CN113215088A - 体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，包括以下步骤：S1、将人多能干细胞铺在基底胶包被的培养皿中，加入mTeSR培养基培养至细胞汇合度为80％‑90％；S2、将mTeSR培养基更换为SSCLC诱导培养基培养12天，每天更换培养基，即可诱导得到精原干细胞样细胞；所述SSCLC培养基为在MEM‑α培养基的基础上添加了血清替代物、L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、脂质浓缩物、青霉素、链霉素、人胶质源性神经营养因子、人碱性成纤维细胞生长因子、维生素C和丙戊酸。本发明在SSCLC诱导培养基中加入丙戊酸，提高了精原干细胞样细胞的诱导效率。

Description

体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法。
背景技术
精子发生是一个复杂且被严格调控的事件。睾丸中的精原干细胞(Spermatogonial stem cell,SSC)具有自我更新和分化的能力，是维持精子发生持续进行的细胞。SSC的耗竭会导致精子发生的彻底失败，产生无精子症，临床上表现为不育。因此，人SSC的相关研究对认识男性不育和开发男性不育的治疗手段具有极大意义。人SSC的研究受到取材和伦理的制约，且SSC难以分离和体外培养。将人的干细胞诱导分化为精原干细胞样细胞(Spermatogonial stem cell-like cell,SSCLC)是一种短期内获得大量SSC细胞的方法，这些细胞可用作模型用于人SSC的研究。
Easley等首先报道了在体外将人干细胞直接诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的“一步法”，该诱导体系中起主要诱导分化作用的成分为胶质源性神经营养因子(GDNF)，其他成分碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)起促进GNDF的作用，β-巯基乙醇能刺激细胞增殖，用该方法分别对H1人胚胎干细胞(H1 embryonic stem cell,H1 ESC)和人诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cell,hiPSC)进行体外向精原干细胞样细胞(SSCLC)诱导分化，在第10天可得到约60％或40％的VASA+细胞(用VASA标记SSCLC)。
Zhao等用Easley等的方法对H1 ESC和hiPSC进行体外向精原干细胞样细胞(SSCLC)诱导分化，发现诱导过程中细胞大量死亡。Zhao等将Easley等的SSCLC诱导体系中的β-巯基乙醇改为维生素C(Vitamin C,VC)，以减少诱导过程中细胞的死亡；用3％的血清替代品替换牛血清蛋白，可得到更高比例的SSCLC；将干细胞种植于明胶包被的培养皿中，实现了无饲养层细胞的培养方式。Zhao等的方法分别对H1 ESC和hiPSC进行体外向SSCLC诱导分化，在第12天可得到约60.3％至85.1％的PLZF+细胞(用PLZF标记SSCLC)。
以上两种方法均为将人干细胞体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的“一步法”，在实际操作中，精原干细胞样细胞(SSCLC)的诱导分化效率在不同的干细胞系和实验条件下会有比较大的区别。发明人按照文献中报道的方法将人干细胞进行精原干细胞样细胞(SSCLC)的诱导分化，其诱导分化为人精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率较低，需要一种新的方法，提高其诱导效率。
发明内容
本发明为解决人干细胞体外诱导分化为精原干细胞样细胞过程中诱导效率低、重复性不高的问题，提供了一种体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，提高了诱导分化的效率以及稳定性。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，包括以下步骤：
S1、将人多能干细胞铺在基底胶包被的培养皿中，加入mTeSR培养基培养至细胞汇合度为80％-90％；
S2、将mTeSR培养基更换为SSCLC诱导培养基培养12天，每天更换新的SSCLC诱导培养基，即可诱导得到精原干细胞样细胞；所述SSCLC培养基在MEM-α培养基的基础上添加了血清替代物、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、脂质浓缩物、青霉素、链霉素、人胶质源性神经营养因子、人碱性成纤维细胞生长因子、维生素C和丙戊酸。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述SSCLC培养基中所述血清替代物、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、青霉素、链霉素、人胶质源性神经营养因子和人碱性成纤维细胞生长因子的浓度分别为3％、2mM、10μg/mL、5.5μg/mL、0.0067μg/mL、2μg/mL、100U/mL、100μg/mL、20ng/mL和1ng/mL。
进一步，所述SSCLC培养基中维生素C和丙戊酸的浓度分别为100-200μg/mL、100-200μg/mL。
进一步，所述脂质浓缩物包括花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚醋酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。
进一步，所述花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚醋酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸的浓度分别为0.004μg/mL、0.44μg/mL、0.14μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL和0.02μg/mL。
进一步，所述血清替代物为KnockOutTM血清替代物。
进一步，还包括步骤S3，清洗收集细胞并将其重悬，加入PLZF单抗标记精原干细胞样细胞并通过流式细胞仪检测PLZF阳性细胞以计算人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的效率。
进一步，所述步骤S1中，细胞培养前在mTeSR培养基中添加10μM的ROCK抑制剂。
进一步，所述步骤S1和S2中，细胞的培养条件为：37℃，5％CO2浓度。
本发明的有益效果为：本发明在精原干细胞样细胞诱导培养基中加入丙戊酸，提高了精原干细胞样细胞的诱导效率，采用本发明的方法能够将不同来源的干细胞系诱导分化为精原干细胞样细胞，方法稳定可靠，诱导效率高。
附图说明
图1为本发明实施例1中将人诱导多能干细胞002 hiPSC体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图1A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图1B为进行PLZF单抗标记的实验组；
图2为本发明实施例1中将人诱导多能干细胞1106 hiPSC体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图2A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图2B为进行PLZF单抗标记的实验组；
图3为本发明本发明实施例1中将人H1胚胎干细胞(H1 ESC)体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图3A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图3B为进行PLZF单抗标记的实验组；
图4为本发明对比例中将人诱导多能干细胞002 hiPSC体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图4A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图4B为进行PLZF单抗标记的实验组；
图5为为本发明对比例中将人诱导多能干细胞1106 hiPSC体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图5A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图5B为进行PLZF单抗标记的实验组；
图6为为本发明本发明对比例中将人H1胚胎干细胞(H1 ESC)体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图3A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图3B为进行PLZF单抗标记的实验组；
图7为本发明实施例2中将人诱导多能干细胞002 hiPSC体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图7A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图7B为进行PLZF单抗标记的实验组；
图8为本发明实施例2中将人诱导多能干细胞1106 hiPSC体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图8A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图8B为进行PLZF单抗标记的实验组；
图9为本发明实施例2中将人H1胚胎干细胞(H1 ESC)体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图9A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图9B为进行PLZF单抗标记的实验组。
图10为本发明对比例2中将人诱导多能干细胞002 hiPSC体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图10A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图10B为进行PLZF单抗标记的实验组；
图11为本发明对比例2中将人诱导多能干细胞1106 hiPSC体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图11A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图11B为进行PLZF单抗标记的实验组；
图12为本发明对比例2中将人H1胚胎干细胞(H1 ESC)体外诱导分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率，其中图12A为未进行PLZF单抗标记的空白对照，图12B为进行PLZF单抗标记的实验组；
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明中发明人分别将人H1胚胎干细胞(H1 ESC)和人诱导多能干细胞(hiPSC)诱导为精原干细胞样细胞(SSCLC)，其中hiPSC采用本实验室制备的两株分别为002 hiPSC和1106 hiPSC。
本发明的方法包括以下步骤：
S1、将人多能干细胞铺在基底胶包被的培养皿中，加入mTeSR培养基中培养至细胞汇合度为80％-90％；
S2、将mTeSR培养基更换为SSCLC诱导培养基培养12天，每天更换新的SSCLC诱导培养基，即可诱导得到精原干细胞样细胞(SSCLC)；所述SSCLC培养基为在MEM-α培养基的基础上添加了血清替代物、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、脂质浓缩物、青霉素、链霉素、人胶质源性神经营养因子、人碱性成纤维细胞生长因子、维生素C和丙戊酸。
优选的，其中血清替代物、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、青霉素、链霉素、人胶质源性神经营养因子和人碱性成纤维细胞生长因子的浓度分别为3％、2mM、10μg/mL、5.5μg/mL、0.0067μg/mL、2μg/mL、100U/mL、100μg/mL、20ng/mL和1ng/mL。
优选的，SSCLC培养基中维生素C和丙戊酸的浓度分别为100-200μg/mL、100-200μg/mL。
优选的，脂质浓缩物包括花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚醋酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。
优选的，所述花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚醋酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸的浓度分别为0.004μg/mL、0.44μg/mL、0.14μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL和0.02μg/mL。
优选的，还包括步骤S3，清洗收集细胞并将其重悬，加入PLZF单抗标记精原干细胞样细胞(SSCLC)并通过流式细胞仪检测PLZF阳性细胞以计算人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞(SSCLC)的效率。
优选的，所述步骤S1中，细胞培养前在mTeSR培养基中添加10μM的ROCK抑制剂。
优选的，步骤S1和步骤S2中，细胞的培养条件为：37℃，5％CO2浓度。
其中，血清替代物为KnockOutTM血清替代物，添加浓度为3％；
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽为购自Thermo Fisher Scientific的GlutaMAXTM添加剂，其添加浓度为1％；
胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和乙醇胺为购自Thermo Fisher Scientific的ITS-X，添加浓度为1％；
脂质浓缩物为购自Thermo Fisher Scientific的Chemically Defined LipidConcentrate，添加浓度为0.2％；
青霉素和链霉素为购自Thermo Fisher Scientific的青-链霉素，终浓度为1％；
人胶质源性神经营养因子和人碱性成纤维细胞生长因子购自Peprotech；
维生素C和丙戊酸购自Sigma Aldrich；
以下实验中用到的基底胶为
Figure BDA0003091596660000071
Matrix购自Corning，ROCK抑制剂购自Selleck，mTeSR为购自STEMCELL Technologies的mTeSRTM 1，细胞解离试剂为购自ThermoFisher Scientific的AccutaseTM，PLZF小鼠单克隆抗体PE购自Invitrogen。
实施例1
本实施例中发明人分别将人H1胚胎干细胞(H1 ESC)和人诱导多能干细胞(hiPSC)采用本发明的方法进行诱导，其中人诱导多能干细胞(hiPSC)采用本实验室制备的两株分别为002 hiPSC和1106 hiPSC，具体的实验步骤如下：
1、第0天将H1 ESC或hiPSC铺在基底胶包被的12孔板的一个孔中，培养基为1mL含10μM ROCK抑制剂的mTeSR培养基，37℃，5％CO2浓度条件下培养。
2.第1天细胞汇合度为80-90％后，将培养基更换为1mL SSCLC诱导培养基，该培养基在MEM-α培养基的基础上添加3％血清替代物，1％GlutaMAX添加剂，1％ITS-X，0.2％Chemically Defined Lipid Concentrate，1％青-链霉素，20ng/mL人胶质源性神经营养因子，1ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子，100μg/mL维生素C和100μg/mL丙戊酸，37℃，5％CO2浓度条件下培养。
3.第2-11天每天更换新的SSCLC诱导培养基。
4.第12天吸取并丢弃SSCLC诱导培养基，用500μL Accutase将细胞消化为单细胞悬液。
5.将单细胞悬液离心(室温，200×g，5分钟)后留细胞沉淀，4％多聚甲醛重悬，室温固定20分钟，离心(室温，500×g，5分钟)后留细胞沉淀。
6.用500μL破膜固定液(含有5％BSA，0.2％Triton X-100，0.5％Tween 20的PBS溶液)重悬细胞，室温放置20分钟，离心(室温，500×g，5分钟)后留细胞沉淀。
7.用100μL PBS重悬细胞，加入1μL PLZF小鼠单克隆抗体PE混匀，室温放置40分钟，离心(室温，500×g，5分钟)后留细胞沉淀。
8、用500μL PBS重悬细胞，离心(室温，500×g，5分钟)后留细胞沉淀，用100μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测PLZF阳性细胞(SSCLC)。
每组试验均设置空白对照，空白对照除了不用PLZF单抗标记外，其他步骤均同上。
其中002 hiPSC、1106 hiPSC和H1 ESC的流式结果分别如图1、2和3所示，其诱导效率分别为64.2％、24.4％和27.4％。
实施例2
本实施例中SSCLC诱导培养基中维生素C和丙戊酸的浓度均为200μg/mL，其他同实施例1，002 hiPSC、1106 hiPSC和H1 ESC的流式结果分别如图7、8和9所示,其诱导效率分别为24.6％、10.3％和18.1％。
对比例1
本对比例中发明人分别将人H1胚胎干细胞(H1 ESC)和人诱导多能干细胞(hiPSC)采用Zhao等的方法进行诱导，其中hiPSC采用本实验室制备的两株分别为002 hiPSC和1106hiPSC，具体的实验步骤如下：
1、在第0天将H1 ESC或hiPSC铺在Matrigel包被的12孔板的一个孔中，培养基为1mL含10μM ROCK抑制剂的mTeSR培养基，37℃，5％CO2浓度条件下培养。
2.第1天细胞汇合度为80-90％，将培养基更换为1mL SSCLC诱导培养基(含有3％KSR，1％GlutaMAX，1％ITS-X，0.2％Chemically Defined Lipid Concentrate，1％青-链霉素，20ng/mL人胶质源性神经营养因子，1ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子，200μg/mL维生素C的MEM-α培养基)，37℃，5％CO2浓度条件下培养。
3.第2-11天每天更换新的SSCLC诱导培养基。
4.第12天吸取并丢弃SSCLC诱导培养基，用500μL Accutase将细胞消化为单细胞悬液。
5.将单细胞悬液离心(室温，200×g，5分钟)后留细胞沉淀，4％多聚甲醛重悬，室温固定20分钟，离心(室温，500×g，5分钟)后留细胞沉淀。
6.用500μL破膜固定液(含有5％BSA，0.2％Triton X-100，0.5％Tween 20的PBS溶液)重悬细胞，室温放置20分钟，离心(500×g，5分钟)后留细胞沉淀。
7.用100μL PBS重悬细胞，加入1μL PLZF小鼠单克隆抗体PE混匀，室温放置40分钟，离心(500×g，5分钟)后留细胞沉淀。
8.用500μL PBS重悬细胞，离心(500×g，5分钟)后留细胞沉淀，用100μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测PLZF阳性细胞(SSCLC)比例。
每组试验均设置空白对照，空白对照除了不用PLZF单抗标记外，其他步骤均同上。
其中002 hiPSC、1106 hiPSC和H1 ESC的流式结果分别如图4、5和6所示，其诱导效率分别为20.3％、2.28％和12.4％。
对比例2
本对比例中发明人分别将人H1胚胎干细胞(H1 ESC)和人诱导多能干细胞(hiPSC)采用Zhao等的方法进行诱导，其中hiPSC采用本实验室制备的两株分别为002 hiPSC和1106hiPSC，具体的实验步骤如下：
1、在第0天将H1 ESC或hiPSC铺在Matrigel包被的12孔板的一个孔中，培养基为1mL含10μM ROCK抑制剂的mTeSR培养基，37℃，5％CO2浓度条件下培养。
2.第1天细胞汇合度为80-90％，将培养基更换为1mL SSCLC诱导培养基(含有3％KSR，1％GlutaMAX，1％ITS-X，0.2％Chemically Defined Lipid Concentrate，1％青-链霉素，20ng/mL人胶质源性神经营养因子，1ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子，100μg/mL维生素C的MEM-α培养基)，37℃，5％CO2浓度条件下培养。
3.第2-11天每天更换新的SSCLC诱导培养基。
4.第12天吸取并丢弃SSCLC诱导培养基，用500μL Accutase将细胞消化为单细胞悬液。
5.将单细胞悬液离心(室温，200×g，5分钟)后留细胞沉淀，4％多聚甲醛重悬，室温固定20分钟，离心(室温，500×g，5分钟)后留细胞沉淀。
6.用500μL破膜固定液(含有5％BSA，0.2％Triton X-100，0.5％Tween 20的PBS溶液)重悬细胞，室温放置20分钟，离心(500×g，5分钟)后留细胞沉淀。
7.用100μL PBS重悬细胞，加入1μL PLZF小鼠单克隆抗体PE混匀，室温放置40分钟，离心(500×g，5分钟)后留细胞沉淀。
8.用500μL PBS重悬细胞，离心(500×g，5分钟)后留细胞沉淀，用100μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测PLZF阳性细胞(SSCLC)比例。
每组试验均设置空白对照，空白对照除了不用PLZF单抗标记外，其他步骤均同上。
其中002 hiPSC、1106 hiPSC和H1 ESC的流式结果分别如图10、11、12所示，其诱导效率分别为13.7％、2.41％和5.58％。
由实施例1、实施例2和对比例1、对比例2的数据可知，本发明中的方法对H1 ESC和hiPSC的诱导效率均高于现有的方法，且本发明中方法可以将不同来源的干细胞诱导分化为SSCLC，方法稳定可靠。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将人多能干细胞铺在基底胶包被的培养皿中，加入mTeSR培养基培养至细胞汇合度为80％-90％；
S2、将mTeSR培养基更换为SSCLC诱导培养基培养12天，每天更换新的SSCLC诱导培养基，即可诱导得到精原干细胞样细胞；所述SSCLC培养基在MEM-α培养基的基础上添加了血清替代物、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、脂质浓缩物、青霉素、链霉素、人胶质源性神经营养因子、人碱性成纤维细胞生长因子、维生素C和丙戊酸。
2.根据权利要求1所述的体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述SSCLC培养基中所述血清替代物、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、青霉素、链霉素、人胶质源性神经营养因子和人碱性成纤维细胞生长因子的浓度分别为3％、2mM、10μg/mL、5.5μg/mL、0.0067μg/mL、2μg/mL、100U/mL、100μg/mL、20ng/mL和1ng/mL。
3.根据权利要求1所述的体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述SSCLC培养基中维生素C和丙戊酸的浓度分别为100-200μg/mL、100-200μg/mL。
4.根据权利要求1所述的体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述脂质浓缩物包括花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚醋酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。
5.根据权利要求4所述的体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚醋酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸的浓度分别为0.004μg/mL、0.44μg/mL、0.14μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL和0.02μg/mL。
6.根据权利要求1所述的体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述血清替代物为KnockOutTM血清替代物。
7.根据权利要求1所述的体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，其特征在于，还包括步骤S3，清洗收集细胞并将其重悬，加入PLZF单抗标记精原干细胞样细胞并通过流式细胞仪检测PLZF阳性细胞以计算人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的效率。
8.根据权利要求1所述的体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述步骤S1中，细胞培养前在mTeSR培养基中添加10μM的ROCK抑制剂。
9.根据权利要求1所述的体外诱导人多能干细胞分化为精原干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述步骤S1和步骤S2中，细胞的培养条件为：37℃，5％CO2浓度。
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