CN103923876A - 一种单细胞克隆培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单细胞克隆培养方法，包括：步骤1，制备培养液微滴；步骤2，准备显微操作系统；步骤3，筛选单克隆细胞；步骤4，利用步骤2所述的显微操作系统将操作针内的目标细胞以每个液滴放一枚细胞逐一放入步骤1的培养液微滴内，然后进行细胞培养；步骤5，将步骤4培养的细胞在培养2天后进行半量换液；步骤6，扩大培养，获得单细胞克隆。利用本发明的方法，培养液微滴之间的石蜡油隔绝了微滴之间的接触，保证了细胞克隆的单一性；同时由于培养液微滴的体积为5μl以下，所培养细胞分泌的生物因子不被过度稀释，为细胞的生长提供了一个很好的微环境。

Description

一种单细胞克隆培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，特别是涉及一种单细胞克隆培养方法。

背景技术

目前所用的单细胞克隆培养方法是将细胞无限稀释，达到一定的稀释浓度后在培养皿中培养或加入96孔板培养，以实现单个细胞的独立生长成为克隆。培养皿中培养时，在培养皿中培养的细胞在贴壁前处于漂浮状态，很容易与另一个细胞接触或在同一个地方贴壁形成一个克隆，随着细胞增殖数目增多，处于分裂状态的细胞由于贴壁性较差，也会移动到别的细胞克隆里，不能完全保证克隆的单一来源性；另一方面由于最开始培养时为了防止细胞密度太大而导致多个细胞接触成为一个克隆，细胞密度很低，使得细胞所处的环境非常大，细胞自身分泌的一些因子被极度稀释，影响了细胞的自我调节和生长速度。在96孔板培养时，由于细胞的沉降速度存在差异，或者边缘角落不容易看清楚，以及最少20μl的培养体系，存在相同的隐患和不足。此外，在筛选转基因细胞时，由于部分细胞转染效率低下，当转染后只获得数量很少的阳性细胞时，进行常规药物筛选和单克隆培养具有很大的难度。

发明内容

本发明的目的是提出一种单细胞克隆培养方法，以解决单细胞克隆纯度无法保证及培养困难的问题和低转染效率细胞筛选难的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：一种单细胞克隆培养方法，包括以下步骤：

步骤1，制备培养液微滴：在培养皿的间隔位置逐一地加入第一体积的培养液，形成液滴；随后用石蜡油覆盖所述液滴，然后再向每个液滴内补入第二体积的培养液，形成培养液微滴；将其放入培养箱平衡，等待细胞的放入；

步骤2，准备显微操作系统：利用拉针仪拉制出细胞操作针，并安装到显微操作仪上；

步骤3，筛选单克隆细胞：将待筛选的细胞消化成单细胞悬液并放入细胞培养皿中，利用步骤2所述的显微操作系统根据筛选要求挑选目标细胞，将目标细胞逐一吸入显微操作针内；

步骤4，利用步骤2所述的显微操作系统将操作针内的目标细胞以每个液滴培养一枚细胞逐一放入步骤1的培养液微滴内，然后进行细胞培养；

步骤5，对步骤4中所培养细胞经过2天培养后，进行半量换液；

步骤6，扩大培养：对步骤4中经过4～5天培养形成的细胞克隆进行消化处理，分别将每个培养液微滴中消化出的细胞移入96孔板进行培养，获得细胞数量更多的单细胞克隆。

如上所述的单细胞克隆培养方法，进一步，步骤1，第一体积的培养液的体积为1～2.5μl，第二体积的培养液的体积为1～2.5μl，培养液微滴总体积为2～5μl，形成培养液微滴。

如上所述的单细胞克隆培养方法，进一步，在显微操作系统的显微镜观察下，将目标细胞利用显微操作系统逐一收集。

如上所述的单细胞克隆培养方法，进一步，所述半量换液是指吸去培养液微滴一半体积的培养液，重新补入37℃的与吸出体积相同的新鲜培养液。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本研究利用显微操作系统和培养液微滴培养体系，可以在高倍镜下仔细的挑选优质待筛选的细胞，再逐个的放入制作好的培养液微滴中，由于培养液微滴之间的石蜡油隔绝了微滴之间的接触，而且放入细胞时是从显微镜中明确观察到，不会存在多放入的情况，也避免了细胞处于悬浮状态时的细胞相互“串门”，保证了细胞克隆的单一性；同时由于培养液微滴的体积为5μl，在细胞分泌生物因子后能够很好的保证因子的浓度不扩散，为细胞的生长提供了一个很好的微环境。此外，由于是人为挑选，所以会对稀缺细胞实现高效筛选。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。

为了解决现有技术中单细胞克隆培养方法的缺点，本发明的发明构思如下：一种单细胞克隆培养方法，包括以下步骤：

步骤1，制备培养液微滴：在培养皿的间隔位置逐一地加入第一体积的培养液，形成液滴；随后用石蜡油覆盖所述液滴，然后再向每个液滴内补入第二体积的培养液，并使液滴总体积不超过5μl，形成培养液微滴；将其放入培养箱平衡，等待细胞的放入；步骤2，准备显微操作系统：利用拉针仪拉制出细胞操作针，并安装到显微操作仪上；步骤3，筛选单克隆细胞：将待筛选的细胞消化成单细胞悬液并放入细胞培养皿中，利用步骤2所述的显微操作系统根据筛选要求挑选目标细胞，将目标细胞逐一放入显微操作针内；步骤4，利用步骤2所述的显微操作系统将操作针内的目标细胞逐一放入步骤1的培养液微滴内，然后进行细胞培养；步骤5，对步骤4形成的细胞培养微滴进行半量换液，即吸出2.5ul原有培养液，重新补入2.5ul温度为37℃的新培养液；步骤6，扩大培养：对步骤4中培养的细胞进行消化处理，分别将每个培养液微滴中消化出的细胞移入96孔板进行培养，获得单细胞克隆。

由上述步骤可知，通过本发明方法，单个的细胞被置于单个的分离培养液微滴中培养，这样就客服了两个现有技术中的难题：其一是，在培养液微滴中培养的细胞不会发生移动到别的细胞克隆里，能够完全保证克隆的单一来源性；另一方面，细胞所处的环境很小，细胞自身分泌的一些因子被稀释程度低，有利于细胞的自我调节和快速生长。

本方法所获得的每一个单克隆，其细胞同源性(即遗传物质完全相同)均为100％，无需证明，而用常规方法所获得的单克隆，其细胞同源性从50％～100％，都有可能，需要进一步证明其同源性；在转基因细胞的筛选中本方法可提高正筛选的效率，不需要负筛选基因的导入，为转染前的载体构建节约了时间，也避免了进行负筛选时G418等药物对细胞的损伤。

细胞在体内或体外生长的时候会通过旁分泌的方式向周围组织液或培养液分泌一些促进自我生长的营养因子和功能因子，能够更好的调节自身生长；在常规单克隆筛选时，一般用10cm培养皿加10ml培养液培养约100个细胞，太多则影响单细胞克隆的形成，这样平均每个细胞周围有100ul培养液，用96孔板筛选时每孔最少加20ul培养液，平均每个细胞周围20μl培养液，而用本培养方法，每个细胞周围最多5μl培养液，其自分泌的因子浓度是96孔板培养液的4倍，是培养皿筛选法的20倍，因此更有利于细胞的生长。

用本方法进行单克隆培养，在96小时后一个细胞可增殖为近300枚细胞，120小时后可增殖为近800枚细胞，此时消化后移入96孔板培养，3天后可长满，耗时约8天；而用常规方法必须进行负筛选，96小时后非转基因细胞还未被全部杀灭，96孔培养方式要使细胞长满也需10～15天，因此为单克隆细胞的获得节约了时间。

实施例1

利用单细胞克隆培养方法培养转基因成纤维细胞，包括以下步骤：

1、用含20％胎牛血清(FBS)的DMEM(dulbecco's modified eaglemedium)培养液在培养皿中制作5μl的微滴；液滴制作分两步，首先

在培养皿的间隔位置逐一地加入2.5μl培养液，形成液滴；随后用石蜡油覆盖所述液滴，然后再向每个液滴内补入2.5μl培养液，使液滴总体积为5μl，形成培养液微滴；将其放入培养箱平衡，等待细胞的放入；

2、准备显微操作系统：利用拉针仪(Narishige公司，型号PN-30)制作内径为20μm前端钝口的细胞操作针，安装到显微操作仪(Eppendorf公司，型号NK2)；

3、筛选单克隆细胞：将前一天转染红色荧光蛋白的绵羊成纤维细胞培养液吸干，用PBS清洗一遍，然后加入0.2～1ml胰酶消化液(PBS胰蛋白酶和EDTA的混合液，其中胰蛋白酶0.2wt％，EDTA0.02wt％)消化1分钟左右，加入足量含血清培养液中和消化，再用1ml移液器吹打皿底10次左右后将所得细胞悬液2000rpm离心5分钟收集细胞，离心后吸去上清，最后加入1ml细胞培养液悬浮细胞，制成单细胞悬液，放入直径6cm细胞培养皿中，在安装有显微操作系统的倒置显微镜上，利用步骤2制作的显微操作针进行筛选细胞，在荧光显微镜下挑选红色、圆形、白光下胞质均匀的细胞逐个吸入显微操作针内，在吸入约20个细胞时进行下一步操作；

4、利用步骤2所述的显微操作系统在视野下逐个将操作针内的绵羊成纤维细胞放入步骤1制作的培养微滴中，而且每滴只释放并培养一个，然后进行细胞培养；

5、将培养的单细胞每天进行观察，在生长达到30％覆盖皿底时(48小时)进行半量换培养液(从每个培养液微滴吸取出2.5μl，再加入2.5μl培养箱37℃平衡新培养液)；

6、扩大培养：当细胞达到90％汇合度时(120小时)，吸去大部分培养液，用37度预热的PBS(磷酸缓冲液)轻柔洗涤多次，然后加入胰酶消化处理，将一个微滴中消化出的细胞(500～800枚)移入96孔板进行继续培养，3天后长满获得单细胞克隆。

实施例2

利用单细胞克隆培养方法筛选培养成肌细胞，包括以下步骤：

1、用含20％胎牛血清(FBS)的DMEM(dulbecco's modified eaglemedium)培养液在培养皿中制作5μl的微滴；液滴制作分两步，首先

在培养皿的间隔位置逐一地加入2.5μl培养液，形成液滴；随后用石蜡油覆盖所述液滴，然后再向每个液滴内补入2.5μl培养液，使液滴总体积为5μl，形成培养液微滴；将其放入培养箱平衡，等待细胞的放入；

2、准备显微操作系统：利用拉针仪(Narishige公司，型号PN-30)制作内径为12μm前端钝口的细胞操作针，安装到显微操作仪(Eppendorf公司，型号NK2)；

3、筛选单克隆细胞：将肌细胞培养液吸干，用PBS清洗一遍，然后加入0.2～1ml胰酶消化液(PBS胰蛋白酶和EDTA的混合液，其中胰蛋白酶0.2wt％，EDTA0.02wt％)消化1分钟左右，加入足量含血清培养液中和消化，再用1ml移液器吹打皿底10次左右后将所得细胞悬液2000rpm离心5分钟收集细胞，离心后吸去上清，最后加入1ml细胞培养液悬浮细胞，制成单细胞悬液，放入直径6cm细胞培养皿中，在安装有显微操作系统的倒置显微镜上，利用步骤1制作的显微操作针进行筛选细胞，在荧光显微镜下挑选直径10μm圆形、颜色偏深的成肌细胞，将细胞逐个吸入显微操作针内，在吸入约20个细胞时进行下一步操作；

4、利用步骤2所述的显微操作系统在视野下逐个将操作针内的成肌细胞放入步骤1制作的培养微滴中，而且每滴只释放并培养一个，然后进行细胞培养；

5、将培养的单细胞每天进行观察，在生长达到30％覆盖皿底时(48小时)进行半量换培养液(从每个培养液微滴吸取出2.5μl，再加入2.5μl新培养液)；

6、扩大培养：当细胞达到90％汇合度时(120小时)，吸去大部分培养液，用37度预热的PBS(磷酸缓冲液)轻柔洗涤多次，然后加入胰酶消化处理，将一个微滴中消化出的细胞(500～800枚)移入96孔板进行继续培养，3天后长满获得单细胞克隆。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种单细胞克隆培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，制备培养液微滴：在培养皿的间隔位置逐一地加入第一体积的培养液，形成液滴；随后用石蜡油覆盖所述液滴，然后再向每个液滴内补入第二体积的培养液，形成培养液微滴；将其放入培养箱平衡，等待细胞的放入；

步骤2，准备显微操作系统：利用拉针仪拉制出细胞操作针，并安装到显微操作仪上；

步骤3，筛选单克隆细胞：将待筛选的细胞消化成单细胞悬液并放入细胞培养皿中，利用步骤2所述的显微操作系统根据筛选要求挑选目标细胞，将目标细胞逐一吸入显微操作针内；

步骤4，利用步骤2所述的显微操作系统将操作针内的目标细胞以每个液滴培养一枚细胞逐一放入步骤1的培养液微滴内，然后进行细胞培养；

步骤5，对步骤4中所培养细胞经过2天培养后，进行半量换液；

步骤6，扩大培养：对步骤4中经过4～5天培养形成的细胞克隆进行消化处理，分别将每个培养液微滴中消化出的细胞移入96孔板进行培养，获得细胞数量更多的单细胞克隆。

2.根据权利要求1所述的单细胞克隆培养方法，其特征在于，步骤1，第一体积的培养液的体积为1～2.5μl，第二体积的培养液的体积为1～2.5μl，培养液微滴总体积为2～5μl，形成培养液微滴。

3.根据权利要求1所述的单细胞克隆培养方法，其特征在于，在显微操作系统的显微镜观察下，将目标细胞利用显微操作系统逐一收集。

4.根据权利要求1所述的单细胞克隆培养方法，其特征在于，所述半量换液是指吸去培养液微滴一半体积的培养液，重新补入37℃的与吸出体积相同的新鲜培养液。