CN112342191A - hMSC生产试剂盒开发和质量管理标准优化和体系建立 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞治疗技术领域，具体涉及一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓等中分离间充质干细胞（MSC）,人间充质干细胞（hMSC）工业化生产体系和质量管理标准优化和体系建立；MSC扩增培养试剂盒和鉴定试剂盒及应用。根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》（试行）、《细胞制品研究与评价技术指导原则》(征求意见稿)以及2015版《中国药典》通则9203——药品微生物实验室质量管理指导原则所规定的内容，建立原辅料控制、脐带接收控制及间充质干细胞胞制剂控制的质量标准。本发明优化并建立了工艺和质量标准，提高了产量，为临床应用，实现工业化生产创造了条件。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞治疗技术领域，具体涉及一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓等中分离间充质干细胞（MSC）,人间充质干细胞（hMSC）工业化生产体系和质量管理标准优化和体系建立； MSC扩增培养试剂盒和鉴定试剂盒及应用。
背景技术
人间充质干细胞(human MSCs, hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等组织。除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生。
hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症，并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示，不同组织来源的hMSCs均具有不同程度，针对不同临床适应症的治疗效果。目前在clinicaltrial.gov登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种，其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮等。
然而，无论是临床前或临床研究阶段，现有的研究结果仍都存在不同程度的问题，而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。其中临床前研究所表现的问题是，不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异，也存在质量评价内容和评价技术的合理性等问题，很难形成相对统一的质量标准；临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺，细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立等。
类似于所有治疗性细胞产品，hMSCs代表着人类医药发展史上最为复杂的医药产品，具有传统医药产品难以比拟的多样性、变异性、复杂性和不稳定性等质量特性。为了有效保障包括hMSCs在内的所有治疗性细胞的质量，为其标准化使用建立标准和规范化管理体系，hMSCs具备基本细胞生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性及生物学有效性“四大类”质量属性。这“四大类”质量属性，是质量标准、质量体系建立的对象，是临床前研发阶段首要解决的关键问题，也是整个细胞产品研发周期全质量要素的基础。
在临床应用中，MSC细胞培养过程中采用的试剂较多，标准不一致，培养过程中工作量大，培养时间长，工艺繁琐，不稳定，染菌风险大，细胞质量标准难以控制，难在短时间内培养出质量均一的MSC细胞，迫切需要开发简单、格式化的试剂盒，本发明提供一种MSC细胞培养添加剂MSC-Ⅱ，对添加剂的配方进行了优化，使MSC增殖能力提高10-20%，同时优选了血清，使生产成本降低50%，本发明改进了工艺，这对获得大量间充质干细胞，满足临床试验，实现工业化生产具有重要的意义；同时本发明优化了脐带原代组织处理工艺，组织块贴壁率达到95%以上，原代细胞得率提高10倍；优化了传代培养工艺，用预传代细胞的培养上清液终止消化，防止细胞出现损伤性拉丝，使显微镜下视野中细胞拉丝率降低至1%以下，传代细胞扩增倍数由5倍提高至10倍，提高了细胞产量，由于细胞上清液是废液，用来终止消化，降低了原材料消耗和生产成本。
发明内容
根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》（试行）、《细胞制品研究与评价技术指导原则》(征求意见稿)以及2015版《中国药典》通则9203——药品微生物实验室质量管理指导原则所规定的内容，建立原辅料控制、脐带接收控制及间充质干细胞胞制剂控制的质量标准。
本发明是通过以下步骤得到的：
1. 产妇脐带捐献准入标准：
无家族性遗传病及病原微生物感染，知晓并签署知情同意书；
运输过程：脐带采集管完全密封，运输温度为4℃-25℃；运输时间不应超过24h
传染病检测：
母血或脐血TP /HIV/HBV/HCV/HCMV/EBV/HPV/HHV阴性；储运液取样细菌培养无菌、支原体检测阴性；母血无凝块、溶血及重度乳糜，储存容器无破损；无母血脐带中可留少量脐血；
脐带标准：重量≥15g，形态饱满呈乳白色
2. 种子细胞库控制
培养液澄清，细胞长梭形涡旋状排列，细胞融合度达80%，P2代种子细胞入种子细胞库前取500ul做内毒素检测，106-107细胞做流式检测，上清和细胞悬液留样，留样样本按照编码规格进行编号；
3. 工作细胞库控制
种子细胞复苏，传代培养，待培养至P5代细胞长到80-90%融合时，收获细胞，即为工作细胞库，细胞长梭形涡旋状排列，细胞融合度达80%，细胞数量≥1×109，细胞活率≥90%，P5代工作细胞收获时各取1ml做内毒素检测、真菌和细胞内外病毒因子检测，第二次离心后取20ml上清做菌检、 BSA残留量检测、抗生素残留量检测、EGF、bFGF残留量和支原体检测，P5代细胞入工作细胞库待检区，上清和细胞悬液留样各四份，留样样本按照编码规格编号；
4. 冻存装置
完全密封，细胞编号、类型、冻存日期标记完整清晰，保存位置明确；冻存过程：程序降温；
5. 复苏过程：37℃快速复苏；
6. MSC细胞制剂出库控制标准：
细胞数量达标，细胞活率≥90%，内毒素检测阴性；取适量细胞用适量生理盐水悬浮，添加人血白蛋白浓度至3%，经细胞筛过滤。采用生理盐水袋或专用容器灌装，终体积可根据要求适当选择（5～80）ml，细胞制剂进行细胞数量、活率、内毒素检测。细胞制剂留样4份，留样样本按照编码规则编号。
质保部人员负责做好对细胞制剂出库的审核与质量监督，细胞制剂接收人即为细胞制剂运输人，负责再次确认、接收出库细胞制剂，并放置进保温血箱，保证细胞制剂安全存放（4～25℃），避光保存和运输，直至运达目的地，自生产之时起，有效期为12小时。
本发明提供一种MSC制备试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用MSC细胞扩增培
养液MSC-
、细胞培养添加剂MSC-
。本发明提供一种临床用MSC细胞扩增基础培养液MSC- 
，PH7.2～7.4，平衡盐Earle’s 盐 、核苷、L-谷氨酰胺2mM、NaHCO3 2200mg/L、D-葡萄糖
1000mg/L、丙酮酸钠 1mM、酚红指示10mg/L、无机盐、氨基酸、维生素、核糖核苷、脱氧核糖核
苷等，使用时添加2mM GlutaMAX™-I和10%Prime FBS，本发明不排除可以采用上述培养基
之外的培养基实施培养。
本发明提供一种MSC细胞培养添加剂MSC-
，其中含有2-50ng/mL bFGF和2-50ng/
ml EGF；
优选的[0012]中，3-20ng/mL bFGF、3-20ng/ml EGF；
MSC按照细胞密度8-10×103/cm2用完全培养液重悬；
所述完全培养液的配制：MSC- 
中添加1/1000 MSC-
和2mM GlutaMAX™-I、10%Prime
FBS。
本发明提及的培养基和诱导因子可以从市场上购买，并且长期冷冻保存细胞和小分子蛋白的技术已经非常成熟，本领域技术人员完全可以利用上述技术保存组成本发明试剂盒的培养基和组合物。
本发明另一方面还提供一种MSC培养后鉴定试剂盒，所述临床用MSC细胞流式表型和活性鉴定试剂盒包括五组双色抗体组合物，分别是IgG-Percp-cy5/CD105-PE/CD73/CD90、CD44-PE和Annexin-FINKTC/PI，洗涤液50ml一管，固定液50ml一管；每5-10ul可检测一次，共计50套，所述洗涤液是磷酸盐缓冲液；所述固定液是1%多聚甲醛。
所述试剂盒制备中的质量控制鉴定方法，按照GMP要求，将相关物料密封装入试剂盒，按照《中国药典》进行无菌和内毒素检测；
所述制备的细胞制剂的质量控制鉴定方法，根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》（试行）、《细胞制品研究与评价技术指导原则》(征求意见稿)以及2015版《中国药典》通则9203——药品微生物实验室质量管理指导原则所规定的内容，建立间充质干细胞制剂的质量标准，保证临床应用时的安全性。
上述方法中，在获得本发明MSC之前，用生理盐水洗涤并重悬所述MSC细胞2-3次，直至满足《中国药典》要求的无菌、内毒素和残留量的检测指标，保证本发明的MSC细胞在回输给患者时残留的本发明所述的培养基组分和诱导因子组合物不会引起患者不适反应。所述MSC细胞组合物包括1x105-3x107/ml本发明的MSC，优选为1x106-2x107/ml。所述组合物还包括人血白蛋白，其中，以所述组合物为基础，所述人血白蛋白的质量体积含量为1-5%，优选为3%；
本发明提供了一种MSC在临床试验中的应用方法，其中包括让患者知晓本发明MSC的治疗作用并签署知情同意书后，自由选择本发明MSC细胞在临床试验及治疗中的联合应用；
优选所述MSC组合物使用的方式为滴注或局部注射。具体地，使用所述MSC细胞组合物的方式为采用6号针头或7号针头、输液器，静脉注射或局部注射；
所述MSC细胞组合物优选包含3x106-2x107/ml的本发明MSC细胞，其有效量为20ml-100ml/个体的生理盐水组合物；
以上所述MSC细胞组合物都是一次注射的剂量，一个疗程四-六次，从第一次开始期间连续或每间隔一个月再回输下一次。一个疗程结束后，适疗效情况可以间隔两到三个月后继续给药。如有必要，间隔时间为一年或两年后还可继续再治疗。
统计学分析
实验数据以均数士标准差来表示。应用SPSS16.0统计软件进行统计分析。各指标先进行正态性及方差齐性检验。采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法， P<0.05时，被认为差异具有统计学意义。
本发明所述疾病包括但不限于脊髓损伤、心脏损伤、骨、软骨、关节损伤、肝脏损伤；系统性红斑狼疮、银屑病；脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、系统性硬化症、克隆氏病、中风、糖尿病、糖尿病足等组织损伤修复，自身免疫性疾病和神经系统疾病。
本发明的有益效果：
1）本发明建立了一种临床用hMSC细胞工业化生产体系和质量标准管理体系，为其标准化使用建立标准和规范化管理体系；
2）本发明对hMSC细胞的扩增培养及产品质量控制进行了优化和完善，通过一套MSC细胞扩增培养及产品质量控制鉴定的试剂盒形式，规范hMSC细胞临床应用，为MSC细胞高效快速制备和临床应用质量标准统一提供标准模式；
3) 本发明提供一种MSC细胞培养添加剂MSC-
，对添加剂的配方进行了优化，使MSC增
殖能力提高10-20%，同时优选了血清，使生产成本降低50%，本发明改进了工艺，这对获得大
量间充质干细胞，满足临床试验，实现工业化生产具有重要的意义；
4)同时本发明优化了脐带原代组织处理工艺，组织块贴壁率达到95%以上，原代细胞得率提高10倍；
5)传代培养时，用预传代细胞的培养上清液终止消化，防止细胞出现损伤性拉丝，使显微镜下视野中细胞拉丝率降低至1%以下，传代细胞扩增倍数由5倍提高至10倍，提高了细胞产量；由于细胞上清液是废液，用来终止消化，降低了原材料消耗和生产成本。
本发明获得的干细胞保持成体干细胞的特征：细胞贴壁生长，形态呈长梭形，生长呈现漩涡状；表面抗原表达呈现CD44、CD105、CD90和CD73阳性表达，阳性率大于95%，CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR阴性表达，阴性率小于2%。培养后的细胞形状稳定，没有染色体变异产生。
附图说明 图1 人脐带间充质干细胞形态特征；
图2人脐带间充质干细胞表型特征；
图3人脐带间充质干细胞遗传学鉴定；
图4 生物学效力试验；
图5 六组培养条件下hMSC生长曲线；
图6 六组培养条件下hMSC表型分析；
图7 hMSC细胞周期分析；
图8 MSC-
-80℃冻存2个月、6个月、12个月稳定性分析；
图9细胞不同批次间稳定性分析；
图10 P2-P7不同代次间传代稳定性分析；
图11 P2-P10不同代次间传代稳定性分析；
图12细胞制剂配方的摸索。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1人脐带MSC工业化生产工艺质量研究
1.细胞鉴别
（1）细胞形态：
一般认为，标准培养条件下人脐带间充质干细胞形态表现为呈纤维细胞样或梭型，贴壁生长，高倍镜下细胞应有较强立体感，胞内颗粒较少，见图1。
（2）细胞遗传学鉴定：
人脐带间充质干细胞来源应当具有单一性，以保证细胞功能的稳定和可控，在进行来源确定时，采用STR图谱进行遗传学分析，以确定细胞来源是单一的细胞供体来源，见图2；
STR图谱分析表明，分离的细胞在21个常染色体等位基因位点上扩增后，其检测结果均为单一峰或双峰形态，未出现三峰态，故检测细胞的基因型不存在三等位基因的情形，说明分离出的细胞均为单一来源，不存在供体来源的交叉污染。
（3）细胞存活率及生长活性
1）细胞数量及存活率
细胞对相关疾病治疗的有效性，其基础在于活细胞的生物效应，在质量研究中，考察了人脐带间充质干细胞制剂中活细胞数量的情况，确定了活细胞的比例应不少于90%；
2）细胞周期：处于G0/G1期的细胞比例不低于70%，见图7；
根据细胞分裂和增殖的特征，当细胞处于细胞周期的G0/G1期时，细胞具有分化效力，可用于实现治疗作用，研究发现，间充质干细胞的细胞周期分布为G0/G1期为80.33±3.65(%)，S期为3.69±1.39 (%)，G2/M期为10.67±1.04 (%)，G0/G1期的细胞不低于70%，可确定所使用代次的人间充质干细胞的存在良好的干性；
表1：人脐带间充质干细胞周期分布
| 细胞批号 | G0/G1期比例(%) | S期比例(%) | G2/M期比例(%) |
| SS170314A01P5 | 76.4 | 2.03 | 10.4 |
| SS170305A01P5 | 80.3 | 4.04 | 11.9 |
| SS170306A01P5 | 84.3 | 4.97 | 9.7 |
（3）纯度或均一性检测
脐带间充质干细胞是存在于脐带华通胶和血管周围组织中的一种干细胞，根据文献报道，其细胞表面高表达CD90、CD105、CD73和CD44，极地表达CD45、CD34、CD11b-、CD19和HLA-DR。
本研究考察了各标志物的阳性率，研究结果表明，人脐带间充质干细胞高表达CD90、CD105、CD73和CD44，阳性率不低于95%；低表达HLA-DR，证明细胞低免疫原性；细胞中不含有CD34阳性细胞，证明细胞中不混有造血干细胞；
表2 不同批次hMSC表型检测
（4）无菌试验
脐带采集后储运液入厂检验，剥离华通胶后清洗液做无菌检验，种子细胞库P2和工作细胞库P5分别进行了无菌检测，按2015版《中国药典》三四部附录与梅里诶全自动培养仪进行测定，结果为阴性。
1）储运液
储运液采用BD全自动微生物培养系统检测，应为阴性。
表3：梅里诶全自动微生物培养法无菌检测结果
2）清洗液
清洗液采用BD全自动微生物培养系统检测，应为阴性。
表4：梅里诶全自动微生物培养法无菌检测结果
3）P2代细胞
P2代细胞采用BD全自动微生物培养系统检测，应为阴性。
表5：梅里诶全自动微生物培养法无菌检测结果
4）P5代细胞
P5代细胞采用BD全自动微生物培养系统检测，应为阴性。
表6：梅里诶全自动微生物培养法无菌检测结果
（5）支原体检测
工作细胞库P5分别进行了支原体检测，参照2015版《中国药典》三四部附录，采用全自动培养仪进行测定和支原体检测 qPCR 方法，结果为阴性。
表7：核酸法支原体检测结果
（6）细胞内外源致病因子的检测
脐带采集后入厂，脐血做外源性致病因子检测，主要在组织来源上考察传染病因子（HBV、HCV、TP、HIV、CMV、EBV和HPV27型），细胞制剂检测细胞悬液的细胞内外病毒因子。本研究旨在考察所制定的检验方法能够识别制备各阶段中可能出现的致病因子，并能有效控制来源质量和产品质量，不符合标准要求的脐带组织均不会进入生产过程。
1）脐血病毒因子检测
脐血病毒因子HBV、HCV、CMV、EBV和HPV27型检测采用核酸检测法，HIV采用酶联免疫吸附法，TP采用TP-PA法检测，结果合格。
表8脐血病毒因子检测
2）细胞制剂病毒因子检测
细胞制剂病毒因子HBV、HCV、CMV、EBV和HPV27型检测采用核酸检测法，HIV采用酶联免疫吸附法，TP采用TP-PA法检测，结果合格。
表9细胞制剂病毒因子检测
（7）内毒素检测
取待测样本，按2015年版《中国药典》三四部附录进行测，采用重组C因子法检测，内毒素的含量均不高于0.25EU/ml，符合要求。
表10：内毒素检测结果
（8）生物学效力试验
对三批脐带来源的hMSC多向分化功能进行评价，包括成骨细胞、成脂细胞分化功能的检测，见图4。
（9）添加的细胞因子残留物的检测
在人脐带间充质干细胞培养过程中，所使用的主要外源性细胞因子有EGF和bFGF，按照《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》（试行），对EGF和bFGF在制剂中的残留情况进行考察，研究结果表明，细胞末次洗脱液中的EGF＜0.5ng和bFGF＜0.03ng，细胞制剂内外源因子的残留量在合格范围内。
1）检测结果
表11：EGF和bFGF残留物检测结果
*注：ND表示低于检测下限
（10）牛血清白蛋白残留物的检测
在人脐带间充质干细胞培养过程中，使用了胎牛血清，按照《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》（试行），对BSA在制剂中的残留情况进行考察，研究结果表明，细胞末次洗脱液中的BSA浓度均在正常范围内（<30ng/mL）
1）检测结果
表12：BSA残留物检测结果
| 批号 | SS170314A01 | SS170305A01 | SS170306A01 |
| BSA含量(ng/ml) | 1.62 | 1.39 | 3.63 |
（11）抗生素残留物的检测
在人脐带储运过程中，储运液中添加了15IU/ml庆大霉素，按照《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》（试行），对庆大霉素在制剂中的残留情况进行考察，研究结果表明，细胞末次洗脱液中的庆大霉素已无残留，细胞制剂内无外源庆大霉素的存在。
1）检测结果
表13：庆大霉素残留物检测结果
上述结果提示，各组样本中庆大霉素浓度均在正常范围内（<2ng/mL），符合质检要求。
实施例2 hMSC的培养试剂盒制备及使用
本发明提供一种MSC诱导培养试剂盒，包括容器和装入容器中的临床MSC细胞无血清扩
增养液MSC- 
和细胞培养添加剂MSC-
：
1）本发明提供一种临床用MSC细胞扩增完全培养液MSC- 
，PH7.2～7.4，平衡盐Earle’
s 盐 、核苷、L-谷氨酰胺2mM、NaHCO3 2200mg/L、D-葡萄糖 1000mg/L、丙酮酸钠 1mM、酚红
指示10mg/L、无机盐、氨基酸、维生素、核糖核苷、脱氧核糖核苷等，使用时添加2mM
GlutaMAX™-I和10% Prime 血清，本发明不排除可以采用上述培养基之外的培养基实施培
养；
2)本发明提供一种MSC细胞培养添加剂MSC-
，其中含有2-50ng/mL bFGF、2-50ng/ml
EGF；
所述完全培养液的配制：MSC- 
中添加1/1000 MSC-
、2mM GlutaMAX™-I和10%Prime
FBS；
所述脐带间充质干细胞的分离和培养方法：用尖头直剪将脐带剪成约2cm长度的小段，至少清洗3次。取最后一次清洗液20ml做菌检。转移脐带组织至一新的培养皿中，将脐带一端沿静脉腔内剪个切口，用组织镊沿切口方向静脉血管边缘纵向撕开，用组织镊去除羊膜，小心地将1根静脉血管和2根动脉血管剖离，翻转脐带，撕去上皮，得到的华通氏胶用手术刀切成边长 3-5mm 之间的小块，培养皿中添加10ml完全培养基，将 3-5mm 之间的组织小块均匀的种植在150培养皿中，组织块之间的间距为 1cm左右，放入培养箱中，48H后补液至30ml，至第七天静止不动。第七天全量换液，经过11-15天的原代培养，收获原代MSC细胞，P0细胞数量达到约1x107，P0传P1代，细胞扩增倍数不应低于7倍，低于7倍说明原代细胞有老化现象，传至P2代时收获种子细胞，内毒素和流式表型检测合格后入种子细胞库；P5代工作细胞入待检区，待细胞数量、活性、表型、内毒素、真细菌、支原体、STR分型检测、核型分析、细胞内、外病毒因子检测和诱导分化能力检测，检测合格后入工作细胞库。
台盼蓝染色法获取MSC体外培养后生长曲线。
上述细胞培养过程中及以下实施例中MSC组合物制备都应该在GMP要求的百级洁净室或者操作台进行，严格保证细胞及其制剂的质量安全。
上述实施例包括培养袋培养，本发明的实施例中设计到的添加剂或者因子加入量只明示了其中某个比例，凡是试剂盒涉及的MSC细胞培养鉴定，以及添加相关添加剂或者因子比例能满足在上述权利要求的浓度范围的都应属于本发明要求保护之列。
实施例3 hMSC细胞培养添加剂MSC-
配方进一步优化
实验共分6组：
A组：α-MEM +3ng/mL bFGF+3ng/ml EGF+10%FBS+Gln；
B组：α-MEM +6ng/mL bFGF+6ng/ml EGF+10%FBS+Gln ；
C组：α-MEM +6ng/mL bFGF+6ng/ml EGF+6ng/ ml VEGF+6ng/ml PDGFP+10%FBS+Gln ；
D组：α-MEM +3ng/mL bFGF+3ng/ml EGF+3ng/ ml VEGF+3ng/ml PDGF+10%FBS+Gln；
E组：α-MEM +3ng/mL bFGF+3ng/ml EGF+6ng/ ml VEGF+6ng/ml PDGF+10%FBS+Gln；
Prime血清组：α-MEM +6ng/mL bFGF+6ng/ml EGF+56ml Prime+5ml Gln
六组培养条件下，脐带MSC连续培养至P3代，绘制生长曲线见图5:
统计学分析六组数据，组间差异无显著性，P=0.62，P>0.05；
六组培养条件下培养的脐带MSC流式检测结果见图6：
六组培养条件下培养的脐带MSC做流式结果无差异显著性，综合考虑，优选工艺条件为Prime组。
实施例4 工艺稳定性分析
1. hMSC细胞培养添加剂MSC-
有效期稳定性分析
MSC-
-80℃冻存2个月、6个月、12个月后配置三组培养基，分别为2月组、6月组、12月
组，绘制生长曲线见图8。添加剂MSC-
-80℃冻存2个月、6个月、12个月组间差异无显著性，
P=0.33， P>0.05；
2. 细胞不同批次间稳定性分析，见图9， 批间差异无显著性，P=0.33， P>0.05；
3. 不同代次间传代稳定性分析，见图10和图11，P2、P5和P7之间传代差异无显著性 P=0.2 ，P>0.05；P10和P2、P5、P7之间传代差异有显著性P=0.002，P＜0.05。
4. 按照工艺条件摸索的结果，在符合GMP要求的现有生产条件下，进行了8个批次细胞制剂的生产，对细胞制剂相关数据进行考察。
1）细胞扩增倍数验证
按照人脐带间充质干细胞制备工艺制备的细胞制剂，细胞扩增倍数范围为49.60±2.62，各批次扩增倍数表现稳定，符合制备工艺的要求，见表14。
表14：细胞扩增倍数结果
| 制剂批号 | 初始细胞数量（×10<sup>7</sup>） | 获得种子细胞数量（×10<sup>7</sup>） | 细胞活率（%） | 细胞扩增倍数 |
| SS170301A01 | 0.97 | 45.6 | 97.5 | 47.01 |
| SS170302A01 | 1.02 | 47.9 | 98.12 | 46.9 |
| SS170303A01 | 0.93 | 45.6 | 99.0 | 49.0 |
| SS170304A01 | 1.09 | 56.3 | 95.8 | 51.6 |
| SS170305A01 | 1.2 | 69.7 | 98.8 | 58 |
| SS170306A01 | 1.22 | 61.6 | 98.6 | 50.5 |
| SS170307A01 | 1.16 | 51.9 | 97.9 | 44.7 |
| SS170308A01 | 1.05 | 51.6 | 98.1 | 49.1 |
| 统计分析 | \ | \ | \ | 49.60±2.62 |
2）细胞纯度验证
按照现有细胞制备工艺，我们对8个批次的细胞进行了细胞表面标志的检测，代表间充质干细胞标志CD90比例达99.89±0.06（%），CD105比例达98.13±0.80（%），CD73比例达99.93±0.05（%），CD44比例达99.95±0.05，代表造血性的标志CD34为0.24±0.12 (%)，CD45为0.24±0.12，HLA-DR为0.24±0.12 (%)，由此可见，现有工艺可以制备出高效、均一且稳定的脐带间充质干细胞，见表15。
表15：细胞制剂放行质控数据收集
3）细胞安全性验证
根据人脐带间充质干细胞的制备工艺要求，我们在工作细胞收获后2小时内取样品对细胞悬液进行无菌、支原体、内毒素检测、病毒和表型检测，制剂制备当天取细胞悬液检测内毒素，并对制剂做计数。以上8批次细胞制剂的检测均符合要求，安全有效。此外，均对细胞制剂留样保存，以备需要时进行复检，见表16。
表16：细胞制剂质控结果
| 制剂批号 | 无菌 | 支原体 | 内毒素 | 病毒 |
| SS170301A01 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 合格 |
| SS170302A01 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 合格 |
| SS170303A01 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 合格 |
| SS170304A01 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 合格 |
| SS170305A01 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 合格 |
| SS170306A01 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 合格 |
| SS170307A01 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 合格 |
| SS170308A01 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 合格 |
实施例5 制剂稳定性分析
为考察人脐带间充质干细胞制剂在运输条件和不同存储温度条件下的稳定性，通过模拟运输条件和不同温度的存储条件，检测细胞制剂在外观、细胞数量、活性、流式表型方面的变化情况，从而判断运输条件和不同温度存储条件对细胞制剂稳定性的影响。
（1）运输稳定性试验
1）实验方法
取两个批次P5代人脐带间充质干细胞，按制剂制备方法制备细胞制剂，细胞密度除常规密度为5×106/ml，增加了高密度组2×107/ml。把包装好的细胞制剂按《细胞制剂运输管理规程》放置于运输保存箱，以80转/min转速振荡，模拟运输环境，分别取不同时间的细胞进行外观观察、细胞数量和活率、流式表型以及细胞功能检测。
2）实验结果
表17：不同密度细胞制剂运输稳定性试验数据统计
3）实验结果显示：
a.密度为5×106细胞/ml，2×107细胞/ml的两组注射液，活性及纯度质检项目的检测结果随放置时间的增长而出现微小下降，差异无显著性；
b.密度为5×106细胞/ml，2×107细胞/ml的两组注射液，表示生物学效力的质检项目EGF和bFGF分泌水平检测结果在各时间点均符合质量标准；
c.两批次细胞的稳定性研究的结果一致。
（2）不同温度条件稳定性试验
1）实验方法
取三批P5代人脐带间充质干细胞，按制剂制备方法制备细胞制剂，密度为×106/ml。将制备好的制剂装于密封离心管中，分别放置于2-8℃、室温、4℃和室温交叉和37℃四个温度条件下保存，分别取不同时间的细胞进行外观观察、细胞活率计数、流式表型检测。
2）实验结果
a. 2-8℃试验
①细胞数量及存活率
表18：存储温度下限试验数据收集
②细胞表型
表19：存储温度下限试验细胞表型结果
b.室温试验
①细胞数量及存活率
表20：室温存储试验细胞数量及存活率结果
②细胞表型
表21：室温存储试验细胞表型结果
c. 4℃和室温交叉试验
①细胞数量及存活率
表22：4℃和室温交叉存储试验细胞数量及存活率结果
②细胞表型
表23：4℃和室温交叉存储试验细胞表型结果
c. 37℃试验
①细胞数量及存活率
表24：37℃存储试验细胞数量及存活率结果
3）结果分析
a.对在2-8℃、室温、2-8℃和室温交叉、37℃四个存储温度下存储的细胞制剂进行外观观察，细胞制剂均有沉淀现象，经过颠倒或轻微抖动后可混匀，没有出现大量细胞成团集聚的现象，细胞状态良好；
b.细胞数量和活率，在室温和2-8℃的不同存储温度条件下，各实验组细胞在12h内的细胞活率均在90%以上，细胞活率稳定；
c.人脐带间充质干细胞流式表型，在2-8℃、室温、2-8℃和室温交叉不同存储温度条件下， 12小时内无明显变化，CD90、CD105、CD73、CD44和LIN的表型无显著差异，变化均不大于1%，细胞的表型维持稳定。
（3）结论
运输条件和不同温度存储条件稳定性试验的结果表明，人脐带间充质干细胞的质量在运输条件下可在12h内保持稳定，符合质量标准；在2-27℃存储条件下，可于12h内保证质量稳定。由以上实验结果，公司规定，人脐带间充质干细胞注射液的存储温度为2-27℃，保质期为12h。
实施例6制剂配方的摸索
以0.9%注射用生理盐水为基本溶液，添加不同浓度的人血白蛋白成，将人脐带间充质干细胞按照一定浓度保存其中，经12小时后检测细胞存活率及数量，确定含3%人血白蛋白的生理盐水能够保证脐带间充质干细胞的稳定，见图12。
MSC组合物制备及临床应用：
（1）上述实施例中获得的MSC细胞用0.9%医用生理盐水重悬，计数，在细胞重悬液中添加人血白蛋白3%，调整总体积20-100ml；
（2）事先准备临床用100ml装有0.9%生理盐水袋或瓶，将上述细胞组合物装入其中，贴上说明标签；
（3）待细胞组合物相应检测合格后，送临床转化部实施hMSC细胞治疗；
（4）临床应用方法说明如下：
1）MSC组合物给药的途径优选：在手臂或者下肢采用7号针头输液器进行静脉滴注；
2）所述MSC细胞组合物临床有效剂量包括：组合物含3x106-2x107/ml细胞，途径80ml-100ml/个体，一个疗程连续回输3-4次；
3）从第一次开始期间连续或每间隔一天再回输下一次。一个疗程结束后，适疗效情况可以间隔两到三个月后继续给药。如有必要，间隔时间为一年或两年后还可继续再治疗。
实施例7 hMSC鉴定试剂盒制备及应用
种子细胞库P2和工作细胞库P5进行流式检测，用本发明的hMSC鉴定试剂盒检测：
（1）单细胞悬液：细胞密度调整至5x105-5x106/ml；
（2）吸取样本100ul，加入IgG-Percp-cy5/（同型对照）、CD105-PE/CD73/CD90、CD44-PE和Annexin-FINKTC/PI荧光标记抗体各5ul，室温避光孵育15min；
（3）加入清洗液2ml，1600rpm离心5min；
（4）去上清，500ul PBS缓冲液重悬后上机检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓等中分离间充质干细胞（MSC）；人间充质干细胞（hMSC）工业化生产体系和质量管理体系优化和标准建立，MSC扩增培养试剂盒和鉴定试剂盒及应用：
（1）产妇脐带捐献准入标准：
无家族性遗传病及病原微生物感染，知晓并签署知情同意书；
运输过程：脐带采集管完全密封，运输温度为4℃-25℃；运输时间不应超过24h；
传染病检测：母血或脐血TP /HIV/HBV/HCV/HCMV/EBV/HPV/HHV阴性；储运液取样细菌培养无菌、支原体检测阴性；
母血无凝块、溶血及重度乳糜，储存容器无破损；无母血脐带中可留少量脐血；
脐带标准：重量≥15g，形态饱满呈乳白色；
（2）P2种子细胞库控制
培养液澄清，细胞长梭形涡旋状排列，细胞融合度达80%，P2代种子细胞入种子细胞库前取500ul做内毒素检测，106-107细胞做流式检测，上清和细胞悬液留样，留样样本按照编码规格进行编号；
（3）P5工作细胞库控制
种子细胞复苏，传代培养，待培养至P5代细胞长到80-90%融合时，收获细胞，即为工作细胞库，细胞长梭形涡旋状排列，细胞融合度达80%，细胞数量≥1×109，细胞活率≥90%，P5代工作细胞收获时各取1ml做内毒素检测、真菌和细胞内外病毒因子检测，第二次离心后取20ml上清做菌检、 BSA残留量检测、抗生素残留量检测、EGF、bFGF残留量和支原体检测，P5代细胞入工作细胞库待检区，上清和细胞悬液留样各四份，留样样本按照编码规格编号；
（4）冻存装置：完全密封，细胞编号、类型、冻存日期标记完整清晰，保存位置明确；冻存过程：程序降温；
（5） 复苏过程：37℃快速复苏；
（6） MSC细胞制剂出库控制标准：
细胞数量达标，细胞活率≥90%，内毒素检测阴性；取适量细胞用适量生理盐水悬浮，添加人血白蛋白浓度至3%，经细胞筛过滤；
采用生理盐水袋或专用容器灌装，终体积可根据要求适当选择（5～80）ml，细胞制剂进行细胞数量、活率、内毒素检测，细胞制剂留样4份，留样样本按照编码规则编号；
质保部人员负责做好对细胞制剂出库的审核与质量监督，
细胞制剂接收人即为细胞制剂运输人，负责再次确认、接收出库细胞制剂，并放置进保温血箱，保证细胞制剂安全存放（4～25℃），避光保存和运输，直至运达目的地，自生产之时起，有效期为12小时；
（2）hMSC培养试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用MSC细胞扩增培养液MSC-
、细胞
培养添加剂MSC-
，本发明提供一种临床用MSC细胞扩增基础培养液MSC- 
，PH7.2～7.4，
平衡盐Earle’s 盐 、核苷、L-谷氨酰胺2mM、NaHCO3 2200mg/L、D-葡萄糖 1000mg/L、丙酮酸
钠 1mM、酚红指示10mg/L、无机盐、氨基酸、维生素、核糖核苷、脱氧核糖核苷等，使用时添加
2mM GlutaMAX™-I和10%Prime FBS，本发明不排除可以采用上述培养基之外的培养基实施
培养；
本发明提供一种MSC细胞培养添加剂MSC-
，其中含有2-50ng/mL bFGF、2-50ng/ml
EGF；
优选的[0012]中，3-20ng/mL bFGF、3-20ng/ml EGF；
MSC按照细胞密度8-10×103/cm2用完全培养液重悬；
所述完全培养液的配制：MSC- 
中添加1/1000 MSC-
、2mM GlutaMAX™-I和10%Prime
FBS；
（3）一种hMSC鉴定试剂盒，所述临床用MSC细胞流式表型和活性鉴定试剂盒包括五组双色抗体组合物，分别是IgG-Percp-cy5/CD105-PE/CD73/CD90、CD44-PE和Annexin-FINKTC/PI，洗涤液50ml一管，固定液50ml一管；每5-10ul可检测一次，共计50套，所述洗涤液是磷酸盐缓冲液；所述固定液是1%多聚甲醛；
（4）本发明还包括将上述hMSC培养试剂，MSC细胞扩增培养液MSC- 
、细胞培养添加剂
MSC-
和鉴定试剂装入专用洁净容器制备成试剂盒。
2.应用权利要求1所述的hMSC工业化生产和质量管理体系标准和试剂盒制备hMSC，其特征在于，包括以下步骤：
脐带间充质干细胞的分离和培养方法：
（1）hMSC细胞培养添加剂MSC-
配置，其中含有2-50ng/mL bFGF和2-50ng/ml EGF；
（2）配置完全培养液的配制：MSC- 
中添加1/1000 MSC-
、2mM GlutaMAX™-I和10%
Prime FBS，取10ml包被150cm培养皿；
（3）用尖头直剪将脐带剪成约2cm长度的小段，至少清洗3次，取最后一次清洗液20ml做菌检；
（4）转移脐带组织至一新的培养皿中，将脐带一端沿静脉腔内剪个切口，用组织镊沿切口方向静脉血管边缘纵向撕开，用组织镊去除羊膜，小心地将1根静脉血管和2根动脉血管剖离，翻转脐带，撕去上皮，得到的华通氏胶用手术刀切成边长 3-5mm 之间的小块，将 3-5mm 之间的组织小块均匀的种植在150cm培养皿中，组织块之间的间距为 1cm左右，放入培养箱中，48H后补液至30ml，至第七天静止不动；
（5）第七天全量换液，经过11-15天的原代培养，收获原代MSC细胞，P0细胞数量达到约1x107，P0传P1代，细胞扩增倍数不应低于7倍，低于7倍说明原代细胞有老化现象；
（6）细胞分为种子细胞库和工作细胞库二级库，传至P2代时收获种子细胞，内毒素和流式表型检测合格后入种子细胞库；
（7）传代培养至P5代工作细胞入待检区，待细胞数量、活性、表型、内毒素、真细菌、支原体、STR分型检测、核型分析、细胞内、外病毒因子检测和诱导分化能力检测合格后入工作细胞库；
（8）质量检测合格的hMSC细胞装入50-100ml生理盐水中，制成干细胞细胞制剂，配合临床治疗需要使用。
3.根据权利要求2所述的脐带原代细胞制备，其特征在于步骤（2）hMSC完全培养液中血清优选为Prime血清，降低生产成本；步骤（3）中组织块大小3-5mm，均匀的种植在150cm培养皿中，48H后补液至30ml，至第七天静止不动。
4.根据权利要求2所述的hMSC传代培养，其特征在于优选步骤（5）传代培养时，用预传代细胞的培养上清液终止消化，防止细胞出现损伤性拉丝，提高细胞增殖能力和产量。
5.根据权利要求2所述的hMSC工作细胞质控标准，其特征在于细胞末次洗脱液中的EGF＜0.5ng、bFGF＜0.03ng、庆大霉素残留量<2ng/mL、BSA残留量<30ng/mL、内毒素的含量均不高于0.25EU/ml、单一的细胞供体来源、处于G0/G1期的细胞比例不低于70%、细胞表面高表达CD90、CD105、CD73和CD44，阳性率不低于95%，极地表达CD45、CD34、CD11b-、CD19和HLA-DR，阴性率<2%、采用BD全自动微生物培养系统检测，应为阴性、采用全自动培养仪进行测定和支原体检测 qPCR 方法，结果为阴性、细胞内外源致病因子的检测均为阴性。
6.权利要求1所述的hMSC工业化生产和质量管理体系标准和试剂盒，其特征在于将相关物料密封装入试剂盒，按照《中国药典》进行无菌和内毒素检测；根据《药品生产质量管理规范》（GMP）、《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》（试行）、《细胞制品研究与评价技术指导原则》(征求意见稿)以及2015版《中国药典》通则9203——药品微生物实验室质量管理指导原则所规定的内容，建立原辅料、脐带接收控制及间充质干细胞制剂控制的质量标准，保证临床应用时的安全性。
7.根据权利要求2所述的hMSC工作细胞，其特征在于在获得本发明hMSC工作细胞之前，用生理盐水洗涤并重悬所述hMSC细胞2-3次，直至满足《中国药典》要求的无菌、内毒素和培养液中残留量的检测指标，保证本发明的hMSC细胞在回输给患者时残留的本发明所述的培养基组分和因子组合物不会引起患者不适反应。
8.所述hMSC细胞组合物包含3x106-2x107/ml的本发明hMSC细胞，其有效量为50ml-100ml/个体的生理盐水组合物，密度为1x105-3x107/ml，优选为1x106-2x107/ml，还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基础，所述人血白蛋白的质量体积含量为1-5%，优选为3%。
9.根据权利要求2所述的hMSC细胞，其特征在于上述步骤hMSC组合物使用的方式为滴注或局部注射，具体地，MSC组合物给药的途径优选：在手臂或者下肢采用7号针头输液器进行静脉滴注；一个疗程四-六次，从第一次开始期间连续或每间隔一个月再回输下一次；一个疗程结束后，适疗效情况可以间隔两到三个月后继续给药，如有必要，间隔时间为一年或两年后还可继续再治疗。
10.一种权利要求1-9中任一项所述的hMSC细胞在临床慢性病中的应用，包括但不限于脊髓损伤、心脏损伤、骨、软骨、关节损伤、肝脏损伤；系统性红斑狼疮、银屑病；脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、系统性硬化症、克隆氏病、中风、糖尿病、糖尿病足等组织损伤修复，自身免疫性疾病和神经系统疾病等。
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