CN108611316A - 一种诱导人成纤维细胞转分化为人生殖细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱导人成纤维细胞转分化为人生殖细胞的方法,包括以下步骤:S1、将人成纤维细胞贴壁培养至第二代后的细胞产物接种于人成纤维细胞染色体活化培养基中培养若干天,以进行染色体激活的诱导;S2、将步骤S1所获得的细胞进行消化后细胞产物接种于人生殖细胞诱导培养基中培养若干天,以进行生殖细胞的诱导。通过本发明所揭示的一种诱导人成纤维细胞转分化为人生殖细胞的方法,实现了在体外高效、安全地获得生殖细胞的技术效果,有效规避了因将多能性干细胞分化来的功能细胞移植回体内导致的包括致瘤性在内的风险,安全性更高,给干细胞分化技术治疗男性不育应用上临床提供了技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,尤其涉及一种诱导人成纤维细胞转分化为人生殖细胞的方法。
背景技术
近年来男性生殖健康研究已成为生命科学领域的一个重要课题。随着不孕不育发病率的逐渐上升,对男性不育进行有效的诊断和治疗也显得尤为迫切,调查研究表明育龄夫妇中有10~15%不能生育,其中男性原因占到一半左右。
2006年8月,日本京都大学中山伸弥教授领导的实验室首次通过实验证明通过逆转录病毒载体向已经分化的小鼠体细胞中过表达四个基因(OCT4、SOX2、C-MYC及KLF4)就能够获得拥有多种潜能性细胞,并被称为诱导的多功能干细胞(Induce pluripotent stemcells,iPSCs)。另外,与胚胎干细胞相似,获得iPSCs可以在体外被诱导分化成外、中、内胚层的终末端分化的细胞。
许多研究结果表明利用人类胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)或人诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)能够分化得到人类原始生殖细胞或者直接得到单倍体精原干细胞。尽管hESCs和hiPSCs具有多能性,但若要得到特定类型的体细胞,往往要经过复杂,漫长且低效的体外分化过程。同时,与多能性相伴而来的则是危险的致瘤性。而且在OCT4,SOX2,C-MYC,KLF4四个重编程因子中,C-MYC以及KLF4都是重要的致癌基因,这进一步增加了hiPSCs移植后形成肿瘤的风险。并且所有这些研究都面临着同样的问题,即未得到成熟的生殖细胞并且未完成减数分裂。
虽然通过各方面的努力,在人类多能干细胞分化为人类单倍体细胞领域取得了一些进展,目前仍然没有方法能够在体外高效地获得人类单倍体精原干细胞。因此,人类再生医学的研究之路仍然任重而道远。作为再生治疗的细胞资源,如何能够定向,高效和大量的获得病人所需要的特定类型的细胞,才是临床治疗的关键所在。而能否快速,高效,稳定地获得病人所需要的特定类型的体细胞,并且尽量降低致瘤的风险,已经成为了科学家们面临的全新挑战。
发明内容
本发明的目的在于公开一种诱导人成纤维细胞转分化为人生殖细胞的方法,以有效规避因将多能性干细胞分化来的功能细胞移植回体内导致的包括致瘤性在内的风险。
为实现上述目的,本发明提供了一种诱导人成纤维细胞转分化为人生殖细胞的方法,包括以下步骤:
S1、将人成纤维细胞贴壁培养至第二代后的细胞产物接种于人成纤维细胞染色体活化培养基中培养若干天,以进行染色体激活的诱导;
S2、将步骤S1所获得的细胞进行消化后细胞产物接种于人生殖细胞诱导培养基中培养若干天,以进行生殖细胞的诱导。
作为本发明的进一步改进,所述步骤S1中的接种密度为2×105~3×105/mL。
作为本发明的进一步改进,所述步骤S2中的接种密度为2×105~3×105/mL。
作为本发明的进一步改进,所述步骤S1中的人成纤维细胞取自人脐带组织、流产死亡胎儿或者包皮环切组织。
作为本发明的进一步改进,所述步骤S1中的贴壁培养具体为:
将人脐带组织、流产死亡胎儿或者包皮环切组织使用无菌剪刀剪成2mm×2mm左右的小块组织,进行贴壁培养,置入37℃,5%CO2的恒温培养箱中静止培养7天,其中,贴壁培养所使用的基础培养基为高糖DMEM培养基;
使用0.25%胰酶处理5分钟,收集细胞后离心,按照2×105~3×105/mL的接种密度接种于人成纤维细胞染色体活化培养基中,然后向高糖DMEM培养基中添加第一型抑制剂20~30μl,置入37℃,5%CO2的恒温培养箱中静止培养7天,观察细胞形变,所述人成纤维细胞染色体活化培养基为含有10wt%胎牛血清的高糖DMEM培养基。
作为本发明的进一步改进,所述第一型诱导剂选自500μM VPA、10μM CHIR99021、0.1μM DZNep、0.1mM Sodium butyrate、0.5μM RG108和100ng/ml Activin A的混合物。
作为本发明的进一步改进,所述步骤S2具体为:将步骤S1所获得的细胞进行使用0.25%胰酶-EDTA处理5分钟,收集细胞后离心,按照2×105~3×105/mL的接种密度接种于人生殖细胞诱导培养基,并向人生殖细胞诱导培养基添加第二型抑制剂20~30μl,置入37℃,5%CO2的恒温培养箱中静止培养13天;所述人生殖细胞诱导培养基为含有1wt%胎牛血清的StemPro-34SFM培养基。
作为本发明的进一步改进,所述第二型抑制剂选自100ng/ml BMP4、50ng/mlWnt3a、20ng/ml GDNF、10ng/ml EGF、1000U Lif、10ng/ml bFGF的混合物。
作为本发明的进一步改进,所述步骤S2中经过诱导得到的生殖细胞为精原干细胞。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:通过本发明所揭示的一种诱导人成纤维细胞转分化为人生殖细胞的方法,实现了在体外高效、安全地获得人体生殖细胞(并具体为精原干细胞)的技术效果,有效规避了因将多能性干细胞分化来的功能细胞移植回体内导致的包括致瘤性在内的风险,安全性更高,给干细胞分化技术治疗男性不育应用上临床提供了技术基础。
附图说明
图1为分离的人原代成纤维细胞,标尺:100μm;
图2为培养于人成纤维细胞染色体活化培养基中细胞及形成的生殖细胞样细胞克隆,标尺:100μm;
图3为荧光检测人生殖细胞的特异蛋白DDX4、PLZF的表达情况,标尺:100μm;
图4为Real time-PCR检测转分化过程中人成纤维相关基因及精原干细胞特异基因的表达水平。
具体实施方式
下面结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细说明,但应当说明的是,这些实施方式并非对本发明的限制,本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代,均属于本发明的保护范围之内。
本实施方式公开了一种诱导人成纤维细胞转分化为人生殖细胞的方法。在本实施方式中,在诱导分化并得到人生殖细胞,并具体为人精原干细胞,首先进行染色体激活的诱导,然后进行精原干细胞的诱导。
人成纤维细胞染色体活化培养基中可添加第一型诱导剂,例如:500μM丙戊酸钠盐(Valproic acid sodium salt,VPA),10μM CHIR99021,0.1μM 3-deazaneplanocin A(DZNep,Z),0.1mM丁酸钠(Sodium butyrate),0.5μM RG108,100ng/ml激活素A(ActivinA),隔天换液,进行染色体激活的诱导。
培养7天后,向人生殖细胞诱导培养基中加入第二型诱导剂,例如:100ng/ml骨形态生成蛋白4(Bone morphogenetic protein,BMP4),50ng/ml Wnt3a,1000U白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,Lif),10ng/ml成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF),20ng/ml神经胶质源神经营养因子(Glial cell-derivedneurotrophic factor,GDNF),10ng/ml表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF),继续培养13天,进行人生殖细胞的诱导分化。
参图1及至图4所示,在本实施方式中,该诱导人成纤维细胞转分化为人生殖细胞的方法,包括以下步骤。
步骤S1、将人成纤维细胞贴壁培养至第二代后的细胞产物接种于人成纤维细胞染色体活化培养基中培养若干天,以进行染色体激活的诱导。所述步骤S1中的接种密度为2×105~3×105/mL。人成纤维细胞取自人脐带组织、流产死亡胎儿或者包皮环切组织,并进一步优选为、流产死亡胎儿或者包皮环切组织。参图1所示,经过贴壁培养后的HEF细胞,并观察目的基因及其表达蛋白在上述细胞中的功能。
在本实施方式中,步骤S1中的贴壁培养具体为:将人脐带组织、流产死亡胎儿或者包皮环切组织使用无菌剪刀剪成2mm×2mm左右的小块组织,进行贴壁培养,置入37℃,5%CO2的恒温培养箱中静止培养7天;其中,贴壁培养所使用的基础培养基为高糖DMEM培养基。使用0.25%胰酶处理5分钟,收集细胞后离心,按照2×105~3×105/mL的接种密度接种于人成纤维细胞染色体活化培养基中,然后向高糖DMEM培养基中添加第一型抑制剂20~30μl,置入37℃,5%CO2的恒温培养箱中静止培养7天,观察细胞形变,所述人成纤维细胞染色体活化培养基为含有10wt%胎牛血清的高糖DMEM培养基。从图2可知,细胞开始聚集并发生形变。所述第一型诱导剂选自500μM VPA、10μM CHIR99021、0.1μM DZNep、0.1mM Sodiumbutyrate、0.5μM RG108和100ng/ml Activin A的混合物。
步骤S2、将步骤S1所获得的细胞进行消化后细胞产物接种于小鼠胚胎成纤维细胞制作的饲养层(feeder),用人生殖细胞诱导培养基中培养若干天,以进行生殖细胞的诱导。所述步骤S2中的接种密度为2×105~3×105/mL。
步骤S2具体为:将步骤S1所获得的细胞进行使用0.25%胰酶-EDTA处理5分钟,收集细胞后离心,按照2×105~3×105/mL的接种密度接种于人生殖细胞诱导培养基,并向人生殖细胞诱导培养基添加第二型抑制剂20~30μl,置入37℃,5%CO2的恒温培养箱中静止培养13天;图2示出了第二阶段中贴壁培养后第3天、第7天及第11天时诱导活化后的人成纤维细胞形成精原干细胞类似克隆。所述人生殖细胞诱导培养基为含有1wt%胎牛血清的StemPro-34SFM培养基。所述第二型抑制剂选自100ng/ml BMP 4、50ng/ml Wnt3a、20ng/mlGDNF、10ng/ml EGF、1000U Lif、10ng/ml bFGF的混合物。
参图3及图4所示,本实施方式所揭示的的方法,第一次真正意义上实现了在体外将人成纤维细胞直接诱导转分化为人生殖细胞的过程,人成纤维细胞向生殖细胞的直接转分化增加了生殖细胞的来源,为人类生殖细胞的研究提供了更丰富的资源,解决了精子生殖细胞缺如的问题。
与现有技术体外获得人生殖细胞的技术不同,本发明所提供的是一种高效地、安全地在体外获得人生殖细胞的方法。本发明的方法有效规避了因将多能性干细胞分化来的功能细胞移植回体内导致的包括致瘤性在内的风险,安全性更高,给干细胞分化技术治疗男性不育应用上临床提供了技术基础。本发明作为新一代的辅助生殖技术,将造福更多的男性不育症患者。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明,它们并非用以限制本发明的保护范围,凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (9)
1.一种诱导人成纤维细胞转分化为人生殖细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将人成纤维细胞贴壁培养至第二代后的细胞产物接种于人成纤维细胞染色体活化培养基中培养若干天,以进行染色体激活的诱导;
S2、将步骤S1所获得的细胞进行消化后细胞产物接种于人生殖细胞诱导培养基中培养若干天,以进行生殖细胞的诱导。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中的接种密度为2×105~3×105/mL。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S2中的接种密度为2×105~3×105/mL。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中的人成纤维细胞取自人脐带组织、流产死亡胎儿或者包皮环切组织。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中的贴壁培养具体为:
将人脐带组织、流产死亡胎儿或者包皮环切组织使用无菌剪刀剪成2mm×2mm左右的小块组织,进行贴壁培养,置入37℃,5%CO2的恒温培养箱中静止培养7天,其中,贴壁培养所使用的基础培养基为人成纤维细胞培养基(高糖DMEM添加10wt%胎牛血清);
使用0.25%胰酶处理5分钟,终止胰酶反应,收集细胞后离心,按照2×105~3×105/mL的接种密度接种于人成纤维细胞染色体活化培养基中,然后向人成纤维细胞培养基中添加第一型诱导剂20~30μl,置入37℃,5%CO2的恒温培养箱中静止培养7天,观察细胞形变,所述人成纤维细胞染色体活化培养基为含有10wt%胎牛血清的高糖DMEM培养基。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述第一型诱导剂选自500μM VPA、10μMCHIR99021、0.1μM DZNep、0.1mM Sodium butyrate、0.5μM RG108和100ng/ml Activin A的混合物。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S2具体为:将步骤S1所获得的细胞进行使用0.25%胰酶-EDTA处理5分钟,终止胰酶反应,收集细胞后离心,按照2×105~3×105/mL的接种密度接种于人生殖细胞诱导培养基,并向人生殖细胞诱导培养基添加第二型诱导剂20~30μl,置入37℃,5%CO2的恒温培养箱中静止培养13天;所述人生殖细胞诱导培养基为含有1wt%胎牛血清的StemPro-34SFM培养基。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述第二型诱导剂选自100ng/ml BMP4、50ng/ml Wnt3a、20ng/ml GDNF、10ng/ml EGF、1000U Lif、10ng/ml bFGF的混合物。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S2中经过诱导得到的生殖细胞为精原干细胞。
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