CN101684455A - 抗坏血酸在诱导多能干细胞制备和胚胎干细胞培养的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用抗坏血酸(VC)或其衍生物高效产生诱导多能干细胞(iPSC)的方法，同时公开了利用抗坏血酸产生iPSC的培养基用于胚胎干细胞(ESC)的培养的方法。在本发明中，利用含有VC或其衍生物的培养基可以将小鼠或人的iPSC产生效率提高10－100倍；同时利用VC的ESC培养基显著改善了iPS细胞以及ESC的生长状态。本发明为VC或其衍生物在iPSC以及ESC在再生医学研究中的应用提供了一种简便易行的新方法。

Description

抗坏血酸在诱导多能干细胞制备和胚胎干细胞培养的应用

一，技术领域

本法明涉及再生医学研究领域，特别涉及改进诱导多能干细胞的制备方法以及改善胚胎干细胞的培养方法及其应用。

二，发明背景

胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)来自哺乳动物早期胚胎的内细胞团，在体外培养中能够在自我更新(self-renewal)的同时保持多能性(pluripotency)和向不同组织细胞分化。1981年随着小鼠胚胎干细胞的首次分离成功(Evans and Kaufman，1981；Martin，1981)，胚胎干细胞研究拉开序幕。直到1998年，人的胚胎干细胞得到分离和建立(James A.Thomson 1998)，标志着再生医学研究的真正开始。随后多年的研究集中在两大方面，一是研究胚胎干细胞在自我更新的同时保持多能行的分子机理，同时不断完善不同物种的胚胎干细胞的培养以及建立新的哺乳动物胚胎干细胞；二是建立胚胎干细胞向特定组织细胞的分化方法并研究分化的分子机理。前一方面的标志性事件包括，以Nanog-Oct4-Sox2转录因子为核心的调控网络的阐明(Jonghwan Kim 2008；Xi Chen 2008)；LIF(Hitoshi Niwa 1998)/BMP4(QiLong Ying 2003)/FGF4(Tilo Kunath 2007)信号传导通路的阐明，并因此发现小鼠胚胎干细胞的基态(ground state)培养方法(Qilong Ying et al，2008)。后一方面，利用小鼠和人胚胎干细胞进行的分化研究已经在包括神经细胞，心肌细胞，胰岛细胞，血细胞等多种体外分化过程中得到成功结果，与此同时，也建立了这些分化过程的成熟方法和分子检测标准，同时大大推动了胚胎干细胞或成体干细胞分化的分子机理研究。以上两个方面的研究相对独立但又相辅相成。

在以小鼠胚胎干细胞为核心材料的机理和应用研究快速进展的同时，如何获得作为再生医学研究的关键材料-人胚胎干细胞，尤其是来自病人自身的胚胎干细胞一直以来都面临着巨大的技术困难和伦理争议。

直到2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组在小鼠中初步实现了诱导重编程过程。他们采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导的多能性干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS cell)(Takahashi K 2006)。次年，同一个实验室进一步用Nanog代替Fbx15进行筛选，得到了Nanog+的iPS细胞系，该iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、标志物表达、移植到小鼠皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。此外，研究还发现重新激活原癌基因c-Myc是嵌合体动物出现肿瘤形成的原因；而转染的上述4个基因在iPS细胞中并没有表达，表明这些基因只在诱导过程中起作用，iPS细胞保持多潜能性状态的原因是内源性转录因子，如Nanog等基因的表达(Okita K 2007)。同时，来自美国科学家的研究工作同样证实了上述4个转录因子足以使小鼠成纤维细胞在体外诱导重编程为类似小鼠ES细胞的iPS细胞(Wernig M 2007)。

基于同样或类似的思路，同年(2007年)晚些时候，人的iPS细胞建立获得成功(Takahashi K 2007；Yu J 2007)。随后的研究进一步利用人类皮肤活检组织中提取的体细胞成功诱导为iPS细胞(Park IH2008)，这充分证明了利用这种方法制备患者特异性的干细胞是可行的，因而有望克服细胞异体移植治疗中存在的免疫排斥反应以及避免传统方法带来的伦理争议。

在最近一年的研究工作中，围绕iPS的两大根本问题，即效率低下和安全问题，已经在不断取得突破。虽然有利用非整合型质粒或蛋白质进行重编程的报道(Yu J 2009；Zhou H 2009)，然而归根结底，iPS的效率低下始终对于其发展和应用都将是巨大的障碍。

与此类似，胚胎干细胞的体外长期稳定的培养，不仅是一个关键技术问题，同时又是一个重要的基础研究领域。如何建立一个成分明确并尽量简单，易于操作的胚胎干细胞培养基和培养方法，一直以来都备受关注。

因此，本发明提供了利用抗坏血酸或其衍生物进行体细胞诱导重编程以及胚胎干细胞培养的方法。

三，发明内容

共两部分内容，第一部分，为了提高产生小鼠和人iPS细胞的效率，本发明提供了利用抗坏血酸或其衍生物作为主要添加成分用于产生iPS细胞的具体方法以及应用。具体方法包括以下步骤：

(1)将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；

(2)用本发明提到的添加抗坏血酸或其衍生物的胚胎干细胞培养基，培养(1)中经导入的体细胞，将体细胞诱导重编程为iPS细胞；

(3)利用内源报告基因激活表达或形态观察初步确定(2)中形成克隆的状态；

(4)挑出符合(3)条件的单克隆，即内源报告基因激活或克隆呈现胚胎干细胞在相同培养基中生长的形态；

(5)利用含有抗坏血酸的胚胎干细胞培养基培养(4)中的单克隆细胞；

(6)利用多种检测手段，鉴定(5)中单克隆细胞的状态是否达到类似胚胎干细胞的状态，主要包括定量PCR分析干细胞特异基因表达，分析体内自发分化形成畸胎瘤的能力，对于非人iPS细胞，检测嵌合能力，是否有生殖细胞转移(germ line transmission)。

涉及利用抗坏血酸或其衍生物为主要添加剂高效产生iPS的应用有两个方面，一，研究iPS形成的分子机理；二，筛选新的能够显著改变iPS进程的化合物或因子。

第二部分，为了改善小鼠和人胚胎干细胞的体外连续培养，本发明提供了利用抗坏血酸或其衍生物作为主要添加成分用于小鼠，猴和人胚胎干细胞的培养方法以及应用。

当前标准的胚胎干细胞培养方法，主要有两大类。对于使用血清的胚胎干细胞培养基，如小鼠和猴胚胎干细胞的培养基，简单地额外添加抗坏血酸可以显著改善胚胎干细胞的自我更新状态；对于无血清胚胎干细胞培养基，目前国际较公认的培养基有使用血清替代物(KSR)或其他多种添加成分(如TeSR)的胚胎干细胞培养基，这些培养基已经含有抗坏血酸，无须额外添加；但对于其他类型即将开发的无血清干细胞培养基，添加抗坏血酸有利于胚胎干细胞的自我更新状态和多能性维持。因此本发明第二部分内容针对范畴是以血清为主要成分的胚胎干细胞培养基以及不含KSR或TeSR的其他新型无血清培养基。

涉及利用抗坏血酸或其衍生物为主要添加剂改善胚胎干细胞的自我更新状态的应用有两个方面，一，研究胚胎干细胞维持自我更新和多能性的分子机理；二，筛选新的能够显著影响胚胎干细胞自我更新和多能性的化合物或因子。

四，附图说明

图一，VC显著提高OG2小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的诱导重编程效率。在以血清为基础的小鼠iPS实验中，与其他抗氧化剂(维生素B1，VB1；N-乙酰半胱氨酸，NAC；还原型谷胱甘肽，Gmee；亚硒酸钠，Sel)相比，VC显著提高经典四因子SKOM(Sox2，Oct4，Klf4和cMyc)和三因子SKO(Sox2，Oct4和Klf4)的iPS效率(iPS效率以流式细胞仪分别检测四因子第9天以及三因子第16天转基因Oct4启动子驱动的GFP基因表达效率)。

图二，用添加有VC的血清胚胎干细胞培养基制备的iPS克隆具有与胚胎干细胞相似的多能性。(A)用mES+VC培养基制备的不同小鼠iPS克隆细胞内源胚胎干细胞标记基因的表达用实时定量PCR检测结果与小鼠胚胎干细胞系R1基本一致；(B)不同小鼠iPS克隆细胞胚胎干细胞标记基因Nanog启动子甲基化水平检测结果与R1一致，显著低于iPS初始细胞MEF(黑色实心圈代表该位点甲基化，空心圈代表去甲基化)；(C)这些iPS克隆细胞具有多能性，分别体现在在裸鼠畸胎瘤实验中能够形成内(腺体)，中(骨骼)，外胚层(皮肤)细胞，以及形成嵌合小鼠(蓝色胚胎来自OG2小鼠的lacZ转基因染色)。

图三，其他抗坏血酸衍生物对小鼠iPS的影响。与对照相比，抗坏血酸(LAA)，稳定型衍生物抗坏血酸磷酸酯(ASCP)均能显著提高四因子和三因子iPS效率，但是氧化型抗坏血酸(DHA)则对iPS无显著影响。

图四，VC促进iPS前体细胞(pre-iPS cells)向完全iPS细胞(full-iPS cells)的转变。(A)MEF iPS前体细胞C2，C4和C5用含有VC的培养基处理9代后GFP阳性率显著提高，而对照组不加VC的GFP阳性率持续很低；(B)C2和C4加VC处理后的克隆形态和GFP荧光情况比较相同代数的未处理对照细胞更加接近mES细胞。

图五，VC有利于iPS细胞维持自我更新状态。。(A)iPS细胞在含VC培养基中能更好的维持Oct4-GFP的表达；(B)iPS细胞在含VC培养基中能更好维持胚胎干细胞形态和GFP克隆比例。

图六，用添加有VC的培养基制备的人iPS细胞形态与人ESC没有明显区别。(A)人成体细胞形态；(B，C)以VC为主要添加剂制备的人iPS克隆AP染色及形态图；(D)人iPS克隆在无滋养层培养的形态图。

图七，用添加有VC的培养基制备的iPS的效率比较其他经典或已报道的培养基显著提高。在图示中的三次独立实验中，以AP染色阳性克隆数为指标(纵坐标)衡量不同培养基，包括单纯血清(DFBS)，血清加以VC为主的抗氧化剂(DFBS+A)，单纯血清替代物(KSR)，以及血清加丙戊酸(VPA)，结果显示，DFBS+A得到的AP阳性iPS效率显著高于其他培养基，值得注意的是，该组合甚至高于目前国际已报道的显著提高人iPS效率的VPA。

图八，含有VC的培养基用于细胞因子对小鼠iPS效率影响的筛选。相比经典的mES培养基，添加以VC为主的抗氧化剂(A)培养基更有利于细胞因子对iPS影响的筛选。具体体现在在mES中没有显著差异的bFGF在mES+A中显著提高iPS效率。

五，具体实施方案

定义和技术

除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODS INENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995))，Harlow和Lane编著，(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL and ANIMALCELL CULTURE(R.I.Freshney编著，(1987))；W.French Anderson等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷2。

除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。

在说明书和权利要求书中使用的，单数型“一个”，和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“(一个)细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。

所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。

本文所述的抗坏血酸添加到培养基中的浓度在1ug/ml-200ug/ml范围内。

本文所述的“抗坏血酸衍生物”是指结构类似抗坏血酸，具有抗氧化活性的类似化合物。这些化合物在保持抗坏血酸生物活性的同时，具有更加稳定或更加易于被细胞吸收的特征。

本文所述的“诱导的多能性干细胞(iPS细胞)”是这样的细胞，其来源是体细胞通过诱导体细胞重编程的干细胞多能性因子体外诱导变化而成，其在ES细胞培养条件下，与ES细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。

本文中所用的术语“体细胞”是相对于“生殖细胞”以及“胚胎干细胞”而言的概念，其是由“胚胎干细胞”分化产生的不再具有多能性，而是具有某一具体功能的细胞，其是由“胚胎干细胞”分化或内细胞团继续发育产生的不再具备多能性，一般具有具体功能的细胞，其一般从发育阶段位于囊胚期(在小鼠中具体为受精后3.5天)之后的胎鼠或成鼠取材，取材时一般避免取到可能具有多能性的生殖细胞及其来源(如精原干细胞、生殖嵴干细胞等)。本文中所用的体细胞优选来源于哺乳动物，更优选来源于人、猴、狗、猫、大鼠或小鼠，最优选地，来源于小鼠。本文中的体细胞可以是机体内任何类型的体细胞，优选为成纤维细胞或脑膜细胞。

本文所述的“诱导体细胞重编程的干细胞多能性因子”为对于干细胞多能性维持关键的因子，通过向体细胞中导入所述因子可以在一定条件下诱导体细胞重编程为胚胎干细胞。迄今为止众多文献已经报道了多个可以用于重编程的这样的因子，参见例如Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D.Direct generationof ES-like cells from unmodified mouse embryonic fibroblasts by Oct4/Sox2/Myc/Klf4.Cell research17，959-962(2007)、Okita，K.，Ichisaka，T.& Yamanaka，S.Generation of germline-competentinduced pluripotent stem cells.Nature 448，313-317(2007)、Wernig，M.等人In vitro reprogrammingof fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.Nature 448，318-324(2007)、Yamanaka，S.Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells.Cell Stem Cell 1，39-49(2007)等等。本领域技术人员已知多种可以用于这样的干细胞多能性因子。优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)，以及Klf4(任选地，Klf5或Klf2)、Esrrb、Nanog、以及Lin28。上述多能性因子可以根据所要导入的细胞而是任何来源的，优选为小鼠的多能性因子以及其变体，如Sox2，NCBI登录号为NM_011443.3(小鼠包含SRY-框的基因2)；Oct4，NCBI登录号为NM_013633.2(小鼠POU结构域，5类，转录因子1(Pou5f1))；Klf4，NCBI登录号为NM_010637.2(小鼠Kruppel-样因子4))；c-Myc，NCBI登录号为NM_010849.4(小鼠髓细胞瘤病癌基因(myelocytomatosis oncogene)(c-Myc))；Sox1，NCBI登录号为NM_009233.3，(小鼠包含基因1的SRY-框)；Klf2，NCBI登录号为NM_008452.2，(小鼠Kruppel-样因子2(肺))；Klf5，NCBI登录号为NM_009769.4，(小鼠Kruppel-样因子5)；Nanog，NCBI登录号为NM_028016；或者Lin28，NCBI登录号为NM_145833。C-Myc还可以被换为其突变体L-myc(登录号为NM_008506.2，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒爱基因同源物1v，肺癌来源的(禽类)((Mycl1)))；或者N-Myc(登录号为NM_008709.3，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因，神经母细胞瘤衍生的(禽类)(Mycn)。

本文所述的术语“诱导重编程”(有时也仅被简化为“诱导”)是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化成为多能性干细胞(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006；126：663-676；Wernig M，Meissner A，ForemanR，等人，Nature.2007；448：318-324；Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K等人Science.2007；318：1917-1920)。其中，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)、Klf4(任选地，Klf5或Klf2)、Nanog、以及Lin28中的一个或多个。

将所述干细胞多能性因子cDNA导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、转座子介导的插入表达、穿膜蛋白、药物诱导、电穿孔、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多种病毒载体。优选地逆转录病毒载体(例如pMX载体)，如实施例中所述的。

本文所述的“适宜细胞生长的条件”是本领域的常规干细胞培养条件，并且包括一些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质的修饰，培养方法以及培养条件参见W.French Anderson等人，HANDBOOKOF STEM CELLS，卷2。

本文所述的报告基因是指能够指示细胞通过外加诱导已经转变为类似胚胎干细胞的阶段，包括利用转基因或同源重组手段加入一段表达荧光蛋白基因或者特种针对普通哺乳动物细胞的抗生素抗性基因序列，这段序列处在胚胎干细胞特异表达的一些基因的启动子的控制下，故而可以在细胞到达类似胚胎干细胞状态时激活这段荧光蛋白或抗性基因的表达，从而使这个细胞具有某些可以被检测的性状特征(如发出绿色荧光或在含有特殊抗生素培养基中能够生长)而区别于其他未重编程至该状态的细胞。本领域技术常用的报告基因包括绿色荧光蛋白，抗性基因例如β-geo抗性基因等。本领域的技术人员可以根据细胞的培养条件和用途选择适合于各种实施方案的报告基因。参考例如Young II Yeom等人，Germline regulatoryelement of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells，Development122，000-000(1996)，Printed in Great Britain，The company of Biologists Limited 1996，881-894页；Shin-ya Hatano等人，Pluripotential competence of cells associated with Nanog activation，Mechanisms of Development 122(2005)，67-79。

本文所述的检测细胞多能性的方法是本领域技术人员熟知的，参见例如Yamanaka，S.Strategies andnew developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells.Cell Stem Cell1，39-49(2007)等。所述方法包括鉴定多能性分子标记的表达、细胞的甲基化状态检测、胚胎小体EB的形成、畸胎瘤的形成以及施用经诱导的多能性干细胞形成嵌合鼠等等。

本文所述的“嵌合鼠”是通过本领域普通技术人员熟知的“嵌合鼠”技术实施的。是指将胚胎干细胞或通过本文技术获得的iPS细胞注射入小鼠囊胚中，使得其与所注射入小鼠的囊胚中的胚胎细胞混合，共同在代孕母鼠中的子宫内生长发育，小鼠出生后全身上下的各个组织即由两种胚胎细胞共同混合组成，如马赛克拼图样，这样的小鼠被称为嵌合鼠(Evans M J，等人；The ability of EK cell to form chimerasafter selection of clones in G418 and some observation on the integration of retroviral vectorproviral DNA into EK cells[M]；Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology；1985年；Xian MW，Wu BY，Hu XL，Shang KG，Wu HL，1996.Construction of chimeric mice of ES cells bymicroinjection method.Hereditas(北京)18(1)：7-10(中文))。使用iPS能否形成嵌合鼠是检验iPS是否与胚胎干细胞具有类似性质的最直接和最关键的证据。

本文所述的“筛选化合物或因子”是指通过对报告基因表达或者细胞本身特性改变如形态接近ESC作为检测指标，筛选1，对iPS效率有显著影响的化合物或因子；2.能够取代诱导iPS过程所需的某个或全部因子的化合物或因子。“因子”指不同类型的生物大分子，如细胞激动素(cytokine)，基因，siRNA，microRNA等。本领域技术人员已经开发了利用iPS过程来筛选化合物的方法，参见例如1，Yan Shi等人，2008年，Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4with Small-Molecule Compounds，Cell Stem Cell 3，568-574；2，CA Lyssiotis等人，2009年，Reprogramming of murine fibroblasts to induced pluripotent stem cells with chemicalcomplementation of Klf4.PNAS 106(22)，8912-7。

实施例

下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例。根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。

本发明中所用技术概述：

除了特别说明，本文中提及的各种物质均来自英杰生命科学公司(Invitrogen)

包装反转录病毒以及诱导iPS细胞

从Addgene公司购置包含小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的DNA的反转录病毒载体(pMXs)。按照现有技术进行病毒的产生和感染(Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D.Direct generation of ES-likecells from unmodified mouse embryonic fibroblasts by Oct4/Sox2/Myc/Klf4.Cell research 17，959-962(2007)；Qin，D.等人Mouse meningiocytes express Sox2 and yield high efficiency ofchimeras after nuclear reprogramming with exogenous factors.J Biol Chem 283，33730-33735(2008).)简言之，利用常规方法将这些质粒转染到PlatE细胞中。48小时后收集病毒上清液并且过滤，以感染MEF，其中补充有1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物。在第二天重复相同的步骤。添加病毒上清液的当天被定义为第0天(D0)。将病毒感染后(即已经转染了Sox2、Klf4、Oct4和/或c-Myc，下文中，如无特殊说明，3因子感染代表用Sox2、Klf4和Oct4感染，4因子感染代表用Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc感染)的成纤维细胞培养在mES培养基中，在感染后13-15天(4因子感染实验)或23-25(3因子感染实验)挑取iPS集落，这是基于Oct-GFP(即在荧光显微镜下发射荧光的集落)和典型的ES形态来挑取的。随后如ES细胞样延展和保持挑取的集落(如上所述Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D，2007；以及Qin，D.等人，2008)。

重编程效率的定量

用于定量重编程效率的主要方法有：1，直接利用流式细胞仪对D9-10天的四因子SKOM或D15-16天的三因子iPS测定Oct3/4-GFP阳性细胞比例；2，在感染原盘或孔中(未分到滋养层细胞上)计数Oct3/4-GFP阳性克隆数；3，将感染后的细胞以确定细胞数分到滋养层细胞上，培养一定时间后，AP染色，计数AP阳性克隆和Oct3/4-GFP阳性克隆。

iPS细胞的表征：

进行碱性磷酸酶和免疫荧光染色(如上所述Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D，2007；以及Qin，D.等人，2008)。使用下列一抗：小鼠抗-Oct4(Santa Cruz公司)、小鼠抗-SSEA1(Abcam公司)，小鼠抗-Nanog(Abcam公司)。

实施例1：利用VC提高小鼠iPS效率。

a，将四因子(SKOM)或三因子(SKO)的病毒以等体积混合(每种病毒1ml)后感染到12孔板的一孔中共计2.0万个OG2小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中，在37度5％CO2培养在mES培养基中。从两次感染结束后D2天起，添加VC或其他化合物(VC，50ug/ml；Vb1，9ug/ml；NAC，1mM；GMEE，1.5ug/ml；Selenite，20nM；抗氧化剂混合物Antiox，即VC+Vb1+GMEE+Selenite)；对四因子，D9-10天消化，对三因子，D15-16天消化，流式检测GFP阳性细胞比例。

如图一所示，与对照组相比，添加VC或含有VC的多种抗氧化剂均显著提高SKOM和SKO的iPS效率。

b，如上所述，将三因子SKO-iPS细胞分到滋养层细胞上，继续用含VC或含VC的抗氧化剂的mES培养基(Vc，50ug/ml)培养，10-14天后挑出GFP阳性的mESC形态的克隆，这些细胞经过去除滋养层细胞，使用Trizol(Takara公司)试剂，按照制造商说明提取总RNA。用M-MLV(Takara公司)试剂盒进行逆转录，并使用

Premix Ex Taq^TM试剂盒(Takara公司)，ABI 7300荧光定量PCR仪(ABI公司)进行Real-Time PCR。所有上述PCR条件均使用常规PCR条件，按照制造商说明进行。其中鉴定iPS各标志物使用引物列表如表1所示。

表1，RT-PCR所用引物

SEQ ID NO：	引物名称(前：因子名称)F：正向；R反向	引物序列
			SEQ ID NO：11	pMX-F	GACGGCATCGCAGCTTGGATACAC
SEQ ID NO：12	pMX-R	TTATCGTCGACCACTGTGCTG
			SEQ ID NO：13	c-Myc-S1093	CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
SEQ ID NO：14	Sox2-S768	GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG
			SEQ ID NO：15	Klf4-S1236	GCGAACTCACACAGGCGAGAAACC
SEQ ID NO：16	Oct3/4-AS210	TGCGGGCGGACATGGGGAATCC

如图二A所示，使用本申请的方法获得的iPS表达较高水平与mESC细胞R1一致的多能性因子Nanog和Rex1，而这些因子在原始MEF细胞中均没有可检测到的表达。

c，根据制造商的说明，使用CpGenome修饰试剂盒(Chemicon公司)进行亚硫酸氢盐处理。处理过程中使用的Nanog启动子的PCR引物见下表2。将上述PCR产物克隆到pMD18-T(Takara公司)载体中，随机选择克隆用于对每个基因测序，所述测序用M13正向和M13反向引物。

表2：PCR所用引物

SEQ ID NO：	引物名称F：正向；R反向	引物序列
			SEQ ID NO：19	mNanogU	AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT
SEQ ID NO：20	mNanogL	CCCACACTCATATCAATATAATAAC

图二B中显示iPS克隆与R1中内源性Nanog启动子区域没有甲基化，而MEF细胞中，上述基因组区域均呈现相对高度甲基化。也就是说，经过诱导重编程的iPS细胞中，内源性多能性干细胞因子Nanog的启动子区去甲基化，从而其表达得以被激活。

d，将消化重悬在PBS中的2百万iPS克隆细胞注射到裸鼠腋下，经过2-3周，解剖裸鼠取出肿瘤，固定，包埋，切片，HE染色观察畸胎瘤分化情况。如图二C所示，iPS细胞成功分化为三个胚层的不同组织细胞，如外胚层的皮肤，中胚层的骨骼，以及内胚层的腺体。

e，将消化重悬在培养基中的iPS细胞注射到ICR小鼠囊胚中的内细胞团中进行嵌合实验，在E12-16天解剖母鼠，对胚胎进行beta-半乳糖酐酶染色，结果如图二C显示，iPS细胞成功嵌合到皮肤组织中。

实施例2：利用VC促进小鼠iPS前体细胞向完全iPS细胞的转化。

用经典的mES培养基诱导产生的多数四因子SKOM-iPS克隆没有GFP表达，初步显示这些细胞没有最终达到完全iPS细胞的状态。我们将这些克隆挑出并连续传代，如图四所示，经过5-9代VC处理，约3/4的克隆出现明显的GFP表达。这些克隆的形态也明显接近mESC细胞，而这些克隆在经典mES培养基中连续传代导致其丧失mESC形态。因此，VC对iPS的促进作用至少一部分体现在将多数前体iPS细胞转化为完全iPS细胞。

实施例3：利用VC维持小鼠iPS细胞稳定传代。

与实施例2类似，我们挑取GFP阳性的iPS克隆，体外以经典mES培养基以及加VC的培养基分别连续传代，经过约5代，如图五所示，在经典mES培养基中，iPS克隆荧光显著丧失，同时克隆也丧失mESC形态；而加有VC的培养基可以相对稳定的维持iPS的GFP荧光表达以及细胞的mESC形态。这说明VC能够维持小鼠iPS细胞的mESC状态。

实施例4，VC提高人iPS效率。

a，细胞的制备和培养

由外科手术废弃物中分离人体组织，培养得到原代细胞，用高葡萄糖DMEM(Dulbcco’s Modifed EagleMedium)培养基(4.5g/L的葡萄糖，HyClone公司)培养所得到的细胞，培养基中包含10％胎牛血清(HyClone公司)、非必需氨基酸(NEAA，1％)、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。

在多能干细胞诱导过程中使用DFBS(defined-FBS)培养基和DFBS+A(以VC为主的抗氧化剂组合混合物，详情如下所述)培养基。所述的DFBS+A培养基包含高葡萄糖DMEM培养基，20％特级胎牛血清(DefinedFBS，Hyclone)，4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、青霉素/链霉素、1％L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇和1％非必需氨基酸(NEAA)；所述的DFBS+A培养基为在DFBS基础上添加如下三种组分，50ug/mlVC，9ug/ml维生素(VB1)，10uM还原型谷胱甘肽。

将人胚胎干细胞(hES)和用于扩增的诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS细胞)培养在用丝裂霉素(10ug/ml)处理的MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)上，并且培养在KSR培养基中：DMEM/F12(HyClone公司)，20％血清替代物(KSR，Invitrogen公司)，4ng/ml bFGF、青霉素/链霉素、1％L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇和1％非必需氨基酸。

b，病毒感染人体细胞

根据实施例1所述的方法，在p6孔培养板中按每孔约6×10⁴个细胞接种人的人体细胞，在37℃、5％CO2的常规培养条件下培养过夜，用收集的病毒上清液感染培养的人体细胞。所述病毒上清液是通过用包含人Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的反转录病毒pMX载体(Addgene)按常规方法转染293T细胞(Lipofectamine 2000，Invitrogen)获得的(参见Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002))。

c，感染细胞的继续培养和克隆筛选

在感染后第2天，将感染后的人体细胞的培养基，替换为实施例1中所述的DFBS+A培养基，在37℃、5％CO2的常规培养条件下培养7天，每天更换一次培养基，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)于37℃消化为单细胞悬液，将消化后的细胞按每培养皿约10000个细胞的密度接种到100mm培养皿中，所述培养皿按a中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在37℃、5％CO2的常规培养条件下培养14天，显微镜检可见hESC样克隆(如图六所示)，其中A为人体细胞感染SKOM前的形态，B为人体细胞在感染SKOM后26天在滋养层上形成典型的hES样克隆形态；C为人体细胞hiPS克隆挑取至新的滋养层上传代扩增仍保持很好的hESC样形态，该图为传代2代后的形态，使用KSR培养基；D是人体细胞hES样克隆在Matrigel预包被的6孔平板上生长形态，此处所用培养基为mTeSRTM1。

使用玻璃针分割边缘光滑，细胞核清晰，人胚胎干细胞样的单个克隆(见图六C)，然后用玻璃管吸取这些分割开的克隆接种到12孔板的单个孔中，每个孔接种一个ES样克隆，一共挑取12个。所述12孔板按a中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在KSR培养基中，37℃、5％CO2的常规培养条件下培养。

这些挑取出的克隆具有典型的hES致密形态，在12孔板培养一周后，每孔选择部分克隆进行AP染色，结果为100％AP染色阳性(数据未显示)。

挑取部分hES样克隆后将剩余100mm培养皿AP染色，计数AP阳性克隆数目，第7天时向100mm培养皿共种下10000个SKOM感染的人体细胞，计算诱导iPS细胞效率如图七所示；AP染色后，依据克隆形态及AP结果对hES样的克隆计数，我们这种加VC的方法的总体效率为大约2.2％，与传统用KSR培养基培养的0.01~0.02％的效率相比超过100倍，与本实验中设置的DFBS和KSR对照相比效率提高超过70倍。

实施例5：利用含有VC的培养基筛选能够显著影响iPS的化合物或细胞因子。

由于小鼠三因子iPS GFP效率在D15-16天大大高于四因子D9-10天效率，我们将感染S、K、O三因子的iPS细胞分别加入要筛选的不同细胞因子，包括表皮生长因子(EGF，20ng/ml)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，10ng/ml)，肝细胞生长因子(HGF，10ng/ml)，胰岛素(insulin，10ug/ml)，D16天流式检测GFP阳性细胞比例，结果如图八所示，不含VC的培养基中，HGF和insulin经过统计显示比对照效率有所提高；而在含有VC的培养基中，除了HGF和insulin外，bFGF显示了显著提高的iPS效率。因此，含有VC的培养基更有利于细胞因子或化合物的筛选。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1、用于诱导体细胞形成多能性干细胞以及胚胎干细胞的培养基，所述培养基包括：基础培养基、血清、白血病抑制因子LIF，以及抗坏血酸或其衍生物。

2、权利要求1的培养基，所述抗坏血酸的衍生物为抗坏血酸磷酸酯，抗坏血酸有机酸酯，如棕榈酸酯。

3、权利要求1或2的培养基，所述抗坏血酸或其衍生物的浓度为1-200ug/ml。

4、权利要求1的培养基，其中基础培养基包括但不限于Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)，Minimal Essential Medium(MEM)，Basal Medium Eagle(BME)，F-10，F-12，RPMI 1640，Glasgow’s Minimal Essential Medium(GMEM)，α-Minimal Essential Medium(α-MEM)，Iscove’sModified Dulbecco’s Medium和M199。

5、诱导体细胞成为多能性干细胞的方法，所述方法包括：

a.将一种或多种干细胞多能性因子导入体细胞；

b.在添加了抗坏血酸或其衍生物的胚胎干细胞培养基中培养上述导入干细胞多能性因子的体细胞，进行诱导重编程；

c.挑选符合条件的单克隆，即内源报告基因激活或克隆呈现胚胎干细胞在相同培养基中生长的形态；

d.利用含有抗坏血酸的胚胎干细胞培养基培养(c)中的单克隆细胞；

e.鉴定(d)中单克隆细胞，挑选具有胚胎干细胞性状的克隆。

6、权利要求5所述的方法，其中步骤b中使用的培养基选自权利要求1-4中任一项所述的培养基。

7、权利要求6所述的方法，其中步骤a中所述的干细胞多能性因子包括Oct4、Sox2(或Sox1)、c-Myc(或L-或N-Myc)、K1f4(或K1f2或5)、Nanog、Lin28以及Esrrb。

8、权利要求5所述的方法，其中确定克隆状态的方法包括内源报告基因激活和克隆形态观察。

9、权利要求5-9任一项所述的方法，其中所述体细胞来自哺乳动物的成体细胞。

10、权利要求9所述的方法，所述哺乳动物选自小鼠，大鼠，兔，猪，牛，羊，猴或人。

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