KR101310578B1 - 심혈관 증상의 치료에 지방조직-유래 세포를 사용하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가공된 리포애스퍼레이트(lipoaspirate) 조직에 존재하는 세포를 사용하여 심혈관 증상, 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자를 비롯한 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 이러한 환자의 치료 방법은 지방조직으로부터 수득된 농축량의 줄기세포를 환자에게 전달하도록 지방조직을 가공하는 것을 포함한다. 상기 방법은 줄기세포가 환자에게 투여되기 전에 외부 환경에 노출되지 않도록 밀폐된 시스템에서 수행될 수 있다. 따라서, 바람직한 방법에서는, 가공된 리포애스퍼레이트에 존재하는 세포는 이로운 심혈관 치료 효과를 촉진시키거나 일으키거나 지지하는데 필요한 첨가제들과 함께 수용자에게 직접 주입된다.

가공된 리포애스퍼레이트 조직, 지방 유래 세포, 줄기세포, 선조세포, 심혈관 증상, 허혈증, 혈관신생, 동맥신생

Description

심혈관 증상의 치료에 지방조직-유래 세포를 사용하는 방법{METHODS OF USING ADIPOSE TISSUE-DERIVED CELLS IN THE TREATMENT OF CARDIOVASCULAR CONDITIONS}

관련 출원

본 출원은 "METHODS OF USING ADIPOSE TISSUE DERIVED CELLS IN THE TREATMENT OF CARDIOVASCULAR CONDITIONS" 명칭 하에 2003년 2월 20일 출원된 미국 가출원 제60/449,279호 및 "METHODS OF USING ADIPOSE TISSUE DERIVED CELLS IN THE TREATMENT OF CARDIOVASCULAR CONDITIONS" 명칭 하에 2003년 4월 15일 출원된 미국 가출원 제60/462,911호의 이익을 청구하는 것이다. 상기 출원 모두는 그 전체 내용을 본원에서 참고로 인용한다.

1. 기술 분야

본 발명은 일반적으로 지방조직으로부터 유래된 세포에 관한 것이고, 더욱 구체적으로는 지방-유래의 줄기세포 및 선조세포, 지방-유래의 줄기세포 및 선조세포를 사용하는 방법, 지방-유래의 줄기세포 및 선조세포를 포함하는 조성물 및 지방-유래의 줄기세포 및 선조세포를 제조하고 사용하는 시스템에 관한 것인데, 이들은 심혈관 질환 및 장애의 치료에 사용된다.

2. 관련 기술의 설명

심혈관 질환 및 장애는 모든 산업 국가에서 사망 및 신체 장애의 주된 요인이다. 미국 한 국가에서만, 심혈관 질환은 치사율의 약 40%를 차지하고 5800만 미국인에 영향을 준다 (American-Heart-Association, 2002). 심혈관 질환을 특히 파멸적으로 만드는 가장 주된 인자 중의 하나는 손상 후 심장이 자신을 복구하는 능력을 갖지 못한다는데 있다. 심장 근육 세포, 즉, 심근세포는 손상 부위에서 분열 및 재생될 수 없어, 상해 및 질환에 기인한 심장 세포 손실은 대부분 비가역적이다 (Abbate et al., 2002; Remme, 2000).

이용가능한 치료법 형태 중에서, 인간 대 인간 심장 이식은 중증 심혈관 질환 및 장애의 치료에 가장 효과적인 것이었다. 사실, 심장 이식 수용자의 평균 1년 및 5년 생존율은 현재 70 %가 넘는다. 그러나, 불행히도 이식은 다수의 원인, 즉 적당한 공여자의 부족, 과정의 비용 및 이식편의 높은 거부 가능성 및 합병증, 예를 들면 감염, 신부전 및 면역억제 관련 암으로 인해 매우 제한된 치료 형태이다 (American-Heart-Association, 2002).

이식 치료법의 별법은 손상된 심장 근육 세포의 복구 및 재생을 위한 재생 의학의 사용이다. 임상적으로 표적화된 방식의 재생 의학은 줄기세포 (즉, 체내의 비특정 마스터 세포)가 무한정으로 자신을 복원하고 성숙한 특정 세포로 발생하는 능력을 이용한다. 줄기세포는 발생의 초기 단계에서 배아에서, 태아 조직에서 및 일부 성체 기관 및 조직에서 발견된다 (Pera et al., 2000). 배아 줄기세포 (이하 "ESC")는 전부는 아니지만 상당수의 체내 세포 및 조직형이 되는 것으로 알려졌다. ESC는 개인의 모든 유전자 정보를 포함하고 있을 뿐만 아니라, 체내의 200+ 세포 및 조직 중 어느 것이라도 될 수 있는 발생 능력을 포함한다. 따라서, 상기 세포는 재생 의학에 대한 커다란 잠재력을 가진다. 예를 들면, ESC는 특정 조직, 예를 들면 심장, 폐 또는 신장으로 성장할 수 있는데, 이는 다시 손상된 기관 및 질환을 가진 기관의 복구에 사용될 수 있다 (Assady et al., 2001; Jacobson et al., 2001; Odorico et al., 2001). 그러나, ESC 유래 조직은 임상적 제한이 있다. ESC는 또다른 개인, 즉 배아에서 필수적으로 유래되기 때문에, 수용자 면역계가 신규한 생물적 물질을 거부할 위험이 있다. 상기 거부를 예방할 면역억제 약물이 이용가능하지만, 상기 약물은 또한 바람직한 면역 반응, 예를 들면 박테리아 감염 및 바이러스에 대한 반응을 차단하는 것으로도 공지되어 있다. 더욱이, ESC, 즉, 배아의 공급원에 대한 윤리적 논쟁은 잘 기록되어 있고 가까운 장래에 추가적이고 아마도 극복하기 어려운 걸림돌이 될 것이다.

성체 줄기세포 (이하 "ASC"로도 지칭)는 ESC 사용의 별법을 제시한다. ASC는 많은 비배아 조직에 비활성적으로 존재하는데, 아마 상해된 조직을 치유할 수 있도록 외상 또는 기타 파괴적 질환 경과에 반응하기 위해 대기하고 있는 것이다 (Arvidsson et al., 2002; Bonner-Weir and Sharma, 2002; Clarke and Frisen, 2001; Crosby and Strain, 2001; Jiang et al., 2002a). 주목할 만하게, 현출되는 과학적 증거는 각 개인이 전부는 아니지만 많은 유형의 세포 및 조직이 되는 능력을 ESC와 공유할 수 있는 ASC의 풀(pool)을 보유함을 보여준다 (Young et al., 2001; Jiang et al., 2002a; Jiang et al., 2002b; Schwartz et a1. 2002). 따라 서, ESC와 유사하게 ASC는 재생 의학의 임상적 응용에 커다란 잠재력이 있다.

ASC 집단은 하나 이상의 골수, 피부, 근육, 간 및 뇌에 존재하는 것으로 제시되었다 (Jiang et al., 2002b; Alison, 1998; Crosby and Strain, 2001). 그러나, 상기 조직내 ASC의 빈도는 낮다. 예를 들면, 골수내 중배엽 줄기세포 빈도는 100,000개 유핵 세포 중 하나 내지 1,000,000개 유핵 세포 중 하나로 측정된다 (D'Ippolito et al., 1999; Banfi et al., 2001; Falla et al., 1993). 유사하게, 피부로부터의 ASC의 추출은 수주 동안의 복잡한 일련의 세포 배양 단계를 포함하고 (Toma et al., 2001) 골근육-유래 ASC의 임상적 적용은 2 내지 3주 배양 상을 필요로 한다 (Hagege et al., 2003). 따라서, 상기 조직으로부터의 ASC의 임의의 제시된 임상 적용은 증가된 세포 수, 순도 및 세포 정제 및 세포 배양 과정에 의한 성숙도를 요구한다.

세포 배양 단계는 증가된 세포 수, 순도 및 성숙도를 제공할 수 있지만, 비용도 또한 증가시킨다. 이 비용에는 세포 노화에 따른 세포 기능 손실, 잠재적으로 유용한 비줄기세포 집단의 손실, 환자에게 세포의 잠재적 적용의 지연, 증가된 금전적 비용 및 배양 중 주위 미생물에 의한 세포 오염의 증가된 위험 등의 기술적 난점이 하나 이상 포함될 수 있다. 골수 유래 ASC의 치료 효과를 검사하는 최근의 연구는 세포 배양과 관련된 문제점을 우회하기 위해 전체 골수를 필수적으로 사용했다 (Horwitz et al., 2001; Orlic et al., 2001; Stamm et al., 2003; Strauer et al., 2002). 그러나, 임상적 이점은 차선적이고, 성과는 거의 확실히 골수로부터 내재적으로 입수가능한 제한적인 ASC 용량 및 순도와 관련된다.

최근, 지방조직은 ASC의 공급원인 것으로 제시되었다 (Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002). 골수, 피부, 근육, 간 및 뇌와 달리, 지방조직은 상대적으로 다량으로 채취하기가 비교적 용이하다 (Commons et al., 2001; Katz et al., 2001b). 더욱이, 지방 유래 ASC는 시험관내에서 뼈, 지방, 연골 및 근육을 비롯한 다수의 조직을 생성하는 능력을 가진 것으로 보여졌다 (Ashjian et al., 2003; Mizuno et al., 2002; Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002). 따라서, 지방조직은 재생 의학에 사용하기 위한 최적의 ASC 공급원을 제시한다. 그러나, 지방 유래 ASC를 채취하는 적절한 방법은 선행기술에 없다. 기존 방법은 다수의 단점을 가진다. 예를 들면, 기존 방법은 지방조직을 제거하기 위한 흡출 장치를 최적으로 수용할 수 있는 능력이 부재하다. 기존 방법은 또한 조직 상의 처리를 통해 지방조직 상 채취의 부분적 또는 완전 자동화가 부재하다(Katz et al., 2001a). 기존 방법은 또한100ml의 지방조직보다 큰 부피 용적이 부재하다. 기존 방법은 또한 지방조직 상 채취로부터 조직 상의 처리까지 부분 또는 완전 밀폐 시스템이 부재하다. 마지막으로, 기존 방법은 한 시료로부터의 물질이 다른 시료를 상호 오염시키는 부수적인 위험을 완화시키는 성분의 취급성이 부재하다. 요약하면, 지방조직의 ASC를 채취하기 위한 선행기술 방법은 상기 피부, 간 및 뇌의 ASC 채취와 관련된 기술적 난점을 극복하지 못한다.

따라서, ASC의 커다란 치료 잠재력을 고려하여, 증가된 수율, 농도 및(또는) 순도를 갖는 ASC의 집단을 신속하고 신뢰성있게 제조할 수 있고, 그에 따라 세포의 추출후 조작의 필요성을 감소시키거나 제거할 수 있는 지방조직의 ASC 채취 장치, 시스템 또는 방법에 대한 업계의 절박한 요구가 있다. 이상적으로, 상기 장치, 시스템 또는 방법은 수용자에게 직접 제공하기에 적합한 방식으로 ASC를 수득할 것이다. 상기 장치, 시스템 또는 방법과 함께 심혈관 질환 및 장애의 치료용 지방 유래 ASC를 사용한 방법 및 조성물의 이용은 상기 장애의 치료를 혁신시킬 것이다. 심혈관 질환의 보편 및 현재 치료 선택의 부족을 고려하면, 상기 치료는 절박하게 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 지방 유래 성체 줄기세포가 심혈관 증상, 질환 또는 장애의 치료용으로 사용될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 본 발명은 또한 지방-유래의 성체 줄기세포 및 선조세포의 제조 장치, 시스템 및 방법의 발견에 기초한다. 본 발명은 또한 심혈관 증상, 질환 또는 장애의 치료용 지방-유래의 성체 줄기세포 및 선조세포의 조성물 및 방법의 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 한 태양에서 치료적 심혈관 이점을 촉진하거나 발생시키거나 유지하기에 필수적인 첨가제와 함께 수용자에게 직접 제공되는, 지방조직으로부터 유래된 세포를 사용하기 위한 조성물, 방법 및 시스템에 관한 것이다.

한 실시태양에서, 지방조직 처리는 밀폐된 무균성 유체/조직 경로를 유지하는 시스템에서 일어난다. 이는 예비조립되고 연결된 세트의 밀폐된 무균성 용기 및 밀폐된 경로 내에서 조직 및 유체 성분의 전달을 가능케하는 튜브의 사용에 의해 달성된다. 이 처리 세트는 시약의 첨가, 온도 및 처리 시간을 조절함으로써 조작자가 공정을 수동으로 다룰 필요성을 경감시킬 수 있는 장치에 삽입된 일련의 처 리 시약(예, 염수, 효소 등)과 연결될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 조직 추출에서부터 가공 및 수용자에 대한 투여의 전공정은 동일한 설비, 실제 그 과정을 받는 환자의 동일한 방에서 모두 수행될 것이다.

본 발명의 일면에 따르면, 원료 지방조직은 성숙한 지방세포 및 연결 조직을 실질적으로 수거하고, 그에 따라 수용자의 체내에 배치하기에 적절한 균질한 다수의 지방조직-유래 세포를 얻도록 처리된다. 세포는 다른 세포, 조직, 조직 단편 또는 다른 세포 성장 및(또는) 분화의 자극제와 함께 수용자에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기한 임의의 첨가제와 함께 세포는 수용자에 대한 치료적 이점을 얻을 목적으로 단일의 작동 과정의 측면에서 세포가 얻어진 사람에게 투여된다.

한 실시태양에서, 환자를 치료하는 방법은 a) 조직 수거 시스템을 제공하는 단계, b) 조직 수거 시스템을 사용하여 환자에게서 소정 농도의 줄기세포를 갖는 지방조직을 수거하는 단계, c) 지방조직의 적어도 일부를 처리해 처리 전의 지방조직의 줄기세포의 농도와 다른 줄기세포의 농도를 수득하는 단계 및 d) 정맥내, 관상동맥내 및 심내막심근을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업자에 공지된 다수의 방법을 사용하여, 환자에게 투여되기 전에 조직 수거 시스템으로부터 줄기세포 및 선조세포를 수거하지 않고 줄기세포 및 선조세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

본원에 개시된 본 발명에 따른 시스템은 i) 환자에게서 수거된 지방조직을 수용하도록 구성된 조직 수집 입구부 및 ii) 용기 내에 배치되어 환자에게서 수거 된 지방조직을 보유하고 환자에게서 수거된 비지방조직을 통과시키도록 구성된 필터를 포함하는 조직 수집 용기(a), 조직 수거 시스템으로부터 줄기세포를 수거함이 없이 지방조직으로부터 얻어진 줄기세포를 수용하는 조직 수집 용기와 결합되어, 1종 이상의 첨가제를 투여하여 그 안에 함유된 줄기세포와 혼합하는 첨가제 투입부를 포함하는 혼합 용기(b) 및 혼합 용기 중의 세포가 환자에게 투여 중 조직 수집 시스템으로부터 수거되도록 구성된 출구(c)를 포함한다.

본원에 기술된 임의의 특징 또는 그의 조합은, 임의의 조합에 포함된 특징들이 정황, 본 명세서 및 당업자의 지식에서 자명한 바와 같이 상호 모순되지 않는 한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 추가의 이점 및 측면은 아래 상세한 설명으로부터 명확하다.

도 1은 가공된 지방조직의 조직 수거 시스템이다.

도 2는 도 1의 조직 수거 시스템의 조직 수집 용기이다.

도 3은 도 2의 조직 수집 용기의 부분 횡단면도이다.

도 4는 조직 수거 시스템의 작업을 자동화하는 가공 장치이다.

도 5A 및 5B는 배양된 지방 유래 줄기세포에 의한 VEGF (5A) 및 PIGF (5B) 단백질의 발현을 도시한다.

도 6은 지방 유래 줄기세포 집단내 내피 선조세포의 검출을 도시한다.

도 7A 및 7B은 정상 (7A) 및 스트랩토조토신-처리 (7B) 마우스 모두의 혈관 구조의 시험관내 발생을 도시한다.

도 8은 음성 대조군에 대비한 지방 유래 줄기세포로 처리된 뒷다리 허혈성 마우스의 증가된 평균 혈류 회복을 도시한다.

도 9A 및 9B는 지방 유래 줄기세포의 용량 증가가 이식편 생존 및 혈관신생을 개선함을 보여주고(9A), 조직학적 시험편내 지방조직 구조의 유지를 도시한다(9B).

도 10은 심근 경색 부위내 공여자 유래 지방 유래 줄기세포의 생착의 조직학적 시간 경과를 도시한다.

도 11은 베타-갈락토시다제 및 미오신 중쇄의 이중 양성 염색을 도시한다. 강조된 세포는 공여자 지방조직 세포의 기원을 증명하는 청색 베타-갈락토시다제 염색 및 심장 근육 단백질 미오신 중쇄의 발현을 지시하는 갈색 염색 모두를 보인다. 갈색 및 청색 염색을 모두 보이는 세포 (화살표로 표시)는 심장 근육 세포의 표현형을 가진 지방조직 유래 세포이다.

도 12는 래트의 폐색/재관류 상해 후 심근 경색 부위내 공여자 유래 지방 유래 줄기세포의 클러스터를 예시한다.

본 발명은 또한 지방-유래의 줄기세포 및 선조세포를 이용한 심혈관 증상, 질환 또는 장애의 증명된 치료 방법을 최초로 제공한다. 특히, 본 발명은 본 발명의 지방 유래 줄기세포 및 선조세포가 (1) 태반 성장 인자 (Placenta Growth Factor (PIGF)) 및 혈관 내피 성장 인자 (Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF))를 비롯한 혈관신생 및 동맥신생 성장 인자를 발현하고, (2) 혈관 형성에 공지된 기능을 갖는 내피 선조세포(EPC)를 함유하며, (3) 시험관내에서 혈관으로 발생하고, (4) 생체내에서 허혈성 조직 생존을 유지하며, (5) 뒷다리의 폐색/재관류 후 재관류를 유도하고, (6) 심장 상해 후 동물내 주입시 심장으로 향하며, (7) 심장 상해 후 동물내 주입시 심근세포로의 분화와 일치하는 마커를 발현하는 세포로 분화된다는 것을 최초로 증명한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 지방 유래 줄기세포 및 선조세포가 심혈관 질환 및 장애의 치료에 유용함을 결론적으로 증명한다.

본 발명이 더 쉽게 이해될 수 있도록, 일부 용어가 먼저 정의된다. 추가 정의는 상세한 설명을 통해 제시된다.

본원에서, "지방조직"은 지방세포 및 미세혈관 세포를 비롯해 복수 세포형을 포함하는 조직을 말한다. 지방조직에는 줄기세포 및 내피 선조세포가 포함된다. 따라서, 지방조직은 지방을 저장하는 연결 조직을 포함하는 지방을 가리킨다.

본원에서 "지방조직 단위"는 지방조직의 분리되거나 또는 측정가능한 양을 말한다. 지방조직의 단위는 단위의 중량 및(또는) 부피를 결정하여 측정할 수 있다. 상기에서 확인된 데이타에 기초해, 환자에게서 수거된 것과 같은 가공된 리포애스퍼레이트(lipoaspirate)의 단위는 0.1% 이상의 세포 성분이 줄기세포인 세포 성분을 갖는다. 본원의 개시 내용에서, 지방조직의 단위는 환자에게서 수거된 지방조직의 전체 양을 의미하거나, 환자에게서 수거된 지방조직의 전체 양보다 적은 양을 의미할 수 있다. 따라서, 지방조직의 단위는 다른 단위의 지방조직과 병합되어 개개 단위의 합인 중량 또는 부피를 갖는 지방조직의 단위를 형성할 수 있다.

본원에서, "부분"은 전체보다 적은 물질 양을 말한다. 작은 부분은 50% 미만의 양을 말하고, 큰 부분은 50%보다 큰 양을 말한다. 따라서, 환자에게서 수거된 지방조직의 전체 양보다 적은 지방조직 단위는 수거된 지방조직의 부분이다.

본원에서 "줄기세포"는 하나 이상의 특정 기능을 갖고 자가 복원능을 갖는 각종 다른 세포형으로 분화하는 잠재력를 갖는 복수분화능(multipotent) 세포를 말한다. 본원에서 개시된 줄기세포의 일부는 다분화능(pluripotent)일 수 있다.

본원에서 "선조세포"는 하나 이상의 세포 유형으로 분화되는 능력을 갖는 단분화능, 이분화능 또는 복수분화능 세포를 지칭하는데, 이는 하나 이상의 특정 기능을 수행하고 자가-복원의 제한된 능력을 갖거나 이러한 능력이 없다. 본원에서 일부 선조세포는 다분화성일 수 있다.

본원에서 "줄기세포 수" 또는 "줄기세포 빈도"는 지방 유래 세포 (ADC)가 낮은 세포 밀도로 평판되고 (<10,000 세포/웰) MSC 성장을 지지하는 성장 배지 (예를 들면, 10% 우태아 혈청, 5% 말 혈청, 및 항생제/항진균제로 보충된 DMEM/F12 배지)에서 배양되는 콜로니형성 분석법에서 관찰된 콜로니 수를 지칭한다. 세포를 2주간 배양한 후 배양물을 헤마톡실린으로 염색하고 50개 초과의 세포를 갖는 콜로니를 CFU-F로 계수한다. 줄기세포 빈도는 평판된 100개 유핵 세포 당 관찰된 CFU-F 수로서 계산한다 (예를 들면; 1,000개 유핵 ADC 세포로 개시된 평판내 계수된 15개 콜로니는 1.5%의 줄기세포 빈도를 부여한다). 줄기세포 수는 줄기세포 빈도에 얻어진 유핵 ADC 세포 총수를 곱하여 계산된다. ADC 세포로부터 배양된 높은 %(~100%)의 CFU-F는 골수-유래 줄기세포에 의해서도 발현되는 세포 표면 분자 CD105를 발현한다 (Barry et al., 1999). CD105는 또한 지방조직-유래 줄기세포에 의해 발현된다 (Zuk et al., 2002).

본원에서 "가공된 리포애스퍼레이트"란 성숙 지방세포 및 연결 조직으로부터 활성 세포 성분(예, 줄기세포 및 선조세포를 포함하는 성분)을 분리하도록 가공된 지방조직을 말한다. 이 분획은 본원에서 "지방-유래 세포" 또는 "ADC"로 지칭된다. 전형적으로, ADC는 지방조직으로부터 세포를 세척하고 분리시켜 수득한 세포 펠렛을 말한다. 상기 펠렛은 세포가 원심분리 용기의 바닥에서 응집되도록 세포 현탁액을 원심분리하여 수득하는 것이 전형적이다.

본원에서 "심혈관 증상, 질환 또는 장애"는 불충분한, 바람직하지 않은 또는 비정상적 심장 기능, 예를 들면 허혈성 심장 질환, 고혈압 심장 질환 및 폐 고혈압 심장 질환, 심장판막증, 선천성 심장 질환 및 개체에서, 특히 인간 개체에서 선천성 심장 질환을 초래하는 임의의 증상으로 특징되는 모든 장애를 포함하려는 의도이다. 불충분한 또는 비정상적 심장 기능은 질환, 상해 및(또는) 노화의 결과일 수 있다. 배경 기술에 의하면, 심근 상해에 대한 반응으로 일부 세포는 사멸하면서 다른 일부는 사멸하지는 않았으나 부전성인 동면 상태로 돌입하는 공지된 경로를 따른다. 그 후 염증성 세포의 침윤, 반흔의 일부로서 콜라겐의 침착이 따르는데, 모두 신규한 혈관의 내부 성장 및 계속되는 세포 사멸 정도와 함께 일어난다. 본원에서 "허혈증"은 혈류의 감소로 인한 임의의 국소 조직 허혈증을 지칭한다. 용어 " 심근 허혈증"은 관상동맥 죽상경화증 및(또는) 심근으로의 부적절한 산소 공급으로 기인한 순환 장애를 지칭한다. 예를 들면, 급성 심근 경색은 심근 조직으로의 비가역적 허혈 손상을 나타낸다. 상기 손상은 관상동맥 순환계내 폐색 (예를 들면, 혈전 또는 색전)으로 기인하고 심근 대사 요구량이 심근 조직으로의 산소 공급을 초과하는 환경을 만든다.

본원에서 "혈관신생"은 기존의 혈관계 및 조직으로부터 신규한 혈관이 생성되는 과정을 지칭한다(Folkman, 1995). 문구 "손상 또는 리모델링"은 기존 혈관계의 재형성을 지칭한다. 조직 허혈증의 완화는 혈관신생에 결정적으로 의존한다. 신규한 혈관의 자발적 성장은 허혈 부위내 및 주위에 부수적 순환을 제공하고, 혈류를 개선하며, 허혈증에 의한 증상들을 완화한다. 본원에서, "혈관신생인자" 또는 "혈관신생 단백질"은 기존 혈관계로부터 신규한 혈관의 성장을 촉진할 수 있는 임의의 공지된 단백질을 지칭한다("혈관신생"). 본 발명에 사용하기 위한 적절한 혈관신생인자는 태반 성장 인자 (Luttun et al., 2002), 대식세포 콜로니 자극 인자 (Aharinejad et al., 1995), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (Buschmann et al., 2003), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)-A, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E (Mints et al., 2002), 뉴로필린 (Wang et al., 2003), 섬유아세포 성장 인자(FGF)-1, FGF-2 (bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6 (Botta et al., 2000), 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2 (Sundberg et al., 2002), 에리쓰로포이에틴 (Ribatti et al., 2003), BMP-2, BMP-4, BMP-7 (Carano and Filvaroff, 2003), TGF-베타 (Xiong et al., 2002), IGF-1 (Shigematsu et al., 1999), 오스테오폰틴 (Asou et al., 2001), 플레이오트로핀 (Beecken et al., 2000), 액티빈 (Lamouille et al., 2002), 엔도쎌린-1 (Bagnato and Spinella, 2003) 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 혈관신생인자는 독립적으로 또는 서로 조합되어 작용할 수 있다. 조합시, 혈관신생인자는 또한 상승적으로 작용하여 인자의 조합된 효과가 별도의 개개 인자의 효과의 총합보다 크게 한다. 용어 "혈관신생인자" 또는 "혈관신생 단백질"은 또한 상기 인자의 기능적 유사체를 포함한다. 기능적 유사체는, 예를 들면 인자의 기능부를 포함한다. 기능적 유사체는 또한 인자의 수용체에 결합하여 혈관신생 및(또는) 조직 리모델링을 촉진하는 인자의 활성을 모방하는 항-개체형 항체를 포함한다. 상기 항-개체형 항체를 생성하는 방법은 선행기술에 공지되어 있고 예를 들면, 그 내용이 본원에 참고로 인용된 WO 제97/23510호에 기술되어 있다.

본 발명에 사용된 혈관신생인자는 적절한 공급원으로부터 생산되거나 수득될 수 있다. 예를 들면, 상기 인자는 그의 천연 공급원으로부터 정제되거나 합성적으로 또는 재조합 발현으로 생산될 수 있다. 인자는 단백질 조성물로 환자에 투여될 수 있다. 별법적으로, 인자는 인자를 코딩하는 발현 플라스미드 형태로 투여될 수 있다. 적절한 발현 플라스미드의 제작은 선행기술에 공지되어 있다. 발현 플라스미드의 제작용 적절한 벡터는 예를 들면, 아데노바이러스 벡터, 래트로바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, RNA 벡터, 리포좀, 양이온성 지질, 렌티바이러스 벡터 및 트랜스포존을 포함한다.

본원에서, "동맥신생"은 관상 동맥 및 기존 동맥 연결부의 기타 동맥의 성장을 강화하는 과정을 지칭한다 (Carmeliet, 2000; Scholz et al., 2001; Scholz et al., 2002). 더 구체적으로, 동맥신생은 허혈 조직, 종양 또는 염증 부위로 혈액을 공급하는 기존 동맥 연결부의 내피 및 평활근 세포의 증식에 의한 동맥의 인 시츄 (in situ) 동원 및 확장이다. 상기 혈관은 발병 조직 외부로 대부분 성장하고 허혈 경계, 종양 또는 염증 부위로의 영양분 전달에 중요하다. 동맥신생은 심근 경색에 대한 정상적 반응의 일부이다 (Mills et al., 2000; Monteiro et al., 2003). 또한, 관상동맥 우회 이식(CABG)의 보편적 수술 기법은 사실 인공적 관상 혈관의 생성일 뿐이다 (Sergeant et al., 1997). 따라서, 경색 후 동맥신생을 강화하는 과정은 허혈 조직으로의 혈류를 개선하여 감소된 세포 사멸 및 감소된 경색 크기를 초래할 것이다. 상기 개선점들은 개선된 심장 기능 및 치료 이점을 초래할 것이다.

본원에서, "치료하는"은 심혈관 증상, 질환 또는 장애, 즉, 불충분한 또는 바람직하지 않은 심장 기능으로 특징되는 임의의 장애의 하나 이상의 부작용 또는 증상을 완화하거나 감소시키는 것을 포함한다. 심장 장애의 부작용 또는 증상은 선행기술에 공지되어 있고 호흡곤란, 동통, 심계항진, 어지러움, 졸도, 부종, 치아노제, 창백, 피곤 및 사망을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에서, "투여하는," "도입하는" 및 "이식하는"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 ADC의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 본 발명의 ADC의 배치를 지칭한다. ADC는 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다.

본원에서, "개체"는 온혈 동물, 바람직하게 인간을 비롯한 포유동물을 포함한다. 바람직한 태양에서, 개체는 영장류이다. 더욱 더 바람직한 태양에서, 개체는 인간이다.

이제, 본 발명의 현재 바람직한 실시태양을 상세히 언급할 것이고, 본 발명의 예가 첨부된 도면에 예시되어 있다. 가능하다면, 동일하거나 유사한 부분을 나타내기 위해 동일하거나 유사한 부호를 도면 및 설명 부분에서 사용한다. 도면은 단순화된 형태이고 정밀한 축척이 아님을 주목해야 한다. 본원의 개시 내용을 참조하여, 오직 편의 및 명료함을 위해서, 상부, 바닥, 좌측, 우측, 상향, 하향, 위쪽, 보다 위에, 밑에, 보다 아래에, 배면 및 정면과 같은 방향에 관한 용어를 첨부된 도면과 관련하여 사용한다. 그러한 방향에 관한 용어는 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.

본원의 개시 내용은 소정 예시된 실시태양에 관한 것이지만, 이들 실시태양은 예시적으로 제시된 것이지 제한적으로 사용된 것이 아님을 이해하여야 한다. 아래 상세한 설명은 대표적 실시태양을 논한 것이지만, 첨부된 특허청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명의 취지 및 범위에 들어올 수 있는 실시태양의 모든 변형 형태, 대체물 및 등가물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명은 당업계에서 통상적으로 사용된 다양한 세포 또는 조직 분리 기술과 함께 실시될 수 있고, 통상적으로 실시되는 가공 단계가 본 발명을 이해하는데 필요한 만큼만 본원에 포함된다.

따라서, 한 실시태양에서 본 발명은 지방조직에 존재하는 세포 집단 및 세포 집단을 심혈관 질환 및 장애를 치료하기 위해 인간 또는 동물 환자에게 투여하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 지방조직의 세포 집단은 치료적 목적으로 세포의 공급원으로 사용될 수 있다. 특히, 세포는 심혈관 질환 및 장애를 비롯한 재생 세포로 치료될 수 있는 질환과 같이 재생 의약으로 사용될 수 있다. 세포 집단은 다른 지방세포 또는 결합 조직 없이 심혈관 질환 또는 장애를 갖는 환자에게 투여될 수 있다.

특히, 본 발명은 손상을 최소화하고 심근 복구 및 이 과정 동안의 재생을 촉진하는데 기여할 수 있는 다수의 성질을 갖는 지방조직 유래 세포 및 그의 이용 방법에 관한 것이다. 상기 성질은 그 중에서도 하기를 포함한다: 신규 혈관 형성을 촉진하는 성장 인자의 합성 및 분비 능력; 세포 생존 및 증식을 촉진하는 성장 인자의 합성 및 분비 능력; 신규 혈관 형성에 직접 참여하는 세포로의 증식 및 분화 능력; 손상된 심근의 생착 및 반흔 형성의 억제 능력 (콜라겐 침착 및 가교결합); 심근 수축에 기여할 수 있는 근육 세포로의 증식 및 분화 능력; 및 심근세포로의 증식 및 분화 능력.

I. 본 발명의 방법

1. 가공된 리포애스퍼레이트의 수득 방법 (ADC)

지방조직은 본질적으로 줄기세포 및 선조세포가 풍부한 공급원인 것으로 밝혀졌다. 이 발견은 적어도 부분적으로는 지방조직의 주요 비줄기세포 성분(지방세포; adipocyte)의 수거의 용이성 때문일 수 있다. 따라서, 인간 및 동물 연구에서, 가공된 리포애스퍼레이트(ADC)는 0.1 % 이상, 더욱 전형적으로는 0.5 %보다 큰 빈도수로 줄기세포를 함유한다. 본 발명의 소정 실시태양에서, 약 2 내지 12 %의 줄기세포를 함유하는 ADC가 얻어졌다. 추가의 실시태양에서, ADC를 가공하여 줄기세포가 집단에서 100 %까지의 세포를 구성하는 세포의 집단을 얻는다. 본원에서 본 발명에 따라 얻어진 줄기세포의 순도/빈도는 골수 중에서 100,000분의 1(0.001%)의 공개된 빈도수보다 실질적으로 크다(D'Ippolito et al., 1999; Banfi et al., 2001; Falla et al., 1993; Muschler et al., 2001). 나아가, 지방조직의 수집은 유사한 부피의 골수의 수집보다 더 낮은 치사율과 관련된다(Nishimori, Yamada et al. 2002). 또한, 지방조직은 환자에게 치료법을 제공할 수 있는 내피 선조세포를 함유한다(Asahara et al., 1999; Kaushal et al., 2001; Kawamoto et al., 2003; Kawamoto et al., 2001)).

본 발명의 방법을 실시함에 있어, 환자에게 투여된 세포는 지방조직으로부터 얻어진다. 지방조직은 당업자에게 알려진 임의의 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 지방조직은 흡입 보조 지방흡입술, 초음파 보조 지방흡입술 및 절개 지방조직제거술에 의해 환자로부터 수거될 수 있다. 또한, 상기 과정에는 절개 지방조직제거술과 흡입 보조 지방흡입술의 조합과 같이 위 과정들의 조합이 포함될 수 있다. 조직 또는 그의 일부 분획은 환자에게 재이식될 것으로 의도될 때, 지방조직은 세포 성분의 생존율을 보전하고 잠재적인 감염성 미생물(예, 박테리아 및(또는) 바이러스)에 의한 조직의 오염의 가능성을 최소화하는 방식으로 수집되어야 한다. 따라서, 조직 추출은 오염을 최소화하기 위해 무균성 또는 살균성 방식으로 수행되어야 한다. 흡입 보조 지방흡입술이 지방조직을 수거하는데 바람직할 수 있는데, 다른 기술(예, 초음파 보조 지방흡입술)과 관련될 수 있는 줄기세포 손상에 대한 최소한의 가능성으로 조직을 수집하는 최소한의 해로운 방법을 제공하기 때문이다.

흡입 보조 지방흡입술의 경우, 지방조직은 환자에게서 존재하는 지방조직 저장소내에 또는 그 근처에 캐뉼러를 삽입한 후에 흡인 장치내로 지방을 흡출하여 수집된다. 한 실시태양에서, 작은 캐뉼러가 시린지에 결합될 수 있고 지방조직이 수동 힘을 사용해 흡출될 수 있다(Asken, 1990). 시린지 또는 다른 유사한 장치의 사용이 비교적 적당한 양의 지방조직(예, 0.1 ml 내지 수백 밀리리터의 지방조직)을 수집하는 데 바람직할 수 있다. 이들 비교적 작은 장치를 사용하는 과정은, 과정이 일반적인 마취와 반대로 오직 국부 마취로 수행될 수 있다는 장점이 있다. 이 범위를 넘는(예, 수백 밀리리터보다 큰) 더 큰 부피의 지방조직은 공여자 및 수집 과정을 수행하는 사람의 판단에 의해 일반적인 마취를 필요로 할 수 있다. 더 큰 부피의 지방조직의 수거가 바람직한 경우, 비교적 더 큰 캐뉼러 및 자동화 흡인 장치를 이 과정에서 사용할 수 있다 (Commons et al., 2001).

절개 지방조직제거술 과정에는, 지방조직을 함유하는 조직(예, 피부)을 과정의 부수적인 부분으로 수거하는 과정, 즉 수술의 1차 목적이 조직(예, 비만 또는 미용 수술에서의 피부)의 수거이고 지방조직이 1차 목표의 조직과 함께 수거되는 과정이 포함된다(단, 위 과정에 한정되는 것은 아님).

환자에게서 수거되는 지방조직은 추가의 가공을 위해 장치로 수집된다. 본원에서 논의하는 바와 같이, 본 발명의 한 실시태양에서, 상기 장치는 줄기세포 및(또는) 내피 선조세포를 포함하는 가공된 지방조직 세포 집단의 제조를 위한 조직을 수집할 목적으로 고안되고 사용된다. 다른 실시태양에서, 상기 장치는 추출 과정을 수행하는 의사에 의해 조직 수집을 위해 전형적으로 사용된 임의의 통상의 장치일 수 있다.

수집된 조직의 양은 공여자의 체중, 접근 가능한 지방조직 채취 부위의 입수가능성, 수반되는 및 기존의 투약 및 증상 (예를 들면 항응고제 치료), 및 수집된 조직의 임상적 목적을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다수의 변수에 좌우될 것이다. 조혈성 줄기세포 (수용자의 혈액 세포-형성 능력을 재생시키는데 사용되는 골수 또는 제대혈-유래의 줄기세포)의 이식 경험은 생착이 역치 효과를 갖는 세포 용량-의존적이라는 것을 나타낸다(Smith and Sweetenham, 1995; Barker et al., 2001). 그러므로, 다른 변수에 의하여 정해진 한계 내에서 "많을수록 좋다"가 적용될 것이며, 채취가 가능한 경우 가능한 많은 조직을 수집할 것이 일반 원칙일 것이다.

마른 개체에서 추출한 지방조직의 100 ml의 줄기세포 백분율이 비만 공여자에서 추출한 것보다 많다는 것이 발견되었다 (표 1). 이는 비만 개체의 증가한 지방 함량의 희석 효과를 반영한다. 그러므로, 본 발명의 한 면에 따라서, 보다 마른 환자에서 꺼내질 양에 비하여 과체중 공여자로부터는 더 많은 양의 조직을 수득하는 것이 바람직할 것이다. 이 관찰은 또한 본 발명의 유용성이 다량의 지방조직을 갖는 개체에 제한되지 않는다는 것을 나타낸다.

조직 및 세포 수율에 대한 체중 지수의 영향

체중 지수 상태	얻어진 조직의 양 (g)	총 세포 수율(x107)
보통	641±142	2.1±0.4
비만	1,225±173	2.4±0.5
p 값	0.03	0.6

농축된 줄기세포는 실질적으로 성숙한 지방 세포 및 결합 조직이 없는 지방-유래의 줄기세포 및(또는) 내피 선조세포를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 소정 실시태양에서, 조성물은 0.1 % 이상의 세포가 줄기세포인 세포 성분을 갖는다. 다른 실시태양에서, 조성물은 줄기세포가 세포 성분의 약 2 % 내지 12 % 사이로 이루어진 세포 성분을 갖는다. 100 % 이하와 같은 보다 높은 농도의 줄기세포는 상이한 조성물에 또한 포함된다. 본 조성물은 본원에서 논의한 바와 같이 추가의 성분, 예를 들어 세포 분화 인자, 성장 촉진제, 면역억제 약물 또는 의료 장치를 포함할 수 있다. 조성물이 주로 한 유형의 세포 (예를 들어, 지방-유래의 줄기세포 또는 지방-유래의 내피 선조세포)를 함유하는 임의의 조성물을 얻기 위하여, 줄기세포 또는 내피 선조세포에 존재하는 항원을 인식하고 결합하는 세포-특이적 항체를 사용하는 것과 같이 다른 세포 유형을 분리하는 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다.

대부분의 적용을 위하여, 활성 세포 집단의 제조는 지방조직의 성숙 지방을 많이 갖는 지방세포 성분을 결핍시키는 것이 요구될 것이다. 이는 통상적으로, 조직을 우선 유리 지방 (파열된 지방세포에서 유리됨) 및 말초 혈액 요소 (조직 채취 중에 절단된 혈관에서 유리됨)의 존재를 감소시키기 위하여 헹구고, 그 후 결합 조직 매트릭스로부터 유리 무손상 지방세포 및 다른 세포 집단으로 분해하는 일련의 세척 및 분해 단계에 의하여 달성된다. 소정의 실시태양에서, 전체 지방세포 성분 또는 비-줄기세포 성분은 지방조직의 줄기세포 성분으로부터 분리된다. 다른 실시태양에서, 지방세포 성분의 한 부분 또는 부분들 만이 줄기세포로부터 분리된다. 그러므로, 소정의 실시태양에서, 줄기세포는 내피 선조세포와 함께 투여될 수 있다.

헹굼은 조직을 유리 지방 및 혈액의 성분인 단일 세포 성분을 씻어내기 위하여 용액과 혼합하고, 무손상 지방조직 단편을 남기는 임의적이나 바람직한 단계이다. 한 실시태양에서, 환자로부터 수거된 지방조직은 등장성 식염수 또는 다른 생리학적 용액(예를 들어, 애보트 랩스(Abbott Labs)의 박스터 인코포레이티드 (Baxter Inc) 또는 노르모소(Normoso)(등록상표)의 플라스마라이트(Plasmalyte)(등록상표))과 혼합한다. 무손상 지방조직 단편은 유리 지방 및 세포로부터 여과, 경사법, 침전 및 원심분리를 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의하여 분리될 수 있다. 본 발명의 예시된 실시태양에서, 본원에서 논의된 바와 같이, 지방조직은 조직 수집 용기 내에 위치한 필터를 사용하여 비-지방조직으로부터 분리된다. 다른 실시태양에서, 지방조직은 경사법, 침전 및(또는) 원심분리 기술을 이용하여 물질을 분리하는 조직 수집 용기를 사용하여 비-지방조직으로부터 분리된다.

그후 무손상 조직 단편은 기계적 힘(다지기 또는 전단력), 단일 또는 조합의 단백질 분해 효소(예를 들어 콜라게나제, 트립신, 리파제, 리버라제 H1, 또는 미국 특허 제5,952,215호에 개시된 블렌드자임(Blendzyme)류 중 하나, 및 펩신)로 효소적 분해, 또는 기계적 및 효소적 방법의 조합을 포함하는 임의의 통상적인 기술 또는 방법을 사용하여 분해된다. 예를 들어, 무손상 조직 단편의 세포 성분은, 미국 특허 제5,372,945호에 개시된 바와 같이 지방조직의 모세혈관 내피세포를 수집하는 방법과 유사하게 지방조직의 콜라게나제-매개된 해리를 이용한 방법에 의하여 분해될 수 있다. 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 콜라게나제를 사용하는 추가적인 방법이 미국 특허 제5,830,714호 및 5,952,215호 및 문헌[Williams et al., 1995]에서 개시되었다. 유사하게, 문헌[Twentyman and Yuhas, 1980]에 개시된 바와 같이 중성 프로테아제가 콜라게나제를 대신하여 사용될 수 있다. 더욱이, 문헌[Russell et al., 1976]에서 개시된 바와 같이 콜라게나제 및 트립신의 조합과 같은 효소의 조합을 사용하거나, 문헌[Engelholm et al., 1985]에서 개시된 바와 같이 트립신과 같은 효소 및 기계적 해리의 조합을 사용할 수 있다.

그후 활성 세포 집단(가공된 리포애스퍼레이트)이 성숙한 지방 세포의 존재를 감소시킴으로써 분해된 조직 단편으로부터 얻어질 수 있다. 가공된 리포애스퍼레이트 현탁액 및 지방조직이 분해된 액체는 그 후 또다른 용기(예를 들어, 세포 수집 용기)를 통과한다. 현탁액은 조직 수집 용기로부터 현탁액을 거두어서 세포 수집 용기로 넣는 연동 펌프와 같은 펌프를 사용하여 1 개 이상의 도관을 통하여 세포 수집 용기로 흐를 수 있다. 다른 실시태양은 밀폐 시스템을 유지하면서 중력 또는 진공을 사용할 수 있다. 현탁액 중의 세포의 분리는 부력 밀도 침전, 원심 분리, 세광, 여과, 고체 상 부분에의 차별 부착 및 고체 상 부분으로부터의 용출, 항체-매개 선별, 전하의 차이; 면역자기 비드, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 다른 수단에 의하여 달성될 수 있다. 이러한 각종 기술 및 본 기술을 수행하기 위한 장치의 예는 문헌[Hemstreet et al., 1980]; [Schweitzer et al., 1995]; [Gryn et al., 2002]; [Prince et al., 2002]; [Watts et al., 2002]; [Mainwaring and Rowley, 1985]; [Greenberg and Hammer, 2001] 및 미국 특허 제6,277,060호; 6,221,315호; 6,043,066호; 6,451,207호; 5,641,622호; 및 6,251,295호에서 발견될 수 있다.

예시된 실시태양에서, 현탁액 중의 세포는 현탁액 중의 비세포 성분으로부터 스핀 막 필터를 사용하여 분리된다. 다른 실시태양에서, 현탁액 중의 세포는 비세포성 성분으로부터 원심분리기를 사용하여 분리된다. 상기 예시적인 실시태양에서, 세포 수집 용기는 원심분리기에 놓여지도록 구성된(예를 들어, 수동으로 또는 로봇에 의함) 가요성 백일 수 있다. 다른 실시태양에서, 가요성 백은 사용되지 않는다. 본원에서 논의된 바와 같이 원심 분리 후에, 세포 성분은 펠렛을 형성하고, 그후 이는 세포가 하나 이상의 도관을 통과하여 혼합 용기로 갈 수 있도록 완충 용액에 재현탁될 수 있다. 재현탁액 유체는 임의의 적절한 수단에 의하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 완충액은 세포 수집 용기 상의 포트로 주사될 수 있거나, 세포 수집 용기는 여분을 파열함으로써 세포의 펠렛과 혼합될 수 있는 완충액의 여분을 포함할 수 있다. 스핀 막 필터가 사용되는 경우, 세포는 분리 절차 후에 액체의 부피로 남기 때문에 재현탁액은 임의적이다.

본 발명의 임의의 실시태양이 지방조직을 완전히 분해하여 성숙한 지방 세포 및 결합 조직으로부터 활성 세포를 분리하는 방법에 관한 것이지만, 본 발명의 추가의 실시태양은 지방조직을 단지 부분적으로만 분해하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 부분적 분해는 하나 이상의 효소로 수행될 수 있고, 다른 경우 효소가 완전히 조직을 분해하는데 남겨질 시간의 양에 비교하여 일찍 지방조직의 적어도 일부로부터 수거된다. 상기 공정은 더 적은 가공 시간을 필요로 한다.

한 특정 실시태양에서, 조직은 무균 완충 등장성 식염수로 세척하고, 적당한 분해에 충분한 콜라게나제 농도, 온도 및 시간에서 콜라게나제와 인큐베이션하였다. 바람직한 실시태양에서, 사용된 콜라게나제 효소는 관련 당국(예를 들어, 미국 식품 의약품 안전청(U. S. Food and Drug Administration))에 의하여 인간의 사용이 승인될 것이다. 적절한 콜라게나제 제제는 재조합 및 비-재조합 콜라게나제를 포함한다. 비-재조합 콜라게나제는 인디애나주 인디애나폴리스의 호프만-라 로슈 리미티드(F. Hoffmann-La Roche Ltd) 및(또는) 뉴욕주 린브룩의 어드밴스 바이오팩쳐 코포레이션(Advance Biofactures Corp.)에서 얻었다. 재조합 콜라게나제는 또한 미국 특허 제6,475,764호에 개시된 바와 같이 얻을 수 있다.

한 실시태양에서, 용액은 약 10㎍/ml 내지 약 50㎍/ml 농도의 콜라게나제를 함유하고, 약 30 ℃ 내지 약 38 ℃에서 약 20 분 내지 약 60 분 동안 인큐베이션한다. 이러한 파라미터는, 시스템이 적당한 시간 프레임에서 목적하는 세포 집단을 추출하는데 효과적임을 입증하기 위한 경험적 연구에 의하여 최적화된 콜라게나제 효소의 출처에 따라 다양할 것이다. 특히 바람직한 농도, 시간 및 온도는 45 분 동안, 약 37 ℃에서 인큐베이션된 20 ㎍/ml 콜라게나제(중성 프로테아제 디스파제와 혼합; 블렌드자임 1, 로슈(Blendzyme 1, Roche))이다. 별개의 바람직한 실시태양은 0.5 단위/ml 콜라게나제(중성 프로테아제 써모라이신과 혼합; 블렌드자임 3)을 사용한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 사용된 콜라게나제 효소는 관련 당국(예를 들어, 미국 식품 의약품 안전청)에 의하여 인간의 사용이 승인된 물질이다. 사용된 콜라게나제는 미생물 및 오염 물질, 예를 들어 내독소가 없어야 한다.

이하의 활성 세포 집단의 분해는 첨가제 및(또는) 분해 공정의 부산물(예를 들어, 콜라게나제 및 새로 유리된 유리 지방)을 수거하기 위하여 세척/헹구어질 수 있다. 그 후 활성 세포 집단은 앞서 논의한 바와 같이 원심 분리 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의하여 농축될 수 있다. 이러한 후-가공 세척/농축 단계는 별개로 또는 동시에 적용될 수 있다.

한 실시태양에서, 세포를 농축시키고, 세포 집단을 연속 흐름 스핀 막 시스템 등, 예를 들어 미국 특허 제5,034,135호 및 5,234,608호에 개시된 시스템을 통과시킴으로써 콜라게나제를 수거한다.

전술한 것에 추가로, 활성 세포 집단을 더욱 정제하는데 적용될 수 있는 많은 후-세척 방법이 있다. 이들은 양성 선별(표적 세포를 선별), 음성 선별(원하지 않는 세포의 선택적 수거), 또는 그것의 조합을 포함한다.

한 실시태양에서, 가공된 리포애스퍼레이트 내의 세포의 아집단을 차별 부착 및(또는) 용출하게 하기 위하여 선택된 부착 성질을 갖는 고체 상 물질이 세포 세척 단계 후에 시스템에 삽입된다. 이 일반적 접근은, 차별적으로 백혈구를 포획하는 필터를 사용하여 백혈구를 오염시키는 수혈된 적혈구를 제거하는 임상적 혈액 수혈에서 수행된다(문헌[Soli et al., 2001]). 이 유형의 필터는 팔 베디칼 (Pall Bedical(Leukogard RS and Purecell RCQ)) 및 아사히(Asahi (RS2000))에 의하여 분배되었다. 차별 부착은 또한 단핵 세포(문헌[Berdel et al., 1982]) 및 표피 줄기세포(문헌[Bickenbach and Dnnwald, 2000])의 양성 선별에 적용되었다. 이 실시태양에서, 가공된 리포애스퍼레이트는 흐르면서 표적 세포 및 원하지 않는 세포 집단의 차별적 부착을 촉진하도록 미리-정해진 완충액 조건에서 필터 물질을 통과할 것이다. 양성 선별을 위하여, 필터 물질 및 조건은 원하지 않는 물질이 필터를 자유롭게 통과하고 과량의 완충액으로 씻어내면서, 표적 세포의 선택적 부착을 허용할 것이다. 표적 세포는 유속, pH, 이온 강도 및(또는) 부착에 필요한 양이온의 존재와 같은 조건을 변화시켜서 필터로부터 용출될 것이다. 필터 물질은 3-차원 메쉬, 소입자의 충진된 카세트, 중공-섬유 또는 높은 표면적을 갖는 다른 기전의 형태일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 이 필터 장치는 도 1에 나타난 일회용 세트의 완전한 부분이고 도 4에 나타난 장치로 끼워질 것이다. 세트 및 장치는 둘다 특정 도면에 나타난 예에서; 도 1에서 필터 및 하우징을 포함하기 위하여 그리고 도 4에서 밀폐, 무균 액체 경로의 유지에 필요한 필터 하우징 및 튜브(밸브 포함)를 끼워 넣기 위하여 약간 변형될 것이다. 다르게는 혼합 챔버(도 4의 성분 108; 도 1의 성분 30)는 장치 설비 및 필터/하우징 각각에 의하여 대체될 수 있다.

이 차별 부착 접근의 대안의 실시태양은 표적 세포 및 원하지 않는 세포에서 차별적으로 발현된 표면 분자를 인식하는 항체 및(또는) 항체의 조합을 사용하는 것을 포함한다. 특정 세포 표면 표지(또는 그것의 조합)의 발현에 기초한 선별은, 고체 상 지지 구조에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착하는 항체의 또다른 일반적으로 적용되는 기술이다(문헌[Geiselhart et al., 1996]; [Formanek et al., 1998]; [Graepler et al., 1998]; [Kobari et al., 2001]; [Mohr et al., 2001]). 이 접근은 양성 선별 및 음성 선별 둘다에서 명백한 적용인데, 예를 들어 잔여 백혈구는 CD45 항체를 사용하여 수거될 수 있다. 유사하게, 레이(Reyes)등은 인간 골수로부터 다기능 성체 선조세포(multipotential adult progenitor cell)를 선별하는 항체의 복합 블렌드를 적용하였다(문헌[Reyes et al., 2001]). 예를 들면, 지방 세포에 특이적으로 결합하는 AP2와 같은 항체(문헌[Joyner et al., 1999])는 잔여 지방 세포(미성숙 지방세포 및 지방모세포 포함)를 선택적으로 수거하는데 사용될 수 있다. 양성 선별은 표적 세포 집단에 특이적인 항체를 사용하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 퀴리시(Quirici) 등은 신경 성장 인자 수용체(Nerve Growth Factor Receptor)에 항체를 사용하여 골수-유래의 중간엽 줄기세포를 풍부하게 하였다(문헌[Quirici et al., 2002]).

항체-기재 접근의 한 실시태양에서, 항체(예를 들어, AP2) 또는 항체의 칵테일(예를 들어, AP2, CD3, CD19, CD11b)는 가공된 리포애스퍼레이트에 첨가될 것이다. 많은 다른 항체 및 항체 조합은 당업자에 의하여 인식될 것이고 예시 목적으로만 제공된다. 인큐베이션 후, 이러한 항체가 그들의 동족 항원에 적절한 결합을 하도록 미리-정해진 상태 하에서, 세포를 스핀 막 필터 또는 세포 세척 챔버의 다른 실시태양을 통과시킴으로써 세척하여 결합되지 않은 과량의 항체를 수거할 것이다. 그후 세포를 앞서 기재한 실시태양과 유사한 고체 상 구조를 통과시키고, 고체 상은 세포 표면에 현재 결합한 1차 항체에 높은 친화도로 부착할 수 있는 2차 항체에 부착한다. 표적 세포, 예를 들어 지방조직-유래의 줄기세포는 선택된 항체(항체 칵테일)에 의하여 인식된 세포 표면 항원의 발현이 없기 때문에 이 필터를 자유롭게 통과할 것이고, 이로써 음성 선별 시스템이 만들어진다. 이 실시태양에서, 일회용 세트(도 3) 및 장치(도 4)는 상기 실시태양에 기재된 바와 매우 유사하게 약간 변형될 것이다.

항체-매개 양성 선별 실시태양은 세포를 고체 상 지지체로부터의 박리를 촉진시키는 제3 첨가제를 포함하여 유사한 방식으로 달성될 수 있다. 이 실시태양에서, 효소 파파인 또는 키모파파인은 항체 분자를 절단하고 고체 상 지지체로부터 세포를 유리시키기 위하여 첨가될 수 있다(문헌[Civin et al., 1990]). 또다른 대안은 미국 특허 제6,017,719호에 승-라우(Tseng-Law) 등에 의하여 기재된 바와 같이, 항체에 결합하는 세포 표면 항원과 경쟁하는 특정 펩티드를 사용하는 것일 것이다.

또다른 실시태양에서 세포 펠렛을 재현탁하고, 연속 또는 불연속 밀도로 형성되는 액체 물질 위에(또는 아래에) 깔고, 세포 밀도에 기초하여 세포 집단을 분리하기 위하여 원심분리기에 위치시킬 수 있다. 상기 경사를 형성하는데 적절한 매질의 예는 퍼콜 및 피콜-파크(문헌[Qian et al., 1998]; [Smits et al., 2000]) 또는 피콜-파크(문헌[Lehner and Holter, 2002]; [Van, V et al., 2001])를 포함한다. 이 실시태양은 임의의 잔여 세포 집단 및 미성숙 지방 세포(전-지방세포)를 세포 집단으로부터 분리해 낼 수 있을 것이다.

유사한 실시태양에서, 성분채집술과 같은 연속 흐름 접근(문헌[Smith, 1997]) 및 (반류가 있거나 없는) 세광(문헌[Lasch et al., 2000]; [Ito and Shinomiya, 2001])이 사용될 수 있다. 상기 기전은 연령 기초로 적혈구를 분리하는 것을 포함한, 혈액 세포를 분류하기 위하여 사용되었고(문헌[Lasch et al., 2000]), 가공된 리포애스퍼레이트로부터 관심 세포를 더욱 정제하는데 있어서 이 일반 접근의 적용은 당업자에게 쉽게 이해될 것이다. 이 실시태양은 본 장치가 성분채집술 또는 세광 가능성을 제공하는 제2 장치와 통합되도록 도 4 및 일회용 세트(도 3)의 장치에 변형을 요구할 수 있다.

단기간의 세포 팽창의 따른 플라스틱에의 부착은 또한 골수-유래의 성체 줄기세포 집단에 적용되었다(문헌[Jaiswal et al., 2000]). 이 접근은 다른 집단이 유지되거나(그로써 성장하는 선택된 세포에 의하여 희석되어 감소되고) 요구되는 성장 조건이 없기 때문에 손실되는 동안 한 집단을 선택적으로 팽창시키기 위한 배양 조건을 사용한다. 세키야(Sekiya) 등은 골수-유래의 줄기세포에 대하여 사용될 수 있는 조건을 기재하였다(문헌[Sekiya et al., 2002]). (조직 배양 플라스틱에 차별 부착이 있거나 없는) 이 접근은 본 발명의 추가의 실시태양에 적용될 수 있다. 상기 실시태양에서, 세포는 도 4에 나타낸 장치로부터 수거되어 세포 배양 구성요소를 제공하는 제2 장치로 주입된다. 상기 장치는 통상적인 실험실용 조직 배양 인큐베이터 또는 타사오 등의 미국 특허 제6,001,642호 또는 암스트롱 등의 미국 특허 제6,238,908호에 개시된 바와 같은 바이오리액터-스타일 장치의 형태도 가능하다. 또다른 실시태양에서, 혼합 성분(도 4에 나타낸 장치의 구성요소 108; 도 3에 나타낸 구성요소 30)은 가공된 리포애스퍼레이트의 단기간 부착 및(또는) 세포 배양을 가능하게 하는 바이오리액터 구성요소로 교환될 수 있다. 상기 또다른 실시태양은 바이오리액터 구성요소를 장치 내로 포함시키는 것을 허용하여 상기 장치로부터 세포를 수거하여 또다른 장치로 주입할 필요를 없앤다.

i. 가공된 리포애스퍼레이트를 수득하기 위해 예시된 방법

환자로부터 지방조직을 수거하는 조직 수거 시스템의 예가 도 1에 예시되어 있다. 넓은 실시태양에서는, 조직 수거 시스템(10)은 조직 수집 용기(12) 및 조직 수집 용기(12)에 결합된 혼합 용기(30)을 포함한다. 혼합 용기(30) 및 조직 수집 용기(12) 간의 결합은 바람직하게는 조직 수집 용기(12)로부터 혼합 용기(30)으로 향하는 조직이 외부 환경에 노출되지 않는 밀폐 시스템을 정의한다. 시스템(10)은 또한 조직 수거 시스템(10)으로부터 수거된 농축된 줄기세포가 환자에게 투여되는 것을 구조화시킨 출구(32)를 포함한다. 조직 수집 용기(12)는 조직 수집 입구부(14) 및 필터(16)을 포함한다. 필터(16)은 용기내에 배치되고, 예를 들어 조직이 환자로부터 수거될 때 지방조직을 보유하고 비-지방조직은 통과시키도록 구성된다. 보다 구체적으로, 필터(16)은 유리 지질, 혈액 및 염수를 통과시키면서 지방조직의 초기 수집 중에, 또는 다른 실시태양에서는 지방조직의 초기 수집 후에 지방조직의 단편을 보유한다. 이에 관해, 필터(16)은 약 20μm 내지 5mm 크기 범위의 동일하거나 상이한 크기의 다수의 세공을 포함한다. 바람직한 실시태양에서는, 필터는 약 265㎛ 및 약 47% 개방 면적의 세공 크기를 갖는 약 200㎛ 두께의 임상 등급 폴리에스테르 메쉬이다. 상기 물질은 헹구는 동안 조직을 보유하지만 세포는 메쉬를 통해 빠져나가 조직 분해시킨다. 따라서, 조직을 환자로부터 흡입할 때, 비-지방조직을 지방조직으로부터 분리시킬 수 있다. 혼합 용기(30)은 혼합 용기(30)에 포함된 줄기세포와 혼합된 혼합 용기(30)으로 첨가제를 사용자가 투여하는 것을 가능하게 하는 구조의 추가 포트(31)을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 조직 수집 용기(12)의 치수는 필터 내로 약 1 리터의 조직 단편의 보유가 가능한 정도여야 한다. 다른 실시태양에서, 조직 수집 용기(12)는 더 크거나 작은 부피의 조직 단편을 보유하는 크기일 수 있으며; 예를 들어, 조직 수집 용기는 지방조직 단편 100ml 이상이며, 지방조직 단편 약 2L 이하를 저장하는 크기일 수 있다.

도 1의 시스템(10)에 존재하는 추가 특징을 보면, 조직 입구부(14)는 튜빙(22)를 경유하여 캐뉼러(24)와 결합되어 조직 수거 라인을 정의한다. 예시적인 실시태양에서, 캐뉼러(24)는 통합된 일회용 지방 흡입 캐뉼러이고, 튜빙은 구부러질수 있는 튜빙이다. 캐뉼러는 환자내로 주입되어 환자로부터 지방조직을 수거하도록 치수화된다. 시스템에서 사용되는 튜빙(22)는 붕괴 가능성이 감소되도록 흡입형 지방흡입과 관련된 음압을 견딜 수 있어야 한다. 조직 수집 용기(12)는 또한 조직 입구부(14)로부터 필터(16)의 반대 방향에 배치된 흡출 포트(18)을 포함한다. 흡출 입구(18)은 손으로 또는 자동으로 작동될 수 있는 흡인 장치(20)과 결합되도록 구성된다. 흡인 장치(20)은 시린지일 수 있거나, 다른 것들 중에서 전기 진공 흡인 장치일 수 있다. 흡인 장치(20)은 환자로부터 조직을 수거하는 용기(12) 및 캐뉼러(24)에 충분한 음압을 제공할 수 있어야 한다. 예시된 바와 같이, 흡인 장치(20)은 튜빙(22)을 경유하여 흡출 포트(18)에 결합된다.

조직 수거 시스템(10)은 조직 수집 용기(12) 및 혼합 용기(30) 사이에 배치된 세포 수집 용기(26)을 포함하는 것으로도 예시된다. 세포 수집 용기(26)은 시스템(10) 내에 배치되어 세포, 예를 들어, 줄기세포를 혼합 용기로 통과시키기 전에 조직 수집 용기(12)에서 세포 수집 용기(26)로 통과시킨다. 예시적인 실시태양에서, 세포 수집 용기(26)은 세포 수집 포트(48)을 경유하여 조직 수집 용기(12)와 결합된다. 시스템(10)의 일 실시태양에서, 세포 수집 용기(26)은 현탁액 중의 세포 분리를 용이하게 하는 세포 농축기(나타내지 않음)을 포함한다. 세포 농축기의 예는 예를 들어, 세포의 크기 또는 밀도에 기초하여 다른 물질로부터 세포를 분리시킬 수 있는 원심분리 장치이다. 또다른 예는 상기 논의된 바와 같은 스피닝 막 필터이다. 시스템(10)은 또한 세포 수집 용기(26)으로부터 혼합 용기(30)으로 세포를 통과시키고, 예를 들어, 세포보다 큰 물질의 통과를 막도록 구성된 필터(28)을 포함하는 것으로 예시된다. 세포 수집 용기(26)은 또한 폐기물 용기(36)으로의 출구를 포함한다. 세포 수집 용기(26)에 포함된 물질의 유동 방향은 물질이 폐기물 용기(36)으로 흘러가는지 또는 혼합 용기(30)으로 흘러가는지를 조절할 수 있는 하나 이상의 밸브의 배치에 의해 정해진다.

예시적인 실시태양에서, 세포 필터(28)은 200㎛미만의 직경 또는 길이를 갖는 다수의 세공을 포함한다. 일정 실시태양에서, 세공은 200㎛보다 작은 직경을 가질 수 있다. 또다른 실시태양에서는 세공은 20 내지 200㎛사이의 직경을 갖는다. 세포 필터(28)은 세포 수집 용기(26)으로부터 이격되어 있을 수 있거나 세포 수집 용기(26) 내에 포함될 수 있다. 세포 필터(28)은 또한 세포 수집 용기(26)에 일체적으로 형성될 수 있다. 시스템(10)의 추가 실시태양은 필터(28)을 포함하지 않는다. 세포 수집 용기는 임의의 적절한 물질로 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포 수집 용기(26)은 플라스틱 백, 예를 들어, 혈액 은행에서 혈액 처리에 통상적으로 사용되는 것들 일 수 있거나; 다른 실시태양에서, 구조적으로 딱딱할 수 있다. 특정 실시태양에서, 세포 수집 용기(26)은 구성성분 제조 챔버 및 세포 세척/분리 챔버를 포함할 수 있다.

일부 실시태양에서는 구성요소 제조 챔버는 상기 세포를 재현탁시키기 위한 완충제 또는 성장 인자와 같은 환자에게 투여하기 위한 줄기세포 분리 공정을 강화시키는 약물의 첨가를 위한 하나 이상의 포트를 포함한다. 상기 실시태양에서, 바람직하게는 구성요소 제조 챔버는 용기 중에서 세포 및 첨가제를 혼합 또는 교반시키는 혼합 장치를 포함한다. 구성요소 제조 챔버는 또한 그 내부에 수집되는 세포를 수거하기 위한 하나 이상의 포트를 포함한다. 어떤 입구는 혼합 용기(30)으로 세포를 통과시키도록 제공될 수 있다. 다른 입구는 세포 또는 세포의 일부를 뼈 단편을 포함하는 다른 표적, 예를 들어, 이식 물질로 또는 세포 배양 또는 정화 장치로 향하도록 제공될 수 있다. 일 실시태양에서, 세포 세척/분리 챔버는 원심분리기 이외에 세포 농축기로 사용될 수 있거나 또는 바람직하게는 원심분리기의 대용품으로서 사용될 수 있는 스피닝 막 필터 성분을 포함한다.

시스템(10)은 조직 수집 용기(12)로부터 혼합 용기(30)으로의 도관을 제공하도록 배치된 조직 복구 라인(34)를 포함하는 것으로 예시된다. 따라서, 조직 복구 라인(34)는 조직 수집 용기(12)에 포함된 조직을 조직 수집 용기(26)으로부터 수득한 세포와 조직을 혼합시킬 수 있는 혼합 용기(30)으로 통과시키거나 이동시키게 한다. 예시적인 실시태양에서, 조직 복구 라인(34)은 필터(16)에 포함된 지방조직을 수거하는 조직 용기(12)내로 연장된다. 조직은 하나 이상의 펌프 또는 흡인 장치를 사용하여 조직 복구 라인(34)를 통해 통과되거나 이동하게 되어 헹구어졌지만 반드시 분해된 것은 아닌 지방조직을 통과시킨다.

일 실시태양에서, 시스템(10)은 조직 수집 용기(12)에 포함된 물질의 온도를 조절하도록 시스템(10)에 대해 위치한 온도 조절 장치를 포함한다. 일부 실시태양에서, 온도 조절 장치는 가열기이고, 다른 실시태양에서, 온도 조절 장치는 냉각기이다. 또다른 실시태양에서는, 온도 조절 장치는 가열기과 냉각기 사이를 전환시킬 수 있다. 온도 조절 장치는 조직 수집 용기(12)에 포함된 지방조직의 온도를 조절하는 장치일 수 있거나, 조직 수집 용기(12)에 전달되는 액체의 온도를 변화시키도록 배치된 장치일 수 있다. 지방조직을 가열하는 것이 활성 세포 구성요소의 분리를 증가시키도록 조직의 분해를 용이하게 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 일부 실시태양에서는 세포를 보호하도록 조직의 일부, 바람직하게는 활성 세포 구성요소를 냉각시키는 것이 바람직하다. 세포의 온화한 냉각조차도 처리 중에 세포 생존을 증가시키는데 적절한 보호를 제공할 수 있다.

조직 수거 시스템(10)의 출구(32)는 혼합 용기(30)의 구성요소로 예시되어 있다. 추가 실시태양에서, 출구(32)는 혼합 용기(30)으로부터 이격되어 있다. 출구(32)는 조직 수거 시스템(10)의 밀봉된 배열을 유지하는 칸막이를 포함하고, 일부 실시태양은 출구(32)는 액체 불투과성 막(예를 들어, 액체 및 공기를 불투과시키는 막)을 포함한다. 출구(32)는 적절한 조건하에서 혼합 용기(30)의 조성물을 환자에게 전달하도록 구성되어야 한다. 예를 들어, 시린지가 조성물을 빨아들이도록 사용된다면, 출구(32)는 시스템 또는 조성물의 무균성을 손상시키지 않고 시린지의 바늘을 수용할 수 있어야 한다. 또다른 실시태양에서, 출구가 조성물을 투여하지만 조성물을 빨아들이지는 않도록 형성된 장치, 예를 들어, 조성물이 캐뉼러를 통해 치환되도록 양압을 적용하여 조성물을 투여하는 캐뉼러와 결합된다면, 출구(32)는 혼합 용기(30)에 포함된 조성물이 캐뉼러로 통과되는 것을 가능하게 하도록 배치되어야 한다. 다른 실시태양에서, 출구(32)는 양압을 적용함으로서 조성물을 투여하는 캐뉼러 또는 시린지의 바늘과 같은 조성물을 투여하는 장치를 포함할 수 있거나 밀폐 시스템 방식으로 결합될 수 있다.

조직 수거 시스템(10)은 또한 조직 수집 용기(12)로부터 폐기물을 수집하도록 배치된 폐기물 용기(36)을 포함하는 것으로 예시된다. 예시적인 실시태양에서, 폐기물 용기(36)은 또한 세포 수집 용기(26)으로부터 폐기물을 수집하도록 결합되고 배치된다. 세척 용기(38)은 세척액, 예를 들어, 염수 또는 임의의 다른 적절한 완충액을 세척 포트(46)을 경유하여 조직 수집 용기(12)로 전달하는 세척 라인(29)와 용액 소통하도록 제공된다. 조직 수집 용기(12)는 또한 조직 수집 용기(12) 내에 압력의 양을 조절하기 위한 공기 입구(40)을 포함한다. 첨가 라인(42)는 조직 수집 용기(12)상에 제공되고, 첨가제가 조직 수집 용기(12)로 첨가되는 것을 가능하게 한다. 본원에 개시된 방법을 참고하여, 첨가 라인(42)은 하나 이상의 효소를 조직 수집 용기(12)로 전달하도록 하여 필터(16)에 포함되는 지방 조직의 잔여물로부터 활성 세포 성분의 분리를 용이하게 하도록 제공된다. 예시된 바와 같이, 첨가 라인(42)은 효소를 적절한 용기로부터 수집하도록 사용될 수 있는 바늘 (44)을 포함한다.

조직 수거 시스템(10)의 구성요소의 특정 실시태양이 도 2 및 도 3에 예시되어 있고, 유사 번호가 유사 부분을 나타낸다. 도 2 및 도 3의 특정 실시태양에서, 조직 수집 용기(12)는 흡입이 용기에 적용되는 경우 그 형태를 보유하는 보디를 포함한다. 더 구체적으로는, 조직 수집 용기(12)는 강체(rigid body), 예를 들어, 275㎛의 메쉬 크기를 갖는 임상 등급 폴리에스테르의 개략적으로 원뿔형 필터를 포함하는 임상 등급 폴리카르보네이트로 구성되는 본체를 포함한다. 딱딱한 조직 수집 용기는 대략 8 인치 높이 및 대략 5 인치 직경의 크기를 가질 수 있고; 벽 두께는 약 0.125인치일 수 있다. 실린더의 내부는 흡입 튜빙을 위한 2개의 포트, 무균 도킹 기술을 통해 연결을 위한 튜빙을 갖는 2개의 포트, 고무 격벽을 통해 바늘 구멍 접근을 위한 2개의 포트를 통해 접근된다. 상이한 물질, 메쉬 크기 및 포트의 수 및 종류를 이용하여 동일한 성능이 얻어질 수 있다. 예를 들어, 100 ㎛보다 작거나 수천 마이크론 크기의 메쉬 세공 크기는 염수 및 혈액 세포의 통과를 가능하게 하면서도 지방 조직 집합 및 단편을 보유하는 동일한 목적을 달성한다. 유사하게, 장치 목적은 별법의 딱딱한 플라스틱 물질의 사용에 의해, 일회용 캐뉼러를 비-일회용, 다중-사용 무균 캐뉼러로 교환함에 의해 또는 당업자에게 공지된 다수의 다른 변형에 의해서도 달성될 수 있다. 그러나, 조직 수거 시스템(10)의 다른 실시태양에서는, 조직 수집 용기(12)는 접을 수 있는 바디, 예를 들어, 조직 수집 백을 포함할 수 있다. 이러한 시스템에서 백은 백에 흡입 적용시 백으로 접혀질 가능성을 수거하는 것을 돕는 지지체, 예를 들어, 내부 또는 외부 프레임을 제공하는 것이 바람직하다.

조직 수거 시스템(10) 안의 오염을 감소시키기 위해서 하나 이상의 클램프(23)이, 상기 시스템의 다수의 구성요소에 상기 라인을 통해 재료의 흐름을 조절하는 다수의 라인 또는 도관 상에 제공된다. 클램프(23)은 사용자가 조직 수거 시스템(10)의 다양한 영역을 효과적으로 밀봉하도록 한다. 바람직한 실시태양에서, 시스템(10)의 하나 이상의 구성요소는 일회용이다. 본 실시태양에서 상기 구성요소들을 재사용하는 것을 방지하는 것은 다양한 구성요소의 반복사용과 관련될 수 있는 오염을 감소시키는데 도움이 된다. 또한, 일회용 세트로 구성요소들을 제공하는 것은, 단번에 모든 구성요소들을 살균할 수 있어 여기에 개시된 방법의 실시에 요구되는 시간을 실질적으로 감소시키는 장점을 제공한다, 완전 또는 부분 자동화 실시태양에서, 컴퓨터-조절 밸브는 클램프(23)의 대체물로서 또는 부가하여 장착될 수 있다.

또한, 조직 수거 시스템(10)은 부가적인 장치 또는 구성요소를 포함할 수 있는데, 이는 다른 것 중에서 필터(16)에 보유된 재료 부피의 측정을 가능하게 하거나, 추출 또는 처리 단계에 관한 문자화된 정보의 기록을 가능하게 하거나, 작동 중에 스탠드 또는 베딩(bedding)에 장치를 부착하는 것과 같은 기타 보조 기능을 수행한다.

상기 조직 수거 시스템(10)의 구성요소들은 생체 유체 또는 조직과 비반응성이어야 하고, 생체 유체 또는 조직을 처리하는데 사용되는 약제와 비반응성이어야 한다. 또한, 다양한 구성요소들이 제조되는 재료는 오토클레이빙이나 조사 (이에 한정되지는 않으나 베타- 또는 감마-조사를 포함함)와 같은 살균과정에 잘 견딜 수 있어야 한다. 튜빙과 캐뉼러 핸들은 폴리에틸렌과 같은 임의의 적당한 재료로 제조될 수 있다. 상기 캐뉼러는 스테인레스 스틸을 포함한 임의의 적당한 재질로 제조될 수 있다.

여기에 개시된 본 발명에 따라서, 상기 조직 수거 시스템(10)은 지방 조직 안에 발견된 줄기세포의 수거, 처리 및 관리에 편리한 밀폐 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 지방 조직의 수거를 위해 환자 근처에 둘 수도 있고, 상기 조직은 상기 시스템으로부터 수거될 조직을 요구하지 않고 처리 될 수 있다. 따라서, 제공된 시스템은 신선한 줄기세포가 개선된 조성물을 환자에게 제공할 수 있으며 줄기세포의 배양 및(또는) 보존에 관련된 가능한 위험을 감소시킬 수 있다.

여기의 개시를 참조하여, 환자에서 조직을 추출하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (i) 환자를 종래의 지방분해흡입술에 대해 준비시키는 단계; (ii) 캐뉼러와 조직 수거 시스템을 패키징 재료로부터 살균 필드로 수거하는 단계; (iii) 지방흡인 펌프 (통상적인 트랩과 인-라인 미생물 필터를 가짐)를 조직 수집 용기로부터 통해진 호스 어댑터에 연결시키는 단계; (iv) 상기 조직 수집 용기의 흡인구 상에 튜빙 스크류 클램프가 결합되지 않음을 확인하는 단계; (v) 원하지 않는 지방 조직을 수거하기 위해 일정한 지방흡인 캐뉼러로 캐뉼러를 사용하는 단계; (vi) 원하는 양의 지방 조직이 조직 수집 용기에 수집된 후에 조직 수집 용기를 밀봉하기 위해 두개의 튜빙 스크류 클램프를 수동으로 적용하는 단계; (vii) 조직 수집 용기가 바르게 환자 식별 레이블로 표지되었는지 확인하고 기관 업무에 따라 레이블 (단계의 날짜 및 시간 등)상에 다른 정보를 기록하는 단계; 및 (viii) 지방조직을 환자로부터 추출하는 단계.

상기 도시된 조직 수거 시스템(10)를 참조하여, 튜빙(22)를 인-라인 유체 트랩을 가진 흡인 소스(20)에 부착하고 캐뉼러(24)를 채취 장소(harvest site) 안으로 삽입함에 의해 조직은 처리 구성요소 안으로 직접 수집된다. 그리고 나서 지방 조직은 조직 수집 용기(12)안으로 흡출(aspirate)되며, 조직 수집 용기(12)안에 수용된 필터(16)에 의해 유지된다. 조직 수집에 이어서, 수집된 지방 조직은 세척 라인(39)를 통해 조직 수집 용기(12)에 부가된 세척 용기(38)에 포함된 살균 식염수로 씻겨 진다. 조직 수집 용기(12)가 도시된 실시태양에서 흡인 하에서 수집을 견디는 강성 재료로 제조될 때, 염수가 추가되는 동안 하우징으로부터 치환된 공기는 공기-입구(40)을 통해 배출될 수 있다. 다르게는, 상기 공기는 폐용기(36) 또는 유사한 유지 장소 안으로 치환되어질 수 있다. 일단 상기 조직이 씻겨지면, 폐물질은 폐용기(36) 안으로 흐르게 할 수 있다.

조직이 수집된 후, 바늘(44)가 콜라게나제가 포함된 효소 용액의 살균 바이알 안으로 삽입될 수 있으며, 그리고 나서 상기 용액은 조직 수집 용기(12) 안으로 통과되고 여기서 37 ℃에서 또는 근방에서 15 내지 60분 동안 상기 지방 조직과 혼합된다. 세척 단계는 필요한 만큼 반복될 수 있으며, 분해된 조직은 세척 후 수율을 최대화하기 위해 활성 세포 집단이 용출된다. 조직 분해의 끝에서 상기 조직 수집 용기(12)는 피하 지방 세포를 부상(flotation)하게 하기 위해 수직으로 놓여진다. 그 때 상기 활성 세포 집단은 세포 수집 용기(26) 안으로 흘러들어가게 하고, 여기서 상기 세포는 콜라게나제와 잔여 유리지방과 분리된다. 세포는 당업자에게 알려진 임의의 방법 (예를 들면 순차 원심분리/재-현탁 세척 또는 연속 흐름 기구등을 포함하나, 이에 한정되지는 않음)에 의해 세척 및(또는) 농축될 수 있다. 그리고 나서 상기 농축되고 세척된 세포는 혼합 용기(30) 안으로 흘러들어가게 하는데, 거기서 환자에의 투여를 위한 출구(32)를 통해 수거되기 전에 조직 회복 라인(34)로부터의 미손상 조직 및(또는) 임의의 의도된 첨가제와 혼합될 수 있다. 세포 수집 용기(26) 안에 포함된 물질은 세포 필터(28)을 사용하여 여과되고, 이어서 적용시 색전증(embolism)에 이르게 할 수 있는 원하지 않는 잔여 세포와 조직을 세척할 수 있다.

가공하는 동안에, 다양한 용기에 결과를 향상시키기 위해 하나 이상의 첨가제가 필요한 만큼 첨가될 수 있다. 첨가제의 몇가지 예로서는 세척과 분해를 최적화하는 약제, 처리 동안에 활성 세포 집단의 생존능력을 향상시키는 첨가제, 항생제와 같은 항균제, 피하지방세포 및(또는) 적혈 세포를 용해시키는 첨가제, 흥미 있는 세포 집단을 풍부하게 하는 첨가제 (고체상에 차별적 부착 또는 세포집단의 풍부함 또는 실질적인 감소를 촉진함)를 들 수 있다.

상기 실시태양에서, 상기 조직 수집 용기(12)는 조직 수거 시스템(10)의 처리 구성요소에 내재한 것이다. 다르게는, 그 내용이 명백히 여기에 참조로 포함된 공유 미국특허출원 10/242,094호 [제목: PRESERVATION OF NON EMBRYONIC 세포 FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES, 2002. 9. 12 출원, 우선권주장: 미국임시특허출원 60/322,070 2001. 9. 14]에 개시된 바와 같은 분리된 조직 수집 용기가, 처리 구성요소에 상기 분해된 물질을 계속해서 운반하면서 전체적으로 또는 부분적으로 사용될 수 있다. 부가적인 가능한 조직 수집 용기는 미국특허 6,316,247호와 미국특허 5,372,945호에 개시되어 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 일부 실시태양에서는 상기 방법은 상기 방법의 단계들을 자동적으로 수행할 수 있는 하나 이상의 부가장치를 제공함으로써 자동화될 수 있다. 그러한 실시태양에서, 가공 장치 (예를 들어 마이크로프로세서 또는 퍼스널 컴퓨터)는 상기 기술한 바와 같이 단계를 부분적으로 또는 완전히 자동화하는 장치이다. 그러한 자동화할 수 있는 단계의 예로서는, 이에 한정되지는 않지만, 상기 시스템 또는 가공 장치의 펌프 또는 밸브를 제어함으로써, 특정한 튜빙 경로에 따른 유체와 조직의 유입과 유출의 제어; 압력 센서로 방해물의 탐지; 혼합 기구, 부피 측정 메커니즘을 사용하여 특정 경로를 따라 이동하는 조직 및(또는) 유체의 양의 측정; 열제어 장치를 사용하여 다수의 구성요소의 온도 유지; 세포의 세척과 농축, 및 타이밍과 소프트웨어 메커니즘으로 공정통합을 포함한다. 한 실시태양에서 소프트웨어는 공정의 파라미터를 제어하여 특정한 오퍼레이터-정의된 파라미터로 합성된 세포 집단을 생산하게 한다. 따라서, 상기 자동화 장치(들)은 단계의 성능을 향상시키고, 지방 조직의 자동화된 수집과 환자에의 투여를 위한 지방 조직의 자동화된 처리를 제공한다.

구체적인 자동화 장치가 도 4에 도시되어 있다. 조직 수거 용기(도시하지 않음)가 장치(100)안으로 제대로 정렬되도록 색표지된 가이드 마크(112-118)을 사용하여 놓여지고, 적절한 경로로 튜빙을 삽입하였다. 장치(100)은 다수의 밸브(105, 110)와 다수의 펌프(104, 109)을 포함한다. 사용자가 정의한 프로그램에 따라 유체와 조직의 흐름을 조절하는 집적 마이크로프로세서 시스템에 의해 제어되는 일련의 밸브(105, 110)과 펌프(104, 109) 안에 튜빙이 놓여진다. 프로그램 선택은 사용자 인터페이스 패널(106)을 통해 전달된다. 염수 용기는 홀딩 구조체(101) 상으로 놓여지고 조직 수집 용기에 부착된다. 콜라게나제 또는 다른 조직 분해 매질 또는 혼합물(도시하지 않음)의 바이알 또는 튜브가 조직 수집 용기 안으로 점(103)에서 삽입된다. 폐백(waste bag)이 홀딩 구조체(111) 안으로 삽입되고, 세포 분리 챔버/세포 수집 용기는 홀딩 구조체(107) 안으로 놓여지며 조직/세포 혼합 용기는 홀딩 구조체(108) 안으로 놓여진다. 상기 조직 수집 용기는 교반/인큐베이션 챔버(102) 안으로 놓여진다.

상기 용기가 상기 장치 안에 배치되기 전에 또는 상기 장치 안에 자리를 잡은 동안에, 지방 조직은 조직 수집 용기 안으로 수집될 수 있다. 상기 장치는 임의의 투명한 삽입물(119) 또는 조직 수집 용기 안에 조직의 부피를 측정하게 하는 기타 장치를 포함할 수 있다. 다르게는, 부피는 교반/인큐베이션 챔버(102) (조직 수집 용기(12)에 대응됨)에 포함된 물질의 중량을 측정하여 결정될 수 있다. 이 부피는 사용자 인터페이스 스크린(106) 상에 표시될 수 있다.

그리고 나서, 마이크로프로세서는 라인(114, 115) 상의 밸브(105)를 열고, 수집 챔버(102) 안으로 염수를 도입하고 폐백(111)에 폐물질(115)를 수거하기 위해기 위해 라인(114) 상의 펌프(104)를 작동시킨다. 본 공정에서, 수집 챔버는 진동에 의해서 흔들리며 상기 챔버(102)안에 통합된 가열 장치에 의해 프로그램된 온도로 유지된다. 어떤 실시태양에서는 조직 처리가 미리 덥혀진 염수를 사용할 수 있는데, 이 경우, 교반/인큐베이션 챔버의 가열장치의 역할은 온도를 증가시키는 것보다 정해진 미리 프로그램된 온도로 보유하는 것이다.

일단 상기 조직이 0 % 내지 100 % 중 임의의 미손상된 비율로 세척되면, 세척된 지방 조직은 라인(116) 상의 밸브(110)과 펌프(109)의 작동에 의해 인큐베이션 챔버(102)로부터 수거될 수 있다. 이 시점에서 회수된 물질은 혼합 챔버(108)에 보관된다. 분해 매질(103)은 라인(113) 상의 밸브(105)를 열고 다른 밸브를 닫고 라인(113) 상의 펌프(104)를 작동시킴으로써 챔버(102)에 남아 있는 물질에 첨가된다. 분해 매질의 첨가 후에 상기 챔버(102)를 교반하고 상기한 바와 같은 온도에서 유지된다. 프로그램된 인큐베이션 기간의 끝에서, 교반은 정지되어 피하지방세포가 부상하게 한다. 부가적인 염수가 이 공정을 촉진하기 위해 첨가될 수 있다. 피하지방세포의 부상 후에, 라인(112, 115) 상의 밸브들이, 챔버(102)에서 세포 세척 챔버(107) 안으로 목적 세포 집단을 수거하게 하기 위해 열린다. 세척된 세포는 혼합 챔버(108) 안으로 라인(117)을 통해 수거된다. 표면에 부상하는 세척 용액은 라인(118)을 통해 폐챔버(111)로 수거된다. 부가적인 염수는 라인(114)를 통해 세척 공정을 완료하기 위해 시스템 안으로 통과되어진다. 세포는 챔버(108)에서 처리시 미리 라인(116)을 통해 수거된 임의의 미손상 조직과 혼합된다. 혼합은 당 업계에서 알려진 임의의 수단에 의해 달성될 수 있는데, 그 수단으로는, 이에 한정되지는 않지만, 챔버의 교반/역립(inversion) 또는 간헐적인 압축 또는 움직이는 롤러 등을 포함한다. 그리고 나서 혼합된 물질은 일회용 세트의 혼합 챔버의 출구를 통해 수거된다.

상기 장치는 미리 프로그램된 파라미터(106)에 따른 공정을 자동화하기 위한 마이크로프로세서-제어 메커니즘을 포함한다. 본 시스템은 또한 방해물의 탐지를 위한 압력센서의 사용과 유사한 안전 및 품질 제어 메커니즘을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 시스템의 소프트웨어 구성요소는, 예를 들어 다수의 일회용 구성요소, 온도, 부피 측정, 조직 부피, 세포 수 파라미터, 가해진 효소 투여량, 인큐베이션 시간, 오퍼레이터 동일성, 날짜와 시간 등을 포함하는 "데이터 처리"의 자동화된 수집을 포함한다. 상기 장치의 바람직한 실시태양에서, 바코드 판독 시스템이 처리의 문서화의 일부로서 이들 변수 (예를 들어 일회용 세트 제조번호, 유효기간, 콜라게나제의 제조번호 및 유효기간, 환자/샘플 식별표 등)의 데이터를 장치 제어기 안에 기록하도록 통합된다. 이는 데이터 기재 오류의 확률을 감소시킨다. 이 장치는 USB 또는 당 업계에서 알려진 다른 인터페이스 포트와 시스템을 사용하여 제어기 시스템으로 쉽게 일체화될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 장치는 데이터 기재와 공정의 문서화의 통합 제어를 제공한다. 이들 파라미터의 출력된 보고서는 상기 장치의 프로그램된 작동의 사용자-정의된 파라미터의 부분이다. 자연스럽게 이는 프린터 요소 (하드웨어와 드라이버) 또는 소프트웨어용 프린터 드라이버와 프린터용 인터페이스 출력 커넥터 (USB 포트 등)을 상기 장치의 하드웨어에 통합시키도록 요구한다.

추가의 실시태양에서는 제어기에 통합된 소프트웨어가 장치 안에 튜빙과 다른 구성요소를 적절히 삽입하는데 필요한 단계동안 사용자를 촉진한다. 소프트웨어는 또한 튜빙의 정확한 삽입, 방해물의 부존재 등을 확인하기 위한 자동화 시험을 개시한다.

본 장치에서 가공에의 일반적인 접근방법은 본 개시에서 수동 세포 처리에서 기술된 것과 동일한 파라미터를 사용한다.

세포 가공을 위해 사용된 다단계 메커니즘의 다른 많은 형태는 당업자에게 자명하고 본 기재는 단지 하나의 예로서 포함되는 것이다. 예를 들어, 세척 및 분해 과정 동안의 조직과 염수의 혼합은 현재 실시예에서와 같이 교반에 의해, 또는 유체 재순환에 의해 일어날 수 있다. 세포 세척은 회전 멤브래인 접근법, 순차 부착, 순차 원심분리 (순차 침강, 속도 또는 변화도 분리 등에 한정되지는 않지만, 이들을 포함) 같은 연속 유체 메커니즘에 의해 또는 이들 수단의 조합에 의해 중개된다. 유사하게, 세포의 추가적인 조작을 하게 하는 부가 구성요소는 성장 인자 또는 다른 생물 반응 변성제의 첨가 (문헌[Lind, 1998; Hanada et al., 1997; Lieberman et al., 1998]), 다른 구조 구성요소와 세포의 혼합 또는 수여자 안에 세포 이식을 위한 합성 구성요소 (문헌[Fukuda, 2001; Sodian et al., 2002; Ye et al., 2000])를 포함한다.

후-가공 조작도 또한 세포 배양 (문헌 [Caplan and Bruder, 2001; De Ugarte et al., 2003; Zuk et al., 2001]), 유전자 전이 (문헌 [Luskey et al., 1990; Morizono et al., 2003]), 또는 추가적인 세포 정제 (문헌 [Greenberg and Hammer, 2001; Mainwaring and Rowley, 1985; Schweitzer et al., 1995])를 또한 포함할 수 있다. 그러한 기능의 수행에 대한 메커니즘은 도 4에 도시된 장치 내에 통합될 수 있고, 별도의 장치로 결합될 수도 있다.

본 발명의 추가적인 실시태양에서, 종래의 지방 조직 트랩 안에 수집된 조직은 다른 조직들을 가공하기 위해 고안된 가공 세트로 이동될 수 있었다. 예를 들어, 박스터 사 (Baxter Inc.)는 골수기질 이식 채취 (bone marrow transplant harvest)의 세팅에 사용되기 위해 의도된 일련의 플라스틱 백과 필터를 제조 및 판매한다 (문헌 ["Bone Marrow Collection Kit with Flexible Pre-Filters and Inline Filters", Product Code, 4R2107, U. S. Pat. Nos. 4,346,703 and 5,724,988] 참조). 이 백 세트는 수집된 지방 조직을 세척하기 위해 사용될 수 있는 통합된 800 ㎛ 필터를 가진 큰 원추형의 백을 포함한다. 본 실시예에서, 800 ㎛보다 큰 지방 조직 조각들은 백 속에 남게 된다. 그리고 나서 이 조각들은 염수 (또는 다른 세척 용액)을 반복적으로 가해 세척할 수 있으며, 이어서 필터 아래의 포트를 통해 폐물질은 수거된다. 혼합은 수동으로 또는 벤치탑 록킹 (benchtop rocking) 장치를 사용하여 행해질 수 있으며, 가열 패드를 사용하여 가열되었다. 분해는 이 백의 관강 (lumen) 안에서 일어날 수 있다. 분해 후에 세포는 통합된 800 ㎛ 필터를 통해 (그리고 임의적으로 키트에 의해 제공된 하나 이상의 더 작은 메쉬 크기를 갖는 필터를 통해) 통과되었고, 수집 백 (또한 제공됨) 안에 수집되었다. 그리고 나서 이 백은 원심분리기 (예를 들어 Sorval RC-3C) 안에 놓여질 수 있었고, 거기서 세포는 순차적으로 세척되고 농축될 수 있었다. 세포는 또한 박스터 사 (Cytomate 또는 Baxter CS3000)나 코브 사 (Cobe Inc.) (Cobe Spectra)에 의해 판매되는 존재하는 세포 세척 장치 (대부분 인간 혈액 제품을 세척하기 위해 개발된)를 사용하여 세척할 수도 있다. 상기 일회용 구성 요소는 제조사에 의해 제공되는 부속품을 사용하여 통합될 수 있거나 또는 테루모 사 (Terumo Inc.)에 의해 제작된 것과 같은 살균 연결 장치 (sterile connecting device)를 사용하여 연결될 수 있다. 유사하게 덜 통합적인 이 접근방법에서 기술된 메커니즘은 중앙 제어기에 연결될 수 있으며 더 통합적인 장치의 구성요소로서 조립될 수 있다. 튜브 연동식 펌프 (peristaltic pump) 또는 펌프의 배터리는 유체 경로를 열고 닫기 위해서 수동의 또는 자동화된 클램핑을 사용하여 유체 흐름을 자동화하는데에 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 조직 수거 시스템과 처리 세트는 수술실 또는 외래 환자 수속실 (효과적으로는 환자의 침대 쪽에서)과 같은 치료를 받는 환자의 주변에 존재한다. 이는 신속하고 효과적인 조직 채취와 처리를 가능하게 하며, 샘플 핸들링/레이블링 상의 오류를 방지하며, 이에 따라 전체 단계의 수행을 단일 수술 절차 진행으로 가능하게 한다.

다음 실시예들은 본 기술이 적용될 수 있는 구체적인 상태와 세팅들을 예시하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위와 본 발명에 포함된 청구범위를 제한하기 위해 의도된 것들은 아니다.

2. 가공된 리포애스퍼레이트(ADC)를 사용한 심혈관 질환 및 장애의 치료 방법

이전의 개시에서 보였듯이, 특히 바람직한 실시태양에 있어, 본 발명의 ADC는 심혈관 질환 및 장애의 치료에 사용될 수 있다. 본원 발명의 방법을 실시하여 수득된 지방조직-유래 줄기 및 선조세포는 손상을 줄이고 (줄이거나) 최소화하고, 손상에 뒤따르는 심근 또는 심혈관 복구 및 재생을 촉진할 수 있는 여러 가지 성질을 가진다. 이들은, 다른 것들과 더불어, 새로운 혈관 형성을 자극하는 성장 인자의 합성 및 분비 능력, 세포 생존 및 증식을 자극하는 성장 인자의 합성 및 분비 능력, 새로운 혈관 형성에 직접 참여하는 세포의 증식 및 이로의 분화 능력, 손상된 심근의 접목 및 반흔 형성(콜라겐 침착 및 가교)의 억제 능력, 심근 신축성에 기여할 수 있는 근육 세포의 증식 및 이로의 분화 능력 및, 심근 세포의 증식 및 이로의 분화 능력을 포함한다.

본 발명의 지방 유래 성체 줄기세포를 사용한, 손상을 줄이고 (줄이거나) 최소화하고, 손상에 뒤따르는 심근 또는 심혈관 복구 및 재생을 촉진하는 다음의 수단은 이전의 개시에 대한 하기 실시예 부분에서 자세히 기술된다. 특히, 본원 발명은 처음으로, 본 발명의 지방 유래 줄기세포(또는 ADC)가 플래센타 성장 인자(PIGF, Placenta Growth Factor) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor)를 포함하는 수많은 혈관신생 성장 인자를 발현하고, 혈관 형성에 있어 잘 확립된 기능을 가지는 내피 선조세포(EPC, endothelial progenitor cells)를 포함하고, 심장 손상 뒤에 동물에 주사되었을 경우 심장으로 돌아오는, 후부 사지의 폐색/재관류 손상에 따르는 재관류를 유도하며, 심장 손상 뒤에 동물에 주사되었을 경우 심근세포로의 분화와 일치하는 표지를 발현하는 세포로 분화시킨다는 것을 설명한다.

따라서, 본원 발명의 한 측면에 있어, 지방조직-유래 세포는 공여자의 지방조직으로부터 추출되고, 본원에서 설명되는 하나 이상의 작용기전을 통해 손상 또는 퇴화된 심근 또는 다른 심혈관조직에 치료적인 이로움을 유도하는 데 사용된다. 바람직한 실시태양에 있어, 세포는 사람에게 이식된 뒤 그의 지방조직으로부터 추출되고, 이로 인해 이식물에 항원성 및(또는) 면역성 반응을 수반하는 잠재적 합병증을 감소시킨다. 환자들은 일반적으로 심근 손상 및 질환을 평가하기 위해 내과의사 또는 다른 임상 제공자에 의해 수행되는, 환자의 건강 병력, 신체 검사 및 EKG, 혈청 심장 효소 프로파일 및 심초음파 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 객관적인 정보 중 하나 이상의 절차들에 의해 평가된다.

일실시태양에 있어서, 심근 경색 치료와 연결된 혈액 응고 감소를 위해 설계된 임의의 제품을 환자가 받아들이기 이전에 채취 절차가 수행된다. 그러나, 어떤 실시태양에서는, 환자가 채취 절차 이전에 아스피린을 받아들였을 수도 있다. 또한, 바람직한 한 방법은 임의의 재혈관화 절차의 시도 이전에 지방조직을 수집하는 것을 포함한다. 그러나, 당업자가 이해하는 것처럼, 수집의 시점이 다양할 것으로 기대되고, 다른 것들과 더불어, 환자의 안정성, 환자의 응고 프로파일, 제공자의 유용성 및 품질 관리 표준을 포함하는 여러 가지 인자에 의존할 것이다. 결국, 수집의 시점은 영향을 받는 환자로의 투여 관리에 책임 있는 의사에 의해 결정될 것이다.

환자로부터 수집된 지방조직의 부피는 약 0cc 내지 약 2000cc로 다양할 수 있으며 몇몇 실시태양에서는 최대 약 3000cc일 수 있다. 제거되는 지방의 부피는 환자에 따라 다양하며, 연령, 체형, 응고 프로파일, 혈류역동학적 안정성, 경색의 격렬 정도, 동반이환률 및 신체적 우선성을 포함하나 이에 한정되지 않는 몇 가지 인자에 의존할 것이다.

세포는 심근 기능이 절충되는 임의의 세팅으로 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 세팅의 예로는, 다른 것들과 더불어, 급성 심근경색(심장마비), 울혈성 심부전증(치료요법으로서 또는 이식물에의의 다리로서) 및, 관상 동맥 우회로 이식 수술의 보충물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 세포는 사전에 추출되어 저온보존 방식으로 저장되거나, 정해진 필요 시간이나 그 근처의 시간에 추출될 수도 있다. 본원에서 개시되듯이, 상기 세포는 더 이상의 가공 또는, 더 이상의 정제, 변형, 자극 또는 다른 세포 변화를 위한 추가적 절차 없이 환자에게 투여되거나, 손상된 조직 또는 손상된 조직의 부근에 직접 적용될 수 있다. 예를 들면, 환자로부터 수득된 세포는 환자 투여 전 세포배양 없이, 필요한 환자에게 투여될 수 있다. 일실시태양에 있어, 지방조직의 수집은 환자의 침대 옆에서 수행될 것이다. 혈류역동학적 관찰이 환자의 임상 상태를 관찰하는 데 사용될 수도 있다.

본원에 개시된 발명에 의해, 환자로부터 지방조직을 채취한 직후에, 지방-유래 세포가 전달될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포는 지방조직의 가공 직후에 투여되어 지방-유래 줄기세포의 조성물을 획득할 수 있다. 일실시태양에 있어, 바람직한 전달 시점은 심장 손상 후에 존재하는 신경호르몬적 환경을 이용할 수 있도록 경색 후 수 시간 내지 수일의 순서로 일어나야 한다. 결국, 전달 시점은 환자의 유용성 및 지방조직을 가공하는 데 필요한 가공 시간에 의존할 것이다. 다른 실시태양에 있어, 본원에서 논의되는 대로, 환자로 재주입되는 세포가 추가적인 변형, 정제, 자극 또는 다른 조작을 필요로 하는 경우, 전달 시점은 비교적 더 길 수도 있다. 또한, 지방-유래 세포는 경색 후 여러 차례로 투여될 수도 있다. 예를 들면, 상기 세포는 연장된 일정 시간에 걸쳐(예를 들면, 수 시간) 연속적으로 투여되거나, 연장된 일정 시간에 걸쳐 다중 덩어리(bolus) 주입으로 투여될 수도 있다. 어떤 실시태양에서는, 세포의 초기 투여가 경색 후 약 12시간 내, 예를 들어 약 6시간 내에 투여될 것이며, 하나 이상의 세포 투여량이 12시간 간격으로 투여될 것이다.

환자에게 투여되는 세포수는, 예를 들면, 지방조직 가공 후의 세포 수율과 관련될 수 있다. 세포 총 수의 일부는 이후의 사용 또는 저온보존을 위해 보관될 수 있다. 또한, 전달되는 투여량은 환자로의 세포의 전달 경로에 의존할 것이다. 심외막 및 심내막 전달 시스템이 사용되는 경우 더 적은 세포가 필요할 수도 있는데, 이는 이러한 시스템 및 방법이 심혈관 증상을 치료하는 데 가장 직접적인 경로를 제공할 수 있기 때문이다. 본 발명의 일실시태양에 있어, 환자에게 전달되는 세포(예를 들면 미정제 세포) 수는 약 5.5x10⁴ 개인 것으로 예상된다. 그러나, 이 수치는 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 크기 순서로 조절될 수 있다.

상기 세포는 의도된 치료 효과를 강화, 조절 또는 다른 식으로 유도하는 첨가제와 함께 적용될 수도 있다. 예를 들면, 일실시태양에 있어, 그리고 본원에서 기술되었듯이, 상기 세포는 세포 개체수를 보강하기 위한 항체-매개 양성 및(또는) 음성 세포 선택의 사용에 의해 더 정제되어 효능을 향상하고 이환률을 낮추며, 또는 절차의 용이성을 촉진할 수 있다. 비슷하게, 세포는 이식된 세포의 운명을 지지 및(또는) 유도함으로써 생체 내 조직 처리를 촉진하는 생체 적합성 매트릭스과 함께 적용될 수 있다. 같은 방법으로, 세포는 유전자 조작에 이어 투여될 수 있는데, 이로써 세포들은 그 세포들에 의해 제공되는 치료적 신호를 촉진하는 것으로 여겨지거나 의도되는 유전자 생성물들을 발현하게 된다. 조작의 예로는 혈관신생 또는 혈관형성을 촉진하는 인자의 발현(예를 들면 VEGF), 특정 세포 계통으로의 분화를 촉진하는 발생 유전자의 발현(예를 들면 MyoD), 또는 세포 성장 및 증식을 자극(예를 들면 bFGF-1)하는 발현을 조절(증가 또는 감소)하는 조작을 포함한다.

상기 세포는 또한, 이식되기 이전에 스캐폴드 물질 위로의 세포 배양을 필요로 할 수도 있다. 그러므로, 수용자 내부로 삽입 또는 이식하기 전, ADC를 이용하여 조직이 처리되는 밸브, 심실 패치, 심막, 혈관 및 다른 구조들이 천연 또는 합성 매트릭스 또는 스캐폴드 위에서 합성될 수 있다(문헌 [Eschenhagen et al., 2002; Zimmermann et al., 2004; Zimmermann et al., 2002; Nerem and Ensley, 2004]). 실제로, 심장 근세포의 표지를 발현하는 지방 유래 줄기 및 선조세포의 세포 내로의 시험관 내 분화가 설명되어 있다(문헌 [Gaustad et al., 2004; Rangappa et al., 2003]).

3. 심혈관 질환 및 장애의 치료를 위한 ADC의 투여 경로

일실시태양에 있어, 의도적인, 이로움이 있는 위치로의 세포의 직접 투여가 바람직하다. 이것은 심장 외부 표면(심외막)으로의 직접 주사, 적당한 캐뉼라의 삽입에 의한, 내부 표면(심내막)을 통한 심근으로의 직접 주사, 동맥 또는 정맥 주입액(퇴행성 유동 기전을 포함), 또는 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 다른 수단들에 의해 달성될 수 있다. 당업자에게 공지된 투여 경로는 정맥내, 관상동맥내, 심내막심근, 심외막심근, 심실내, 후동 또는 정맥내를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

위에서 언급했듯이, 세포는 정맥 또는 동맥 주입에 의한 전신 투여(퇴행성 유동 주입을 포함) 또는 심장으로의 직접 주사를 포함하는 여러 경로를 통해 적용될 수 있다. 특히 말초 정맥 접근법에 의한, 전신 투여는 심장의 자연 관류 및, 손상된 목적 위치에 대한 지방조직-유래 세포의 능력에 의존하여 최소로 침투한다는 장점이 있다. 세포는 단일 덩어리 형태로, 느린 주입을 통해, 또는 여러 시간으로 분리된 적용의 파상 시리즈를 통해 주사될 수 있으며, 또는 제공된 세포들은 여러 날 또는 여러 주 동안 적절히 보관되기도 한다. 세포는 또한 도관법을 사용하여 적용될 수도 있는데, 심장을 통한 세포의 제1 경로는 심근 혈류를 조절하기 위해 풍선을 사용하여 강화될 수 있다. 말초 정맥 접근법에 있어서, 세포는 단일 덩어리 또는 여러 개의 더 작은 분취량으로 도관을 통해 주사될 수 있다. 세포는 또한 심외막 주사에 의해 심근으로 직접 적용될 수 있다. 이는 개심 절차(심장 동맥 우회로 이식 수술 등)와 관련, 직접적인 기관 노출 하에서, 또는 심실 보조 장치의 장착을 통해서 사용될 수 있다. 바늘과 함께 장착되는 도관이 사용되어, 덜 침투적인 직접 적용 수단을 가능하게 하는 심외막 방식으로 심근 내에 직접 세포를 전달할 수도 있다.

일실시태양에서, 전달 경로는 표준 말초 정맥내 도관, 중앙 정맥 도관, 또는 폐동맥 도관을 통한 정맥내 전달을 포함할 것이다. 다른 실시태양에서, 세포는 현재 허용되는 방법을 통해 접근되는 관상동맥내 경로를 통해 전달될 수도 있다. 세포의 유동은 환자의 혈관 구조 내에 위치하는 말단 및 인접 풍선의 순차적인 팽창/수축에 의해 조절될 수 있으며, 이 때문에 세포의 혼합 또는 세포 치료 작용을 촉진하는 일시적인 무유동 영역이 형성된다. 다른 실시태양에 있어서, 세포는 상용성 도관의 사용 및 계획된 목적 조직을 형상화 또는 탐지하는 능력을 필요로 할 수 있는 심내막(심장의 안쪽 표면) 방법을 통해 전달될 수도 있다. 별법으로, 세포는 심외막(심장의 바깥쪽 표면) 방법을 통해 전달될 수도 있다. 이 전달은 개심 절차시에 직접적인 기관 노출을 통해서, 또는 특화된 세포 전달 기구를 필요로 하는 흉강경 접근법을 통해서 달성될 수 있다. 또한, 세포는 피하, 근육내, 설하, 퇴행성 심장 관류, 심장 우회로 장치, 체외 막 산화(ECMO, extracorporeal membrane oxygenation) 장치 및 심낭창 등의 경로들 단독으로, 또는 하나 이상의 상기 명시된 접근법을 통해 전달될 수 있다.

일실시태양에서, 세포는 환자에게 혈관내 덩어리 또는 적시 주입 형태로 투여된다. 다른 실시태양에서, 세포는 환자에게 투여되기 전 인공 또는 자연 배지 또는 조직 스캐폴드 내에 재현탁될 수 있다.

환자에게 투여되는 세포 투여량은 채취되는 지방조직의 양 및 공여자의 신체 질량 지수에 의존할 것이다(이용 가능한 지방조직의 양을 측정함으로써). 채취되는 조직의 양은 또한 심간 손상 또는 변성의 정도에 의해 결정될 수도 있다. 다중 조직 채취 또는 적용간에 적당한 세포 저장을 수반하는 단일 채취를 사용한 다중 치료법이 본 발명의 범위에 포함된다.

가공된 리포애스퍼레이트 부분은 환자에게 투여되기 이전 보관될 수 있다. 단기 보관(6시간 미만)을 위해서는, 세포는 영양 용액의 보충 또는 보충 없이 밀봉된 용기 내에서 상온 또는 그 미만의 온도에서 저장될 수 있다. 중기 보관(48시간 미만)은 바람직하게는 등장, 완충 용액(예를 들면 플라스마라이트(Plasmalyte, 등록상표)) 내에서, 세포 응착을 막는 물질을 포함하거나 이로 코팅된 용기 내에서, 2-8℃에서 수행된다. 더 긴 기간의 보관은 바람직하게는 공유되고 지정된 PCT 출원번호 PCT/US02/29207 (2002년 9월 13일 출원) 및 미국 가출원번호 60/322,070(2001년 9월 14일 출원)에 개시된 것 등의 적당한 저온 보존 및 세포 기능의 유지를 촉진하는 조건 하에서의 세포 저장에 의해 수행되는데, 이들 모두의 내용은 본원에 참조문헌으로 포함되었다.

본 발명의 한 측면에 따라, 환자에게 투여되는 지방조직 유래 세포는 성장 인자 전달 매체로 작용할 수 있다. 예를 들면, 심혈관 장애 또는 질환을 수반하는 현상을 완화하기에 적당한 하나 이상의 성장 인자를 발현하기 위해 세포를 처리함으로써, 세포는 환자에 투여될 수 있고 하나 이상의 성장 인자를 방출하도록 처리될 수 있다. 방출은 연장된 시간 동안 조절된 방식으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 방출은 성장 인자가 규칙적 또는 주기적 형태로 방출되어 조직의 손상 영역의 부근에 성장 인자의 국소적 상승 및(또는) 성장 인자의 양의 국소적 감소가 존재할 수 있도록 조절될 수 있다.

환자에게 투여되는 세포는 손상되거나 다른 이유로 건강하지 않은 조직의 기능을 복구하는 것을 도울 뿐 아니라, 손상된 조직의 재건을 촉진하기도 한다.

세포 전달은 개인 병원, 개인 병원 오피스, 응급실, 병동, 중환자실, 수술실, 도관실 및 방사선실 등의 장소에서 일어날 수 있으나 이에 한정되지 않는다: .

일실시태양에 있어, 세포 전달 치료법의 효과는 증가된 심장 배출 분율, 감소된 심부전증율, 감소된 경색 크기, 감소된 수반 이환률(폐부종, 신부전, 부정맥), 향상된 운동 내성 또는 다른 생명 측정치의 우량성, 및 감소된 사망률 등의 임상 측정치들 중 하나에 의해 설명될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 세포 치료법의 효과는 상기 절차 후 수 일 내지 수 주의 경과로부터 명백할 수 있다. 그러나, 상기 절차 후 여러 시간 이내에 이로운 효과가 관찰될 수도 있고, 수 년 동안 잔존할 수도 있다.

환자들은 일반적으로 세포의 전달 이전 및 전달 중에 관찰된다. 관찰 절차는 응고 연구, 산소 포화도, 혈류역동학적 관찰 및 심장 율동 관찰 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 세포의 전달 후, 환자는 불리한 사고를 대비해 약 24시간의 관찰 기간을 필요로 할 수도 있다. 상기 절차로부터 기능적 개선을 평가하는 사후 연구는 환자 기능 용량(예를 들면, 격심한 활동시 호흡 곤란, 발작성 야간 호흡 곤란, 협심증), 초음파 심장 검진, 핵 관류 연구, 자기 공명상, 양전자 발산 해부학 및 심장 혈관 촬영 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

위에서 이미 제시하였듯이, 바람직한 실시태양에서, ADC(즉, 활성 지방 유래 줄기세포 집단)은 환자에게 직접 투여된다. 다시 말하면, 활성 세포 집단(예를 들면, 줄기세포 및(또는) 내피 선조세포)은 환자에게 투여되기 전 시스템으로부터 제거되거나 시스템의 외부 환경에 노출되지 않고 환자에게 투여된다. 밀폐 시스템을 제공하면 환자에게 투여되는 물질의 오염 가능성을 감소시킬 수 있다. 그러므로, 밀폐 시스템에서의 지방 조직의 가공은 기존 방법에 비해 장점을 제공하는데, 이는 활성 세포 집단이 더욱 멸균되는 경향을 가지기 때문이다. 이러한 실시태양에서는, 줄기세포 및(또는) 내피 선조세포가 외부 환경에 노출되거나 시스템에서 제거되는 유일한 때는 세포가 적용 장치 내부로 회수될 때와 환자에게로 투입될 때이다. 일실시태양에서는, 상기 적용 장치 또한 밀폐 시스템의 일부일 수도 있다. 그러므로, 이러한 실시태양에서 사용되는 세포는 배양 또는 저온 보전을 위해 가공되지 않으며, 더 이상의 가공 없이 환자에게 투여되거나, 다른 조직 또는 세포와 혼합된 후에 환자에게 투여될 수 있다.

다른 실시태양에 있어, 적어도 일부분의 활성 세포 집단이 이후 이식/주입을 위해 보관된다. 집단은 한 분취량 또는 단위보다 많게 나누어져, 줄기세포 및(또는) 내피 선조세포의 집단의 일부가 이후 적용을 위해 보존되고 일부는 환자에게 즉시 적용된다. 세포 은행 내에 세포의 일부 또는 전부의 중기 또는 장기 보관 역시 본 발명의 범위에 포함되는데, 이는 2002년 9월 12일에 출원되고 "PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES"로 명명된 미국 특허출원번호 10/242,094에서 개시되었고, 이는 공통으로 지정된, 2001년 9월 14일에 출원된 미국 가출원 60/322,070의 우선권을 주장하고 있으며, 이들의 내용은 본원에서 참조문헌으로 명백히 포함되었다. 가공의 최종 단계에서, 농축된 세포는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 수용자에게로 놓아지기 위해 주사기 등의 전달 장치에 채워질 수 있다.

II. 제약 조성물

활성 세포 집단은 단독으로, 또는 다른 세포, 조직, 조직 단편, VEGF 및 다른 알려진 혈관신생 또는 동맥신생 성장 인자 등의 성장 인자, 생물학적으로 활성 또는 비활성인 화합물, 재흡수성 플라스틱 스캐폴드, 또는 전달, 효능, 내성, 또는 집단의 기능을 강화할 목적의 다른 첨가제들과의 조합으로 적용될 수 있다. 세포 집단은 또한, 구조적 또는 치료적 목적으로의 유도를 위해 세포 기능을 변화, 강화 또는 보충하는 방법을 통한, 세포 배양에서의 DNA의 삽입 또는 주입에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 줄기세포용 유전자 전달 기법은 문헌[Morizono et al., 2003; Mosca et al., 2000]에 개시된 것처럼 당업자에게 공지되어 있으며, 바이러스성 트랜스펙션 기법, 더욱 특정적으로는, 문헌[Walther and Stein, 2000] 및 문헌[Athanasopoulos et al., 2000]에 개시된 것처럼, 아데노-수반 바이러스 유전자 전달 기법을 포함할 수도 있다. 비-바이러스 기반 기법 또한, 문헌[Muramatsu et al., 1998]에 개시된 것처럼 수행될 수 있다.

또 다른 측면에서, 세포는, 심장 복구 또는 재생 중에 세포를 그들 자신의 성장 인자 소스로 작용하도록 하는 혈관신생 전구성 및(또는) 심근 성장 인자를 인코딩하는 유전자와 조합될 수 있다. 항-아포프토시스 인자 또는 제제를 인코딩하는 유전자 또한 적용될 수 있다. 유전자(또는 유전자의 조합)의 첨가는 아데노바이러스성 형질변환, "유전자 총", 리포솜-매개 형질변환 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스-매개 형질변환, 플라스미드, 아데노-수반 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 임의의 기법에 의해 수행될 수 있다. 세포는 유전자를 시간에 걸쳐 세포에 방출 및(또는) 전달할 수 있는 유전자 전달 매체를 지니는 담체 물질과 함께 이식되어, 형질변환이 그 장소에서 계속 또는 개시될 수 있도록 한다. 특히 세포 및(또는) 세포를 함유하는 조직이 그 세포 및(또는) 조직이 수득된 환자가 아닌 환자에 투여되는 경우, 하나 이상의 면역억제 제제가 그 세포 및(또는) 조직을 받는 환자에 투여되어, 이식 거부반응을 감소시키거나, 바람직하게는 피하게 할 수도 있다. 본원에서 사용되는 용어 "면역억제 약물 또는 제제"는 정상 면역 기능을 억제 또는 간섭하는 제약 제제를 포함하도록 의도된다. 본원에서 개시되는 방법에 적합한 면역억제 제제의 예는 T-세포/B-세포 공자극 경로를 억제하는 제제, 예를 들어 CTLA4 및 B7 경로를 통해 미국 특허공보번호 20020182211에 개시된 T-세포 및 B-세포의 커플링을 방해하는 제제를 포함한다. 바람직한 면역억제 제제는 시클로스포린 A이다. 다른 예는 미오페닐레이트 모르페틸, 라파마이신 및 항-티모사이트 글로불린을 포함한다. 일실시태양에서, 면역억제 약물은 하나 이상의 다른 치료 제제와 함께 투여된다. 면역억제 약물은 투여 경로가 상용성인 제형으로 투여되고, 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 투여량으로 피험자에게 투여된다. 다른 실시태양에서, 면역억제 약물은 본 발명의 ADC에 대한 내성을 유도하기 위해 충분한 시간 동안 단기적으로 투여된다. 또다른 실시태양에서, 면역억제 약물은 본 발명의 ADC에 대한 내성을 유도하기에 충분한 시간 동안 일시적으로 투여된다.

본 발명의 특정 실시태양에 있어서, 세포들은 하나 이상의 사이토킨 및 성장 인자 같은 세포 분화제를 사용하여 환자에게 투여된다. 다양한 세포 분화제의 예들은 문헌[Gimble et al., 1995]; [Lennon et al., 1995]; [Majumdar et al., 1998]; [Caplan and Goldberg, 1999]; [Ohgushi and Caplan, 1999]; [Pittenger et al., 1999]; [Caplan and Bruder, 2001]; [Fukuda, 2001]; [Worster et al., 2001]; [Zuk et al., 2001]에 개시된다.

본 발명은 하기 실시예들에 의해 더 설명될 것인데 이 실시예들은 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 본원 전체를 통해 인용된, 참조 문헌, 등록 특허, 공개 특허 출원, 및 계속중인 특허 출원을 포함하는 모든 인용된 참고문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.

아래 설명된 모든 실시예들에 사용된 ADC 또는 지방 유래 줄기세포의 활성 집단은 본 개시 내용에 기술된 방법 및(또는) 통상적으로 양도되고 본원에 그 내용이 참조로 인용된, 2001년 12월 7일에 출원된 미국 가출원 제 60/338,856호에 관한 우선권을 주장하며 2002년 12월 9일에 출원된, 발명의 명칭이 "가공된 리포애스퍼레이트 세포를 사용하여 환자를 치료하는 시스템 및 방법"인 미국 출원 제 10/316,127호에 기술된 방법에 의해 수득하였다.

실시예 1: ADC에 의한 혈관신생 성장 인자, VEGF의 발현

혈관 내피성 성장 인자(VEGF)는 혈관신생의 핵심 조절자 중 하나이다(문헌[Nagy et al., 2003]; [Folkman, 1995]). VEGF류의 또다른 하나인 태반 성장 인자는, 평행한 혈관이 관류(perfusion) 및 전단력에 대응하여 회복 및 팽창되는 과정 인, 혈관신생 및 동맥신생 모두에 있어서 유사한 역할을 한다(문헌[Nagy et al., 2003]; [Pipp et al., 2003]; [Scholz et al., 2003]). 구체적으로, 야생형(PIGF +/+) 세포를 PIFG 유전자가 결여된 마우스에게 이식하면 뒷다리 허혈증(hind limb ischemia)으로부터의 신속한 회복을 유발하는 능력이 복구된다(문헌[Scholz et al., 2003]).

재혈관화 과정에 혈관신생 및 동맥신생 모두의 중요성을 부여하면서, ADC 세포에 의한 PIGF 및 VEGF 발현을 세 공여자로부터의 ADC 세포를 사용한 ELISA 분석(알 앤드 디 시스템즈(R&D Systems), 미니애폴리스, 미네소타)을 사용하여 조사하였다. 하나의 공여자는 과혈당증 및 유형 2 당뇨병(관상 동맥 질환을 갖는 환자를 포함하는, 미세혈관 및 대혈관 질환 고도로 연관된 증상)의 병력을 가졌다. 각각의 공여자로부터의 ADC 세포를 10% FCS 및 5% HS를 보충한 DMEM/F-12 배지 내의 1000세포/㎠의 평판에서 배양하고 융합할 때까지 성장시켰다. 상청액 시료를 PIGF 및 VEGF 단백질의 발현을 위해 분석하였다. 도 5A 및 5B에 도시된 바와 같이, 결과는 본 발명의 지방 유래 줄기세포에 의한 VEGF(도 5A) 및 PIGF(도 5B) 모두의 강한 발현을 설명한다.

이들 데이터는 정상 및 당뇨병 환자 모두로부터의 지방조직 유래 줄기세포 및 선조세포가 혈관신생 및 동맥신생 성장 인자를 발현한다는 것을 설명한다. 당뇨병 환자가 심혈관 질환의 증가된 위험을 갖기 때문에 이는 중요하고 이들 데이터는 ADC 세포가 당뇨병 환경에서 그 혈관신생 능력을 보유한다는 것을 보여준다. 따라서, 당뇨병 환자들은 그들 자신의 ADC 세포로부터 혈관신생의 혜택을 얻을 수 있다.

실시예 2: ADC는 혈관신생에 관여하는 세포 집단을 함유한다.

내피성 선조세포들(EPCs)은 혈관신생에 관여한다고 알려져 있다. 순환하는 내피성 선조세포를 말초혈, 제대혈, 골수, 및 태아 간에서 검출하였다(문헌[Takahashi, 1999]; [Asahara, 1999]; [Asahara, 1997]; [Loomans, 2004]; [Shintani, 2001]; [Vasa, 2001]). 지방 유래 줄기세포 내의 EPCs의 빈도를 결정하기 위해, EPC 분석을 수행하였다. ADC 세포를 피브로넥틴-코팅된 판에서 평판 배양하였고 3일 동안 내피세포 배지에서 배양시켜 성숙한 내피세포를 제거하였다. 비점착성 세포를 제거하고 다시 평판 배양하였다. 14일 후, 콜로니들을 FITC-공액된 Ulex 유럽 응집소-1(벡터 랩스(Vector Labs), 벌링앰, 캘리포니아) 및 DiI-표지된 아세틸화 LDL(몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes), 유진, 오레곤)로 착색하여 확인하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 결과는 약 500EPC/10⁶ ADC 세포의 EPC 빈도를 나타낸다.

지방조직 유래 줄기세포 및 선조세포 집단 내의 EPCs의 존재는 이 집단이 새로운 혈관의 발달에 직접 관여할 수 있고 혈관신생 및 재관류를 증진할 수 있고, 그로 인해 허혈증과 후속하는 심근 경색증 또는 울혈성 심부전증의 지속 시간을 감소시킨다.

실시예 3: ADC에서 혈관 구조물의 시험관내 발생

혈관신생에 대한 당업계에 알려진 분석법은 섬유아세포의 공급층 상에서 성 장한 내피세포가 초기 모세관 망상 조직을 상기시키는 CD31-양성 관의 복합 망상 조직을 발생시키는 것이다(문헌[Donovan et al., 2001]). ADC는 공급층의 부존재하에 유사한 망상 조직을 형성한다(도 7A). 명백하게, STZ를 투여하고 8주 후에 스트렙토조토신(STZ)-유발된 유형 1 당뇨병에 걸린 과혈당증 마우스로부터 얻은 ADC 세포는 처리되지 않은 마우스의 그것과 유사한 빈도로 유사한 구조를 형성한다(도 7B).

당뇨병 환자가 심혈관 질환의 증가된 위험을 갖기 때문에 이는 중요하고 이들 데이터는 ADC 세포가 당뇨병 환경에서 그 혈관신생 능력을 보유한다는 것을 보여준다. 따라서, 당뇨병 환자들은 그들 자신의 ADC 세포로부터 혈관신생의 혜택을 얻을 수 있다.

요약하면, 상기 실시예 1 내지 3의 결과는 지방 유래 줄기세포는 혈관신생 및 동맥신생을 촉진할 수 있는 세포의 집단을 함유한다. 결과는 또한 당뇨병에 걸린 인간 공여자로부터의 또는 지속적인 과혈당증을 보이는 STZ-처리된 마우스로부터의 지방 유래 줄기세포는 혈관신생을 촉진하는 세포 내에 부족하지 않을 것이라는 점을 보여준다. 따라서, 지방은 심혈관 질환의 위험이 실질적으로 증가하는 당뇨병 환경에 의해 손상되지 않는 재생 세포의 저장기를 나타낼 수 있다.

실시예 4: ADC에서 혈관 구조물의 생체내 발생

시험관내 혈관신생 가능성은, 전도 유망하지만, 세포가 생체내 혈관신생 활성을 보이지 않는다면 가치가 떨어진다. 설치류 내의 위험한 사지 허혈증의 외과 유도는 동맥신생(증가한 전단력에 크게 대응하는 평행한 혈관의 회복 및 팽창) 및 혈관신생(허혈증에 대응하는 새로운 혈관의 발달)이 공동으로 작용하는 과정들이 관찰될 수 있는 널리-인식된 모델이다(문헌[Schatteman, 2000]; [Scholz, 2002]; [Takahashi, 1999]). 이 모델은 재관류를 유발할 수 있는 인간 세포의 능력이 관찰될 수 있는 면역결여(NOD-SCID) 마우스 내에서 발달하였다. 구체적으로, 동물을 케타민 및 자일라진(80mg/kg; 7.5mg/kg)으로 마취시키고 앙아위(supine position)로 수술 표면상에 위치시켰다. 수술 전의 혈류량의 값을 하기 설명하는 바와 같이 뒷다리 양쪽에 대해 측정하였다. 동물에 대해 베타딘을 준비하였고 통상적인 멸균 방법에 의해 멸균한 천으로 덮고 회전하는 물중탕에 위치시켰다. 뒷다리의 기시점부터 무릎의 가장 가까운 쪽까지 연장되게 일측성으로 1.5㎝ 절개를 하여 깊은 동맥 및 표면상의 대퇴부 동맥 내의 그 분기점에 가장 가까운 장골 동맥을 노출시켰다. 혈관계를 3-0 비단 봉합사를 사용하여 다음의 부위에서 묶었다: 1) 그 분기점에 가장 가까운 장골 동맥, 2) 깊은 대퇴부 동맥의 기시점의 말단, 3) 표면상의 대퇴부 동맥의 분지점에 가장 가까운 쪽. 봉합 후, 혈관계를 일괄적으로 제거하였다. 그 후, 봉합되고 후속하여 제거된 임의의 명백한 옆 가지를 확인하려는 시도를 하였다. 상처 및 근육 층을 4-0 흡수성 봉합사로 봉합하였고 피부를 5-0 흡수성 봉합사로 봉합하였다. 동물을 수술 후 부프레노르핀(0.5mg/kg)으로 처리하였고 자발적으로 모로 누울 때까지 회전 물중탕 상에서 회복시켰다. 수술 후 24시간 후 동물에 5×10⁶ ADC 세포를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. NOD-SCID 마우스에 대한 연구에서 당뇨병 환자로부터의 세포를 포함하는 인간 공여자 세포를 주사하였다. 처리 후 14일 동안 흐름을 영상화하였다.

이 연구에서, ADC-처리된 동물들은 사지 구조의 보유(사지 구조; 처리되지 않은 마우스 2/3는 ADC-처리된 동물들 0/5과 비교해보면 모든 하부 뒷다리 구조를 잃었다) 및 흐름의 복구에 있어서 통계적으로 현저한 향상을 보였다(도 8). 가장 현저하게, 당뇨병에 걸린 인간 공여자 세포를 받은 NOD-SCID 마우스에 있어서, 14일 째의 흐름은 처리된 동물 내에서 50±11%로 복구되었고 이에 비해 처리되지 않은 동물 내에서는 10±10%로 복구되었다(p<0.05). 19일째까지 반동이 발생하여 실험 사지 내의 관류가 대조군의 그것보다 컸다(136±37%). 이 반응은 두 정상(당뇨병에 안 걸린) 공여자로부터 얻은 세포로 관찰한 범위 내이다(50-90%).

자가 조직 세포 전달의 효과를 측정할 수 있는 면역성 마우스(129S 마우스) 내의 유사한 실험에서 ADC 세포 처리된 마우스는 80±12%의 14일째에서의 흐름 복구를 보인데 비해 처리되지 않은 마우스는 56±4%를 보였다.

이 모델에서, 혈류량은 평행한 혈관의 회복 및 팽창으로부터 및 하부 사지 내의 혈관신생에 의해 복구된다. 이들 과정들은 또한 심근 경색에 후속하는 심장 내에서의 흐름의 복구에 대한 열쇠이다. 따라서, ADC의 이들 과정들을 자극하는 능력은 생체 내에서 강하게 ADC 세포의 심근 경색증의 환경 내에서의 응용을 지지한다. 당뇨병에 걸린 공여자(심혈관 질환에 걸릴 더 높은 위험을 갖는 환자 집단의 구성원)로부터 얻은 ADC 세포 또한 이 활성을 보임을 주목하는 것 역시 중요하다.

실시예 5: ADC 투여량의 증가는 향상된 이식편 생존 및 혈관신생과 관련된 다.

자가 조직 지방조직의 이식은 성형 및 재건 수술에 있어서 상대적으로 통상적인 과정이다(문헌[Fulton, 1998]; [Shiffman, 2001]). 그러나, 이 과정은 지방조직편은 혈관 공급 없이 전달되고, 그 결과로서, 이식편 생존은 신생혈관 형성에 의존한다는 사실에 의해 제한된다(문헌[Coleman, 1995]; [Eppley et al., 1990]). 따라서, 제한된 방법으로, 이식된 조직은 허혈증 조직을 나타낸다.

지방조직편이 외부 허벅지 근육 위의 피하 공간으로 이식되는 수컷 래트(Fisher rat)의 연구를 수행하였다. 오른쪽 다리에 0.2g의 지방조직편을 단독으로 이식하였고, 왼쪽 다리에는 0.2g의 지방조직편을 지방 유래 줄기세포의 첨가에 의해 보충하면서 세 가지 다른 투여량(1.7×10⁵ - 1.3×10⁶세포/이식편; 투여량 당 세 동물)으로 이식하였다; 이 방법으로, 반대쪽 다리는 대조군으로서 작용하였다. 그 후 동물들을 한 달 동안 유지시킨 후 안락사시키고 이식편을 회수하고, 중량을 재고, 포르말린에 고정하고 조직학적 분석을 위해 파라핀에 넣었다.

도 9A에 도시된 바와 같이, 결과는 대조군 다리 내에 이식된 조직의 최소 보유 및 처리된 다리 내의 이식편 중량의 보유에 있어서의 투여량-의존적인 증가를 보여준다. 또한, 이식편의 면역 조직 화학적 분석은 지방 유래 줄기세포 처리된 이식편 내의 상당한 신생혈관 형성 및 관류를 보여주었다(도 9B, 화살표). 이는 또한 지방조직 형태학의 보유와 관련되었다.

상기한 바와 같이, ADC 세포가 부적합하게 관류된, 허혈증에 걸린 조직의 생 존을 촉진한다는 설명은 심혈관 질환에 있어서 임상 가능성의 중요한 지표이다.

실시예 6: ADC에 의한 심근 생착

심근에 대한 저온상처(cryoinjury)는 심근 재생성에 있어서의 세포 치료의 역할을 조사하기 위한 잘 확립된 수술 모델이다(문헌[Marchlinski et al., 1987]). ADC 세포의 손상된 심근을 생착하고 그로 인해 상처 형성을 억제하는 능력(콜라겐 침착 및 가교 결합)을 설명하기 위해, B6129SF1/J 마우스 내에 심근 저온상처를 내었다. 상처가 난 바로 직후, lacZ 유전자에 대해 유전자 도입한 ROSA26 마우스로부터 얻은 백만(1.0×10⁶) ADC 세포를 심실내 경로를 통해 주사하였다. B-갈락토시다제로 착색한 수령하는 심장 조직은 파란색으로 착색하여 공여자 지방 유래 줄기세포의 존재를 검출할 것이다. 마우스 심장을 얻었고 주사 후 다음의 다섯 시간 지점에서 처리하였다: 1일째, 7일째, 14일째, 28일째, 84일째. 도 10에 도시된 바와 같이, 결과는 상기 언급된 모든 시간 지점에서 경색된 심근 부위 내에서의 공여자 유래 지방 유래 줄기세포의 생착을 설명한다. 도 10은 생착의 조직학적 타임 라인을 설명한다.

중요하게, 공여자-유래(베타 갈락토시다제-양성) 세포의 14일째의 면역 조직 화학적 분석은 많은 공여자-유래 세포들이 심근세포 표지 미오신 중쇄를 발현하였다는 것을 보여주었다(도 11). 이는 ADC 세포는 손상된 심장 내의 상처 부위로 귀소(homing)할 수 있으며 심근세포로 분화할 수 있음을 보여준다. 따라서, ADC 세포는 심장마비(심근 경색증) 후에 잃은 심근세포를 보충할 수 있다.

이 발견을 종들을 가로질러 연장하기 위해, 래트 폐색/재관류 모델에 있어서 공여자 유래 가공된 리포애스퍼레이트의 생착을 연구하였다. 이 실험 구성에 있어서, 면역성 위스타(Wistar) 래트의 주 관상 동맥(좌전하행)을 7-0 플라스틱제 봉합사(prolene) 및 동맥 상에서 스내어(snare)로 작용하는 작은 조각의 실라스틱(silastic) 관을 사용하여 일시적으로 폐색하였다. 1시간 후, 폐색을 해제하였고 혈액이 허혈증 심근을 재관류하도록 하였다. 이 모델은 더 가깝게 인간 임상 패러다임에 존재하는 상처 및 회복의 메카니즘을 나타낸다. 재관류 후 즉시, Rosa26 마우스로부터 얻은 약 백만(1×10⁶) ADC 세포를 심실내 경로를 통해 주사하였다. 주사 후 일주일 후 심장을 얻었다. 도 12에 도시된 바와 같이, 결과는 공여자 유래 ADC 세포의 생착을 설명한다.

실시예 7: 급성 심장 손상의 치료

급성 심근 경색증(심장마비)은 심근에 허혈증 상처를 내는 것을 초래한다. 조직 손상은 손상된 조직의 재관류 및 심근 조직의 재생성에 의해 최소화될 수 있다(문헌[Murry et al., 1996]; [Orlic et al., 2001]; [Orlic et al., 2003]; [Rajnoch et al., 2001]; [Strauer et al., 2002]; [Assmus et al., 2002]). 본원에 개시된 지방-유래 세포 치료는 골수 채취와 같은 비-지방-유래 세포 치료에 비해 상대적으로 더 우수한 재생 세포의 공급원을 제공하는 것을 추구하는데, 이는 예를 들면 많은 수의 비-배양된 세포들 및 비-지방-유래 치료(예를 들어, 골수 채취)와 관련된 희박한 사망률을 갖는 더 순수한 세포들 중 적어도 하나의 사용에 기 인한다.

환자는 심근 경색증으로부터 고통받고 있다는 의심을 받았다. 환자를 1 시간 내의 경색을 겪게 하였다. 환자에게 지방-유래 세포 치료를 하였다. 환자의 체질을 지방조직 수집에 대해 적합한 부위를 위해 검사하였다. 채취 부위는 다음의 것 중 적어도 하나에 의해 특징지워졌다: 정상 해부 구조에 의해 제한된 잠재적 공간, 대다수가 아닌 손상의 위험에 처한 혈관 또는 내장 구조, 및 접근 용이. 순수한 채취 부위가 바람직하지만, 이전의 채취 부위는 추가적인 지방조직 채취를 배제하지 못했다. 잠재적 채취 부위는 좌우 양쪽 하부 말단의 측면 및 중간 허벅지 구역, 전방 복부 벽 판누스(pannus), 및 좌우 양쪽 옆구리 구역을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

환자는 리도카인, 염수, 및 에피네프린의 조합을 함유하는 팽창한 유체 용액의 피하 주사를 예를 들면 서로 다른 표준화된 투여 처방 계획에 의해 맞았다. 외과용 메스(예를 들면, 11-날 외과용 메스)를 사용하여, 진피를 가로지르기 위해 작은 구멍 상처를 환자의 오른쪽 및(또는) 왼쪽 다리의 중간 허벅지 구역에 내었다. 상처를 완성하기 위해 날을 360° 돌렸다. 둥근 가는 캐뉼러(예를 들면, 14-게이지 캐뉼러)를 절개 상처 아래의 피하 지방조직 면에 삽입하였다. 캐뉼러를 전력 보조 흡입 장치에 연결하였다. 캐뉼러를 결합성 조직 구조를 분해하기 위해 지방조직면 전체에 걸쳐 이동시켰다. 약 500cc의 흡인물을 얻었다. 지방조직의 제거 후, 표준 수술 기술을 사용하여 지혈하였고 상처를 봉합하였다.

리포애스퍼레이트를 본원에 기술된 방법에 따라 처리하여 농축된 지방유래 줄기세포 단위를 수득하였다. 경색 후 약 6시간 후, 환자에게 줄기세포를 투여하였다. 리포애스퍼레이트의 처리에 근거하여, 환자가 약 5.5×10⁴ 줄기세포와 5.5×10⁵ 줄기세포 사이의 범위의 초기 투여량의 줄기세포를 받았다고 평가되었다. 환자는 초기 투약 후 12시간 간격으로 두 번의 보충 투여를 받았다. 줄기세포를 중심 정맥 카테터를 통해 환자에게 투여하였다. 표적 구역 내에서의 세포 생착을 촉진하기 위해, 줄기세포의 흐름을 표적 부위의 하류부에 위치한 풍선 및 표적 부위의 상류부에 위치한 풍선에 의해 조절하여 낮은 또는 최소 혈류량의 구역을 생성하였다.

세포 투여 과정 후 약 6시간 내에 환자에게서 향상이 관찰되었다. 세포 투여 과정 후 여러 날 후에 환자에게서, 증가한 혈액 부피 분출률, 감소한 심부전증 비율, 감소한 경색 크기, 향상된 운동 내구력 및 기타 삶의 척도의 질에 의해 증명되는 추가의 향상이 관찰되었다.

참고문헌

본원에 기재된 임의의 특징 또는 특징들의 조합은 이러한 임의의 조합에 포함되는 특징들이 상호 모순되지 않는다면 본 발명의 범위 내에 포함되고, 이는 정황, 본 명세서, 및 당업자의 지식으로부터 명백할 것이다. 본 발명을 요약하기 위한 목적으로, 본 발명의 특정 측면, 이점 및 신규 특징들을 본원에 기재하였다. 물론, 이러한 모든 측면, 이점 또는 특징들이 본 발명의 특정 실시태양에서 반드시 구체화될 필요는 없음을 이해하여야 한다. 본 발명의 추가적 이점 및 측면은 하기 상세한 설명 및 청구의 범위에서 명백하다.

상기 실시태양은 예시적으로 제공된 것이고, 본 발명은 이 실시예에 의해 제한되지 않는다. 당업자가 상기 기재를 고려하여 상호 배타적이지 않은 범위까지 개시된 실시태양에 다수의 변경 및 변형을 가할 것이다. 또한, 다른 조합, 삭제, 치환 및 변형이 본 개시로부터 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 실시태양에 의해 한정되는 것으로 의도되지 않고, 첨부하는 청구의 범위에 의해 한정된다.

다수의 간행물 및 특허가 상기에 인용되었다. 인용된 간행물 및 특허는 각 각 그 전체가 참고로 본원에 인용된다.

균등물

당업자라면 단지 통상적인 실험을 사용하여도 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시태양에 대한 다수의 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구의 범위에 포함된다.

Claims (84)

1. 지방(adipose) 유래 선조세포 및 지방 유래 줄기세포를 포함하는 복수분화능(multipotent) 지방 유래 세포(ADC)의 농축된 집단을 포함하고, 상기 복수분화능 지방 유래 세포의 농축된 집단이 배양에서 시험관내 성장 및 분화된 것이 아닌, 허혈 증상이 있는 것으로 평가된 개체에서 혈류를 회복시키기 위한 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 농축된 세포 집단이 복수분화능 지방 유래 세포 10⁶개 당 내피 선조세포 500개 이상을 포함하는 것인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 허혈 증상이 울혈성 심부전증을 포함하는 것인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 허혈 증상이 심근 경색증인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 개체가 당뇨병에 걸린 것인 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 개체가 비만증에 걸린 것인 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 복수분화능 지방 유래 세포의 덩어리(bolus)를 포함하는 조성물.
8. 제1항에 있어서, 55,000 내지 550,000개의 지방 유래 줄기세포를 제공하는 조성물.
9. 제1항에 있어서, 하나 이상의 혈관신생인자를 포함하는 조성물.
10. 제1항에 있어서, 상기 세포 집단이 배양시 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 발현시키는 것인 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 세포 집단이 배양시 태반 성장 인자 (PLGF)를 발현시키는 것인 조성물.
12. 제1항에 있어서, 하나 이상의 동맥신생인자(arteriogenic factor)를 포함하는 조성물.
13. 제1항에 있어서, 하나 이상의 면역억제 약물을 포함하는 조성물.
14. 제1항에 있어서, 복수분화능 지방 유래 세포의 농축된 집단이, 혼합/처리 챔버에 연결된 수집 챔버를 포함하며 밀폐된 무균성 유체/조직 경로를 유지하는 구조를 갖는 시스템에서 상기 개체로부터의 지방 조직을 처리함으로써 얻어지는 것인 조성물.
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