WO2012034352A1

WO2012034352A1 - 使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的方法、试剂盒及其应用

Info

Publication number: WO2012034352A1
Application number: PCT/CN2011/001393
Authority: WO
Inventors: 林雄斌
Original assignee: Lin Xiongbin
Priority date: 2010-09-19
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2012-03-22
Also published as: CN102399739A

Description

使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的

方法、试剂盒及其应用技术领域

本发明涉及领域属于生物医学技术领域，具体而言，本发明涉及一种使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的细胞培养方法及其应用。背景技术

在哺乳动物中，生殖腺里的生殖干细胞来源于一种从胚胎传留下来的数量稀少的原始生殖干细胞。胚胎形成及卵巢或睾丸形成的过程中，原始生殖干细胞就只定居卵巢或睾丸。在卵巢或睾丸分化、发育和形成成熟的卵泡及卵子或精子是一个消耗过程。女性一生中，经过 400至 500次卵泡发育成熟、排卵和月经形成后，卵巢的生殖干细胞：原卵细胞就会枯竭，卵巢中就不再有原卵细胞和卵泡细胞，雌激素的主要来源也同时发生枯竭；卵巢萎缩变小，卵巢就衰老了。多数情况下, 男性 65岁开始睾丸的原始生殖干细胞也会逐渐枯竭。衰老枯竭的卵巢或睾丸使男女性不可避免地走向机体整体衰老的阶段，并且，影响男女性的寿命。

自然的生殖干细胞不仅能分化形成包括精子和卵子在内的配子，具有生殖功能，还是一种能够分化形成多种细胞和组织的多能干细胞，具有再生性修复功能；而且，生殖干细胞还具有一定程度的增殖和传代能力，是唯一的能够复制和传递遗传信息的千细胞。所以，自体生殖干细胞在生殖系统的疾病和损伤的治疗领域，在男女性不孕不育的修复治疗应用领域，在抗衰老保健和延长寿命的应用领域以及建立自体生殖干细胞库的领域都有着十分重要的价值和意义。

现在国际上主要采用两种方法制备生殖干细胞。一种方法是通过自然的胚胎干细胞体外分化形成异体生殖细胞，应用于研究领域；第二种方法是从睾丸或卵巢分离培养制备自体生殖干细胞，应用不孕不育的治疗领域，分离培养耗时困难，生殖细胞来源困难，获取数量极其稀少。

体细胞是干细胞顺向分化产生的，具有某些具体功能的子代细胞。体细胞的染色体 DNA和干细胞的染色体 DNA在基因结构和基因的数量上并不存在差异。体细胞和千细胞之间的最主要的差别可能只是某些功能基因处于不同的活性表达状态。功能基因表达的差异决定了细胞的具体功能和形态的差异。我们推测，干细胞向体细胞顺向分化的程序启动后，干细胞本身的干细胞特性决定基因的开关就被关闭，随后，干细胞就分化形成了具有某种特定功能的体细胞；换句话说，在体细胞染色体 DNA序列中仍然存在生殖干细胞特性决定基因，例如 Oct4、 Nanog、 C-kit、 Dazl和 Mvh基因等，这些基因只是处于关闭或静止状态。利用某些物质打开体细胞 DNA序列中的生殖干细胞特性决定基因 Oct4、 Nanog、 C-kit、 Dazl和 Mvh等基因开关，这些体细胞就可能重新逆向分化而形成新的自体生殖干细胞。

在本项发明中，从血液单个核细胞等人的体细胞逆向分化，迅速产生百亿数量级别的自体生殖干细胞，不仅为疾病的潜在治疗和抗衰老保健提供了一种新的独特的多能干细胞，而且也为每一个不同年龄的人提供了建立自体生殖干细胞库，永久保存具有独特遗传信息的自体生殖细胞的潜在可能性。发明内容

本发明所要解的技术问题是：研发一种新的人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的干细胞生产调控技术，在不改变人的体细胞染色体 DNA序列，不插入任何外来基因或 DNA片段的情况下，应用含有某些植物提取物和蛋白的一系列配方，在体外重新激活体细胞 DNA序列中的生殖千细胞特性决定基因开关，使这些体细胞重新逆向分化而形成新的生殖干细胞；另夕卜，经水冻长期保存植物和蛋白诱导性人自体生殖干细胞，建立个人的植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞库。

为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的方法。本发明的另一个目的是提供采用该方法产生的自体生殖干细胞以及其在制备治疗多种疾病的药物中的应用。本发明的再一个目的是提供在上述方法中所采用的含有植物提取物和蛋白的多种细胞培养液以及该培养液的应用。此外，本发明还提供相应的用于制备自体生殖干细胞的试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一方面，本发明提供一种使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的方法，其中，所述方法包括：

将人的体细胞在细胞培养液 B1 中培养 2-3天，所述细胞培养液 B1为 RPMI 1640, 并含有淫羊藿提取物 5-100mg/ml、鹿茸提取物 5-100mg/ml、 Υ-27632 1-25μΜ、干细月包因子（ Stem cell factor ) 1-lOOng/mK 白细月包介素 3 ( IL-3 ) 1-lOOng/mK 白细胞介素 6 ( IL-6 ) l-100ng/ml; 然后换用细胞培养液 B2培养 6-9天，所述细胞培养液 B2为 RPMI 1640, 并含有淫羊藿提取物 5-100mg/mK 鹿茸提取物 5-100mg/mK 水蛭提取物 5-100mg/ml、促红细胞生成素（EPO ) 1-lOOng/mK 干细胞因子 l-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF ) 1-lOOng/mL Υ-27632 1-25μΜ、白细胞介素 3 l-100ng/ml、白细胞介素 6 l-100ng/ml、白细胞介素 11 ( IL-1 1 ) l-100ng/ml，从而获得植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞。

优选地，在 5%C0₂和 37°C条件下进行细胞培养。

在上述方法中，所述人的体细胞包括但不限于人的皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞、脐带血细胞、胎盘细胞。

优选地，在将人的体细胞以细胞培养液 B 1培养之前，先以 2-5x l0⁶的密度，在 5%C0₂和 37°C条件下培养 24-48小时。

优选地，先将细胞在细胞培养液 B1 中培养 3天，所述细胞培养液 B1 为含有淫羊藿提取物 50mg/ml、鹿茸提取物 50mg/ml、 Υ-27632 10μΜ、干细胞因子 10 ng/ml、白细胞介素 3 lOng/mK 白细胞介素 6 10ng/ml的 RPMI 1640; 然后换用细胞培养液 B2培养 8天，所述细胞培养液 B2为含有淫羊藿提取物 50mg/m】、鹿茸提取物 50mg/ni】、水蛭提取物 50mg/m〗、促红细胞生成素 10 ng/mK 干细胞因子 10 ng/mK 碱性成纤维细胞生长因子 10 ng/mK Υ-27632 10μΜ、白细胞介素 3 10ng/ml、白细胞介素 6 10ng/mK 白细胞介素 1 1 10ng/ml的 RPMI 1640,从而获得植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞。殖干细胞进行扩增和传代，所述细胞培养液 B3为 RPMI 1640，并含有鹿茸提取物 5-100mg/ml、水蛭提取物 5-100mg/ml、激活素 A ( Activin A ) 1-lOOng/mK 胶盾细胞源性神经营养因子（ GDNF ) Ι-lOOng/mK 促红细胞生成素（EPO ) l-100ng/ml, 干细胞因子 l-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 l-100ng/ml、白细胞介素 3 Ι-lOOng/mK 白细胞介素 6 Ι-lOOng/mK 白细胞介素 1 1 l-100ng/ml、胰岛素 l-100ng/ml;

优选地，当培养植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞至 100%密度后， 1 :3 稀释传代，继续用细胞培养液 B3培养。

优选地，所述细胞的扩增传代在 5%C0₂和 37°C条件下进行。

优选地，采用细胞培养液 B3为含有鹿茸提取物 50mg/ml、水蛭提取物 50mg/ml、激活素 A 10 ng/ml、胶盾细胞源性神经营养因子 10 ng/ml、促红细胞生成素 10 ng/ml、干细胞因子 10 ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 10 ng/ml、白细胞介素 3 lOng/mK白细胞介素 6 10ng/mK白细胞介素 11 10ng/ml、胰岛素 10 ng/ml的 RPMI 1640。的步骤;' 优选地，所冷冻保存方法为：将产生的植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞以 1 X 10^1G/ml的细胞密度与 10%二曱基亚砜和 10%低分子右旋糖酐浓度混合，降温至 -80°C，然后转移到 -186°C液氮中深低温保存。

另一方面，本发明提供由上述方法制备的植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞。

本发明还提供所述的植物和蛋白诱导性自体生殖千细胞的应用，优选地 ,本发明提供该自体生殖干细胞在制备用于治疗男女性不孕不育的药物和用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病药物中的应用；优选地，所述疾病为卵巢衰竭；优选地，本发明提供该自体生殖干细胞在建立自体生殖干细胞库中的应用。

又一方面，本发明提供用于使人的体细胞逆向分化的培养液，所述培养液选自细胞培养液 Bl、 B2和 B3，所述细胞培养液 B1为 RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物 5-100mg/ml、鹿茸提取物 5-100mg/mK Υ-27632 1-25μΜ、干细胞因子 l-100ng/ml、白细胞介素 3 1-lOOng/mK白细胞介素 6 l-100ng/ml; 所述细胞培养液 B2为 RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物 5-100mg/ml、鹿茸提取物 5-100mg/ml、水蛭提取物 5-100mg/ml、促红细胞生成素 l-100ng/ml、干细胞因子 l-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 l-100ng/ml、 Y-27632 1-25μΜ、白细胞介素 3 1-lOOng/mK 白细胞介素 6 vng/ml、白细胞介素 11 l-100ng/ml ; 所述细胞培养液 B3 为 RPMI 1640 , 并含有鹿茸提取物 5-100mg/mK 水蛭提取物 5-100mg/ml、激活素 A l-100ng/ml、胶盾细胞源性神经营养因子 l-100ng/ml、促红细胞生成素 l-100ng/ml、干细胞因子 l-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 l-100ng/ml、白细胞介素 3 1-lOOng/mK 白细胞介素 6 l-100ng/ml、白细胞介素 11 1-lOOng/mK 胰岛素

此外，本发明提供所述细胞培养液 B1和 B2在培养人的体细胞使之逆向分化产生自体生殖干细胞中的应用。

本发明还提供所述细胞培养液 B3在自体生殖干细胞扩增和传代中的应用。

再一方面，本发明提供一种用于制备自体生殖干细胞的试剂盒，其中所述试剂盒包括细胞培养液 B1和 B2;

优选地，所述试剂盒进一步包括人的体细胞；所述体细胞包括但不限于人的皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞、脐带血细胞、胎盘细胞。

优选地，所述试剂盒进一步包括细胞培养液 B3。

本发明还提供所述试剂盒在制备自体生殖干细胞和用于治疗男女性不孕不育的药物和用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病药物中的应用；优选地，所述疾病为卵巢衰竭。以下是本发明的详细描述：

为完成本发明涉及到以下技术问题：

( 1 )选用什么样的人的体细胞作为逆向分化生产植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞的原料细胞；

( 2 )怎样处理和培养各种原料细胞；

( 3 )怎样使原料细胞逆向分化生产植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞； ( 4 )怎样扩增传代植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞；

( 5 )怎样检测生产的人自体生殖干细胞；

( 6 )怎样冰冻长期保存植物和蛋白诱导性人自体生殖干细胞；

( 7 )怎样建立植物和蛋白诱导性人自体生殖干细胞库的系统过程以及方法。

因此，本发明的发明目的可以通过下述方法得以实现：

选用的人的原料体细胞可以是： A.脐带血， B.胎盘， C.细胞专业公司商品化提供的非永生化人的各种体细胞株， D.细胞专业公司商品化提供的永生化人的各种体细胞株， E.常规血库保存的血液和白细胞悬液， F.新鲜分离制备的人的皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞等等； G因手术切除而废弃的部分健康組织器官，如脑、肌肉、肝、脾、腎、骨、和脂肪组织等。选用的人的原料体细胞可以是：人的皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞、脐带血细月包、胎盘细月包。

选用的原料体细胞的培养包括：以 2-5xl0⁶的密度，用 DMEM等相应的细胞培养液在 5%C0₂和 37°C条件下培养 24-48小时。

使原料细胞逆向分化生产人自体生殖干细胞包括：将相应的原料体细胞用 DMEM等相应的细胞培养液在 5%C0₂和 37°C条件下培养 24-48小时后，换用细胞培养液 Bl ( RPM 1640、淫羊藿提取物 50mg/ml、鹿茸提取物 50mg/ml、 Υ-27632 10μΜ、干细胞因子 10 ng/ml、白细胞介素 3 10ng/ml、白细胞介素 6 lOng/ml )继续在 5%(：0₂和 37°C条件下培养 2-3天，然后换用细胞培养液 B2 ( RPMI 1640 淫羊藿提取物 50mg/ml、鹿茸提取物 50mg/ml、水蛭提取物 50mg/ml、促红细胞生成素 10 ng/ml、干细胞因子 10 ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 10 ng/ml、 Υ-27632 ΙΟμΜ, 白细胞介素 3 10ng/ml、白细胞介素 6 10ng/ml、白细胞介素 11 10ng/ml )继续在 5%C0₂和 37°C条件下培养 6-9天。

产生的植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞可以采用以下步驟扩增和传代：用细胞培养液 B3 ( RPMI 1640、鹿茸提取物 50mg/ml、水蛭提取物 50mg/ml、激活素 A 10 ng/ml、胶质细胞源性神经营养因子 10 ng/ml、促红细胞生成素 10 ng ml、干细胞因子 10 ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 10 ng/mK白细胞介素 3 lOng/mK白细胞介素 6 lOng/mL白细胞介素 11 10ng/ml、胰岛素 10 ng/ml )继续在 5%C0₂和 37°C条件下培养植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞至 100%密度后， 1:3稀释传代，继续用细胞培养液 B3培养；根据本发明的一个实施方案，所获得的人自体生殖干细胞可以通过以下方法进行检测：利用生殖干细胞的特异细胞表型 Oct4、 Nanog、 C-kit、 Dazl 和 Mvh等作为检测指标，分别采用流式细胞仪、细胞免疫荧光技术和 Western blot蛋白印迹技术检测生殖干细胞的生成速度、生成率、生成数量和纯度 ( Oct4、 Nanog、 C-kit、 Dazl和 Mvh等作为检测指标及检测方法参考：王毓斌、陈斌，胚胎干细胞体外分化为生殖细胞的研究进展，生殖与避孕，第 28 卷第 9 期； Lacham-Kaplan O, Chy H, Trounson A (2006) Testicular cell conditioned medium supports differentiation of embryonic stem cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells 24: 266-273； Jinlian Hua, Kuldip Sidhu(2008).Recent Advances in the Derivation of Germ Cells from the Embryonic Stem Cells. Stem cells and development 17:399-411 )„

根据本发明的另一个实施方案，所产生的植物和蛋白诱导性人自体生殖千细胞经冰冻长期保存：吹打悬浮贴壁生长的植物和蛋白诱导性生殖干细胞并收集到 50ml毫升的离心管内，在离心机内以 1500rpm，4°C离心 10分钟，弃上清。制备的植物和蛋白诱导性生殖干细胞以 lxl0^1G/ml和 DMSO混合，以 10%二甲基亚砜和 10°/。低分子右旋糖肝浓度混合，降温至 -80°C , 然后转移到 -186°C液氮中深低温保存。本发明的技术方法可应用于男女性不孕不育症的治疗 , 并适用于自体干细胞的抗衰老保健，利用巨额数量的自体生殖干细胞再生性修复全身各组织器官的衰老变性，尤其是衰竭卵巢的再造，可以恢复组织器官的年青结构及生理功能，抗衰老及延年益寿。所产生的自体生殖干细胞的体外诱导分化在避孕药开发、人口调控、瀕危物种的保存、动物育种和转基因动物生产方面都有重大作用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下几个优点：

一、本发明不同于已有的利用基因重组技术诱导体细胞逆向分化产生干细胞（iP干细胞），提供了一种新的体细胞逆向分化，产生人自体生殖干细胞的生产调控技术，利用植物提取物和蛋白配方技术诱导体细胞逆向分化产生的干细胞 ( Plants and Proteins induced pluripotent stem cell, PPiPS干细月包），使得细胞结果接近于自然千细胞，安全性高。具体而言，本发明通过采用人的常规的体细胞，在不改变体细胞染色体 DNA序列，不插入任何外来基因或 DNA片段的情况下，应用经过筛选优化设计的植物提取物和蛋白配方使体细胞重新逆向分化而形成自体生殖干细胞，为解决不孕不育治疗领域目前所存在的困难提供了新的思路和途径，克服了从睾丸或卵巢分离制备自体生殖干细胞中分离培养耗时困难、生殖细胞来源困难、获取数量极其稀少的缺陷。

二、本发明的方法可以直接采用来自患者的体细胞，使该体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞,应用此自体生殖干细胞避免了采用异体 /异种干细胞移植带来的免疫排斥，为临床应用提供了显著的便利条件。在两组棵鼠移植试脸中，棵鼠皮下移植注射 lxlO⁸ 个植物和蛋白诱导性生殖干细胞或 lxlO⁸个人自然胚胎干细胞，观察接种部位有否肿瘤形成，连续观察 90天后，发现采用植物和蛋白诱导性生殖干细胞的试验组 10只棵鼠无一例产生肿瘤，人胚胎干细胞试验组 10只棵鼠全部产生肿瘤，因此本发明的植物和蛋白诱导性生殖干细胞具有较高的安全性。本发明还是一种可以在任何年龄的人个体中生产生殖干细胞的新技术方法。

四、已证明采用本发明的方法可以使 200ml人周围血液在 2周内产生几百亿数量级别的第 1代自体 /异体生殖干细胞，生产速度快，产量巨大，纯度达到 15-50%，可以在任何年龄阶段的人个体中，短期内迅速生产巨额数量的自体生殖干细胞。利用生殖干细胞的特异表型作为检测指标，各种植物和蛋白诱导性人自体干细胞的生产工艺流程可以被严格地、多次地、系统地进行流式细胞技术和免疫细胞化学技术检测，因此，作为自体种子细胞和再生修复细胞，在再生医学、自体组织器官工程和自体生殖干细胞生产的产业化领域，植物和蛋白诱导性人自体生殖千细胞可能具有良好的潜在应用前景，还具有大规模工业化和产业化生产自体生殖干细胞的可能性。

五、本发明的方法还适用于建立自体生殖干细胞库，长期永久保存自体生殖干细胞及个人独特的遗传信息，是一种可以在任何年龄的人个体中建立自体生殖干细胞库的新技术方法。附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图 1中， 1-A为血液单个核细胞 PBMC (周围血单个核细胞，即原料细胞）； 1-B 为植物和蛋白诱导性生殖干细胞 PPiPGC (Plants and Proteins induced primordial germ cell)。

Nanog、 oct4、 Klf4和 SOX2特异表型。

图 3为应用 Western blot蛋白印迹技术检测植物和蛋白诱导性生殖干细胞的 Nanog、 oct4、 Klf4和 SOX2特异表型， PBMC为周围血单个核细胞（原料细胞）。

图 4为应用流式细胞仪技术检测植物和蛋白诱导性生殖干细胞的 c-kit、 Dazl、 Mvh和 Fragilis特异表型。 PPiPGC-P2为第 2代植物和蛋白诱导性生殖干细胞 PPiPGC (Plants and Proteins induced primordial germ cell)。

图 5中，图 5-A为第 3代植物和蛋白诱导性生殖干细胞； 5-B为第 6代植物和蛋白诱导性生殖干细胞。具体实施方式

通过下面的详述，将对本发明的操作方法及特点和优点作进一步说明，当然，应该指出的是尽管本文描述的以下几种实施例，人们也可以根据本发明的基础，提出各种变化和个性的形式也是可能的。

实施例中采用的培养液为：

细胞培养液 Bl: RPMI 1640, 含淫羊藿提取物 50mg/ml、鹿茸提取物 50mg/mK Υ-27632 10μΜ、干细胞因子 10 ng/ml、白细胞介素 3 1 Ong/ml、白细胞介素 6 1 Ong/ml;

细胞培养液 B2: RPMI 1640, 含淫羊藿提取物 50mg/ml、鹿茸提取物 50mg/ml、水蛭提取物 50mg/ml、促红细胞生成素 10 ng/ml、干细胞因子 10 ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 10 ng/ml、 Υ-27632 10μΜ、白细胞介素 3 1 Ong/ml、白细胞介素 6 1 Ong/ml、白细胞介素 11 1 Ong/ml; 细胞培养液 B3: RPMI 1640，含鹿茸提取物 50mg/ml、水蛭提取物 50mg/ml 激活素 A 10 ng/ml、胶质细胞源性神经营养因子 10 ng/ml、促红细胞生成素 10 ng/ml、干细胞因子 10 ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 10 ng mK白细胞介素 3 10ng mK白细胞介素 6 10ng/mK白细胞介素 11 10ng/ml、胰岛素 10 ng/ml。

实施例中采用的试剂及其来源：

淫羊藿提取物、鹿萆提取物和水蛭提取物购自河南天然植物原料厂和郑州荔诺生物科技有限公司； Y-27632购自 Sigma公司；干细胞因子、白细胞介素 3、白细胞介素 6、白细胞介素 11、促红细胞生成素、碱性成纤维细胞生长因子、激活素 A、细胞源性营养因子、胰岛素购自 R&D公司。实施例：采用周围静脉血、脐带血作为原料细胞，生产和长期保存植物和蛋白诱导性生殖千细胞

周围静脉血和脐带血（北京五洲女子医院、北京安定门医院、科研人员捐献等）的无菌采集。采集周围静脉血 /脐带血前应征得供血本人或直系亲属的同意，并记录供血本人及家庭的遗传和传染病史以及医院所有相关的病毒检查结果。

周围静脉血 /脐带血常规抗凝， 4°C保存。在 24小时之内送至干细胞制作生产中心。在中心需要再做相应的病毒检测后，进入中心电脑登记程序，在记录相应的条形码编号后，血液标本进入无菌干细胞生产车间。

在干细胞生产车间，血液标示应用 Ficoll标准分离技术（《现代免疫学实验技术》第十二章第 288页）分离单个核细胞后，进行单个核细胞计数。应用 DMEM培养液以 2-5xl0⁶的密度，在 5°/。C0₂和 37。C条件下培养 24-48 小时；换用细胞培养液 B1继续在 5%C0₂和 37°C条件下培养 72小时，然后换用细胞培养液 B2继续在 5%C02和 37°C条件下培养 9-15天。

对生产的人自体生殖干细胞进行了检测：利用生殖干细胞的特异细胞表型 Nanog、 Oct4、 Klf4、 SOX2、 c-kit. Dazl、 Mvh和 Fragilis等作为检测指标，在换用细胞培养液 B2继续培养后的第 6、第 9和第 12天，分别釆用流式细胞仪、细胞免疫荧光技术和 Western blot蛋白印迹技术（《现代免疫学实验技术》第六章、第七章、第十八章）检测生殖干细胞的生成速度、生成率、生成数量和纯度。结果发现， 200ml周围静脉血 /80ml脐带血的单个核细胞在细胞培养液 B2培养后的第 6-9天，植物和蛋白诱导性生殖干细胞的产量可达 1-2.5x10" (其它实验结果请见附图 1-4 )。形态，分别如图 1A和 IB所示。图 2中示出了应用细胞免疫荧光化学技术检测生产的诱导性生殖干细胞的 Oct4和 Nanog特异表型。应用 Western blot 蛋白印迹技术检测植物和蛋白诱导性生殖干细胞 (PPiPGC)的 Oct4、Nanog、 Klf4和 SOX2特异表型，并且以原料细胞 (周围血单个核细胞， PBMC)作为对照。由电泳结果可见， PPiPGC干细胞 Oct4、 Nanog. Klf4和 SOX2 特异表型阳性，而 PBMC原料细胞 Oct4、 Nanog. Klf4和 SOX2特异表型阴性。图 4为应用流式细胞仪技术检测生产的诱导性生殖干细胞的 c-kit、 Dazl、 Mvh和 Fragilis特异表型的结果。如图所示，用 B2培养液培养第 6 天， c-kit、 Dazl、 Mvh和 Fragilis特异表型的生成速度分别为 6.87°/。、 28.14%、 37.13%和 16.75%。

对产生的植物和蛋白诱导性人自体生殖干细胞进行扩增传代。用细胞培养液 B3 (Medium) 继续在 5%C0₂和 37°C条件下培养植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞至 100%密度后， 1:3稀释传代，继续用细胞培养液 B3培养。培养结果请参考图 5，其中图 5-A为第 3代植物和蛋白诱导性生殖干细胞，图 5- B为第 6代植物和蛋白诱导性生殖干细胞。打悬浮贴壁生长的植物和蛋白诱导性生殖干细胞并集到 50ml毫升的离心管内，在离心机内以 1500rpm,4°C离心 10分钟，弃上清。制备的植物和蛋白诱导性生殖干细胞以 lxl0^1Q/ml和 DMSO混合，以 10%二曱基亚砜和 10% 低分子右旋糖肝浓度混合，降温至 -80°C , 然后转移到 -186°C液氮中深低温保存，建立植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞库。实施例 2

本实施例对实施例 1 中制备的植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞进行棵鼠移植的安全性研究，具体如下。

在两组棵鼠移植试验中，棵鼠皮下移植注射 lx lO⁸ 个植物和蛋白诱导性的生殖干细胞或 ΙχΙΟ⁸个人自然生殖干细胞（海南医学院生殖中心赠送），观察接种部位有否肿瘤形成。连续观察 90天。

结果显示，植物和蛋白诱导性生殖干细胞试验组 10只棵鼠无一例产生肿瘤，具有较高的安全性；而人自然生殖干细胞试验组 10只棵鼠全部产生肿瘤。

Claims

权利要求书

1、一种使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的方法，其中，所述方法包括：

将人的体细胞在细胞培养液 B 1 中培养 2-3天，所述细胞培养液 B 1为 RPMI 1640,并含有淫羊藿提取物 5-100mg/ml、鹿茸提取物 5-100mg mg/ml、 Υ-27632 1-25μΜ> 干细胞因子 l-100ng/ml、白细胞介素 3 l-100ng/ml、白细胞介素 6 l-100ng/ml; 然后换用细胞培养液 B2培养 6-9天，所述细胞培养液 B2 为 RPMI 1640 , 并含有淫羊藿提取物 5-100mg mg/mK 鹿茸提取物 5-100mg mg/ml 水蛭提取物 5-100mg mg/ml、促红细胞生成素 l-100ng/ml、干细胞因子 l-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 l-100ng/ml、 Y-27632 1-25μΜ、白细胞介素 3 l-100ng/ml、白细胞介素 6 l-100ng/ml、白细胞介素 1 1 l-100ng/ml, 从而获得植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞；

优选地，在 5%C0₂和 37°C条件下进行细胞培养。

2、如权利要求 1 所述的方法，其中，所述人的体细胞包括但不限于人的脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞等；

优选地，在人的体细胞以细胞培养液 B1培养之前，先以 2-5X 10⁶的密度在 5%C0₂和 37°C奈件下培养 24-48小时；

优选地，先将细胞在细胞培养液 B1 中培养 3天，所述细胞培养液 B1 为含有淫羊藿提取物 50mg/ml、鹿茸提取物 50mg/ml、 Υ-27632 ΙΟμΜ, 干细胞因子 10 ng/ml、白细胞介素 3 lOng/mK 白细胞介素 6 10ng/ml的 RPMI 1640；然后换用细胞培养液 B2培养 6-⁸天，所述细胞培养液 B2为含有淫早藿提取物 50mg/ml、鹿茸提取物 50mg/ml、水蛭提取物 50mg/ml、促红细胞生成素 10 ng/mK 干细胞因子 10 ng/mU 碱性成纤维细胞生长因子 10 ng/mK Υ-27632 10μΜ、白细胞介素 3 10ng/mK 白细胞介素 6 10ng/mK 白细胞介素 1 1 10ng/ml的 RPMI 1640,从而获得植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞。

3、如权利要求 1或 2所述的方法，其中所述方法还包括采用细胞培养液 B3对获得的植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞进行扩增和传代，所述细胞培养液 B3 为 RPMI 1640, 并含有鹿茸提取物 5-100mg/ml、水蛭提取物 5-100mg/m 激活素 A (激活素 A ) 1-l OOng/mK 胶质细胞源性神经营养因子（胶质细胞源性神经营养因子） l-100ng/ml、促红细胞生成素（促红细胞生成素） l-100ng/ml、干细胞因子 l-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 1-lOOng/mK 白细胞介素 3 l-100ng/ml、白细胞介素 6 l-100ng/ml、白细胞介素 11 l-100ng/ml、胰岛素 l-100ng/ml;

优选地，当培养植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞至 100%密度后， 1:3 稀释传代，继续用细胞培养液 B3培养；

优选地，所述细胞的扩增传代在 5%C0₂和 37°C奈件下进行；

优选地，所述细胞培养液 B3为含有鹿萆提取物 50mg/ml、水蛭提取物 50mg/ml、激活素 A 10 ng/ml、胶盾细胞源性神经营养因子 10 ng/ml、促红细胞生成素 10 ng/ml、干细胞因子 10 ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 10 ng/ml、白细胞介素 3 lOng/ml,白细胞介素 6 10ng/ml 白细胞介素 11 10ng/ml、胰岛素 10 ng/ml的 RPMI 1640。

4、如权利要求 1-3中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括冷冻保存使体细胞逆向分化产生的自体生殖干细胞的步骤；

优选地，所述冷冻保存步骤包括：将产生的植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞以 1 X 10¹⁽⁾/ml的细胞密度与二曱基亚砜混合，以 10%二曱基亚砜和低分子右旋糖酐浓度降温至 -80'C，然后转移到、 186°C液氮中深低温保存。

5、如权利要求 1-4 中任一项所述的方法制备的植物和蛋白诱导性自体生殖干细月包。

6、如权利要求 5所述的植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞在制备用于治疗男女性不孕不育的药物和用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病药物中的应用；

优选地，所述疾病为卵巢衰竭；

优选地，所述自体生殖干细胞用于建立自体生殖千细胞库。

7、用于使人的体细胞逆向分化的细胞培养液，其中，所述培养液选自细胞培养液 Bl、 B2和 B3，所述细胞培养液 B1为 RPMI 1640, 并含有淫羊藿提取物 5-100mg/ml、鹿茸提取物 5-100mg/ml、 Υ-27632 1-25μΜ、干细胞因子 l-100ng ml、白细胞介素 3 1-lOOng mK 白细胞介素 6 l-100ng/ml; 所述细胞培养液 B2为 RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物 5-100mg/ml、鹿茸提取物 5-100mg/ml、水蛭提取物 5-100mg/ml、促红细胞生成素 l-100ng/ml、干细胞因子 l-100ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子 l-100ng/ml、 Y-27632 1-25μΜ, 白细胞介素 3 l-100ng/ml、白细胞介素 6 l-100ng/ml、白细胞介素 11 l-100ng/ml; 所述细胞培养液 B3 为 RPMI 1640, 并含有鹿茸提取物 5-100mg/m 水蛭提取物 5-100mg/ml、激活素 A l-100ng/ml、细胞源性神经营养因子 l-100ng/ml、促红细胞生成素 l-100ng/ml、干细胞因子 l-100ng/ml . 碱性成纤维细胞生长因子 l-100ng/ml、白细胞介素 3 Ι-lOOng/mK 白细胞介素 6 l-100ng/ml、白细胞介素 1 1 1-lOOng/mK 胰岛素 l-100ng/mU

8、如权利要求 Ί所述的细胞培养液 B1和 B2在培养人的体细胞使之逆向分化产生自体生殖干细胞中的应用。

9、如权利要求 7所述的细胞培养液 B3在自体生殖干细胞扩增和传代中的应用。

10、一种用于制备自体生殖千细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括如权利要求 7所述的细胞培养液 B1和 B2;

优选地，所述试剂盒进一步包括人的体细胞；所述体细胞包括但不限于人的脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞；

优选地，所述试剂盒进一步包括细胞培养液 B3。

11、如权利要求 10所述的试剂盒在制备自体生殖干细胞和用于治疗男女性不孕不育的药物以及用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病药物中的应用；优选地，所述疾病为卵巢衰竭；建立植物和蛋白诱导性自体生殖干细胞库的应用。