RU2648162C2 - Способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток - Google Patents
Способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2648162C2 RU2648162C2 RU2016115622A RU2016115622A RU2648162C2 RU 2648162 C2 RU2648162 C2 RU 2648162C2 RU 2016115622 A RU2016115622 A RU 2016115622A RU 2016115622 A RU2016115622 A RU 2016115622A RU 2648162 C2 RU2648162 C2 RU 2648162C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- platelet
- samples
- donors
- sample
- growth
- Prior art date
Links
- 230000012010 growth Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 239000006166 lysate Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000654 additive Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 title abstract 11
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000011176 pooling Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 15
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 abstract description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 16
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 16
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 6
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 4
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 3
- 108010017843 platelet-derived growth factor A Proteins 0.000 description 3
- 108010000685 platelet-derived growth factor AB Proteins 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 208000035472 Zoonoses Diseases 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 2
- 208000000104 Arthus reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010053614 Type III immune complex mediated reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004227 calcium gluconate Substances 0.000 description 1
- 229960004494 calcium gluconate Drugs 0.000 description 1
- 235000013927 calcium gluconate Nutrition 0.000 description 1
- NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L calcium;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000018127 platelet degranulation Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000008542 thermal sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биомедицины и касается способа получения ростовой добавки к среде для культивирования клеток человека из тромбоцитарной массы доноров. Представленный способ включает нормирование образца тромбоцитарной массы до заданной концентрации тромбоцитов 1,75×109 кл/мл посредством центрифугирования тромбоцитарной массы при 3130 g в течение 40 минут при 20°С и ресуспендирования осадка в супернатанте заданного объема до указанной концентрации тромбоцитов. Трехкратный температурный лизис нормированного образца путем замораживания на сутки до -80°С и размораживания при +37°С. Осаждение клеточного дебриса посредством центрифугирования при 3130 g в течение 40 минут при 20°С, сбор супернатанта с получением индивидуального образца лизата тромбоцитов с последующим его микроскопическим контролем при увеличении ×200 на наличие в поле зрения не более 3-х фрагментов тромбоцитов. При этом стандартизацию проводят путем пулирования равных по объему индивидуальных образцов лизата, полученных из тромбоцитарной массы не менее 12 доноров обеих тендерных групп, и полученный лизат тромбоцитов центрифугируют при 3130 g в течение 40 минут при 20°С, с последующей ультрафильтацией на фильтрах 0,45 мкм или 0,22 мкм, полученную ростовую добавку делят на аликвоты требуемого объема и замораживают до -80°С. Изобретение позволяет получить стандартизованные образцы нексеногенной ростовой добавки для культивирования клеток человека разных типов с функциональной активностью образцов, определяемой по скорости прироста тест-культур, различающейся не более чем на 10,0%. 3 ил., 8 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биомедицины и направлено на создание «ростовой добавки», пригодной для культивирования клеток, в том числе на этапах получения клеточных продуктов и тканеинженерных конструкций, предназначенных для введения в организм человека.
Культивирование и наращивание клеток человека in vitro является начальным, промежуточным этапом или самостоятельной процедурой во многих сферах, и в частности:
1. культивирование и наращивание разных типов клеток для экспериментальных разработок;
2. культивирование и наращивание клеток гибридом с целью получения моноклональных антител;
3. культивирование и наращивание клеток разных типов (дифференцированных, прогениторных, стволовых) для целей клеточной терапии;
4. культивирование и наращивание клеток - как этап создания тканеинженерных конструкций для регенеративной медицины;
5. культивирование и наращивание клеток для биотехнологических целей (включая генетическую инженерию).
Культивирование клеток человека in vitro осуществляют в коммерческих питательных средах разных типов с добавками (supplements). Добавки делятся на 2 основных типа:
1) традиционно используемые как источники факторов роста, гормонов, витаминов -эмбриональная телячья сыворотка (далее - ЭТС);
2) специальные добавки для решения конкретных задач.
Одной из актуальных проблем регенеративной медицины является безопасность биомедицинских клеточных продуктов и тканеинженерных конструкций, использование которых способствовало бы восстановлению структуры и функции утраченных органов и тканей у пациентов без угрозы возникновения у них различных осложнений, в том числе иммунологических.
Для стандартизации и валидации процесса получения безопасных биомедицинских клеточных продуктов требуется разработка регламента их доклинических испытаний. К этому разделу относится и разработка технологий безопасного культивирования клеток, в частности, с использованием адекватных культуральных сред и добавок.
Традиционно в качестве ростовой добавки («supplement») для культивирования клеток используют ЭТС, которая считается комплексной смесью высоко- и низкомолекулярных биомолекул с физиологическим балансом стимулирующих и блокирующих факторов роста (ФР), с низким содержанием γ-глобулинов - ингибиторов роста и пролиферации клеток [Bieback K., 2013; Mojica-Henshaw М.P. et al., 2013]. Однако использование ЭТС как источника ксеногенных протеинов на этапах приготовления клеточных препаратов и тканеинженерных конструкций, предназначенных для введения человеку, в настоящее время не рекомендуется вследствие возможности аллергических реакций, а также переноса в организм человека вирусов, прионов и зоонозов [Flemming A. et al., 2011; Azouna N. et al., 2012; Vasanthan P. et al., 2014; Naaijkens B.A. et al., 2012; Chen B. et al., 2012; Griffiths S. et al., 2013; Warnke P.H. et al, 2013]. Так, в частности, показано, что при введении человеку ММСК, культивированных с ЭТС, вырабатываются антитела, опосредующие развитие реакции Артюса (Selvaggi et al, 1997). Возможная экспрессия главного комплекса гистосовместимости II типа (МНС II) в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках (ММСК) в присутствии ЭТС, по мнению ряда авторов, также ограничивает использование ЭТС в технологиях регенеративной медицины [Bieback K., 2013; Griffiths S. et al., 2013]. He исключено, что генетическая нестабильность ММСК ряда доноров in vitro тоже может быть индуцирована компонентами ЭТС [Crespo-Diaz R. et al., 2013].
Кроме того, известно, что состав ЭТС значительно варьирует по содержанию активных компонентов от лота к лоту, что не дает возможности стандартизовать ее по наиболее значимым компонентам (Flemming A. et al., 2011; Vasanthan P. et al., 2014; Naaijkens B.A. et al., 2012). Это часто создает трудности при подборе ЭТС для определенных клеточных линий, а в ряде случаев - при сопоставлении результатов, полученных при использовании разных лотов ЭТС.
На этапах разработки гуманизированных ростовых добавок к культуральным средам были апробированы экстракты различных тканей, биологические жидкости и бессывороточные среды с рекомбинантными ФР, однако удовлетворительные результаты получены не были [Seo J. et al., 2013; Vasanthan P. et al., 2014]. Аллогенные сыворотки в качестве замены ЭТС вызывали арест пролиферации и гибель ММСК (Shahdadfar et al., 2005). В аутологичных сыворотках ММСК пролиферировали адекватно, но делать ее дорого и непрактично (Kobayashi et al., 2005).
В последние годы внимание исследователей обращено к тромбоцитам - естественным источникам многих ФР (PDGF, изоформы АА, АВ, ВВ; TGFα1, -β; HGF; IGF-1; VEGF; EGF; FGFb), в частности, к лизату тромбоцитов (ЛТ) человека для замены ЭТС [Шанский Я.Д. и соавт., 2013; Naaijkens В. et al., 2012; Flemming A. et al., 2011; Azouna N. et al., 2012; Chen B. et al., 2012; Vasanthan P. et al., 2014; Ruggiu A. et al., 2013; Griffiths S. et al., 2013; Warnke P.H. et al., 2013].
Основными недостатками ЭТС, как ростовой добавки для культивирования клеток, предназначенных для введения человеку, являются:
- ЭТС - ксеногенный (в отношении человека) материал,
- возможность переноса с ЭТС инфекционных агентов, включая зоонозы, прионы и вирусы (в т.ч. нераспознанные),
- возможность переноса с ЭТС свободной ксеногенной ДНК,
- возможность переноса с ЭТС нежелательных метаболитов,
- возможность иммунологического ответа на ЭТС, в т.ч. аллергических реакций на ксеногенные компоненты,
- изменение экспрессии ряда маркеров в клетках человека, культивируемых в присутствии ЭТС,
- нестандартизированность ЭТС по функциональной активности,
- во многих странах, включая Россию, запрещено введение в организм (минуя желудочно- кишечный тракт) человека биологических клеточных продуктов, которые в процессе приготовления имели контакт с ксеногенными биологическими материалами.
Известен способ получения ЛТ из богатой тромбоцитами плазмы крови взрослых животных (WO 2006/137778 А1), в котором лизис тромбоцитов осуществляют добавлением к тромбоцитам в плазме растворимых солей кальция, либо деионизированной воды. Далее смесь центрифугируют и фильтруют.
Однако данный способ получения ЛТ, обогащенный солями кальция в использованных концентрациях, может быть токсичным для ряда клеточных культур. Кальций в среде культивирования может изменять функционирование клеток, как один из ключевых ионов-регуляторов жизнедеятельности.
Отличительные признаки (от предложенного нами способа) являются:
- используют периферическую кровь животных;
- способы дегрануляции тромбоцитов (для выхода в плазму ФР) - соли кальция или деионизированная вода.
Известен способ приготовления ЛТ и культуральной среды с ЛТ (ЕР 0413727 А1) из цельной крови животных для выращивания гибридом с целью получения антител. Отличия от нашего изобретения:
- используют периферическую кровь животных с бойни;
- получаемый ЛТ - ксеногенный, исключена лишь внутрисердечная пункция эмбриона коровы;
- способ разрушения и дегрануляции тромбоцитов - добавление Са+2.
Как и в предыдущем известном способе, полученный ЛТ, обогащенный солями кальция в использованных концентрациях, может быть токсичным для ряда клеточных культур. Кальций в среде культивирования может изменять функционирование клеток, как один из ключевых ионов-регуляторов жизнедеятельности.
Известен способ получения ростовой добавки из обогащенной тромбоцитами плазмы крови животных (US 5198357 А) для культивирования гибридомных клеток. ЛТ получают из цельной крови животных с раствором цитрата натрия для предотвращения свертывания. Способ лизиса - добавление кальция, что одновременно приводит к коагуляции фибриногена. Сепарацию производят путем центрифугирования, последующую стерилизацию - путем фильтрования. Используют как более дешевую альтернативу ЭТС.
Известен способ выделения ЛТ из ТМ, полученный путем афереза у доноров (CN 104673747 А). Общие с заявляемым способом черты получения ЛТ:
- для разрушения тромбоцитов используют несколько циклов замораживания (-80°C) - оттаивания (+37°C) ТМ;
- авторы доказывают, что несколько циклов замораживания/оттаивания дают лучший выход ФР;
- используют центрифугирование для освобождения от фрагментов тромбоцитов;
- индивидуальные ЛТ, полученные описанным способом, поддерживают рост клеток в сходной с ЭТС концентрацией (10%).
Известен способ получения ростовой добавки из обогащенной тромбоцитами плазмы крови (US 2012276632 Al), включающий температурный лизис тромбоцитов (замораживание/оттаивание).
В отличие от предлагаемого нами метода, авторы перед лизисом тромбоцитов в ТМ освобождаются от плазмы крови центрифугированием, разводя тромбоциты в среде, содержащей альбумин человеческой сыворотки, декстран и гидроксиэтилкрахмал, для восстановления осмолярности.
Известен способ изготовления и применения ЛТ (CN10467 3747-А-2015-06-03) из тромбомассы, полученной путем афереза. Лизис осуществляют путем однократного замораживания (-80°С) - оттаивания (+37°С) тромбомассы с последующей обработкой ультразвуком (100-400 вт, 3-6 секунд), повторяя последнюю процедуру от 5 до 15 раз. Далее ЛТ центрифугируют (для осаждения дебриса), освобождают от фибрина рекальцинацией (глюконатом кальция или хлористым кальцием) и используют ЛТ как ростовую добавку для культивирования ММСК. В полученном ЛТ определяют содержание VEGF, PDGF, заявляя их как наиболее значимые характеристики ЛТ для его функциональной активности.
Самым близким к заявляемому нами способу является способ приготовления композиции, содержащий лизат тромбоцитов (WO 2010/033605 А2 ((Compositions, containing platelet contents»). Приготовление ЛТ включает в себя не менее 2-х циклов замораживания (-80°С) - оттаивания (+37°С), последующее центрифугирование (2000-4000g, оптимально - 3000g) в течение 30 минут. Для стерилизации ЛТ осуществляют ультрафильтрацию (размер пор - 0,45 мкм и 0,2 мкм). Полученный ЛТ в концентрации 5-10% от объема культуральной среды используют в качестве ростовой добавки к средам для культивирования ММСК из жировой ткани (ЖТ), или фибробластов человека (ФЧ), или культур опухолевых клеток (глиомы), что обеспечивает длительную (более 30 дней) пролиферацию этих культур in vitro с динамикой нарастания клеточной популяции, сходной с таковой для 5-10% ЭТС.
Однако в предложенном способе оценку качества приготовленного ЛТ проводят по содержанию фактора роста сосудов VEGF - не менее 200 пг/мл. В предлагаемом нами способе стандартизацию проводят по функциональным свойствам.
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение стандартизованных образцов нексеногенной ростовой добавки для культивирования клеток человека разных типов с функциональной активностью образцов, определяемой по скорости прироста тест-культур, различающейся не более чем на 10,0%.
Задачей изобретения является получение добавки к ростовой среде лизата тромбоцитов, полученного из тромбомассы для наращивания клеточной массы.
Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается за счет того, что так же, как в известном способе проводят нормирование образца ТМ до заданной концентрации тромбоцитов (1,75×109 тромбоцитов/мл) путем центрифугирования ТМ при 3130g в течение 40 минут при 20°С и ресуспендировании осадка в супернатанте заданного объема до концентрации тромбоцитов 1,75×109 тромбоцитов/мл, 3-кратный температурный лизис тромбоцитов путем замораживания
на сутки до -80°С и размораживания при +37°С, осаждение клеточного дебриса путем центрифугирования при 3130 g, 40 минут, 20°С, сбор супернатанта, микроскопический контроль при увеличении ×200 на наличие в поле зрения не более 3-х фрагментов тромбоцитов.
Особенность заявляемого способа заключается в том, что стандартизацию лизата тромбоцитов проводят путем пулирования, объединяя равные по объему образцы, полученные из тромбоцитарной массы не менее 12 доноров обеих тендерных групп, пулированный ЛТ центрифугируют при 3130g, 40 минут при 20°С, далее осуществляют ультрафильтацию пулированного образца на фильтрах 0,45 μкм или 0,22 μкм, после чего разливают по аликвотам требуемого объема и замораживают до -80°С до использования.
Изобретение поясняется подробным описанием, таблицами и иллюстрациями, на которых изображено:
Фиг. 1 - Относительное изменение оптической плотности (OD) раствора формазана культуры фибробластов человека (5-е сутки культивирования) при использовании образцов ЛТ и ЭТС, инактивированных в течение 1 часа при различных температурах (в %, относительно 37°С).
Фиг. 2 - Изменение оптической плотности раствора формазана (МТТ-тест) при культивировании ФЧ в ПРС, содержащей 10% пулированного образца ЛТ или 10% ЭТС.
Фиг. 3 - Изменение оптической плотности раствора формазана (МТТ-тест) при культивировании ММСК в ПРС, содержащей 10% пулированного образца ЛТ или 10% ЭТС.
Способ осуществляют следующим образом.
Технологическая схема получения ЛТ
1. Материал для получения ЛТ - образцы ТМ доноров, полученный путем аппаратного афереза.
Процедура заготовки ТМ валидирована и предполагает контаминацию лейкоцитами в количестве не более 1×106 на дозу (~2×1011 тромбоцитов), что контролируется в соответствии с техническим регламентом «О требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии, а также с применением стандарта «Донорская кровь и ее компоненты: характеристики и контроль качества. IX. Тромбоциты, полученные методом афереза» (Общероссийская общественная организация «Российская ассоциация трансфузиологов»)».
2. Полученный образец ТМ доноров в стерильных условиях переносят в пробирку, тщательно перемешивают и отбирают аликвоту объемом 0,1 мл для определения концентрации тромбоцитов. Перед исследованием аликвоту разводят в 10 раз цитратным буфером ACD-A. Концентрацию тромбоцитов определяют с помощью автоматического гематологического анализатора (например, Sysmex КХ20, Япония).
3. Производят нормирование образца ТМ до заданной концентрации тромбоцитов (1,75×109 тромбоцитов/мл). Для этого ТМ центрифугируют в пробирке объемом 15 мл (например, Corning, США) при 3000 g в течение 40 мин при 20°C (например, центрифуга Eppendorf 5810R, Германия). Осадок тромбоцитов ресуспендируют в супернатанте рассчитанного объема, обеспечивающего конечную концентрацию тромбоцитов (1,75×109 тромбоцитов/мл).
4. Температурный лизис образца ТМ.
Для получения ЛТ - пробирку с образцом ТМ, нормированным по концентрации тромбоцитов, подвергают процедуре температурного лизиса: быстро замораживают при -80°C (низкотемпературный холодильник, например, Sanyo MDF-U500VX) и через 24 ч размораживают при +37°C (20-40 мин; термостат, например ТС-80М-2) до достижения указанной температуры. Процедуру повторяют трехкратно.
5. Центрифугирование образца ЛТ.
Для осаждения фрагментов тромбоцитов (клеточного дебриса) пробирку с образцом ЛТ центрифугируют при 3000g в течение 40 мин при 20°C с минимальной скоростью торможения (например, центрифуга Eppendorf 5810R, Германия). После завершения этапа центрифугирования собирают супернатант, представляющий собой ЛТ.
Представляем обоснование использования 3-х циклов замораживания и оттаивания и указанного режима центрифугирования.
Количество циклов замораживания/оттаивания в литературе варьирует, но очевидно, что оно должно быть минимизировано для сохранения структуры значимых компонентов. Поэтому с помощью световой микроскопии оценивали отсутствие неразрушенных тромбоцитов в образцах лизированной ТМ после 1, 2 и 3 циклов размораживания/оттаивания. Для отделения раствора, обогащенного ФР, от фрагментов тромбоцитов, были апробированы 6 режимов центрифугирования. В этих режимах варьировали такие показатели, как время центрифугирования (20, 30, 40 мин), температура (10, 20°C) и кратность центрифугирования (×1, ×2 и ×3) (табл. 1).
Выбор количества циклов замораживания/оттаивания для получения образцов ЛТ осуществляли в соответствии с визуальным и микроскопическим контролем супернатанта после окончания процедуры (прозрачность, наличие неразрушенных тромбоцитов и/или их фрагментов). Результаты наблюдений показали, что после 3 циклов замораживания/оттаивания наблюдается наименьшее количество неразрушенных тромбоцитов (табл. 2).
По результатам содержания тромбоцитов в супернатанте для оценки содержания ФР в ЛТ были отобраны следующие режимы центрифугирования:
- Режим №1: 3000 об/мин (1400g), 30 мин, 20°C, 3-кратно;
- Режим №2: 3000 об/мин (1600g), 20 мин, 20°C, 3-кратно;
- Режим №3: 4000 об/мин (3130g), 40 мин, 20°C, однократно.
Результаты определения концентрации ФР в образцах ЛТ, полученных при данных режимах, приведены в Таблице 3.
Из приведенных в табл. 3 данных можно видеть, что при использовании всех трех режимов центрифугирования в образцах ЛТ определяются все исследованные нами ФР. Однако при использовании режимов центрифугирования №2 и №3 наблюдается статистически достоверно более высокий выход факторов PDGF АВ, TGF-β1, VEGF, IGF-1, чем при использовании режима №1. Также значимые отличия наблюдаются для режимов №1 vs №3 в отношении содержания PDGF АА в супернатанте. Выход фактора PDGF АА не различался значимо при режимах №1 vs №2, №2 vs №3 (р<0,05). Содержание фактора PDGF ВВ в супернатанте не различалось значимо для всех трех режимов центрифугирования. Выход PDGF АВ, TGF-β, VEGF и IGF-1 не различался значимо при режимах центрифугирования №2 и №3 и был достоверно выше, чем при использовании режима №1.
Таким образом, режимы центрифугирования №2 и №3 обеспечивают наиболее высокое и сходное содержание исследованных нами ФР в супернатанте после лизиса тромбоцитов и осаждения их фрагментов. В то же время, режим №3 требует меньших затрат времени на проведение операции центрифугирования (1 цикл центрифугирования в течение 40 мин vs 3 циклов центрифугирования в течение 20 мин).
6. Микроскопический контроль образца ЛТ
Пробу образца ЛТ оценивают под световым микроскопом при увеличении ×200 на наличие/отсутствие видимых нелизированных тромбоцитов и/или их фрагментов. Очистку считают адекватной при наличии в поле зрения не более 3 фрагментов тромбоцитов.
7. Пулирование образцов ЛТ
Обоснование принципа
Установлено, что образцы ЛТ и ЭТС существенно различаются по содержанию ряда биохимических и гормональных показателей и, главное, по содержанию основных ФР, которые считались ранее ответственными за активирующую способность ЭТС как ростовой добавки. Так, содержание ФР (TGF-β, VEGF, PDGF АА, PDGF АВ, IGF-1, FGFb) в образцах ЛТ было в десятки, а для отдельных ФР в сотни раз выше, чем в образцах ЭТС (табл. 3). Пулы образцов ЛТ от мужчин и женщин обладали сходной способностью активировать пролиферацию клеток, несмотря на существенные различия в содержании женских и мужских половых гормонов. Кроме того, нами установлены различия в термочувствительности образцов ЭТС и ЛТ (Фиг. 1). Это позволило сделать заключение, что за функциональные свойства ЛТ и ЭТС как ростовых добавок ответственны различные коктейли факторов.
Поэтому в основу принципа пулирования мы положили функциональные свойства ЛТ как ростовой добавки - его способность обеспечивать пролиферацию иммортализованных фибробластов кожи человека (ФЧ, штамм 1608h TERT, ФГБУН «Институт молекулярной биологии В.А. Энгельгардта» РАН), задав условие, что по этому признаку пулы ЛТ не должны отличаться более чем нам 10%.
Выбранный нами принцип пулирования образцов ЛТ был основан, таким образом, на оценке пролиферативной активности модельной культуры клеток (ФЧ) в присутствии ЛТ (как ростовой добавки) от индивидуальных доноров. Оценочной величиной служила скорость роста культуры клеток ФЧ in vitro в экспоненциальной фазе роста, наблюдавшейся на начальном этапе культивирования.
В исследовании влияния ЛТ (как ростовой добавки) на пролиферацию ФЧ in vitro средой культивирования служила DMEM с добавлением глютамина 0,58 мг/мл, гентамицина 1,25 мкг/мл, гепарина 2 МЕ/мл. Как ростовую добавку использовали образцы лизатов тромбоцитов от индивидуальных доноров (15 мужчин и 13 женщин) в концентрации 5%, а также образец 5% пулированного ЛТ (от указанных 28 доноров). Культивирование было проведено в 96-луночных планшетах Costar (США) в течение 1-7 суток при плотности посева клеток 1,5×104 клеток/см2. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста (количество повторов каждой пробы - 5).
По результатам измерения оптической плотности (OD) раствора формазана в МТТ-тесте вычислены скорости роста популяции ФЧ в экспоненциальной фазе в присутствии индивидуальных образцов лизатов по формуле
где А - скорость роста популяции клеток (сут-1), Δt - интервал времени культивирования в экспоненциальной фазе роста (4 суток), OD - оптическая плотность раствора формазана на 3-й и 7-е сутки культивирования.
В таблице 4 приведены рассчитанные по получаемым OD значения «А» для индивидуальных доноров, средние значения генеральной совокупности (Aср. ген.) и генеральные стандартные отклонения (σген).
Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что скорость прироста клеток в присутствии индивидуальных образцов ЛТ в отдельных случаях отличалась примерно в 2 раза: минимальное соотношение OD на 7-е сутки к таковой на 3-й составило 2,77, а максимальное - 4,91. Соответствующие индивидуальные скорости находились в диапазоне 0,25-0,4.
Средний прирост культуры ФЧ за 4 суток в присутствии пулированного 5% ЛТ (от 28 доноров) практически совпал с рассчитанными средними для индивидуальных образцов ЛТ мужчин и женщин - 3,90±0,04 vs 4,00±0,58 vs 3,92±0,60. Очевидно, что пулирование с целью стандартизации можно проводить, используя меньшее количество индивидуальных образцов, что математически обосновано ниже.
Далее рассчитывали количество образцов ЛТ для пулирования, исходя из следующих положений.
Если имеются 2 пула, состоящие из n образцов каждый и выбранные из одной нормально распределенной генеральной совокупности, то стандартное отклонение σразн разности
может быть вычислено по формуле
Для того чтобы эта разность не превосходила по абсолютной величине с вероятностью 0,95 значение, равное 10% от Аср.ген, требуется выполнение условия
1,96×σразн≤0,1×Aср,ген
или
Отсюда количество образцов в пуле, соответствующее выполнению условия, вычисляется по формуле
В нашем случае:
Таким образом, для того чтобы скорости прироста популяции ФЧ in vitro в присутствии образца пулированного ЛТ отличались от средней (по группе индивидуальных образцов ЛТ) скорости прироста не более чем на 10,0%, требуется объединять не менее 12 индивидуальных образцов ЛТ. Так как скорости прироста ФЧ в присутствии образцов ЛТ мужчин значимо не отличаются от таковых в присутствии образцов ЛТ женщин, для пулирования можно брать образцы обеих тендерных групп.
Учитывая вышесказанное, при пулировании ЛТ объединяют равные (по объему) образцы, полученные из ТМ 12 доноров. Повторяют центрифугирование по n5.
7. Микрофильтрация и аликвотирование образцов ЛТ
ЛТ подвергают ультрафильтрации (фильтры 0,45 мкм и 0,22 мкм) и разливают в стерильные пластиковые криопробирки (например, Corning, США) по аликвотам от 100 до 500 мкл, маркируют с указанием номера образца, даты изготовления и объема образца ЛТ и замораживают до использования (-80°C).
Пример конкретного исполнения №1
1. Заготовка образцов тромбоцитарной массы доноров
В стерильных условиях методом аппаратного тромбоцитафереза получено 12 индивидуальных образцов тромбоцитарной массы (ТМ, 6 мужчин, 6 женщин). Перед процедурой заготовки ТМ доноры проходили обследование на наличие ВИЧ I и II типа, HBs-антигена, вируса HCV, возбудителя сифилиса. Также был осуществлен клинический анализ крови.
Через 24 часа после процедуры тромбоцитафереза образцы ТМ доноров в специальных пластиковых мешках помещали в транспортировочный контейнер и переносили в лабораторию с прилагаемой сопроводительной информацией (ФИО донора, пол, возраст, дата заготовки ТМ, результаты лабораторных исследований), где в асептических условиях (ламинарный бокс 2-класса защиты) тщательно перемешивали и переносили в пластиковые пробирки (например, Corning, США), примерно по 13,5 мл. Объем полученной ТМ доноров варьировал от 228 до 330 мл (табл. 5).
2. Определение концентрации тромбоцитов в образцах ТМ
Производили определение концентрации тромбоцитов в образце ТМ каждого донора. Для этого тромбоциты ресуспендировали в указанных пробирках путем тщательного перемешивания с использованием механической пипетки на 5,0 мл (например, Eppendorf, Biohit). Далее отбирали пробу ТМ каждого донора объемом 50,0 мкл для определения в ней концентрации тромбоцитов и переносили в пластиковую пробирку (например, Eppendorf) объемом 0,5 или 1,0 мл. В пробирку с пробой добавляли 450 мкл цитратного буфера ACD-A для получения рабочего разведения пробы 1:10. Разведенную пробу вносили в лабораторный анализатор (например, Sysmex КХ21) и измеряли концентрацию тромбоцитов (табл. 5).
3. Нормирование образцов ТМ по количеству тромбоцитов
Образцы ТМ в указанных закрытых пробирках помещали в лабораторную центрифугу (например, Eppendorf 5810R, Швеция) и центрифугировали при 3130g в течение 40 мин при 20°C для осаждения тромбоцитов.
Нормирование тромбоцитов производили в расчете на стандартную концентрацию: рассчитывали объем супернатанта для разведения в нем осадка тромбоцитов, необходимый для достижения концентрации 1,75×109 тромбоцитов/мл. При концентрации тромбоцитов меньше заданной (образцы ТМ от доноров - мужчин №№2, 6 и 2, 3 и 5 доноров - женщин), удаляли лишний объем супернатанта и ресуспендировали осадок тромбоцитов в нужном для достижения указанной концентрации объеме. При концентрации тромбоцитов больше заданной (образцы №1, 3, 4, 5 от доноров - мужчин и 1, 4, 6 от доноров - женщин) ТМ разводили плазмой, аналогичной по составу бесклеточной фракции ТМ.
4. Температурный лизис образцов ТМ
Образцы ТМ доноров, нормированные по концентрации тромбоцитов, в указанных закрытых пробирках переносили в низкотемпературный холодильник (например, Sanyo) и выдерживали при температуре -80°C в течение 1 суток. По истечении указанного времени пробирки переносили в термостат (например, ТС-80М-2) и размораживали содержимое пробирок при +37°С в течение 20-30 мин. Циклы замораживания/оттаивания повторяли 3 раза.
5. Центрифугирование образцов ЛТ
Для освобождения образцов лизированной тромбомассы от фрагментов тромбоцитов производили их центрифугирование. Пробирки с образцами ЛТ переносили в лабораторную центрифугу (например, Eppendorf 5810R, Швеция) и центрифугировали при 3130g в течение 40 мин для осаждения фрагментов тромбоцитов. Собирали супернатант из каждой пробирки.
6. Микроскопический контроль образцов ЛТ доноров осуществляли под световым микроскопом при увеличении ×200, оценивая на наличие/отсутствие видимых нелизированных тромбоцитов и/или их фрагментов. Содержание частиц клеточного дебриса в пробах ЛТ от 12 доноров не превосходило 2.
7. Пулирование, микрофильтрация и аликвотирование образцов ЛТ доноров
На заключительном этапе производили пулирование образцов ЛТ доноров, пользуясь математической выкладкой о количестве образцов ЛТ в пуле.
Для этого равные объемы 12 образцов ЛТ в стерильных условиях объединяли путем переноса с помощью механической лабораторной пипетки указанного типа в пластиковые пробирки объемом 15 мл (например, Corning, США).
Образец пулированного ЛТ в пробирке помещали в лабораторную центрифугу (например, Eppendorf 5810R, Швеция) и центрифугировали при 3130g в течение 40 мин для дополнительного осаждения остаточного дебриса. Пробирку извлекали из центрифуги и в стерильных условиях осуществляли ультрафильтрацию супернатанта, последовательно через фильтры 0,45 мкм и 0,2 мкм (например, Corning, США) в пробирку аналогичного типа. Далее образец пулированного ЛТ разливали в стерильные пробирки по аликвотам (от 100 до 500 мкл), маркировали и замораживали при -80°С.
7. Проверка функциональной активности образца пулированного ЛТ на модели культивирования перевивной клеточной линии остеосаркомы человека (MG-63) и ФЧ
Эксперименты in vitro по оценке динамики роста культур MG-63 с использованием пулированного образца ЛТ доноров (n=12) и образца ЭТС (РАА, Австрия, лот № А10106-0671) в качестве ростовых добавок к среде культивирования состава: среда DMEM (например, ПанЭко, Россия), глутамин (0,65 мг/мл, например, ПанЭко, Россия), буферный раствор HEPES (20 мМ, например, ПанЭко, Россия), гепарин (2 ЕД/мл), осуществляли в 96-луночных планшетах (например, Corning, США) с плотностью посева 5×103 кл./лунка и со сменой среды дважды в неделю. На сроках культивирования 1, 3, 6 суток определяли
жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста (МТТ, Sigma, США). Для проведения МТТ-теста по окончании срока культивирования из каждой лунки отбирали по 100 мкл среды и вносили по 25 мкл раствора МТТ в концентрации 5 мг/мл. Через 3 ч инкубации (5% СО2, 37°C) из каждой лунки полностью удаляли среду и производили растворение образовавшегося формазана с помощью изопропилового спирта (200 мкл/лунку). От осадка, образующегося в результате преципитации белков в изопропиловом спирте, освобождались центрифугированием планшет в течение 10 мин при 3000 об/мин (например, Jouan, Франция). Далее из каждой лунки переносили по 100 мкл супернатанта в 96-луночный планшет для спектрофотометрии (например, Costar, США) и оценивали оптическую плотность раствора формазана на спектрофотометре FC (например, Thermoscientific, США) при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали ПРС без клеток.
На основании результатов МТТ-теста рассчитывали величину прироста популяции клеток А (в процентах) в конкретный срок наблюдения по формуле:
где ОDнастыд - оптическая плотность раствора формазана в условных единицах в конкретный срок эксперимента, ODпредыд- оптическая плотность раствора формазана в предыдущий срок эксперимента. Результаты оценки функциональной активности клеток при культивировании приведены в табл. 6.
Показано, что при данном способе пулирования образцов ЛТ популяция ФЧ при культивировании в ПРС, обогащенной 10% ЛТ, эффективно нарастает и, начиная с 3-х суток наблюдения статистически достоверно превышает популяцию фибробластов в ПРС с 10% ЭТС. Так, показатель OD раствора формазана на 6-е сутки культивирования ФЧ в ПРС с 10% ЛТ (пул от 12 доноров) составил 1,090 усл. ед., величина прироста популяции ФЧ - 429% vs 0.564 усл. ед. и 248% при культивировании клеток в ПРС с 10% ЭТС соответственно (Табл. 6).
Скорость пролиферации клеток линии остеосаркомы человека MG-63 при условии ее культивирования в ПРС с 10% пулированного ЛТ доноров или в ПРС с 10% ЭТС при плотности посева 5 тыс. кл. на лунку практически не отличалась: величина OD раствора формазана составляла на 5 сутки 0,974 усл. ед., величина прироста 313% vs 1,109 усл. ед. и 386%, для ПРС с 10% пула ЛТ и ПРС с 10% ЭТС соответственно (Табл. 6).
Пример конкретного исполнения 2
Для культивирования ФЧ и ММСК, выделенных их жировой ткани (ЖТ) человека (пассаж 4), был приготовлен образец пулированного ЛТ из ТМ других 12 доноров.
1. Заготовка образцов тромбоцитарной массы доноров
В стерильных условиях методом аппаратного тромбоцитафереза было получено 12 индивидуальных образцов ТМ (6 мужчин, 6 женщин). Перед процедурой заготовки ТМ доноры проходили обследование на наличие ВИЧ I и II типа, HBs-антигена, вируса HCV, возбудителя сифилиса. Также был осуществлен клинический анализ крови.
Через 24 часа после процедуры тромбоцитафереза образцы ТМ доноров в специальных пластиковых мешках помещали в транспортировочный контейнер и переносили в лабораторию с прилагаемой сопроводительной информацией (ФИО донора, пол, возраст, дата заготовки ТМ, результаты лабораторных исследований), где в асептических условиях (ламинарный бокс 2-класса защиты) тщательно перемешивали и переносили в пластиковые пробирки (например, Corning, США) приметно по 13,5 мл. Объем полученной ТМ данных доноров варьировал от 249 до 330 мл (табл. 7).
2. Определение концентрации тромбоцитов в образцах ТМ
Производили определение концентрации тромбоцитов в образце ТМ каждого донора. Для этого тромбоциты ресуспендировали в указанных пробирках путем тщательного перемешивания с использованием механической пипетки на 5,0 мл (например, Eppendorf, Biohit). Далее отбирали пробу ТМ каждого донора объемом 50,0 мкл для определения в ней концентрации тромбоцитов и переносили в пластиковую пробирку (например, Eppendorf) объемом 0,5 мл или 1,0 мл. В пробирку с пробой добавляли 450 мкл цитратного буфера ACD-A для получения рабочего разведения пробы 1:10. Разведенную пробу вносили в лабораторный анализатор (например, Sysmex КХ21) и измеряли концентрацию тромбоцитов (табл. 7).
3. Нормирование ТМ по количеству тромбоцитов
ТМ в указанных закрытых пробирках помещали в лабораторную центрифугу (например, Eppendorf 5810R, Швеция) и центрифугировали при 3130g в течение 40 мин при 20°C для осаждения тромбоцитов.
Нормирование тромбоцитов производили в расчете на стандартную концентрацию: рассчитывали объем супернатанта для разведения в нем осадка тромбоцитов, необходимый для достижения концентрации 1,75×109 тромбоцитов/мл. При концентрации тромбоцитов меньше заданной (образцы ТМ от доноров-мужчин №№11 и 12 и №№10 и 12 от доноров-женщин) удаляли лишний объем супернатанта и ресуспендировали осадок тромбоцитов в нужном для достижения указанной концентрации объеме. При концентрации тромбоцитов больше заданной (образцы №№7, 8, 9, 10 от доноров - мужчин и №№7, 8, 9, 11 от доноров - женщин) ТМ разводили плазмой, аналогичной по составу бесклеточной фракции ТМ.
4. Температурный лизис образцов ТМ
Образцы ТМ доноров, нормированные по концентрации тромбоцитов, в указанных закрытых пробирках переносили в низкотемпературный холодильник (например, Sanyo) и выдерживали при температуре -80°C в течение 1 суток. По истечении указанного срока пробирки переносили в термостат (например, ТС-80М-2) и размораживали содержимое пробирок при +37°C в течение 20-30 мин. Циклы замораживания/оттаивания повторяли 3 раза.
5. Центрифугирование ЛТ
Для освобождения образцов лизированной ТМ от фрагментов тромбоцитов производили их центрифугирование.
Пробирки с образцами ЛТ переносили в лабораторную центрифугу (например, Eppendorf 5810R, Швеция) и центрифугировали при 3130g в течение 40 мин для осаждения фрагментов тромбоцитов. Собирали супернатант из каждой пробирки.
6. Микроскопический контроль образцов ЛТ доноров осуществляли под световым микроскопом при увеличении ×200, оценивая на наличие/отсутствие видимых нелизированных тромбоцитов и/или их фрагментов. Содержание частиц клеточного дебриса в пробах ЛТ от 12 доноров не превосходило 2.
7. Пулирование, микрофильтрация и аликвотирование образцов ЛТ доноров.
На заключительном этапе производили пулирование образцов ЛТ доноров, пользуясь математической выкладкой о количестве образцов ЛТ в пуле.
Для этого равные объемы 12 образцов ЛТ в стерильных условиях объединяли путем переноса с помощью механической лабораторной пипетки указанного типа в пластиковые пробирки объемом 15 мл (например, Corning, США).
Образец пулированного ЛТ в пробирке помещали в лабораторную центрифугу (например, Eppendorf 5810R, Швеция) и центрифугировали при 3130g в течение 40 мин для дополнительного осаждения остаточного дебриса. Пробирку извлекали из центрифуги и в стерильных условиях фильтровали супернатант, представляющий собой очищенный ЛТ, последовательно через фильтры 0,45 мкм и 0,2 мкм (Corning, США) в пробирку аналогичного типа. Далее образец пулированного ЛТ разливали в стерильные пробирки по аликвотам (от 100 до 500 мкл), маркировали и замораживали при -80°С.
8. Проверка функциональной активности образца пулированного ЛТ на модели ФЧ и ММСК из ЖТ человека.
Эксперименты in vitro по оценке динамики роста культур ФЧ и ММСК ЖТ человека проводили с использованием 10% пулированного образца ЛТ доноров (n=12) и 10% образца ЭТС (РАА, Австрия, лот № А10106-0671) в качестве ростовых добавок к среде культивирования ФЧ состава: среда DMEM (например, ПанЭко, Россия), глутамин (0,65 мг/мл, например, ПанЭко, Россия), буферный раствор HEPES (20 мМ, например, ПанЭко, Россия), гепарин (2 ЕД/мл); к среде культивирования ММСК: среда DMEM/F12 (например, ПанЭко, Россия), глутамин (0,65 мг/мл, например, ПанЭко, Россия), буферный раствор HEPES (20 мМ, например, ПанЭко, Россия), гепарин (2 ЕД/мл). Культивирование клеток осуществляли в 96-луночных планшетах (например, Corning, США) с плотностью посева 2,5×103 кл./лунка (ФЧ) и 5×103 кл./лунка (ММСК) со сменой среды дважды в неделю. На сроках культивирования 1, 3, 5, 7, 10 и 14 суток определяли жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста. Для проведения МТТ-теста по окончании срока культивирования из каждой лунки отбирали по 100 мкл среды и вносили по 25 мкл раствора МТТ в концентрации 5 мг/мл. Через 3 ч инкубации (5% СО2, 37°C) из каждой лунки полностью удаляли среду и производили растворение образовавшегося формазана с помощью изопропилового спирта (200 мкл/лунку). От осадка, образующегося в результате преципитации белков в изопропиловом спирте, освобождались центрифугированием планшет в течение 10 мин. при 3000 об/мин (например, Jouan, Франция). Далее из каждой лунки переносили по 100 мкл супернатанта в 96-луночный планшет для спектрофотометрии (например, Costar, США) и оценивали оптическую плотность раствора формазана на спектрофотометре FC (например, Thermoscientific, США) при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали ПРС без клеток.
На основании результатов МТТ-теста рассчитывали величину прироста популяции клеток А (в процентах) в конкретный срок наблюдения по формуле:
где ODнаст - оптическая плотность раствора формазана в условных единицах в конкретный срок эксперимента, ODпредыд - оптическая плотность раствора формазана в предьщущий срок эксперимента. Результаты оценки функциональной активности клеток при культивировании приведены в таблице 8 и на фиг. 2, 3.
Выявлена высокая скорость клеточной экспансии как ФЧ, так и ММСК человека при их культивировании на протяжении 14 суток в ПРС, обогащенной 10% пулированного образца ЛТ: величина OD раствора формазана для ФЧ на 14 сутки эксперимента составила 1,296 усл. ед., показатель прироста клеточной популяции за весь период наблюдения 1100% vs 0,920 усл. ед. и 636% при использовании ПРС с 10% ЭТС, соответственно (статистически достоверная разница, р<0,05). Для ММСК эти показатели составили 0,895 усл. ед. и 509% vs 0,895 усл. ед. и 375% (ПРС с 10% ЭТС), соответственно (Табл. 8, Фиг. 2, 3).
Заявленный способ позволил разработать технологию получения и пулирования ЛТ из тромбоцитарной массы (ТМ) доноров как стандартизированную по функциональной активности нексеногенную ростовую добавку для культивирования клеток человека разных типов (стволовых, прогениторных, дифференцированных, опухолевых).
Использование способа в биологических исследованиях и медицинской практике позволит:
- избежать контакта культивируемых in vitro биомедицинских клеточных продуктов, предназначенных для введения человеку с диагностическими, профилактическими или лечебными целями, с ксеногенными компонентами, и исключить инфицирования агентами разных типов, аллергических и других нежелательных реакций;
- культивировать клетки человека (стволовые, прогениторные, дифференцированные опухолевые, гибридомы, ооциты, в том числе в рамках ЭКО, и эндотелиальные прогениторы) для диагностических или лечебных или исследовательских целей в физиологическом микроокружении, что обеспечит сохранность их иммунофенотипа и функциональных характеристик;
- обеспечить повторяемость и возможность сопоставления результатов, полученных в разных сериях экспериментов при культивировании клеток in vitro, что было невозможно при использовании в качестве ростовых добавок разных лотов ЭТС и разных образцов ЛТ.
Claims (1)
- Способ получения ростовой добавки к среде для культивирования клеток человека из тромбоцитарной массы доноров, включающий нормирование образца тромбоцитарной массы до заданной концентрации тромбоцитов 1,75×109 кл/мл посредством центрифугирования тромбоцитарной массы при 3130g в течение 40 минут при 20°С и ресуспендирования осадка в супернатанте заданного объема до указанной концентрации тромбоцитов, 3-кратный температурный лизис нормированного образца путем замораживания на сутки до -80°С и размораживания при +37°С, осаждение клеточного дебриса посредством центрифугирования при 3130g в течение 40 минут при 20°С, сбор супернатанта с получением индивидуального образца лизата тромбоцитов с последующим его микроскопическим контролем при увеличении ×200 на наличие в поле зрения не более 3-х фрагментов тромбоцитов, отличающийся тем, что проводят стандартизацию путем пулирования равных по объему индивидуальных образцов лизата, полученных из тромбоцитарной массы не менее 12 доноров обеих тендерных групп, и полученный лизат тромбоцитов центрифугируют при 3130g в течение 40 минут при 20°С с последующей ультрафильтацией на фильтрах 0,45 мкм или 0,22 мкм, полученную ростовую добавку делят на аликвоты требуемого объема и замораживают до -80°С.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016115622A RU2648162C2 (ru) | 2016-04-21 | 2016-04-21 | Способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016115622A RU2648162C2 (ru) | 2016-04-21 | 2016-04-21 | Способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016115622A RU2016115622A (ru) | 2016-09-10 |
| RU2648162C2 true RU2648162C2 (ru) | 2018-03-22 |
Family
ID=56889360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016115622A RU2648162C2 (ru) | 2016-04-21 | 2016-04-21 | Способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2648162C2 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2664478C2 (ru) * | 2017-08-18 | 2018-08-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский радиологический центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИРЦ" Минздрава России) | Способ получения культуральной ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов человека |
| RU2732150C1 (ru) * | 2020-03-04 | 2020-09-11 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр клеточных технологий" | Способ получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины |
| RU2739515C1 (ru) * | 2020-04-29 | 2020-12-25 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы "Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы" (ГБУЗ "НИИ СП ИМ. Н.В. СКЛИФОСОВСКОГО ДЗМ") | Способ приготовления лизата тромбоцитов с высоким содержанием факторов роста |
| RU2790701C1 (ru) * | 2022-06-03 | 2023-02-28 | Общество с ограниченной ответственностью "МеЛСиТек" | Способ получения раствора факторов роста из тромбоцитов |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010033605A2 (en) * | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Compositions containing platelet contents |
-
2016
- 2016-04-21 RU RU2016115622A patent/RU2648162C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010033605A2 (en) * | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Compositions containing platelet contents |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ЖУРЛОВ О.С. Фракционирование антимикробных пептидов тромбоцитарного лизата (hPL). МЕЖДУНАРОДНЫЙ ЖУРНАЛ ПРИКЛАДНЫХ И ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, 22.03.2016, 3 (ч. 2), с. 247-250, материалы и методы. * |
| Н.С. СЕРГЕЕВА и др. Биологические эффекты тромбоцитарного лизата при добавлении в среду культивирования клеток человека. Гены энд Клетки, 2014, том IX, 31, с. 77-85, материалы и методы. * |
| Н.С. СЕРГЕЕВА и др. Биологические эффекты тромбоцитарного лизата при добавлении в среду культивирования клеток человека. Гены энд Клетки, 2014, том IX, 31, с. 77-85, материалы и методы. ЖУРЛОВ О.С. Фракционирование антимикробных пептидов тромбоцитарного лизата (hPL). МЕЖДУНАРОДНЫЙ ЖУРНАЛ ПРИКЛАДНЫХ И ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, 22.03.2016, 3 (ч. 2), с. 247-250, материалы и методы. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2664478C2 (ru) * | 2017-08-18 | 2018-08-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский радиологический центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИРЦ" Минздрава России) | Способ получения культуральной ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов человека |
| RU2732150C1 (ru) * | 2020-03-04 | 2020-09-11 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр клеточных технологий" | Способ получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины |
| RU2739515C1 (ru) * | 2020-04-29 | 2020-12-25 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы "Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы" (ГБУЗ "НИИ СП ИМ. Н.В. СКЛИФОСОВСКОГО ДЗМ") | Способ приготовления лизата тромбоцитов с высоким содержанием факторов роста |
| RU2790701C1 (ru) * | 2022-06-03 | 2023-02-28 | Общество с ограниченной ответственностью "МеЛСиТек" | Способ получения раствора факторов роста из тромбоцитов |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016115622A (ru) | 2016-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10925901B2 (en) | Compositions containing platelet contents | |
| LU500561B1 (en) | In vitro construction method and use of liver organoids | |
| Davies et al. | Isolation and culture of human macrophages | |
| KR101310578B1 (ko) | 심혈관 증상의 치료에 지방조직-유래 세포를 사용하는 방법 | |
| US20120276632A1 (en) | Plasma-free platelet lysate for use as a supplement in cell cultures and for the preparation of cell therapeutics | |
| WO2021223274A1 (zh) | 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立 | |
| US20150299651A1 (en) | Cell culture supplements | |
| RU2648162C2 (ru) | Способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток | |
| Tancharoen et al. | Human platelet lysate as an alternative to fetal bovine serum for culture and endothelial differentiation of human amniotic fluid mesenchymal stem cells | |
| JP7144872B2 (ja) | ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地 | |
| US20170224736A1 (en) | Method and apparatus for recovery of umbilical cord tissue derived regenerative cells and uses thereof | |
| Wong et al. | Development of a clinical-scale method for generation of dendritic cells from PBMC for use in cancer immunotherapy | |
| CN110090227A (zh) | 人羊膜上皮细胞在治疗移植物抗宿主病中的用途 | |
| RUBINSTEIN | Placental blood-derived hematopoietic stem cells for unrelated bone marrow reconstitution | |
| CN112342191A (zh) | hMSC生产试剂盒开发和质量管理标准优化和体系建立 | |
| Dhot et al. | Cord blood stem cell banking and transplantation | |
| Yu et al. | Clinical immunology Impact on red blood cell immunity patterns in postoperative phase following total hip arthroplasty | |
| WO2014193895A1 (en) | Ex vivo perfusion of donor organs prior to transplantation using mesenchymal stem cells | |
| Christy et al. | Refrigerated human mesenchymal stromal cells as an alternative to cryostorage for use in clinical investigation | |
| Fujiwara et al. | Effect of platelet lysate on Schwann-like cell differentiation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells | |
| WO2012034352A1 (zh) | 使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的方法、试剂盒及其应用 | |
| RU2664478C2 (ru) | Способ получения культуральной ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов человека | |
| CN112156111B (zh) | 脐血血小板线粒体在制备治疗自身免疫疾病药物中的应用 | |
| CN113512529B (zh) | 特异性抗病毒过继免疫细胞ab的制备方法 | |
| WO2023193699A1 (zh) | 血清替代物及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HE9A | Changing address for correspondence with an applicant |