CN108130314B

CN108130314B - 一种单克隆细胞培养方法

Info

Publication number: CN108130314B
Application number: CN201810067517.0A
Authority: CN
Inventors: 张毅; 任飞飞; 李砺锋; 赵启泰; 李峰; 平玉
Original assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2018-01-24
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2038-01-24
Also published as: CN108130314A

Abstract

本申请属于单克隆细胞培养技术领域，具体涉及一种利用基因编辑技术构建稳定表达细胞系过程中的单克隆细胞培养方法专利申请事宜。该方法以CRISPR/Cas9基因编辑技术为基础，具体包括：利用CRISPR/Cas9技术对基因组进行编辑，利用3D软纤维蛋白基质胶对筛选所得细胞进行培养等步骤。总体而言，本发明将优化后的3D软纤维蛋白基质胶培养条件用于构建单克隆细胞群，大大提高了单细胞的存活率，从而快速筛选出基因修饰一致的，遗传背景完全一样的稳定转染细胞系。特别对于那些普通培养方法难以生长的细胞，具有明显的优势，从而有利于后续实验的进行。

Description

一种单克隆细胞培养方法

技术领域

本申请属于单克隆细胞培养技术领域，具体涉及一种利用基因编辑技术构建稳定转染细胞系过程中的单克隆细胞培养方法专利申请事宜。

背景技术

由单个细胞繁衍所形成的细胞群称之为单克隆细胞群，即：将一个细胞进行培养，使之不断分裂形成一个细胞群的过程，这一群细胞来源于共同的祖先细胞。随着利用慢病毒转染技术构建稳定表达细胞系，以及基因编辑技术的普及，使得单克隆细胞群构建方法也得到了发展，尤其在肿瘤相关研究中，如何获得性状单一、稳定的细胞株尤为重要。

慢病毒属于逆转录病毒科，是一种RNA病毒，其中最为人所知的是人类免疫缺陷病毒(HIV-1)。HIV-1 直径约120nm，含两条正链 RNA，可有效的进入细胞核中，对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率。慢病毒感染细胞后可将所携带的基因整合到细胞基因组中，并且长时间持续稳定表达，同时能够随细胞分裂稳定遗传下去，因此成为导入外源基因的有效工具。

慢病毒载体是以 HIV-1 为基础改造获得的基因治疗载体，通过去除致病基因，同时减少辅助质粒与载体质粒的同源性，使慢病毒具有了滴度更高、生物安全性更好、导入外源片段的能力更强等特性。目前慢病毒系统已经广泛应用到基因过表达、RNA 干扰、miRNA研究及基因敲除等功能研究的细胞和动物实验中。

基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标DNA 片段并插入新的基因片段。目前主要有三种基因编辑技术：重组锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、转录激活因子样效应蛋白核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）以及RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶技术(CRISPR-Cas RGNs)。其中CRISPR-Cas RGNs技术中的CRISPR/Cas9基因编辑技术由于其操作简单、效率高、成本低等优点，被得到广泛应用。简单来说，CRISPR/Cas9(CRISPR-associated 9)是一种由向导RNA(guide RNA，gRNA)指导Cas核酸酶9对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，可以对基因组特定位点进行靶向编辑，包括缺失、插入、修复等操作。

一般而言，利用慢病毒转染系统以及基因编辑技术构建稳定表达细胞系操作过程中，需要培养单个细胞，而这种操作一般在96孔板上采用有限稀释法进行培养筛选。但实际操作过程中，受限于细胞类型或细胞活力等因素影响，对96孔板上部分稀释后细胞培养时，存在有的单个细胞几乎不生长、细胞一直未分裂，或者存活的单个细胞极少等问题，需要铺多个96孔板进行培养才能进行后续筛选操作的缺陷，这些缺陷或者严重影响后续实验操作，或者导致筛选结果的不稳定，因此对于单细胞的培养体系极有必要进一步改进。

发明内容

针对现有利用慢病毒转染系统以及基因编辑技术构建稳定表达细胞系过程中的部分问题，本申请目的在于提供一种更方便、更效率的单克隆细胞培养技术，以便筛选到基因修饰一致、遗传背景一样的稳定转染细胞系。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种单克隆细胞培养方法，该方法以CRISPR/Cas9基因编辑技术为基础，具体包括如下操作步骤：

（一）按现有技术，利用CRISPR/Cas9技术对基因组进行编辑，将CRISPER-Cas9 质粒转染待编辑的细胞；

以具体质粒为例，操作步骤具体参考如下：

（1）首先，设计靶基因的sgRNA序列（可利用美国麻省理工学院张锋教授实验室提供的在线网站http：//crispr.mit.edu/进行设计）；

（2）分别构建重组质粒sgRNAs-PX330以及报告基因质粒pmCherry-EGFP-reporter，具体而言：

A、重组质粒sgRNAs-PX330的构建：

将步骤（1）中设计好的sgRNA上下游引物退火形成双链，连接入经BbsI酶切线性化的PX330质粒，构建获得sgRNAs-PX330重组质粒；

B、报告基因质粒pmCherry-EGFP-reporter的构建：

设计含有 sgRNA 序列的 reporter（报告基因序列），设计时在两端加入两个酶切位点EcoRI 和 XhoI 及终止密码子 TAA；

将所设计的reporter退火形成双链后，连接入经EcoRI 和 XhoI 双酶切的质粒pmCherry-EGFP，构建获得pmCherry-EGFP-repoter；

所构建的pmCherry-EGFP-repoter质粒载体含有红色荧光和绿色荧光标记，用于验证 sgRNA 内源切割效率；

若sgRNA不发挥功能的话，细胞仅表达红色荧光；

但如果sgRNA具有切割活性的话，sgRNA能够指导Cas9对靶基因进行打靶，造成双链断裂的同时也会造成移码突变，终止密码子因为移码突变失去作用，细胞既能表达红色荧光基因又能表达绿色荧光基因，流式检测双阳性荧光细胞数占所有具有荧光的细胞数的比值，即可验证 sgRNA 内源切割效率；

（3）将步骤（2）中所构建的重组质粒sgRNAs-PX330与pmCherry-EGFP-reporter共同转染293T细胞（或脑胶质瘤U87），筛选出切割效率高的质粒sgRNA-PX330，并将活性最高的sgRNA质粒与相应的报告基因质粒共同转染进待编辑的细胞中，流式分选获得既能表达红色荧光基因又能表达绿色荧光基因的目的细胞；

（二）利用3D软纤维蛋白基质胶对步骤（一）中筛选所得细胞进行培养，具体操作步骤参考如下：

（1）用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释步骤（一）中筛选所得目的细胞，稀释目的是为保证后续铺板时孔板上每个孔内为单个细胞；

（2）根据孔板数量，在步骤（1）中稀释后体系中加入纤维蛋白原、T7缓冲液和DMEM培养基，混匀后置于冰上待用；

加入量按孔板上孔数计，具体例如96孔板(平底，每孔容量0.36mL)，每孔中纤维蛋白原（20mg/mL）加入量为2.5μL，每孔中T7缓冲液加入量为22.5μL，每孔中DMEM培养基加入量为25μL；

（3）在预冷的孔板上（-20℃预冷，具体例如96孔板）先加入凝血酶，然后加入步骤（2）中的混合体系，轻轻混匀后，迅速晃动孔板以使混合物均匀铺满板底；

凝血酶以0.1U/mL计，每孔加入量为1.5μL；

（4）将步骤（3）中孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养 40~60min，待混合物充分凝固后，每孔贴壁缓慢加入200μL 含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养5~8d左右（优选培养6d）；

（5）培养结束后，将步骤（4）中的培养物捣碎，加入分散酶 II，再置于37℃、5%CO₂培养箱中15~30min（例如20min）左右，以使混合物充分溶解；

分散酶 II以5mg/mL浓度计，每孔加入量为50μL；

（6）将步骤（5）中溶解后混合物离心，弃上清，并用PBS清洗后，再次离心，弃去上清，具体例如：

将步骤（5）中溶解后混合物2500 rpm离心10 min，弃去上清；再加入适量PBS清洗重悬清洗，再2500 rpm离心10 min，弃去上清，保留沉淀；

（7）在步骤（6）的沉淀中加入胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）以分散细胞和含10%胎牛血清的DMEM培养基，混匀后，继续培养；

每孔中胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）加入量为20μL；每孔中含10％胎牛血清的DMEM培养基加入量为200μL；

（8）对步骤（7）中培养细胞培养12~16d左右后（优选15d），消化后接种与24孔板、以及后续6孔板进行扩大培养，进行Western blot以及测序鉴定。

初步试验结果表明，经过3D软纤维蛋白基质胶培养后，能够明显的提高单个细胞的存活率，从而利于后续快速筛选出纯合的、稳定遗传的细胞系。其主要原理在于：3D软纤维蛋白基质胶培养容纳了更高密度的细胞黏附和增殖空间，有利于细胞间信号传递，更能够模拟细胞体内生长环境。在细胞培养过程中，细胞形态比普通单细胞培养方法更能接近体内生存微环境下的形态，并且使细胞生长空间更大，营养物和代谢物流通顺畅。

总体而言，本发明将优化后的3D软纤维蛋白基质胶培养条件用于构建单克隆细胞群，大大提高了单细胞的存活率，从而快速筛选出基因修饰一致的，遗传背景完全一样的稳定转染细胞系。特别是对于那些普通培养方法难以生长的细胞具有明显的优势，从而有利于后续实验的进行。

附图说明

图1为sgRNA-cas9质粒以及报告基因质粒示意图；

图2为IDH1-sgRNAs-PX330重组质粒以及pmCherry-EGFP-reporter报告基因重组质粒菌落PCR鉴定结果，A：构建的IDH1-sgRNAs-PX330重组质粒菌落PCR鉴定，M：Marker；1,2代表IDH1-sgRNA1-PX330；3,4代表IDH1-sgRNA2-PX330；5,6代表IDH1-sgRNA3-PX330；B：构建的pmCherry-EGFP-reporter报告基因重组质粒菌落PCR鉴定， 1,2代表IDH1-reporter1；3,4代表IDH1-reporter2；5,6代表IDH1-reporter3；M：Marker；

图3为IDH1-sgRNAs-PX330重组质粒以及报告基因质粒共同转染进293T细胞，荧光显微镜观察，筛选活性较高的sgRNA；

图4为IDH1-sgRNAs-PX330重组质粒以及报告基因质粒共同转染进293T细胞，流式检测各个sgRNA 绿色和红色荧光双阳细胞数占所有具有荧光的细胞数的比值；

图5为流式分选仪分选出既表达红色荧光又表达绿色荧光的293T细胞；

图6为分选出的293T细胞在3D软纤维蛋白基质胶培养系统和普通平板单细胞生长速度的差异的比较（A图)以及最终存活单个细胞数目的比较（B图）；3D培养和普通培养方法各铺3块96块板；

图7为流式分选仪分选出既表达红色荧光又表达绿色荧光的脑胶质瘤U87细胞；

图8为分选出的U87细胞在3D软纤维蛋白基质胶培养系统（A图）和普通平板（B图）单细胞生长形态比较；3D培养和普通培养方法各铺3块96块板；

图9为经过3D软纤维蛋白基质胶培养获得的U87单细胞基因敲除效率以及敲除序列鉴定；A图为对筛选出来的单细胞1、2、3、4、5进行Western blot鉴定，B图为进一步将鉴定出的敲除细胞株提取基因组DNA，对靶序列进行PCR扩增并进行测序，鉴定敲除序列。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料及实验设备等基本情况简要说明如下。

生物材料：

PX330质粒，美国Addgene公司；

pmCherry-C1-EGFP质粒，美国Clontech公司；

人胚肾293T细胞、脑胶质瘤U87细胞系，均来源于中国科学院细胞所；

引物序列，由上海生工生物合成提供；

实验试剂：

胎牛血清、DMEM培养基购于GIBCO公司；

限制性内切酶BbsI、限制性内切酶EcoRI、限制性内切酶xhoI均购于NEB公司；

质粒提取试剂盒、基因组 DNA提取试剂盒、蛋白酶 K购自天根生化科技(北京)有限公司；

DNA纯化试剂盒、T4 DNA Ligase、TaqDNA聚合酶、DH5a感受态细胞、1kb DNAmarker均购自 TaKaRa 公司；

琼脂糖购于西班牙BIOWEST公司；

TAE缓冲液、4×蛋白上样缓冲液（含β-巯基乙醇）、RIPA细胞裂解液均购于北京索莱宝科技有限公司；

纤维蛋白原，Salmon公司产品（Reagent proteins，cat# SEA-133，100 mg 装），配制使用时，可先用预冷无菌 ddH2O置于冰上缓慢溶解（试剂比较粘稠，溶解较慢，需要吹打并重新置于冰上溶解操作反复多次），分装后-80℃保存备用；

T7 缓冲液，常规配制试剂，Tris 碱（50 mM）与 NaCl（150 mM）的ddH₂O水溶液，pH=7.4，配制后0.22μm滤器过滤，4℃保存备用；

凝血酶，Salmon公司产品（Reagent proteins, cat# SEA-135, 1000 U 装），使用时用T7 缓冲液稀释为 0.1U/mL（为便于使用，所购买成品可先用T7 缓冲液稀释并分装-80℃保存备用）；

分散酶 II，Roche公司产品（cat# 04942078001），使用时，以Hank’s 缓冲液溶解，终浓度为5mg/mL，-20 ℃保存备用；

纤维胶（3D软纤维蛋白基质胶），按12.5μL纤维蛋白原（20mg/mL）与112.5μL的T7缓冲液的比例，混匀制备而成；

30%聚丙烯酰胺（分析纯），购于东莞市科兴贸易有限公司；

四甲基乙二胺（TEMED）（分析纯），购于华中海威基因科技有限公司；

一抗稀释液，购于碧云天公司；

硝酸纤维素（NC）膜，购于GE Health公司；

ECL化学发光试剂盒，购于Santa Cruze公司；

主要设备：

倒置荧光显微镜，日本olympus公司；

流式细胞仪，美国BD公司；

酸定量检测仪，美国Eppendorf 公司；

电泳仪，中国北京六一仪器厂；

凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；

PCR仪，美国Agilent公司。

实施例

本申请所提供的单克隆细胞培养方法，适用于利用慢病毒转染系统以及基因编辑技术构建稳定表达细胞系过程中应用。本实施例以CRISPR/Cas9基因编辑技术为基础，以敲除脑胶质瘤293T细胞系、U87细胞系中IDH1基因（异柠檬酸脱氢酶-1基因）为例，比较了现有普通培养系统和本申请的利用3D软纤维蛋白基质胶培养系统中单个细胞克隆的生长差异情况，相关实验过程简要介绍如下。

（一）按现有技术，利用CRISPR/Cas9技术对基因组进行编辑，具体而言：设计靶向IDH1的sgRNA序列的设计，并根据其序列设计出可用于筛选较高活性的sgRNA的reporters序列（报告基因序列）；构建重组质粒IDH1-sgRNAs-PX330以及报告基因质粒pmCherry-EGFP-reporter（质粒结构示意图如图1所示）；将构建正确的重组质粒IDH1-sgRNAs-PX330以及报告基因质粒共同转染进293T细胞，根据荧光强度筛选出活性较高的sgRNA；将活性最高的sgRNA质粒以及相对应的报告基因质粒共转染脑胶质瘤U87细胞系以及293T细胞系。具体操作步骤介绍如下。

（1）首先，设计靶向IDH1的sgRNA序列的设计；共设计出了3对sgRNA引物：sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3，碱基序列如SEQ ID NO.1~6所示，具体如下：

sgRNA1：

sgRNA1F：5'-CACCATCATCATAGGTCGTCATGC -3',

sgRNA1R：5'- AAACGCATGACGACCTATGATGAT-3'；

sgRNA2：

sgRNA2F：5'-CACCTACGAAATATTCTGGGTGGC-3',

sgRNA2R：5'-AAACGCCACCCAGAATATTTCGTA-3'；

sgRNA3：

sgRNA3F：5'- CACCTTATCTGCAAAAATATCCCC-3',

sgRNA3R：5'- AAACGGGGATATTTTTGCAGATAA -3'。

（2）分别构建重组质粒IDH1-sgRNAs-PX330以及报告基因质粒pmCherry-EGFP-reporter，具体过程介绍如下。

（2.1）构建重组质粒IDH1-sgRNAs-PX330（包括IDH1-sgRNA1-PX330、IDH1-sgRNA2-PX330、IDH1-sgRNA3-PX330），具体过程如下：

首先，用BbsⅠ酶线性化PX330质粒，并使用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行回收纯化；

其次，将步骤（1）中设计的sgRNA（包括sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3）上下游引物退火形成双链，10 μL反应体系参考设计如下：

上、下游引物，各1 μl（10 μmol/L）；

8 μl去离子水，

混匀后，放入沸腾的水中，待沸水自然冷却至室温即可；

第三，利用T4连接酶将线性化的PX330质粒产物与退火后的sgRNA双链产物进行连接，10 μL连接体系参考设计如下：

sgRNA双链退火产物，1 μl；

PX330质粒线性化产物，50 ng；

T4 Ligation buffer，1 μl；

T4 DNA Ligase，1 μl；

灭菌水补充至10 μl，

16℃连接孵育过夜；

第四，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂于氨苄青霉素抗性 LB 琼脂平板上；

待长出单克隆后，挑取单克隆至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃、250 rpm床培养2~3 h；

对培养菌液进行PCR鉴定，鉴定时以PX330checkF（5'-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3'）作为上游引物，以前述sgRNA的下游引物作为下游引物进行PCR鉴定；

对菌液PCR鉴定正确克隆，进一步摇床过夜扩大培养后抽提质粒送测序鉴定，确保重组载体构建正确，将最终所构建的重组载体分别命名为：IDH1-sgRNA1-PX330、IDH1-sgRNA2-PX330、IDH1-sgRNA3-PX330。

（2.2）构建报告基因质粒pmCherry-EGFP-reporter（即：IDH1-reporter1、IDH1-reporter2、IDH1-reporter3），具体过程如下：

首先，设计含有 sgRNA 序列的 reporter序列（报告基因序列，包括reporter1、reporter2、reporter3），设计时在两端加入两个酶切位点EcoRI 和 XhoI 及终止密码子TAA；序列如SEQ ID NO.7~12所示，具体如下：

reporter1：

reporter1F:5'-TCGACAAACCTATCATCATAGGTCGTCATGCTTATGGGGATAAC-3',

reporter1R: 5'-AATTGTTATCCCCATAAGCATGACGACCTATGATGATAGGTTTG-3',

reporter2：

reporter2F:5'- TCGACAATCACCAAATGGCACCATACGAAATATTCTGGGTGGCACGGTCTTCAGATAAC -3',

reporter2R: 5'-AATTGTTATCTGAAGACCGTGCCACCCAGAATATTTCGTATGGTGCCATTTGGTGATTG-3',

reporter3：

reporter3F:5'-TCGACAGAAGCCATTATCTGCAAAAATATCCCCCGGCTAAC-3',

reporter3R: 5'-AATTGTTAGCCGGGGGATATTTTTGCAGATAATGGCTTCTG-3',

其次，将将所设计的reporter上、下游引物序列进行退火以形成双链；

第三，对报告基因质粒pmCherry-C1-EGFP进行EcoRI 和 XhoI 双酶切，并对酶切产物进行回收、纯化；

第四，利用T4连接酶将退火后的reporter双链产物与质粒pmCherry-C1-EGFP的酶切产物进行连接；

将谅解产物转化DH5α感受态后，培养筛选，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，鉴定时以Reporter checkF（5'-CCGCCAAGCTGAAGGTGAC-3'）为上游引物，以各reporter的下游引物为下游引物进行PCR鉴定；

对菌液PCR鉴定正确的阳性克隆进一步扩增后，抽提质粒进行测序鉴定，最终将构建所得报告基因质粒分别命名为：IDH1-reporter1、IDH1-reporter2、IDH1-reporter3；

需要说明的是，相关操作未详细描述部分参考前述“构建重组质粒IDH1-sgRNAs-PX330”部分相关操作即可。

对于所构建IDH1-sgRNAs-PX330质粒以及pmCherry-EGFP-reporter报告基因的重组质粒的菌液PCR鉴定结果如图2所示，结合分析结果表明插入序列大小与碱基序列均符合预期，重组质粒构建是成功。

（3）转染293T细胞，具体操作过程为：

首先，对293T细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在5%CO₂、37℃恒温培养箱内进行培养，培养一定时间后，将处于对数期生长的细胞接种于孔板上进行培养，培养24h后进行转染操作，转染操作时接种量以转染时细胞密度达到90%为宜，质粒用量和转染方法参考lip3000说明书进行即可。

为检验试验效果，设置组别如下：

实验组：为IDH1-sgRNAs-PX330、pmCherry-EGFP-reporter质粒共转染，两质粒质量比为1:1；

对照组：为单转 reporter 组；

转染48h 后荧光显微镜下观察转染结果，并用流式检测确定切割效率最高的sgRNA。

分选结果如图3、图4所示，结果表明：sgRNA3 切割活性最高，介导的 DNA 重组效率达到95%。

（4）流式分选目的细胞

根据步骤（3）中筛选结果，将筛选出活性最高的IDH1-sgRNA-PX330质粒以及相对应的reporter质粒，分别共同转染293T细胞系以及脑胶质瘤U87细胞系；

转染48h后消化24孔板内细胞，灭菌过滤网过滤，用流式分选仪分选出既红又绿的细胞。

分选结果如图5、图7所示，表明成功分选获得既表达红色荧光又表达绿色荧光的293T以及脑胶质瘤U87细胞。

（1）用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释步骤（一）中筛选所得到的细胞，稀释目的为保证后续铺板时孔板上每个孔内为单个细胞；

（2）根据孔板数量（U87细胞和293T细胞分别铺3块96孔板），在步骤（1）中稀释后体系中加入纤维蛋白原、T7缓冲液和DMEM培养基，混匀后置于冰上待用；

加入量按孔板上（96孔板，平底，每孔容量0.36mL）孔数计，每孔中纤维蛋白原（20mg/mL）加入量为2.5μL，每孔中T7缓冲液加入量为22.5μL，每孔中DMEM培养基加入量为25μL；

（3）在预冷的孔板上（-20℃预冷，96孔板）先加入凝血酶，然后加入步骤（2）中的混合体系，轻轻混匀后，迅速晃动孔板以使混合物均匀铺满板底；

凝血酶以0.1U/mL计，每孔加入量为1.5μL；

（4）将步骤（3）中孔板置于培养箱中培养 60min左右，待混合物充分凝固后，每孔贴壁缓慢加入200μL 含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养6d左右；

（5）培养结束后，将步骤（4）中的培养物捣碎，加入分散酶 II，再置于培养箱中20min左右，以使混合物溶解；

分散酶 II以5mg/mL浓度计，每孔加入量为50μL；

（6）将步骤（5）中溶解后混合物2500 rpm离心10 min，弃去上清；再加入适量PBS清洗重悬清洗，再2500 rpm离心10 min，弃去上清，保留沉淀；

（7）在步骤（6）的沉淀中加入胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）分散细胞和含10%胎牛血清的DMEM培养基，混匀后，继续培养；

每孔中胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）分散细胞加入量为20μL；每孔中含10％胎牛血清的DMEM培养基加入量为200μL。

作为对照，同时利用普通培养方法对步骤（一）中筛选所得细胞进行培养，具体操作步骤参考如下：

用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释步骤（一）中筛选所得到的细胞（稀释目的为保证后续铺板时孔板上每个孔内为单个细胞，并且每孔的体积保持一致），然后在稀释后体系中加入200μL培养基。U87细胞和293T细胞同3D软纤维蛋白基质胶各分别铺3块板。

（三）对步骤（二）中培养细胞培养15d左右后，消化后接种于24孔板、以及后续6孔板进行扩大培养，并进行Western blot以及测序鉴定。

（3.1）Western blot 检测单克隆细胞 IDH1蛋白表达量

具体操作过程如下：

收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入细胞裂解液，冰上裂解20分钟；

4℃、12000 rpm 离心 10 min，离心后的上清即为蛋白质样本；

吸入上清到新的EP管中，采用BCA法测定蛋白质浓度后，加入5×上样缓冲液，沸水煮5min后，进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳检测分析时，蛋白质上样量为20μg。

电泳结束后将蛋白转至PVDF膜上，再用 5％脱脂奶粉室温封闭1h，然后1×TBST洗3遍，每次5 min；

用IDH1 抗体室温孵育膜1h，再用 1×TBST洗3遍，每次5 min；

之后用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的鼠抗兔IgG室温孵育1h，然后用1×TBST洗3遍，每次5 min；

最后用含有HRP底物的ECL显影液显影并拍照。

（3.2）扩增靶位点及测序鉴定

将各组培养细胞消化处理后，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，提取基因组DNA作为模板。以上游引物targetcheckF（5'- TGCTGCAGAAGCTATAAAGAAGC -3'）和下游引物targetcheckR（5'- CCTATTGTGCAGCCAGTGTTG -3'）为引物序列，进行PCR扩增，对扩增产物进行回收纯化后，进行测序，将测序结果与原基因组DNA进行对比，检测是否靶向IDH1成功。

针对步骤（二）中不同培养方法所得细胞的生长速度、细胞形态等培养结果如图6、图8所示，简要分析说明如下：

图6为293T目的细胞在3D培养系统培养和普通培养系统下，单个细胞的生长速度的差异比较以及最终存活单个细胞数目的比较；分析可以看出，虽然3D培养系统和普通培养系统对单细胞的生长速度没有明显差异，但是单细胞经过3D培养，能够明显的提高其生存率，结果具有统计学差异；

图8为分选出的U87细胞在3D 培养系统和普通平板单细胞生长形态比较，分析可以看出，在普通培养系统中U87目的细胞基本上不生长，但是3D培养系统却能正常增殖，可见3D培养系统具有明显的生长优势。

而Western blot鉴定及测序鉴定结果如图9所示，分析可以看出，经过3D培养，成功获得了基因修饰一致的，背景完全一样的、稳定遗传的IDH1基因敲除细胞系。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 一种单克隆细胞培养方法

<130> none

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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<400> 2

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 6

aaacggggat atttttgcag ataa 24

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 7

tcgacaatca ccaaatggca ccatacgaaa tattctgggt ggcacggtct tcagataac 59

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 8

aattgttatc tgaagaccgt gccacccaga atatttcgta tggtgccatt tggtgattg 59

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<212> DNA

<213> 人工设计

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<212> DNA

<213> 人工设计

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<212> DNA

<213> 人工设计

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<212> DNA

<213> 人工设计

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Claims

1.一种单克隆细胞培养方法，其特征在于，该方法具体包括如下操作步骤：

（一）按现有技术，利用CRISPR/Cas9技术对基因组进行编辑，将CRISPER-Cas9 质粒转染待编辑的细胞，通过流式分选出目的细胞；

所述待编辑的细胞为293T细胞或U87细胞；

CRISPR/Cas9技术对基因组具体编辑过程为：

（1）首先，设计靶基因的sgRNA序列；

所述靶基因为IDH1；具体sgRNA序列设计如下：

sgRNA3：

sgRNA3F：5 '- CACCTTATCTGCAAAAATATCCCC-3 '，

sgRNA3R：5 '- AAACGGGGATATTTTTGCAGATAA -3；

（2）分别构建重组质粒IDH1-sgRNA3-PX330以及报告基因质粒pmCherry-EGFP-reporter，以报告基因质粒pmCherry-EGFP-repoter载体IDH1-reporter3来检验sgRNA 的内源切割效率；

所述重组质粒IDH1-sgRNA3-PX330，具体通过如下步骤构建获得：

首先，用BbsⅠ酶线性化PX330质粒，并进行回收纯化；

其次，将sgRNA3上下游引物退火形成双链；

第三，利用T4连接酶将线性化的PX330质粒产物与退火后的sgRNA双链产物进行连接，

第四，将连接产物转化DH5α感受态细胞，并进一步进行筛选、鉴定获得重组载体IDH1-sgRNA3-PX330；

所述报告基因pmCherry-EGFP-repoter载体IDH1-reporter3，具体通过如下步骤构建获得：

首先，设计含有 sgRNA 序列的 reporter序列reporter3，具体如下：

Reporter3F:5 '-TCGACAGAAGCCATTATCTGCAAAAATATCCCCCGGCTAAC-3 '，

Reporter3R: 5 '-AATTGTTAGCCGGGGGATATTTTTGCAGATAATGGCTTCTG-3 '；

其次，将将所设计的reporter序列reporter3上、下游引物序列进行退火以形成双链；

将连接产物转化DH5α感受态细胞后，并进一步进行筛选、鉴定获得重组正确的报告基因pmCherry-EGFP-repoter载体IDH1-reporter3；

（3）将所构建的重组质粒IDH1-sgRNA3-PX330以及报告基因质粒pmCherry-EGFP-reporter共同转染293T细胞或U87细胞进行筛选，流式分选获得既能表达红色荧光基因又能表达绿色荧光基因的目的细胞；

（1）用培养基稀释步骤（一）中筛选所得目的细胞，保证后续铺板时孔板每个孔内为单个细胞；

（2）在步骤（1）中稀释后体系中加入纤维蛋白原、T7缓冲液和培养基，混匀后置于冰上待用；

纤维蛋白原浓度以20mg/mL计，以96孔板计，每孔中纤维蛋白原加入量为2.5μL；

每孔中T7缓冲液加入量为22.5μL；

所述T7缓冲液，按如下方法配制：将Tris 碱50 mM与 NaCl 150 mM的ddH₂O水溶液，配制调节pH=7.4后，0 .22μm滤器过滤，4℃保存备用；

（3）在预冷的孔板上先加入凝血酶，然后加入步骤（2）中的混合体系，混匀后均匀铺满板底；

凝血酶以0.1U/mL计，每孔加入量为1.5μL；

（4）将步骤（3）中孔板置于培养箱中培养 40~60min，补充培养基后，继续培养5~8d；

（5）培养结束后，将步骤（4）中的培养物捣碎，加入分散酶 II，以使混合物充分溶解；

分散酶 II以5mg/mL浓度计，每孔加入量为50μL；

（6）将步骤（5）中溶解后混合物离心，弃上清，并用PBS清洗；

（7）在步骤（6）的沉淀中加入胰蛋白酶-EDTA消化液分散细胞和培养基，混匀后继续培养；

（8）对步骤（7）中培养细胞培养12~16d后，进一步扩大培养。