIK的培养体系中添加纤维蛋白凝胶，以更好地模拟体内细胞生长的三维微环境，从而为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，显著增加细胞的扩增倍数，获得的细胞活性更强。

实现上述目的技术方案是，本发明开发出的一种CIK的制备方法，

该方法包括如下步骤，

获取单个核细胞，将所述单个核细胞与纤维蛋白凝胶混合，再对单个核细胞进行诱导培养成CIK。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述单个核细胞的浓度为1*10²-10⁶个/ml。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述纤维蛋白凝胶的制备过程为：

取抑肽酶溶解纤维蛋白原，获得溶液A；将凝血酶加入可溶性钙盐溶液中，获得溶液B；将溶液A和溶液B混合，即得到纤维蛋白凝胶。

在本发明提供的CIK的制备方法中，可溶性钙盐溶液为CaCl₂溶液，且CaCl₂溶液的浓度为30-50mmol/L。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述溶液B中凝血酶的浓度为250-400U/ml。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述抑肽酶的浓度为1000-3000KIU/ml；所述溶液A中，纤维蛋白原的浓度为1.5～3.5g/L。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述单个核细胞与纤维蛋白凝胶混合后的诱导培养过程为：

将单个核细胞与纤维蛋白凝胶置于含有抗CD3单克隆抗体和RetroNectin预包被的培养器皿中，并加入含PPP和IFN-γ的培养基进行培养；

再添加生长因子IL-1α和IL-2继续培养至单个核细胞转化成CIK。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述抗CD3单克隆抗体的浓度为10-150ng/ml，RetroNectin的浓度为10-50g/ml。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述培养基中PPP的体积分数为0.5-2％，IFN-γ的浓度为500-1500IU/ml。

在本发明提供的CIK的制备方法中，所述IL-1α在培养基中的浓度为50-150IU/ml，IL-2在培养基中的浓度为100-500IU/ml。

本发明的有益效果是：培养CIK时通过加入纤维蛋白凝胶，能够模拟体内细胞生长的三维环境，为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，从而更有利于CIK的生长，可显著增加CIK的扩增倍数，获得的细胞的活性更强。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为通过本发明提供的CIK制备方法实施例1所获得细胞分布图；

图2为通过现有的CIK制备方法所获得的细胞分布图。

具体实施方式

为解决现有CIK制备方法存在细胞增殖效果不佳、细胞活性不足的现象，本发明在CIK的培养体系中添加纤维蛋白凝胶，以更好地模拟体内细胞的生长微环境，从而为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，经该方法制备CIK，可显著增加CIK的扩增倍数，获得的细胞活性更强。

具体地，本发明提供的一种CIK的制备方法，包括如下步骤：

获取单个核细胞，将单个核细胞与处于未凝固或半凝固状态的纤维蛋白凝胶充分混合后置于10-40℃下至纤维蛋白凝胶完全凝固，再对单个核细胞进行诱导培养成CIK。其中，纤维蛋白凝胶至少以1000mm³为一个数量单位，单个核细胞与纤维蛋白凝胶以1*10²-1*10⁶：1的数量比例混合；现有技术中，利用细胞生长因子和培养基将单个核细胞诱导培养成CIK的方法均适用于本发明。

由于纤维蛋白凝胶呈立体状的固化物，且纤维蛋白凝胶具有良好的生物相容性，是一种高分子网络体系，具有三维的孔隙结构，这些孔隙不仅使细胞能自由的迁移、增殖，还为细胞所需营养的渗透提供了基础；细胞在纤维蛋白凝胶内均匀分布，不易被体液冲走、降解，并能有效地黏附多种生长因子，利于细胞的再生；除此之外，由于未凝固的纤维蛋白凝胶有流动改变形态的趋势，不利于细胞均匀的接触到氧气和细胞因子，同时流动的纤维蛋白凝胶对细胞会产生剪切力，造成细胞的损伤；因此，本发明通过将单个核细胞与纤维蛋白凝胶充分混合后，使单个核细胞附着在纤维蛋白凝胶上再将纤维蛋白凝胶完全凝固；利用纤维蛋白凝胶的立体结构模拟体内细胞的生长微环境，从而增大了单个核细胞与细胞生长因子和氧气的接触面积，为单个核细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，提高单个核细胞的转化率，从而提高CIK的数量，增强CIK的活性。

进一步地，纤维蛋白凝胶的制备过程为：

1)取抑肽酶溶解冻干纤维蛋白原，获得溶液A；

2)将凝血酶加入可溶性钙盐溶液中，获得溶液B；

3)将溶液A和溶液B混合，即得到未凝固或半凝固的纤维蛋白凝胶，并将其置于2-48℃下避光保存备用。

其中，步骤1)中抑肽酶的浓度为1000-3000KIU/ml，取1ml抑肽酶溶解冻干纤维蛋白原，并使纤维蛋白原在溶液A中的终浓度为1.5～3.5g/L即可；

步骤2)中凝血酶的浓度为1000-500U/ml；优选地，可溶性钙盐溶液为CaCl₂且CaCl₂的浓度为40mmol/L；溶液B中，凝血酶的浓度为250-400U/ml。

步骤3)中，将溶液A和溶液B混合后得到的未凝固的纤维蛋白凝胶，置于底面积为100mm²模具中制作成圆柱体，优选地，将纤维蛋白凝胶制作成1000mm³的圆柱体或球体，更适合细胞附着生长，可以理解的是纤维蛋白凝胶的体积及形状也并不局限于此，也可以是大于1000mm³的立方体等。

其中，凝血酶能够酶切纤维蛋白原，释放出纤维蛋白A肽及B肽，使之形成了纤维蛋白单体，纤维蛋白单体可由氢键及静电引力作用聚合成不稳定的可溶性纤维蛋白纤维；凝血酶同时还能够激活因子，在钙离子存在下参与纤维蛋白多肽的交联，使纤维蛋白纤维和多肽形成坚固不易降解的凝块，使之结构更加稳定，即形成纤维蛋白凝胶。而抑肽酶又能够防止纤维蛋白凝胶中的蛋白酶解，使得附着在纤维蛋白凝胶上的细胞不易脱落，因此，本发明采用的纤维蛋白凝胶能够为单个核细胞提供一个适宜生长转化的立体环境。

可以理解的是，以上仅为本发明提供的纤维蛋白凝胶的其中一种制备方法，在本发明提供的制备纤维蛋白凝胶的原理基础上，采用现有技术中其他制备纤维蛋白凝胶的方法同样适用于本发明。

进一步地，本发明优先采用从血液中分离获取单个核细胞，具体过程为：

A.取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml的无菌离心管中，300g离心10min，将所有的上层血浆转移到2个新的无菌离心管中，56℃水浴灭活30min，再于400g离心10min后，收集上层黄色液体即低血小板血浆(PoorPlateletPlasma，PPP)，4℃储存备用；

B.向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，直到每管30ml混合液，用移液器混匀，再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将血细胞混合液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层，400g离心20min；

C.吸取中间白膜层至新的50ml离心管中，用生理盐水补液到45ml后，离心洗涤单个核细胞2次。

在本发明中将单个核细胞与纤维蛋白凝胶混合后的诱导培养过程为：

1)将单个核细胞与纤维蛋白凝胶混合后置于CD3McAb(抗CD3单克隆抗体)和RetroNectin(重组人纤维蛋白片段)预包被的培养器皿中，并加入含PPP和IFN-γ(γ干扰素)的培养基；

2)第2天，添加IL-1α(白介素1α)和IL-2培养，即可收获CIK；

步骤1)中，采用浓度为10-150ng/ml的CD3McAb和浓度为10-50g/ml的RetroNectin预包被培养器皿，具体预包被过程为现有技术，在此不再赘述。优选地，培养基为GTT551培养基，且GTT551培养基中PPP的体积分数为1％，IFN-γ的浓度为1000IU/ml。CD3McAb和RetroNectin均可刺激单个核细胞生长，与PPP和IFN-γ细胞生长因子配合可促进单个核细胞转化为CIK。

步骤2)中，添加细胞生长因子IL-1α和IL-2，并使其在培养基中的终浓度分别为：50-150IU/ml、100-500IU/ml。IL-1a与IFN-γ和CD3McAb合用时，可以明显提高CIK的细胞毒活性；而IL-2用于促进CIK的增殖。

进一步地，在步骤2)之后，还可以继续对CIK进行培养增殖，以达到临床回输治疗病人的需求，具体步骤为：

3)第3天，补充步骤1)中的培养基，同时添加IL-2，维持IL-2在培养基中浓度不变，对CIK进行扩增；

4)每隔2-3天重复步骤3)；

5)第14-21天，收获增殖后的CIK。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明开发出的一种CIK的制备方法，包括以下步骤：

(1)从血液中将单个核细胞分离出来；

(2)将单个核细胞悬液与1000mm³/个未凝固的纤维蛋白凝胶以1*10⁴：1的比例混合后，置于37℃恒温箱内至纤维蛋白凝胶完全凝固，然后将凝固且带有单个核细胞的纤维蛋白凝胶置于50ng/ml的CD3McAb和10g/ml的RetroNectin预包被的培养瓶中，并加入含1％体积分数的PPP和1000IU/ml浓度的IFN-γ的GTT551培养基；

(3)第2天，添加IL-1α和IL-2，并使其在步骤2)中GTT551培养基中的终浓度分别为100IU/ml、300IU/ml；

(4)第3天，补充步骤2)中的GTT551培养基至体积为100ml，同时添加IL-2,维持其在培养基中的浓度300IU/ml不变；

(5)每隔2-3天重复步骤4)对CIK进行扩增；

(6)第21天收获扩增后的CIK。

其中，步骤(2)中纤维蛋白凝胶的制备方法为：

1)配制2000KIU/ml抑肽酶，取配制好的抑肽酶1ml溶解多肽偶联的冻干纤维蛋白原,配制出纤维蛋白原终浓度为2.0g/L的溶液A；

2)将凝血酶加入40mmol/LCaCl₂溶液中，配制出凝血酶浓度为300U/ml的溶液B；

3)将溶液A和溶液B混合，在底面积为100mm²模具中制作成为圆柱体的复合物，即得到未凝固的纤维蛋白凝胶，4℃冰箱保存备用。

为进一步验证本发明的有益效果，对本发明所获得CIK进行相应参数的检测验证，具体如下：

以下实验的检测对象为：

1、实验组：本发明实施例1所获得的CIK

2、对照组：通过现有技术中的方法所获得的CIK，与本发明实施例1不同的是，该方法中未加入纤维蛋白凝胶与单个核细胞混合，而是直接对单个核细胞进行诱导培养成CIK，诱导培养过程与本发明实施例1基本相同。

实验一、采用台盼蓝法进行CIK细胞计数，分别对实验组和对照组的CIK执行以下操作：

用75％酒精清洗计数板和盖玻片，用吸水纸擦干；在每次细胞补液前取10ul细胞悬液和10ul0.4％苔盼蓝充分混合，再加80ul的PBS缓冲液稀释细胞悬液；吸取少量细胞悬液，加入在计数板上的盖玻片内，一定注意不要溢出至计数板上的小槽内，也不要过少或带气泡，在倒置显微镜下观察血球计数板上计数4个大方格内的细胞总数及活力，记录CIK细胞的增殖情况及细胞活力；细胞悬液密度计算公式：细胞密度＝(4个大格细胞总数/4)×10⁴×10(稀释倍数)个/ml。

表1：

检测结果如表1和图1、图2所示，由此可见，通过本发明提供的CIK制备方法显著提高了CIK的增殖率。

实验二、流式细胞仪分别检测实验组和对照组中的CIK表型

1、取CIK置于24孔板，每孔细胞用枪头吹打均匀后，分别收集至15ml离心管中混匀；

2、分别取50ul至1.5mlEP管中，在管底部分别加入10ul的PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8三色直标荧光抗体、2.5ulAPC-CD56直标荧光抗体及PBS缓冲液使反应体系为100ul；

3、常温避光孵育20min；

4、1ml过滤后的PBS缓冲液或鞘液洗2次，以去除未结合的抗体，1500g离心5min，每次离心后小心吸取上清；上机进行细胞表型检测。

表2

检测结果见表2，由表中数据可知，实验组中CD3+CD56+表达率远远高于对照组，因此，本发明提供CIK制备方法所获得的CIK细胞活性较强。

实验三、ELISA法检测CIK分泌的细胞因子，检测结果见表3：

表3

由表3中的数据可知，通过本发明所获的CIK杀瘤活性远远高于现有技术水平。

实施例2

本发明提供的另一种CIK的制备方法，包括以下步骤：

(1)从血液中将单个核细胞分离出来；

(2)将单个核细胞悬液与1000mm³/个未凝固的纤维蛋白凝胶以1*10²：1的比例混合后，置于37℃恒温箱内至纤维蛋白凝胶完全凝固，然后将凝固且带有单个核细胞的纤维蛋白凝胶置于10ng/ml的CD3McAb和50g/ml的RetroNectin预包被的培养瓶中，并加入含0.5％体积分数的PPP和1500IU/ml浓度的IFN-γ的GTT551培养基；

(3)第2天，添加IL-1α和IL-2，并使其在步骤2)中GTT551培养基中的终浓度分别为50IU/ml、100IU/ml；

(4)第3天，补充步骤2)中的GTT551培养基至体积为100ml，同时添加IL-2,维持其在培养基中的浓度100IU/ml不变；

(5)每隔2-3天重复步骤4)对CIK进行扩增；

(6)第21天收获扩增后的CIK。

其中，步骤(2)中纤维蛋白凝胶的制备方法为：

1)配制1000KIU/ml抑肽酶，取配制好的抑肽酶1ml溶解多肽偶联的冻干纤维蛋白原,配制出纤维蛋白原终浓度为1.5g/L的溶液A；

2)将凝血酶加入40mmol/LCaCl₂溶液中，配制出凝血酶浓度为250U/ml的溶液B；

3)将溶液A和溶液B混合，在底面积为100mm²模具中制作成为圆柱体的复合物，即得到未凝固的纤维蛋白凝胶，4℃冰箱保存备用。

实施例3

本发明提供的另一种CIK的制备方法，包括以下步骤：

(1)从血液中将单个核细胞分离出来；

(2)将单个核细胞悬液与1000mm³/个未凝固的纤维蛋白凝胶以1*10⁶：1的比例混合后，置于37℃恒温箱内至纤维蛋白凝胶完全凝固，然后将凝固且带有单个核细胞的纤维蛋白凝胶置于150ng/ml的CD3McAb和25g/ml的RetroNectin预包被的培养瓶中，并加入含2％体积分数的PPP和500IU/ml浓度的IFN-γ的GTT551培养基；

(3)第2天，添加IL-1α和IL-2，并使其在步骤2)中GTT551培养基中的终浓度分别为150IU/ml、500IU/ml；

(4)第3天，补充步骤2)中的GTT551培养基至体积为100ml，同时添加IL-2,维持其在培养基中的浓度500IU/ml不变；

(5)每隔2-3天重复步骤4)对CIK进行扩增；

(6)第21天收获扩增后的CIK。

其中，步骤(2)中纤维蛋白凝胶的制备方法为：

1)配制3000KIU/ml抑肽酶，取配制好的抑肽酶1ml溶解多肽偶联的冻干纤维蛋白原,配置出纤维蛋白原终浓度为3.5g/L的溶液A；

2)将凝血酶加入40mmol/LCaCl₂溶液中，配制出凝血酶浓度为400U/ml的溶液B；

3)将溶液A和溶液B混合，在底面积为100mm²模具中制作成为圆柱体的复合物，即得到纤维蛋白凝胶，4℃冰箱保存备用。

综上所述，本发明提供的CIK制备方法中，通过添加纤维蛋白凝胶，增加单个核细胞与培养基及细胞生长因子的接触面，为单个核细胞提供了充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，显著提高了CIK的扩增倍数，并提高了CIK的杀瘤活性，对于临床治疗具有重大意义。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种CIK的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，

获取单个核细胞，将所述单个核细胞与纤维蛋白凝胶混合，再对单个核细胞进行诱导培养成CIK。

2.根据权利要求1所述的CIK的制备方法，其特征在于，所述单个核细胞的浓度为1*10²-10⁶个/ml。

3.根据权利要求1所述的CIK的制备方法，其特征在于，所述纤维蛋白凝胶的制备过程为：

取抑肽酶溶解纤维蛋白原，获得溶液A；将凝血酶加入可溶性钙盐溶液中，获得溶液B；将溶液A和溶液B混合，即得到纤维蛋白凝胶。

4.根据权利要求3所述的CIK的制备方法，其特征在于，可溶性钙盐溶液为CaCl₂溶液，且CaCl₂溶液的浓度为30-50mmol/L。

5.根据权利要求3所述的CIK的制备方法，其特征在于，所述溶液B中凝血酶的浓度为250-400U/ml。

6.根据权利要求3所述的CIK的制备方法，其特征在于，所述抑肽酶的浓度为1000-3000KIU/ml；所述溶液A中纤维蛋白原的浓度为1.5～3.5g/L。

7.根据权利要求1所述的CIK的制备方法，其特征在于，所述单个核细胞与纤维蛋白凝胶混合后的诱导培养过程为：

将单个核细胞与纤维蛋白凝胶置于含有抗CD3单克隆抗体和RetroNectin预包被的培养器皿中，并加入含PPP和IFN-γ的培养基进行培养；

再添加生长因子IL-1α和IL-2继续培养至单个核细胞转化成CIK。

8.根据权利要求7所述的CIK的制备方法，其特征在于，所述抗CD3单克隆抗体的浓度为10-150ng/ml，RetroNectin的浓度为10-50g/ml。

9.根据权利要求7所述的CIK的制备方法，其特征在于，所述培养基中PPP的体积分数为0.5-2％，IFN-γ的浓度为500-1500IU/ml。

10.根据权利要求7所述的CIK的制备方法，其特征在于，所述IL-1α在培养基中的浓度为50-150IU/ml，IL-2在培养基中的浓度为100-500IU/ml。