CN103525750B - 培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了培养基及其应用，其中用于制备上皮细胞的培养基包含：基础培养基，所述基础培养基适于上皮细胞生成；DFBS；维生素C磷酸镁酯；以及地塞米松。利用本发明的培养基，在无需加入BMP-4等细胞因子及不采用其他种类细胞制备的条件培养基的条件下，即能够将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，且应用该培养基的诱导方法快速高效、经济简便、分化效果稳定。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及培养基及其应用，更具体地，涉及培养基、试剂盒及其在制备上皮细胞中的用途以及制备上皮细胞的方法。
背景技术
通过将干细胞分化为特定的细胞、组织类型，结合组织工程方法进行组织器官构建，从而应用于临床治疗是再生医学研究的主要内容。在上皮组织和皮肤附属器官构建中，上皮细胞是组织器官构建的核心因素，然而，目前报道的干细胞（包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞）向上皮细胞分化的方法存在着诱导成本高、分化纯度有限、分化时间长、分化效果不稳定等不足。
由此，将诱导干细胞分化为上皮细胞的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够经济、简便、高效地诱导干细胞分化为上皮细胞的方法。
因而，根据本发明的一方面，本发明提供了一种用于制备上皮细胞的培养基。根据本发明的实施例，该培养基包含：基础培养基，所述基础培养基适于上皮细胞生成；DFBS；维生素C磷酸镁酯；以及地塞米松。由此，利用本发明的培养基，在无需加入BMP-4等细胞因子及不采用其他种类细胞制备的条件培养基的条件下，即能够将人胚胎干细胞（ES细胞）和诱导多能干细胞（iPS细胞）诱导分化为上皮细胞，且应用该培养基的诱导方法快速高效、经济简便、分化效果稳定。
其中，需要说明的是，本文中所用的术语“诱导多能性干细胞”是利用病毒感染、脂质体转染、电穿孔、粒子轰击等方法之一将维持干细胞多能性所需的多能性因子导入体细胞，从而诱导体细胞重编程而获得的多能干细胞。其在ES细胞培养条件下，与ES细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与人ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态等方面也与人ES细胞非常相似。上述的表达方式“诱导体细胞重编程”是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于制备上皮细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒中含有DFBS、维生素C磷酸镁酯和地塞米松。由此，利用本发明的试剂盒能够高效地将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，并且分化时间短、分化效果稳定、操作简便、成本较低。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于制备上皮细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含权前面所述的培养基。由此，利用本发明的试剂盒能够有效地将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，且应用该试剂盒的诱导方法快速高效、经济简便、分化效果稳定。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的试剂盒在制备上皮细胞中的用途。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒制备上皮细胞，快速高效、经济简便、分化时间短、分化效果稳定，能够获得典型的上皮细胞。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了前面所述的培养基在制备上皮细胞中的用途。根据本发明的实施例，利用本发明的培养基能够有效地将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，且应用该培养基的诱导方法快速高效、经济简便、分化效果稳定。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种制备上皮细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前面所述的培养基，培养人胚胎干细胞或诱导多能干细胞，以便诱导所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化为上皮细胞。由此，利用本发明的制备上皮细胞的方法，能够在不加入BMP-4等细胞因子及不采用其他种类细胞制备的条件培养基的条件下，高效地将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，且该方法诱导过程快速，操作简便，分化效果稳定，成本较低。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明的一个实施例，制备上皮细胞时，干细胞向上皮细胞诱导分化过程中不同时间点UC-iPS细胞的形态结构图；
图2显示了根据本发明的一个实施例，制备上皮细胞时，干细胞向上皮细胞诱导分化过程中不同时间点的多能性基因及上皮细胞标记基因的表达变化的qPCR检测结果图；
图3显示了根据本发明的一个实施例，制备上皮细胞时，干细胞向上皮细胞诱导分化第14天的多能性基因及上皮细胞标记基因表达的免疫荧光结果图；以及
图4显示了根据本发明的一个实施例，制备上皮细胞时，干细胞向上皮细胞诱导分化第14天的多能性基因及上皮细胞标记基因表达的流式细胞仪检测结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种用于制备上皮细胞的培养基。根据本发明的实施例，该培养基包含：基础培养基，所述基础培养基适于上皮细胞生成；DFBS；维生素C磷酸镁酯；以及地塞米松。由此，利用本发明的培养基，在无需加入BMP-4等细胞因子及不采用其他种类细胞制备的条件培养基的条件下，即能够将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，且应用该培养基的诱导方法快速高效、经济简便、分化效果稳定。
根据本发明的实施例，所述基础培养基的种类不受特别限制，只要利于人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，本领域技术人员，可以根据实际实验条件灵活选择。根据本发明的一些实施例，所述基础培养基为α-MEM培养基。由此，既可以为细胞生长提供充足的营养物质，又可以有效降低成本，同时利于人胚胎干细胞和诱导多能干细胞分化为上皮细胞。
根据本发明的实施例，所述培养基中DFBS、维生素C磷酸镁酯和地塞米松的浓度不受特别限制。根据本发明的一些实施例，所述培养基中含有：10重量%的DFBS；浓度为30μM-100μM的维生素C磷酸镁酯；以及浓度为0.1μM-0.5μM的地塞米松。优选情况下，所述培养基含有：10重量%的DFBS；浓度为50μM的维生素C磷酸镁酯；以及浓度为0.5μM的地塞米松。即该培养基为添加了10重量%的DFBS，浓度为50μM的维生素C磷酸镁酯，以及浓度为0.5μM的地塞米松的α-MEM培养基。由此，利用本发明的培养基可以有效地将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，并且分化时间短，分化效果稳定，同时操作简单，成本较低。
其中，需要说明的是，本文中所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，以0.1的增量变动（+）或（-）。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于制备上皮细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒中含有DFBS、维生素C磷酸镁酯和地塞米松。由此，利用本发明的试剂盒能够高效地将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，并且分化时间短、分化效果稳定、操作简便、成本较低。
根据本发明的实施例，所述DFBS、维生素C磷酸镁酯和地塞米松分别设置在不同的容器中。
根据本发明的实施例，本发明的用于制备上皮细胞的试剂盒进一步包括基础培养基，所述基础培养基为α-MEM培养基。由此，既可以为细胞生长提供充足的营养物质，又可以有效降低成本。根据本发明的一些实施例，所述DFBS、维生素C磷酸镁酯和地塞米松溶解于所述基础培养基中。
根据本发明的实施例，所述基础培养基中DFBS、维生素C磷酸镁酯和地塞米松的浓度不受特别限制。根据本发明的一些实施例，所述基础培养基中含有：10重量%的DFBS；浓度为30μM-100μM的维生素C磷酸镁酯；以及浓度为0.1μM-0.5μM的地塞米松。优选情况下，所述基础培养基中含有：10重量%的DFBS；浓度为50μM的维生素C磷酸镁酯；以及浓度为0.5μM的地塞米松。由此，利用本发明的试剂盒可以有效地将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，并且分化时间短，分化效果稳定，同时操作简单，成本较低。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于制备上皮细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前面所述的培养基。由此，利用本发明的试剂盒能够将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，且应用该培养基的诱导方法快速高效、经济简便、分化效果稳定。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的试剂盒在制备上皮细胞中的用途。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒制备上皮细胞，快速高效、经济简便、分化时间短、分化效果稳定，能够获得典型的上皮细胞。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了前面所述的培养基在制备上皮细胞中的用途。根据本发明的实施例，，利用本发明的培养基能够有效地将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，且应用该培养基的诱导方法快速高效、经济简便、分化效果稳定。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种制备上皮细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前面所述的培养基，培养人胚胎干细胞或诱导多能干细胞，以便诱导所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化为上皮细胞。由此，利用本发明的制备上皮细胞的方法，能够在不加入BMP-4等细胞因子及不采用其他种类细胞制备的条件培养基的条件下，高效地将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞诱导分化为上皮细胞，且该方法诱导过程快速，操作简便，分化效果稳定，成本较低。
根据本发明的实施例，所述诱导多能干细胞衍生自皮肤成纤维细胞、牙周膜干细胞和尿液细胞的至少一种。由此，诱导多能干细胞能够有效地分化为上皮细胞，提高诱导分化的效率。
根据本发明的实施例，为了实现更好的分化效果，在将所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞进行分化培养，需要利用含有10μM Y-27632的mTeSR1TM培养基、E8培养基或KSR条件培养基，于37℃条件下将所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞孵育1小时，然后利用Accutase进行消化3-5min，以便使所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞消化为单细胞。由此，利于后续的分化培养，以便达到更好的分化效果。
根据本发明的实施例，在培养所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞之前，进一步包括对所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞进行预培养。由此，有利于后续所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞的培养，提高制备上皮细胞的效率。
根据本发明的实施例，对所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞进行预培养的培养基的种类不受特别限制，只要有利于对人胚胎干细胞或诱导多能干细胞进行活化，并使其保持干性即可，本领域技术人员可以根据实际条件灵活选择。根据本发明的一些具体示例，通过Metrigel包被的培养板，利用选自mTeSR1TM、E8培养基和KSR条件培养基的至少一种进行所述预培养。由此，经过预培养的人胚胎干细胞或诱导多能干细胞干性好，便于进行后续的诱导分化培养，有利于提高制备上皮细胞的效率。
根据本发明的实施例，对所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞进行分化培养的培养板及接种密度不受特别限制。根据本发明的一些实施例，通过I型胶原包被的6孔培养板，保持1.5-2.0×105细胞/孔的接种密度，进行所述分化培养。由此，使得所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞在最合适的环境下进行分化培养，利于所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞向上皮细胞转化。
根据本发明的实施例，进行所述培养的时间不受特别限制。根据本发明的一些实施例，进行所述培养10-20天。根据本发明的一个优选实施例，进行所述培养14天。由此，分化得到的细胞形态较为均一，排列紧密，呈现典型的上皮样细胞形态，且无非上皮样形态的杂细胞出现。
根据本发明的实施例，进行所述培养时，隔日全量换液。由此，能够为细胞提供充足的营养物质，保证细胞的生长状态良好。需要说明的是，上述使用的表达方式“隔日全量换液”是指每两天更换一次培养基。
根据本发明的实施例，进一步包括：在进行所述培养的第一天，向所述培养基中添加10μM的Y-27632。由此，能够有效降低处于单细胞状态的人iPS细胞的凋亡水平。
根据本发明的实施例，进一步包括：通过选自免疫荧光和流式细胞术的至少一种方法对所述上皮细胞进行鉴定。根据本发明的一些实施例，所述鉴定是通过检测上皮细胞特异标记K14、K15、K18、K19、CD29和P63，以及干细胞多能性特异标记Oct4和Nanog的至少一种实现的。由此，通过检测制备获得的细胞的干细胞多能性特异标记和上皮细胞特异标记的表达情况，能够有效地确定其是否为目的细胞——上皮细胞。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1.人ES细胞和iPS细胞的预培养
材料与试剂：H1人胚胎干细胞（H1-ES细胞），尿液细胞来源的诱导多能干细胞（UC-iPS细胞），mTeSRTM1培养基（STEMCELL catalog#05850）。
方法步骤：将H1-ES细胞和UC-iPS细胞接种于用Metrigel（BD catalog#354277）包被的培养板中，加入mTeSRTM1培养基，于37℃，5%CO2条件下进行培养，约4-6天采用2mg/ml的Dispase酶（Gibco catalog#17105-041）消化传代一次。
实施例2.人ES细胞和iPS细胞的分化培养
材料与试剂：H1-ES细胞；UC-iPS细胞；添加有10重量%的DFBS（Hyclone catalog#SH30070.03），50μM维生素C磷酸镁酯（Sigma catalog#A8960）和0.5μM地塞米松（Sigmacatalog#D4902）的α-MEM培养基（Gibco catalog#32561-037）；Accutase（Sigma catalog#A6964）；牛I型胶原（BD catalog#354231）。
方法步骤：将实施例1中预培养获得的H1-ES细胞或UC-iPS细胞用含有10μM Y-27632的干细胞培养基，于37℃条件下孵育1小时，随后，将H1-ES细胞或UC-iPS细胞用Accutase消化3-5min，吹打为单细胞，然后接种在I型胶原包被的6孔板中，接种密度为1.5-2.0×105细胞/孔，用分化培养基进行培养，其中，在培养的第一天，进一步向培养基中加入终浓度为10μM的Y-27632（此后换液不需加Y-27632），此后隔日全量换液，培养14天可见典型上皮样细胞形成。培养过程中，于不同时间点，利用倒置相差显微镜观察细胞的生长形态、通过免疫荧光及流式细胞仪检测上皮细胞标记基因的表达情况。
其中，以UC-iPS细胞为例，当对UC-iPS细胞进行培养时，各种检测结果如下：
UC-iPS细胞分化培养0、7、14、21、28天的形态结构如图1所示。由图1可以看出，分化培养前，UC-iPS细胞呈克隆样生长；诱导分化第7天，细胞发生明显形变，呈扁平状生长，初步呈现上皮样细胞形态；诱导分化第14天，细胞形态较为均一，排列紧密，呈现典型上皮样细胞形态；在诱导分化的第21天，有少部分非上皮样形态的杂细胞出现；诱导分化28天后，杂细胞会进一步增殖，细胞形态明显不均一。由此表明，诱导分化14天是较好的时间点，而且，这时的上皮细胞可以通过2mg/ml的Dispase酶进行消化，以一层膜状结构的形态进行收集。
UC-iPS细胞分化培养0、7、14、21、28天，干细胞多能性基因以及上皮细胞标记基因的表达检测结果如图2所示。由图2可以看出，在分化培养的前14天，随着培养时间的延长，干细胞多能性基因表达逐渐下调，上皮细胞标记基因的表达程度逐渐升高，大多数上皮细胞标记基因在分化后第14天达到最高的表达水平；14天以后，随着诱导分化的持续，可能由于非上皮形态的杂细胞增殖，部分上皮细胞标记基因的表达逐渐下降。
其中，分化培养第14天的UC-iPS细胞的免疫荧光及流式细胞仪检测结果分别如图3和图4所示。从图3的免疫荧光结果可见：iPS细胞分化后第14天形成的上皮细胞在多能性基因（Nanog）表达上呈阴性，iPS细胞用做阳性对照，可见Nanog呈阳性（图3中C1-C3）；同时，细胞明显表达上皮细胞标记基因p63、K14、K15、K18和K19。其中，图中左侧一栏为绿色荧光下观测到的荧光染色结果，中间一栏为对应视野的细胞核DAPI染色结果，右侧一栏为前二者的合成图，图中标尺为100μm。从图4流式细胞仪检测结果可见，iPS细胞分化后第14天形成的上皮细胞基本不表达多能性基因Nanog，同时，在不同程度上表达上皮细胞标记蛋白，其中，K14和K18的表达较高，p63、K15和K19的表达较低，其中，每个流式图左侧峰为同行对照组，右侧峰为实验组。上述结果均表明iPS细胞成功分化为上皮细胞。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种用于制备上皮细胞的培养基，其特征在于，包含：
基础培养基，所述基础培养基适于上皮细胞生成；
DFBS；
维生素C磷酸镁酯；以及
地塞米松，
其中，所述基础培养基为α-MEM培养基，
按照重量百分比，所述培养基含有：
10重量％的DFBS；
浓度为50μM的维生素C磷酸镁酯；以及
浓度为0.5μM的地塞米松。
2.一种用于制备上皮细胞的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的培养基。
3.权利要求2所述的试剂盒在制备上皮细胞中的用途。
4.权利要求1所述的培养基在制备上皮细胞中的用途。
5.一种制备上皮细胞的方法，其特征在于，包括：
利用权利要求1所述的培养基，培养人胚胎干细胞或诱导多能干细胞，以便诱导所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化为上皮细胞，
其中，所述人胚胎干细胞为H1人胚胎干细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导多能干细胞衍生自皮肤成纤维细胞、牙周膜干细胞和尿液细胞的至少一种，
任选地，在培养所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞之前，进一步包括：将所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞消化为单细胞，
任选地，利用Accutase进行所述消化3-5min，
任选地，在进行所述消化之前，进一步包括：利用含有10μM Y-27632的mTeSRTM1培养基、E8培养基或KSR条件培养基，于37℃条件下将所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞孵育1小时，
任选地，在培养所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞之前，进一步包括对所述人胚胎干细胞或诱导多能干细胞进行预培养，
任选地，通过Matrigel包被的培养板，利用选自mTeSRTM1、E8培养基和KSR条件培养基的至少一种进行所述预培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过I型胶原包被的6孔培养板，保持1.5-2.0×105细胞/孔的接种密度，进行所述培养，
任选地，进行所述培养10-20天，
任选地，进行所述培养时，隔日全量换液，
任选地，进一步包括：在进行所述培养的第一天，向所述培养基中添加10μM的Y-27632，
任选地，进一步包括：通过选自免疫荧光和流式细胞术的至少一种方法对所述上皮细胞进行鉴定，
任选地，所述鉴定是通过检测上皮细胞特异标记K14、K15、K18、K19、CD29和P63，以及干细胞多能性特异标记Oct4和Nanog的至少一种实现的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，进行所述培养14天。
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