ES2373551T3

ES2373551T3 - Métodos para usar células derivadas de tejido adiposo en el tratamiento de afecciones cardiovasculares.

Info

Publication number: ES2373551T3
Application number: ES04713403T
Authority: ES
Inventors: John K. Fraser; Marc H. Hedrick; Min Zhu; Brian M. Strem; Eric Daniels; Isabella Wulur
Original assignee: Cytori Therapeutics Inc
Current assignee: Plus Therapeutics Inc
Priority date: 2003-02-20
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2012-02-06
Anticipated expiration: 2024-02-20
Also published as: RU2005128964A; BRPI0407694A; KR20050109941A; IL214373A0; JP4971787B2; WO2004074457A3; EP1599575B9; CA2516510A1; CA2516510C; ATE524070T1; MXPA05009044A; HK1102085A1; AU2004213858B2; EP2422622B1; WO2004074457A2; KR20120038534A; EP1599575B1; IL170354A; IL214373A; KR101310578B1

Abstract

El uso de una composición que comprende una población concentrada de células derivadas de tejido adiposo (ADC) en la fabricación de un medicamento para restablecer el flujo sanguíneo en un sujeto que se ha determinado que tiene una isquemia, en el que dicha población concentrada de células derivadas de tejido adiposo (ADC) com- prende células progenitoras derivadas de tejido adiposo y células madre de tejido adiposo obtenidas procesando el tejido adiposo de dicho paciente en un sistema que está configurado para mantener una ruta de fluido/tejido cerrada estéril, y dicho sistema comprende una cámara de recogida conectada a una cámara de mezcla/procesamiento.

Description

Metodos para usar celulas derivadas de tejido adiposo en el tratamiento de afecciones cardiovasculares

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

1. Campo de la Invenci6n

5 Esta invenci6n se refiere en general al uso de una composici6n que comprende una poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) en la fabricaci6n de un medicamento para restablecer el flujo sangufneo en un sujeto que se ha determinado que tiene una isquemia, en la que dicha poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) comprende celulas progenitoras derivadas de tejido adiposo y celulas madre de tejido adiposo obtenidas procesando el tejido adiposo de dicho paciente en un sistema que esta configurado para mantener

10 una ruta de fluidos/tejidos cerrada esteril, y dicho sistema comprende una camara de recogida conectada a una camara de mezcla/procesamiento.

2. Descripci6n de la Tecnica Relacionada

Las enfermedades y trastornos cardiovasculares son la causa principal de muerte y discapacidad en todas las na

ciones industrializadas. Solamente en los Estados Unidos, la enfermedad cardiovascular es responsable de alrede

15 dor del 40 por ciento de la tasa de mortalidad, y afecta a 58 millones de americanos (AmericanHeartAssociation, 2002). Uno de los factores principales que hace que la enfermedad cardiovascular sea especialmente devastadora es la incapacidad del coraz6n de repararse tras la lesi6n. Debido a que las celulas musculares cardiacas, es decir, las celulas miocardicas, son incapaces de dividirse y repoblar las areas lesionadas, la perdida de celulas cardiacas como resultado de la lesi6n o la enfermedad es en gran parte irreversible (Abbate et al, 2002; Remme, 2000).

20 De las formas disponibles de terapia, los trasplantes de coraz6n de ser humano a ser humano han sido las mas eficaces para tratar las enfermedades y trastornos cardiovasculares graves. De hecho, actualmente la tasa de supervivencia a un ano y cinco anos del receptor de trasplante cardiaco medio es superior al 70 por ciento. Desafortunadamente, sin embargo, el trasplante es una forma gravemente limitada de terapia por varias razones, concretamente, la escasez de donantes adecuados, el coste del procedimiento y la probabilidad elevada de rechazo del

25 injerto y problemas asociados tales como infecciones, disfunci6n renal y canceres relacionados con los inmunodepresores (AmericanHeartAssociation, 2002).

Una alternativa a la terapia de trasplante es el uso de la medicina regenerativa para reparar y regenerar las celulas musculares cardiacas danadas. La medicina regenerativa aprovecha, de una manera dirigida clfnicamente, la capacidad de las celulas madre (es decir, las celulas maestras sin especializar del cuerpo) de renovarse indefinidamente

30 y desarrollarse hasta celulas especializadas maduras. Las celulas madre se hallan en los embriones durante las etapas tempranas del desarrollo, en el tejido fetal y en algunos 6rganos y tejidos adultos (Pera et al., 2000). Se sabe que las celulas madre embrionarias (denominadas mas adelante en la presente memoria "ESCs") se convierten en muchos, si no todos, los tipos de celulas y tejidos del cuerpo. Las ESCs no solamente contienen toda la informaci6n genetica del individuo, sino que tambien contienen la capacidad nata de convertirse en cualquiera de las mas de 200

35 celulas y tejidos del cuerpo. Asf, estas celulas tienen un potencial enorme para la medicina regenerativa. Por ejemplo, las ESCs se pueden cultivar hasta tejidos especfficos tales como coraz6n, pulm6n o rin6n, que se podrfan usar despues para reparar 6rganos lesionados y enfermos (Assady et al., 2001; Jacobson et al., 2001; Odorico et al., 2001). Sin embargo, los tejidos derivados de ESCs tienen limitaciones clfnicas. Debido a que las ESCs derivan necesariamente de otro individuo, es decir, un embri6n, existe el riesgo de que el sistema inmunitario del receptor re

40 chace el material biol6gico nuevo. Aunque hay disponibles farmacos inmunodepresores para evitar dicho rechazo, se sabe que tales farmacos tambien bloquean respuestas inmunitarias deseables, tales como hacia las infecciones bacterianas y virus. Ademas, el debate etico sobre la fuente de las ESCs, es decir, los embriones, esta bien documentado y presenta un obstaculo adicional y, quizas, insuperable para un futuro previsible.

Las celulas madre de adulto (denominadas de forma intercambiable "ASCs" mas adelante en la presente memoria)

45 representan una alternativa al uso de ESCs. Las ASCs residen discretamente en muchos tejidos no embrionarios, supuestamente esperando para responder a traumatismos u otros procesos patol6gicos destructivos, de manera que puedan curar el tejido lesionado (Arvidsson et al., 2002; BonnerWeir y Sharma, 2002; Clarke y Frisen, 2001; Crosby y Strain, 2001; Jiang et al., 2002a). Notablemente, las pruebas cientfficas emergentes indican que cada individuo porta un grupo de ASCs que pueden compartir con las ESCs la capacidad de convertirse en muchos, si no en todos,

50 los tipos de celulas y tejidos (Young et al., 2001; Jiang et al., 2002a; Jiang et al., 2002b; Schwartz et al., 2002). Asf, las ASCs, como las ESCs, tienen un potencial enorme para las aplicaciones clfnicas de la medicina regenerativa.

Se ha demostrado que las poblaciones de ASCs estan presentes en uno o mas de medula 6sea, piel, musculo, hfgado y cerebro (Jiang et al., 2002b; Alison, 1998; Crosby y Strain, 2001). Sin embargo, la frecuencia de ASCs en estos tejidos es baja. Por ejemplo, se estima que la frecuencia de las celulas madre mesenquimatosas en la medula

55 6sea es entre 1 en 100.000 y 1 en 1.000.000 de celulas nucleadas (D'Ippolito et al., 1999; Banfi et al., 2001; Falla et al., 1993). De forma similar, la extracci6n de ASCs de la piel implica una serie complicada de etapas de cultivo celular durante varias semanas (Toma et al., 2001) y la aplicaci6n clfnica de ASCs derivadas de musculo esqueletico requiere una fase de cultivo de dos a tres semanas (Hagege et al., 2003). Asf, cualquier aplicaci6n clfnica propuesta

de las ASCs a partir de tales tejidos requiere incrementar el numero de celulas, la pureza y la madurez mediante procedimientos de purificaci6n celular y de cultivo celular.

Aunque las etapas de cultivo celular pueden proporcionar un numero de celulas, pureza y madurez incrementadas, lo hacen con cierto coste. Este coste puede incluir una o mas de las siguientes dificultades tecnicas: perdida de la funci6n celular debido al envejecimiento celular, perdida de poblaciones de celulas que no son celulas madre potencialmente utiles, retrasos en la aplicaci6n potencial de las celulas a los pacientes, coste econ6mico incrementado y riesgo incrementado de contaminaci6n de las celulas con microorganismos ambientales durante el cultivo. Los estudios recientes que examinan los efectos terapeuticos de ASCs derivadas de medula 6sea han usado esencialmente medula 6sea completa para evitar los problemas asociados al cultivo celular (Horwitz et al., 2001; Orlic et al., 2001; Stamm et al., 2003; Strauer et al., 2002). Los beneficios clfnicos, sin embargo, han sido sub6ptimos, un resultado relacionado casi con toda seguridad con la dosis y pureza limitadas de las ASCs disponibles intrfnsecamente en la medula 6sea.

Recientemente, se ha demostrado que el tejido adiposo es una fuente de ASCs (Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002). El documento WO 00/53795 describe celulas madre derivadas de tejido adiposo y mallas, p.ej. celulas madre derivadas de tejido adiposo sustancialmente exentas de adipocitos y eritrocitos sangufneos y poblaciones clonales de celulas madre de tejido conectivo. Las celulas se pueden emplear, solas o en composiciones biol6gicamente compatibles, para generar tejidos y estructuras diferenciadas, tanto in vivo como in vitro. A diferencia de la medula 6sea, la piel, el musculo, el hfgado y el cerebro, el tejido adiposo es comparativamente facil de recoger en cantidades relativamente grandes (Commons et al., 2001; Katz et al., 2001b). Ademas, se ha mostrado que las ASCs derivadas de tejido adiposo poseen la capacidad de generar multiples tejidos in vitro, lo que incluye hueso, grasa, cartflago y musculo (Ashjian et al., 2003; Mizuno et al., 2002; Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002). Asf, el tejido adiposo representa una fuente 6ptima de ASCs para su uso en la medicina regenerativa. Los metodos adecuados para recoger ASCs derivadas de tejido adiposo, sin embargo, son escasos en la tecnica. Los metodos existentes poseen varios defectos. Por ejemplo, los metodos existentes carecen de la capacidad de acomodar de forma 6ptima un dispositivo de aspiraci6n para la extracci6n de tejido adiposo. Los metodos existentes tambien carecen de automatizaci6n parcial o completa desde la fase de recogida del tejido adiposo hasta las fases de procesamiento del tejido (Katz et al., 2001a). Los metodos existentes carecen ademas de capacidad para un volumen mayor de 100 ml de tejido adiposo. Los metodos existentes carecen ademas de un sistema parcialmente o completamente cerrado desde la fase de recogida del tejido adiposo hasta las fases de procesamiento del tejido. Finalmente, los metodos existentes carecen de la capacidad de eliminaci6n de los componentes para atenuar los riesgos concomitantes de contaminaci6n cruzada del material de una muestra a otra. En resumen, los metodos de la tecnica anterior para la recogida de ASCs de tejido adiposo no superan las dificultades tecnicas asociadas a la recogida de ASCs de la piel, musculo, hfgado y cerebro descrita anteriormente.

Por lo tanto, dado el potencial terapeutico enorme de las ASCs, existe la necesidad urgente en la tecnica de un dispositivo, sistema o metodo para recoger ASCs de tejido adiposo que produzca una poblaci6n de ASCs con rendimiento, consistencia y/o pureza incrementados, y que lo haga rapidamente y de forma fiable con una necesidad disminuida o inexistente de manipulaci6n postextracci6n. De manera ideal, dicho dispositivo, sistema o metodo producirfa ASCs de una manera adecuada para la colocaci6n directa en un receptor. El acceso a dicho dispositivo, sistema o metodo en combinaci6n con metodos y composiciones que usan ASCs derivadas de tejido adiposo para el tratamiento de enfermedades y trastornos cardiovasculares revolucionarfa el tratamiento de tales trastornos. Dada la prevalencia de la enfermedad cardiovascular y la escasez de opciones de tratamientos actuales, dicho tratamiento se necesita urgentemente.

SUMARIO DE LA INVENCION

La presente invenci6n se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que se pueden usar celulas madre adultas derivadas de tejido adiposo para tratar afecciones, enfermedades o trastornos cardiovasculares. La presente invenci6n se basa ademas en el descubrimiento de dispositivos, sistemas y metodos para la preparaci6n de celulas madre y progenitoras adultas derivadas de tejido adiposo. La presente invenci6n se basa ademas en el descubrimiento de metodos y composiciones de celulas madre y progenitoras adultas derivadas de tejido adiposo para tratar afecciones, enfermedades o trastornos cardiovasculares. Por lo tanto, un aspecto de la presente invenci6n se dirige al uso de una composici6n que comprende una poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) en la fabricaci6n de un medicamento para restablecer el flujo sangufneo en un sujeto que se ha determinado que tiene una isquemia, en la que dicha poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) comprende celulas progenitoras derivadas de tejido adiposo y celulas madre adiposas obtenidas procesando el tejido adiposo de dicho paciente en un sistema que esta configurado para mantener una ruta de fluidos/tejidos cerrada esteril, y dicho sistema comprende una camara de recogida conectada a una camara de mezcla/procesamiento.

El procesamiento del tejido adiposo se da en un sistema que mantiene una ruta de fluidos/tejidos cerrada esteril. Esto se consigue mediante el uso de un grupo unido preensamblado de recipientes y tubos cerrados esteriles que posibilitan la transferencia de elementos de tejidos y fluidos dentro de una ruta cerrada. Este equipo de procesamiento puede estar asociado a una serie de reactivos de procesamiento (p.ej., soluci6n salina, enzimas, etc.) insertados en un dispositivo que puede controlar la adici6n de los reactivos, la temperatura, y el tiempo de procesamiento, por lo que libera asf a los operadores de la necesidad de controlar manualmente el proceso. En una aproximaci6n

preferida, el procedimiento completo de extracci6n de tejido por medio del procesamiento y la preparaci6n para la colocaci6n en el receptor se llevarfa a cabo en su totalidad en la misma instalaci6n, de hecho, incluso dentro de la misma habitaci6n del paciente que se somete al procedimiento.

El tejido adiposo en bruto se puede procesar para eliminar sustancialmente los adipocitos maduros y el tejido conectivo, por lo que se obtiene una diversidad heterogenea de celulas derivadas de tejido adiposo adecuadas para la colocaci6n en el organismo de un receptor. Las celulas se pueden preparar para la colocaci6n en el receptor en combinaci6n con otras celulas, tejidos, fragmentos de tejidos, u otros estimuladores del crecimiento y/o la diferenciaci6n celular. En una realizaci6n preferida, las celulas, con cualquiera de los aditivos anteriormente mencionados, son para la colocaci6n en una persona de la cual se obtuvieron en el contexto de un unico procedimiento operativo con la intenci6n de obtener un beneficio terapeutico para el receptor.

Las celulas de la invenci6n se pueden proporcionar mediante el uso del metodo que incluye las etapas de: a) proporcionar un sistema de extracci6n de tejido; b) extraer el tejido adiposo de un paciente mediante el uso del sistema de extracci6n de tejido, y el tejido adiposo tiene una concentraci6n de celulas madre; c) procesar al menos una parte del tejido adiposo para obtener una concentraci6n de celulas madre distinta de la concentraci6n de celulas madre del tejido adiposo antes del procesamiento, para la administraci6n de las celulas madre y progenitoras a un paciente sin extraer las celulas madre y progenitoras del sistema de extracci6n de tejido antes de administrarlas al paciente mediante el uso de varios metodos conocidos para una persona de experiencia habitual en la tecnica, que incluyen, pero sin limitaci6n, la vfa intravenosa, intracoronaria y endomiocardica.

Un sistema usado por la invenci6n y descrito incluye a) un recipiente de recogida de tejido que incluye i) un orificio de entrada de recogida de tejido estructurado para recibir el tejido adiposo extrafdo de un paciente; y ii) un filtro dispuesto dentro del recipiente y que esta estructurado para retener el tejido adiposo extrafdo de un paciente y para hacer pasar el tejido no adiposo extrafdo del paciente; b) un recipiente de mezcla acoplado al recipiente de recogida de tejido para recibir las celulas madre obtenidas del tejido adiposo sin la extracci6n de las celulas madre del sistema de extracci6n de tejido, y que incluye un orificio de adici6n para la administraci6n de al menos un aditivo para mezclarlo con las celulas madre contenidas en el; y c) una salida estructurada para permitir que las celulas del recipiente de mezcla se extraigan del sistema de recogida de tejido para la administraci6n a un paciente.

Cualquier caracterfstica o combinaci6n de caracterfsticas descritas en la presente memoria estan incluidas dentro del alcance de la presente invenci6n, con tal de que las caracterfsticas incluidas en cualquier combinaci6n no sean mutuamente incoherentes, como sera evidente a partir del contexto, esta memoria descriptiva, y el conocimiento de una persona de experiencia habitual en la tecnica. Las ventajas y aspectos adicionales de la presente invenci6n son evidentes en la siguiente descripci6n detallada.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 representa un sistema de extracci6n de tejido para el procesamiento del tejido adiposo.

La Figura 2 representa un recipiente de recogida de tejido del sistema de extracci6n de tejido de la Fig. 1.

La Figura 3 es una vista transversal parcial del recipiente de recogida de tejido de la Fig. 2.

La Figura 4 representa un dispositivo de procesamiento para automatizar el funcionamiento de un sistema de extracci6n de tejido.

Las Figuras 5A y 5B representan la expresi6n de la protefna VEGF (5A) y PIGF (5B) en celulas madre derivadas de tejido adiposo.

La Figura 6 representa la detecci6n de celulas progenitoras endoteliales en poblaciones de celulas madre derivadas de tejido adiposo.

Las Figuras 7A y 7B representan el desarrollo in vitro de estructuras vasculares en ratones normales (7A) y tratados con estreptozotocina (7B).

La Figura 8 representa el restablecimiento medio incrementado del flujo sangufneo en ratones con isquemia de las extremidades posteriores tratados con celulas madre derivadas de tejido adiposo en comparaci6n con un control negativo.

Las Figuras 9A y 9B demuestran que una dosis creciente de celulas madre derivadas de tejido adiposo mejora la supervivencia del injerto y la angiogenesis (9A), y representan la retenci6n de la arquitectura del tejido adiposo en una muestra histol6gica (9B).

La Figura 10 representa la evoluci6n histol6gica en el tiempo del injerto de celulas madre derivadas de tejido adiposo donante en un area de miocardio infartado.

La Figura 11 representa la tinci6n positiva doble para betagalactosidasa y cadena pesada de miosina. Las celulas destacadas exhiben la tinci6n azul de betagalactosidasa, que demuestra su origen a partir de las celulas de tejido

adiposo donante, y la tinci6n marr6n que indica la expresi6n de la cadena pesada de la protefna muscular cardiaca miosina. Las celulas que exhiben tinci6n tanto marr6n como azul (tal como se indica mediante las flechas) son celulas derivadas de tejido adiposo que han adquirido el fenotipo de celulas musculares cardiacas.

La Figura 12 representa grupos de celulas madre derivadas de tejido adiposo derivadas de donante en una regi6n de miocardio infartado tras una lesi6n por oclusi6n/reperfusi6n en rata.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invenci6n proporciona, por primera vez, medicamentos de eficacia probada para el tratamiento de afecciones, enfermedades y trastornos cardiovasculares mediante el uso de celulas madre y progenitoras derivadas de tejido adiposo. Especfficamente, la presente invenci6n demuestra, por primera vez, que las celulas madre y progenitoras derivadas de tejido adiposo de la invenci6n (1) expresan factores de crecimiento angiogenicos y arteriogenicos, que incluyen factor de crecimiento de placenta (PIGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), (2) contienen celulas progenitoras endoteliales (EPC) que tienen una funci6n bien establecida en la formaci6n de vasos sangufneos, (3) se desarrollan hasta vasos sangufneos in vitro, (4) apoyan la supervivencia del tejido isquemico in vivo, (5) inducen la reperfusi6n tras una lesi6n por oclusi6n/reperfusi6n en las extremidades posteriores, (6) cuando se inyectan en animales tras una lesi6n cardiaca se dirigen al coraz6n, y (7) cuando se inyectan en animales tras una lesi6n cardiaca se diferencian hasta celulas que expresan marcadores coherentes con su diferenciaci6n hasta miocitos cardiacos. Por lo tanto, la presente descripci6n demuestra de manera concluyente que las celulas madre y progenitoras derivadas de tejido adiposo inventivas de la presente invenci6n son utiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos cardiovasculares.

Para que la presente invenci6n se pueda entender mas facilmente, primero se definen ciertos terminos. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripci6n detallada.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresi6n "tejido adiposo" se refiere a un tejido que contiene multiples tipos celulares, que incluyen adipocitos y celulas microvasculares. El tejido adiposo incluye celulas madre y celulas precursoras endoteliales. Por lo tanto, el tejido adiposo se refiere a la grasa, lo que incluye el tejido conectivo que almacena la grasa.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresi6n "unidad de tejido adiposo" se refiere a una cantidad discreta o medible de tejido adiposo. Se puede medir una unidad de tejido adiposo determinando el peso y/o el volumen de la unidad. Basandose en los datos identificados anteriormente, una unidad de lipoaspirado procesado, tal como se extrae de un paciente, tiene un componente celular en el que al menos un 0,1% del componente celular son celulas madre. Con referencia a la descripci6n de la presente memoria, una unidad de tejido adiposo puede referirse a la cantidad total de tejido adiposo extrafda de un paciente, o a una cantidad que es menor que la cantidad total de tejido adiposo extrafda de un paciente. Asf, una unidad de tejido adiposo se puede combinar con otras unidades de tejido adiposo para formar una unidad de tejido adiposo que tiene un peso o volumen que es la suma de las unidades individuales.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "porci6n" se refiere a una cantidad de un material que es menor que el total. Una porci6n menor se refiere a una cantidad que es menor del 50%, y una porci6n mayor se refiere a una cantidad mayor del 50%. Asf, una unidad de tejido adiposo que es menor de la cantidad total de tejido adiposo extrafda de un paciente es una porci6n del tejido adiposo extrafdo.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresi6n "celula madre" se refiere a celulas multipotentes que tienen el potencial de diferenciarse hasta una diversidad de otros tipos celulares, que llevan a cabo una o mas funciones especfficas y que tienen la capacidad de autorenovarse. Algunas de las celulas madre descritas en la presente memoria pueden ser pluripotentes.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresi6n "celula progenitora" se refiere a celulas unipotentes, bipotentes, o multipotentes con la capacidad de diferenciarse hasta uno o mas tipos celulares, que llevan a cabo una o mas funciones especfficas y que tienen una capacidad limitada o inexistente de autorenovarse. Algunas de las celulas progenitoras descritas en la presente memoria pueden ser pluripotentes.

Tal como se usa en la presente memoria, "numero de celulas madre" o "frecuencia de celulas madre" se refiere al numero de colonias observadas en un ensayo clonogenico en el que se siembran en placas celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) a una densidad baja de celulas ( 10.000 celulas/pocillo) y se cultivan en un medio de cultivo que soporta el crecimiento de MSC (por ejemplo, medio DMEM/F12 complementado con un 10% de suero bovino fetal, 5% de suero de caballo, y agentes antibi6ticos/antimic6ticos. Las celulas se cultivan durante dos semanas, tras lo cual los cultivos se tinen con hematoxilina y las colonias de mas de 50 celulas se cuentan como UFCF. La frecuencia de celulas madre se calcula como el numero de UFCF observado por 100 celulas nucleadas sembradas en las placas (por ejemplo; 15 colonias contadas en una placa iniciada con 1.000 celulas ADC nucleadas proporciona una frecuencia de celulas madre del 1,5%). El numero de celulas madre se calcula como la frecuencia de celulas madre multiplicada por el numero total de celulas ADC nucleadas obtenido. Un alto porcentaje (-100 %) de las UFCF cultivadas a partir de celulas ADC expresan la molecula de superficie celular CD105, que tambien se expresa en las celulas madre derivadas de medula 6sea (Barry et al., 1999). CD105 tambien se expresa en las celulas madre

derivadas de tejido adiposo (Zuk et al., 2002).

Como se usa en la presente memoria, la expresi6n "lipoaspirado procesado" se refiere al tejido adiposo que se ha procesado para separar el componente celular activo (p.ej., el componente que contiene celulas madre y progenitoras) de los adipocitos maduros y del tejido conectivo. Esta fracci6n se denomina en la presente memoria "celulas derivadas de tejido adiposo" o "ADC". En general, ADC se refiere al sedimento de celulas obtenido mediante lavado y separaci6n de las celulas del tejido adiposo. El sedimento se obtiene generalmente centrifugando una suspensi6n de celulas, de forma que las celulas se agregan en el fondo de un recipiente de centrffuga.

Tal como se usa en la presente memoria, la frase "afecci6n, enfermedad o trastorno cardiovascular" pretende incluir todos los trastornos caracterizados por una funci6n cardiaca insuficiente, indeseada o anormal, p.ej., cardiopatfa isquemica, cardiopatfa hipertensiva y cardiopatfa hipertensiva pulmonar, valvulopatfa, cardiopatfa congenita, y cualquier afecci6n que conduzca a insuficiencia cardiaca congestiva en un sujeto, en particular un sujeto humano. La funci6n cardiaca insuficiente o anormal puede ser el resultado de una enfermedad, lesi6n y/o envejecimiento. A modo de antecedentes, una respuesta a la lesi6n miocardica sigue una ruta bien definida en la que algunas celulas mueren mientras otras entran en un estado de hibernaci6n en el que todavfa no estan muertas, pero son disfuncionales. Esto va seguido de infiltraci6n de celulas inflamatorias y deposici6n de colageno como parte de la cicatrizaci6n, todo lo cual sucede a la vez que el crecimiento interno de vasos sangufneos nuevos y cierto grado de muerte celular continuada. Tal como se usa en la presente memoria, el termino "isquemia" se refiere a cualquier isquemia tisular localizada debida a la reducci6n del flujo de entrada de sangre. La expresi6n "isquemia miocardica" se refiere a alteraciones circulatorias provocadas por aterosclerosis coronaria y/o aporte de oxfgeno inadecuado al miocardio. Por ejemplo, un infarto de miocardio agudo representa una lesi6n isquemica irreversible del tejido miocardico. Esta lesi6n es el resultado de un suceso oclusivo (p.ej., tromb6tico o emb6lico) en la circulaci6n coronaria, y produce un medio en el que las necesidades metab6licas miocardicas superan el aporte de oxfgeno al tejido miocardico.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "angiogenesis" se refiere al proceso mediante el cual se generan vasos sangufneos nuevos a partir de la vasculatura y el tejido existentes (Folkman, 1995). La frase "reparar o remodelar" se refiere a la reforma de la vasculatura existente. El alivio de la isquemia tisular depende de forma crftica de la angiogenesis. El crecimiento espontaneo de vasos sangufneos nuevos proporciona una circulaci6n colateral en y alrededor de un area isquemica, mejora el flujo sangufneo y alivia los sfntomas provocados por la isquemia. Tal como se usa en la presente memoria, la expresi6n "factor angiogenico" o "protefna angiogenica" se refiere a cualquier protefna conocida capaz de estimular el crecimiento de vasos sangufneos nuevos a partir de la vasculatura existente ("angiogenesis"). Los factores angiogenicos adecuados para su uso en la invenci6n incluyen, pero sin limitaci6n, Factor de Crecimiento Placentario (Luttun et al., 2002), Factor Estimulador de Colonias de Macr6fagos (Aharinejad et al., 1995), Factor Estimulador de Colonias de Macr6fagos y Granulocitos (Buschmann et al., 2003), Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF)A, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, VEGFE (Mints et al., 2002), neuropilina (Wang et al., 2003), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)1, FGF2(bFGF), FGF3, FGF4, FGF5, FGF6 (Botta et al., 2000), Angiopoyetina 1, Angiopoyetina 2 (Sundberg et al., 2002), eritropoyetina (Ribatti et al., 2003), BMP2, BMP4, BMP7 (Carano y Filvaroff, 2003), TGFbeta (Xiong et al., 2002), IGF1(Shigematsu et al., 1999), Osteopontina (Asou et al., 2001), Pleiotropina (Beecken et al., 2000), Activina (Lamouille et al., 2002), Endotelina1 (Bagnato y Spinella, 2003) y combinaciones de los mismos. Los factores angiogenicos pueden actuar de forma independiente, o en combinaci6n entre sf. Cuando estan en combinaci6n, los factores angiogenicos pueden actuar tambien de forma sinergica, por lo que el efecto combinado de los factores es mayor que la suma de los efectos de los factores individuales tomados por separado. La expresi6n "factor angiogenico" o "protefna angiogenica" tambien abarca los analogos funcionales de tales factores. Los analogos funcionales incluyen, por ejemplo, las porciones funcionales de los factores. Los analogos funcionales tambien incluyen anticuerpos antiidiotfpicos que se unen a los receptores de los factores y, asf, imitan la actividad de los factores en la estimulaci6n de la angiogenesis y/o la remodelaci6n de los tejidos. Los metodos para generar tales anticuerpos antiidiotfpicos se conocen bien en la tecnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO 97/23510.

Los factores angiogenicos usados en la presente invenci6n se pueden producir u obtener a partir de cualquier fuente adecuada. Por ejemplo, los factores se pueden purificar a partir de sus fuentes nativas, o se pueden producir de forma sintetica o mediante expresi6n recombinante. Los factores se pueden administrar a pacientes en forma de una composici6n proteica. De manera alternativa, los factores se pueden administrar en forma de un plasmido de expresi6n que codifica los factores. La construcci6n de plasmidos de expresi6n adecuados se conoce bien en la tecnica. Los vectores adecuados para construir plasmidos de expresi6n incluyen, por ejemplo, vectores adenovirales, vectores retrovirales, vectores virales adenoasociados, vectores de ARN, liposomas, lfpidos cati6nicos, vectores lentivirales y transposones.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "arteriogenesis" se refiere al proceso de aumentar el crecimiento de arterias colaterales y/u otras arterias a partir de conexiones arteriolares preexistentes (Carmeliet, 2000; Scholz et al., 2001; Scholz et al., 2002). Mas en particular, la arteriogenesis es el reclutamiento in situ y la expansi6n de arterias mediante la proliferaci6n de las celulas musculares lisas y endoteliales a partir de las conexiones arteriolares preexistentes que suministran sangre al tejido isquemico, tumor o sitio de inflamaci6n. Estos vasos crecen principalmente fuera del tejido afectado y son importantes para el suministro de nutrientes en la zona isquemica, el tumor o el sitio de inflamaci6n. La arteriogenesis es parte de la respuesta normal a la isquemia miocardica (Mills et al., 2000; Monteiro et al., 2003). Ademas, la tecnica quirurgica habitual de un injerto de derivaci6n aortocoronaria

(CABG) es, en efecto, nada mas que la creaci6n de un vaso colateral artificial (Sergeant et al., 1997). Asf, los procesos que favorecen la arteriogenesis tras un infarto mejoraran el flujo sangufneo al tejido isquemico, lo que da como resultado una muerte celular disminuida y un tamano de infarto disminuido. Estas mejoras daran como resultado una funci6n cardiaca mejorada y un beneficio terapeutico.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "tratar" incluye reducir o aliviar al menos un efecto adverso o sfntoma de una afecci6n, enfermedad o trastorno cardiovascular, es decir, cualquier trastorno caracterizado por una funci6n cardiaca insuficiente o indeseada. Los efectos adversos o sfntomas de los trastornos cardiacos son muy conocidos en la tecnica e incluyen, pero sin limitaci6n, disnea, dolor toracico, palpitaciones, mareos, sfncope, edema, cianosis, palidez, fatiga y muerte.

Tal como se usan en la presente memoria, los terminos "administrar", "introducir" y "trasplantar" se usan de forma intercambiable en la presente memoria, y se refieren a la colocaci6n de las ADC de la invenci6n en un sujeto mediante un metodo o vfa que da como resultado al menos la localizaci6n parcial de las ADC en un sitio deseado. Las ADC se pueden administrar mediante cualquier ruta adecuada que de como resultado el suministro en una localizaci6n deseada en el sujeto, en la que al menos una porci6n de las celulas o componentes de las celulas siguen siendo viables. El periodo de viabilidad de las celulas tras la administraci6n a un sujeto puede ser tan corto como unas pocas horas, p.ej., veinticuatro horas, hasta varios dfas, o tan largo como varios anos.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "sujeto" incluye animales de sangre caliente, preferentemente mamfferos, lo que incluye seres humanos. En una realizaci6n preferida, el sujeto es un primate. En una realizaci6n aun mas preferida, el sujeto es un ser humano.

Ahora se hara referencia en detalle a las realizaciones actualmente preferidas de la invenci6n, cuyos ejemplos se ilustran en las Figuras adjuntas. Siempre que sea posible, se usan los mismos o similares numeros de referencia en los dibujos y la descripci6n para referirse a las mismas partes o a partes similares. Se deberfa indicar que los dibujos estan en una forma simplificada, y no estan a una escala precisa. En referencia a la descripci6n de la presente memoria, por comodidad y claridad unicamente, los terminos direccionales, tales como parte superior, parte inferior, izquierda, derecha, arriba, abajo, sobre, por encima, debajo, por debajo, parte trasera y parte frontal, se usan con respecto a los dibujos adjuntos. No se deberfa interpretar que tales terminos direccionales limiten el alcance de la invenci6n de ninguna manera.

Aunque la descripci6n de la presente memoria se refiere a ciertas realizaciones ilustradas, se debe entender que estas realizaciones se presentan a modo de ejemplo, y no a modo de limitaci6n. Se debe considerar que la intenci6n de la siguiente descripci6n detallada, aunque trata las realizaciones ejemplares, cubre todas las modificaciones, alternativas y equivalentes de las realizaciones que se pueden hallar dentro del espfritu y del alcance de la invenci6n, tal como se define mediante las reivindicaciones adjuntas. La presente invenci6n se puede poner en practica junto con diversas tecnicas de separaci6n de celulas o tejidos que se usan convencionalmente en la tecnica, y en la presente memoria se incluyen solamente tantas etapas de los procesos puestos en practica habitualmente como sean necesarias para facilitar el entendimiento de la presente invenci6n.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invenci6n se dirige al uso de una composici6n que comprende una poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) en la fabricaci6n de un medicamento para restablecer el flujo sangufneo en un sujeto que se ha determinado que tiene una isquemia, en el que dicha poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) comprende celulas progenitoras derivadas de tejido adiposo y celulas madre adiposas obtenidas procesando el tejido adiposo de dicho paciente en un sistema que esta configurado para mantener una ruta de fluidos/tejidos cerrada esteril, y dicho sistema comprende una camara de recogida conectada a una camara de mezcla/procesamiento. Las celulas de la poblaci6n se pueden administrar a un paciente que padece una enfermedad o trastorno cardiovascular sin otros adipocitos o tejido conectivo.

En particular, la presente invenci6n se dirige al uso de una composici6n que comprende una poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo para la preparaci6n de un medicamento para minimizar la lesi6n y estimular la reparaci6n y la regeneraci6n miocardica durante este proceso. Estas incluyen, entre otras: la capacidad de sintetizar y secretar factores de crecimiento que estimulan la formaci6n de vasos sangufneos nuevos; la capacidad de sintetizar y secretar factores de crecimiento que estimulan la supervivencia y la proliferaci6n celular; la capacidad de proliferar y diferenciarse hasta celulas que participan directamente en la formaci6n de vasos sangufneos nuevos; la capacidad de realizar un injerto en el miocardio lesionado e inhibir la cicatrizaci6n (deposici6n y reticulaci6n de colageno); la capacidad de proliferar y diferenciarse hasta celulas musculares capaces de contribuir a la contractilidad miocardica; y la capacidad de proliferar y diferenciarse hasta celulas miocardicas.

I. Metodos descritos en la presente memoria

1. Metodos de Obtenci6n de un Lipoaspirado Procesado (ADC)

Se ha descubierto que el tejido adiposo es una fuente especialmente rica de celulas madre y progenitoras. Este hallazgo puede ser debido, al menos en parte, a la facilidadde eliminaci6n del componente mayoritario que no es de celulas madre del tejido adiposo, el adipocito. Asf, tanto en estudios en seres humanos como en animales, el lipoaspirado procesado (ADC) contiene celulas madre con una frecuencia de al menos un 0,1%, y mas en general mas de

un 0,5%. En ciertas realizaciones de la invenci6n, se han obtenido ADC que contienen alrededor de un 212% de celulas madre. En otras realizaciones adicionales, las ADC se procesan para obtener una poblaci6n de celulas en la que las celulas madre constituyen hasta un 100% de las celulas de la poblaci6n. La pureza/frecuencia de las celulas madre obtenidas de acuerdo con la invenci6n descrita en la presente memoria es sustancialmente mayor que la frecuencia publicada de 1 en 100.000 (0,001%) en medula 6sea (D'Ippolito et al., 1999; Banfi et al., 2001; Falla et al., 1993; Muschler et al., 2001). Ademas, la recogida de tejido adiposo esta asociada a una morbilidad menor que la recogida de un volumen similar de medula 6sea (Nishimori et al., 2002). Ademas, el tejido adiposo contiene celulas precursoras endoteliales, que son capaces de proporcionar una terapia a los pacientes (vease (Asahara et al., 1999; Kaushal et al., 2001; Kawamoto et al., 2003; Kawamoto et al., 2001)).

Las celulas que son para la administraci6n a un paciente se obtienen del tejido adiposo. El tejido adiposo se puede obtener mediante cualquier metodo conocido para una persona de experiencia habitual en la tecnica. Por ejemplo, se puede extraer el tejido adiposo de un paciente mediante lipoplastia asistida por succi6n, lipoplastia asistida por ultrasonidos, y lipectomfa de escisi6n. Ademas, los procedimientos pueden incluir una combinaci6n de tales procedimientos, tal como una combinaci6n de lipectomfa de escisi6n y lipoplastia asistida por succi6n. Debido a que el tejido o cierta fracci6n del mismo se destina a la reimplantaci6n en un paciente, el tejido adiposo se deberfa recoger de una manera que preserve la viabilidad del componente celular y que minimice la probabilidad de contaminaci6n del tejido con organismos potencialmente infecciosos, tales como bacterias y/o virus. Asf, la extracci6n del tejido se deberfa llevar a cabo de una manera esteril o aseptica para minimizar la contaminaci6n. Puede ser deseable la lipoplastia asistida por succi6n para extraer el tejido adiposo de un paciente, ya que proporciona un metodo mfnimamente invasivo de recogida del tejido con una probabilidad mfnima de lesi6n de las celulas madre que puede estar asociada a otras tecnicas, tales como la lipoplastia asistida por ultrasonidos.

Para los procedimientos lipoplasticos asistidos por succi6n, el tejido adiposo se recoge mediante la inserci6n de una canula en o cerca de un dep6sito de tejido adiposo presente en el paciente, seguido por la aspiraci6n del tejido adiposo hasta un dispositivo de succi6n. Se puede acoplar una canula pequena a una jeringa, y el tejido adiposo se puede aspirar mediante el uso de una fuerza manual (Asken, 1990). Mediante el uso de una jeringa o de otro dispositivo similar puede ser deseable recoger cantidades relativamente moderadas de tejido adiposo (p.ej., de 0,1 ml a varios cientos de mililitros de tejido adiposo). Los procedimientos que emplean estos dispositivos relativamente pequenos tienen la ventaja de que los procedimientos se pueden llevar a cabo con anestesia local solamente, en vez de anestesia general. Los volumenes mayores de tejido adiposo por encima de este intervalo (p.ej., mas de varios cientos de mililitros) pueden requerir anestesia general segun el criterio del donante y de la persona que lleva a cabo el procedimiento de recogida. Cuando se desea extraer volumenes mayores de tejido adiposo, se pueden emplear canulas relativamente mayores y dispositivos de succi6n automatizados en el procedimiento (Commons et al., 2001).

Los procedimientos de lipectomfa de escisi6n incluyen, y sin limitaci6n, los procedimientos en los que se extraen tejidos que contienen tejido adiposo (p.ej., piel) como parte secundaria del procedimiento; es decir, en los que el prop6sito principal de la cirugfa es la extracci6n de tejido (p.ej., piel en la cirugfa bariatrica o cosmetica) y en los que se extrae el tejido adiposo junto con el tejido de interes principal.

El tejido adiposo que se obtiene de un paciente se recoge en un dispositivo para su procesamiento adicional. Tal como se discute en la presente memoria, el dispositivo esta disenado y dedicado al prop6sito de recoger tejido para la fabricaci6n de una poblaci6n celular de tejido adiposo procesado, que incluye celulas madre y/o celulas precursoras endoteliales. El dispositivo puede ser cualquier dispositivo convencional para la recogida de tejido que usan en general los medicos que llevan a cabo el procedimiento de extracci6n.

La cantidad de tejido recogido dependera de varias variables que incluyen, pero sin limitaci6n, el fndice de masa corporal del donante, la disponibilidad de sitios para la recogida de tejido adiposo accesibles, las medicaciones y afecciones concomitantes y preexistentes (tales como la terapia anticoagulante), y el prop6sito clfnico para el que se recoge el tejido. La experiencia con el trasplante de celulas madre hematopoyeticas (celulas madre derivadas de medula 6sea o de sangre de cord6n umbilical usadas para regenerar la capacidad de formaci6n de celulas sangufneas del receptor) demuestra que el injerto depende de la dosis de celulas con efectos de umbral (Smith y Sweetenham, 1995; Barker et al., 2001). Asf, es probable que el principio general de "mas es mejor" se aplique dentro de los lfmites establecidos por otras variables, y que cuando sea factible la recogida recolecte tanto tejido como sea posible.

Se ha descubierto que el porcentaje de celulas madre de 100 ml de tejido adiposo extrafdo de un individuo delgado es mayor que el extrafdo de un donante obeso (Tabla 1). Esto refleja un efecto de diluci6n del contenido de grasa incrementado en el individuo obeso. Por lo tanto, puede ser deseable obtener cantidades mayores de tejido de donantes con sobrepeso en comparaci6n con las cantidades que se extraerfan de pacientes mas delgados. Esta observaci6n tambien indica que la utilidad de esta invenci6n no se limita a individuos con grandes cantidades de tejido adiposo.

Tabla 1: Efecto del indice de Masa Corporal sobre el Rendimiento Tisular y Celular

Estado del indice de Masa Corporal: Cantidad de Tejido Obtenido (g) Rendimiento Total (x107) Celular

Normal: 641 ± 142 2,1 ± 0,4

Obeso: 1.225 ± 173 2,4 ± 0,5

Valor de p: 0,03 0,6

Las celulas madre concentradas pueden ser para la administraci6n de una composici6n que comprende celulas madre derivadas de tejido adiposo y/o celulas precursoras endoteliales sustancialmente exentas de adipocitos maduros y tejido conectivo. En ciertas realizaciones, la composici6n tiene un componente celular en el que al menos un 0,1 % de las celulas son celulas madre. En otras realizaciones, la composici6n tiene un componente celular en el que las celulas madre comprenden entre alrededor del 2% y el 12% del componente celular. Las concentraciones mayores de celulas madre, tales como hasta un 100%, tambien se incluyen en composiciones diferentes. La composici6n puede incluir componentes adicionales, tales como factores de diferenciaci6n celular, estimuladores del cultivo, agentes inmunodepresores, o dispositivos medicos, tal como se discute en la presente memoria. Para obtener ciertas composiciones en las que la composici6n contiene principalmente un tipo de celula (p.ej., celulas madre derivadas de tejido adiposo o celulas precursoras endoteliales derivadas de tejido adiposo), se puede emplear cualquier metodo adecuado para la separaci6n de los diferentes tipos de celulas, tal como el uso de anticuerpos especfficos de celulas que reconocen y se unen a antfgenos presentes en las celulas madre o en las celulas precursoras endoteliales.

Para la mayorfa de aplicaciones, la preparaci6n de la poblaci6n celular activa requerira la eliminaci6n del componente de adipocitos maduros cargados de grasa del tejido adiposo. Esto se lleva a cabo en general mediante una serie de etapas de lavado y de disgregaci6n, en las que primero se lava el tejido para reducir la presencia de lfpidos libres (liberados por los adipocitos rotos) y de elementos de la sangre periferica (liberados por los vasos sangufneos cortados durante la recogida del tejido), y despues se disgregan para liberar los adipocitos intactos y otras poblaciones celulares de la matriz de tejido conectivo. En ciertas realizaciones, se separa todo el componente de adipocitos,

o componente de celulas que no son celulas madre, del componente de celulas madre del tejido adiposo. En otras realizaciones, solamente se separa una porci6n o porciones del componente de adipocitos de las celulas madre. Asf, en ciertas realizaciones, las celulas madre se pueden administrar con celulas precursoras endoteliales.

El lavado es una etapa opcional, pero preferida, en la que el tejido se mezcla con disoluciones para eliminar mediante lavado los lfpidos libres y los componentes celulares individuales, tales como los componentes de la sangre, dejando fragmentos intactos de tejido adiposo. En una realizaci6n, el tejido adiposo que se extrae del paciente se mezcla con soluci6n salina isot6nica u otra(s) soluci6n(es) fisiol6gica(s) (p.ej., Plasmalyte®, de Baxter Inc. o Normoso® de Abbott Labs). Los fragmentos de tejido adiposo intactos se pueden separar de los lfpidos libres y de las celulas mediante cualquier medio conocido para las personas de experiencia habitual en la tecnica, que incluyen, pero sin limitaci6n, la filtraci6n, decantaci6n, sedimentaci6n o centrifugaci6n. En la realizaci6n ilustrada de la invenci6n, el tejido adiposo se separa del tejido no adiposo empleando un filtro dispuesto en un recipiente de recogida de tejidos, tal como se discute en la presente memoria. En otras realizaciones, el tejido adiposo se separa del tejido no adiposo mediante el uso de un recipiente de recogida de tejidos que utiliza la decantaci6n, sedimentaci6n, y/o tecnicas de centrifugaci6n para separar los materiales.

Los fragmentos de tejido intacto se disgregan despues mediante el uso de cualquier tecnica o metodo convencional, que incluye la fuerza mecanica (fuerzas de rotura o cizallamiento), digesti6n enzimatica con enzimas proteolfticas simples o combinadas, tales como colagenasa, tripsina, lipasa, liberasa H1, o miembros de la familia de Blendzyme tal como se describe en la pat. de EE.UU. nO 5.952.215, y pepsina, o una combinaci6n de metodos mecanicos y enzimaticos. Por ejemplo, el componente celular de los fragmentos de tejido intactos se puede disgregar mediante metodos que usan la disociaci6n mediada por colagenasa del tejido adiposo, similar a los metodos para recoger celulas endoteliales microvasculares en el tejido adiposo, tal como se describi6 en la patente de EE.UU. nO

5.372.945. Los metodos adicionales mediante el uso de colagenasa que se pueden usar se describen en la patente de EE.UU. nO 5.830.714 y 5.952.215, y Williams et al., 1995 (Williams et al., 1995). De forma similar, se puede usar una proteasa neutra en vez de colagenasa, tal como se describi6 en (Twentyman y Yuhas, 1980). Ademas, los metodos pueden emplear una combinaci6n de enzimas, tal como una combinaci6n de colagenasa y tripsina, como se describi6 en (Russell et al., 1976); o una combinaci6n de una enzima, tal como tripsina, y disociaci6n mecanica, como se describi6 en (Engelholm et al., 1985).

La poblaci6n de celulas activas (lipoaspirado procesado) se puede obtener despues a partir de los fragmentos de tejido disgregados reduciendo la presencia de adipocitos maduros. Una suspensi6n del lipoaspirado procesado y del lfquido en el que se disgreg6 el tejido adiposo se hace pasar despues a otro recipiente, tal como un recipiente de recogida de celulas. La suspensi6n puede fluir a traves de uno o mas conductos al recipiente de recogida de celulas

mediante el uso de una bomba, tal como una bomba peristaltica, que extrae la suspensi6n del recipiente de recogida de tejido y la impulsa hacia el recipiente de recogida de celulas. Otras realizaciones pueden emplear el uso de la gravedad o del vacfo a la vez que se mantiene un sistema cerrado. La separaci6n de las celulas de la suspensi6n se puede llevar a cabo mediante sedimentaci6n por densidad de flotaci6n, centrifugaci6n, elutriaci6n, filtraci6n, adherencia diferencial a, y eluci6n desde, restos en fase s6lida, selecci6n mediada por anticuerpos, diferencias de carga electrica; microesferas inmunomagneticas, separaci6n celular activada por fluorescencia (FACS), u otros medios. Los ejemplos de estas diversas tecnicas y dispositivos para llevar a cabo las tecnicas se pueden hallar en (Hemstreet et al., 1980; Schweitzer et al., 1995; Gryn et al., 2002; Prince et al., 2002; Watts et al., 2002; Mainwaring y Rowley, 1985; Greenberg y Hammer, 2001) y en las pat. de EE.UU. nOs 6.277.060; 6.221.315; 6.043.066; 6.451.207; 5.641.622; y 6.251.295.

En el sistema ilustrado, las celulas de la suspensi6n se separan del componente acelular de la suspensi6n mediante el uso de un filtro de membrana giratorio. En otras realizaciones, las celulas de la suspensi6n se separan del componente acelular mediante el uso de una centrffuga. En tal sistema ejemplar, el recipiente de recogida de celulas puede ser una bolsa flexible que esta estructurada para ser colocada en una centrffuga (p.ej., manualmente o mediante un equipo rob6tico). En otras realizaciones, no se usa una bolsa flexible. Tras la centrifugaci6n, el componente celular forma un sedimento, que despues se puede resuspender con una disoluci6n tamponada de manera que las celulas se pueden hacer pasar a traves de uno o mas conductos hasta un recipiente de mezcla, tal como se discute en la presente memoria. Los fluidos de resuspensi6n se pueden proporcionar mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, se puede inyectar un tamp6n en un orificio en el recipiente de recogida de celulas, o el recipiente de recogida de celulas puede incluir una reserva de tamp6n que se puede mezclar con el sedimento de celulas rompiendo la reserva. Cuando se usa un filtro de membrana giratorio, la resuspensi6n es opcional, ya que las celulas permanecen en un volumen de lfquido despues del procedimiento de separaci6n.

Aunque el tejido adiposo se puede disgregar completamente para separar las celulas activas de los adipocitos maduros y del tejido conectivo, en una de las aplicaciones se puede disgregar s6lo parcialmente. Por ejemplo, la disgregaci6n parcial se puede llevar a cabo con una o mas enzimas, que se eliminan de al menos una parte del tejido adiposo antes de tiempo, respecto de la cantidad de tiempo que la enzima se dejarfa de otra manera para disgregar completamente el tejido. Tal proceso puede requerir menos tiempo de procesamiento.

En una realizaci6n particular, el tejido se lava con soluci6n salina isot6nica tamponada esteril y se incuba con colagenasa a una concentraci6n de colagenasa, una temperatura, y un tiempo suficientes para proporcionar una disgregaci6n adecuada. En una realizaci6n preferida, la enzima colagenasa usada estara aprobada para el uso en seres humanos por las autoridades pertinentes (p.ej., en los EE.UU., la Food and Drug Administration). Las preparaciones de colagenasa adecuadas incluyen colagenasa recombinante y no recombinante. La colagenasa no recombinante se puede obtener de F. HoffmannLa Roche Ltd, Indianapolis, IN y/o Advance Biofactures Corp., Lynbrook, NY. La colagenasa recombinante tambien se puede obtener como se describi6 en la patente de EE.UU. nO 6.475.764.

En una realizaci6n, las disoluciones contienen colagenasa a concentraciones de alrededor de 10 �g/ml a alrededor de 50 �g/ml, y se incuban a una temperatura de alrededor de 30 �C a alrededor de 38 �C durante un tiempo de alrededor de 20 minutos a alrededor de 60 minutos. Estos parametros variaran de acuerdo con la fuente de la enzima colagenasa, optimizados mediante estudios experimentales, para validar que el sistema es eficaz para extraer las poblaciones de celulas deseadas en un espacio de tiempo adecuado. Una concentraci6n, tiempo y temperatura preferidas particulares son 20 �g/ml de colagenasa (mezclada con la proteasa neutra dispasa; Blendzyme 1, Roche) incubada durante 45 minutos, a alrededor de 37 �C Una realizaci6n preferida alternativa aplica 0,5 unidades/mL de colagenasa (mezclada con la proteasa neutra termolisina; Blendzyme 3). En una realizaci6n especialmente preferida, la enzima colagenasa usada es un material aprobado para uso en seres humanos por las autoridades pertinentes (p.ej., en los EE.UU., la Food and Drug Administration). La colagenasa usada deberfa estar exenta de microorganismos y contaminantes, tales como endotoxinas.

Tras la disgregaci6n, la poblaci6n de celulas activas se puede lavar/aclarar para eliminar los aditivos y/o subproductos del proceso de disgregaci6n (p.ej., colagenasa y lfpidos libres recien liberados). La poblaci6n de celulas activas se podrfa concentrar despues mediante centrifugaci6n u otros metodos conocidos para las personas de experiencia habitual en la tecnica, tal como se discuti6 anteriormente. Estas etapas de lavado/concentraci6n tras el procesamiento se pueden aplicar por separado o simultaneamente.

En una realizaci6n, las celulas se concentran y la colagenasa se elimina pasando la poblaci6n celular a traves de un sistema de membranas giratorias de flujo continuo o similar, tal como, por ejemplo, el sistema descrito en las patentes de EE.UU. nOs 5.034.135; y 5.234.608.

Ademas de lo anterior, hay muchos metodos postlavado que se pueden aplicar para purificar adicionalmente la poblaci6n de celulas activas. Estos incluyen tanto la selecci6n positiva (seleccionar las celulas objetivo), como la selecci6n negativa (eliminaci6n selectiva de las celulas indeseadas), o las combinaciones de los mismos.

En una realizaci6n, tras la etapa de lavado celular se inserta en el sistema un material de fase s6lida con propiedades adhesivas seleccionadas para posibilitar la adherencia y/o eluci6n diferencial de una subpoblaci6n de celulas del lipoaspirado procesado. Esta aproximaci6n general se ha llevado a cabo en la transfusi6n clfnica de sangre, en la

que se usan filtros que capturan de manera diferencial los leucocitos para reducir el contenido de leucocitos sangufneos contaminantes en los eritrocitos transfundidos (Soli et al., 2001). Los filtros de este tipo los distribuye Pall Bedical (Leukogard RS and Purecell RCQ) y Asahi (RS2000). La adherencia diferencial tambien se ha aplicado a la selecci6n positiva de monocitos (Berdel et al., 1982) y de celulas madre epidermicas (Bickenbach y Dunnwald, 2000). En esta realizaci6n, el lipoaspirado procesado se harfa pasar a traves de un material de filtro en condiciones de flujo y tamp6n predeterminadas para favorecer la adherencia diferencial de las celulas objetivo y las poblaciones de celulas indeseadas. Para la selecci6n positiva, el material de filtro y las condiciones permitirfan la adherencia preferente de las celulas objetivo, mientras el material indeseado pasarfa libremente a traves del filtro y se eliminarfa mediante lavado con tamp6n en exceso. Las celulas objetivo se eluirfan del filtro cambiando condiciones tales como el caudal, el pH, la fuerza i6nica, y/o la presencia de cationes necesarios para la adhesi6n. El material del filtro podrfa estar en forma de una malla tridimensional, casete empaquetado de partfculas pequenas, fibras huecas u otros mecanismos con un area superficial elevada. En una realizaci6n preferida, este dispositivo de filtro serfa una parte integral del equipo desechable mostrado en la Figura 1, y se insertarfa en el dispositivo mostrado en la Figura 4. Tanto el equipo como el dispositivo tendrfan que modificarse ligeramente de los ejemplos mostrados en las figuras especificadas; en la Figura 1 para incluir el filtro y su alojamiento, y en la Figura 4 para posibilitar la inserci6n del alojamiento del filtro y los tubos (que incluyen valvulas) necesarios para el mantenimiento de una ruta fluida cerrada esteril. De manera alternativa, la camara de mezcla (Componente 108 de la Figura 4; componente 30 de la Figura 1) se podrfa sustituir por los adaptadores del dispositivo y el filtro/alojamiento, respectivamente.

Una realizaci6n alternativa de esta aproximaci6n de adherencia diferencial incluirfa el uso de anticuerpos y/o combinaciones de anticuerpos que reconocen las moleculas superficiales expresadas de manera diferencial en las celulas objetivo y en las celulas indeseadas. La selecci6n basada en la expresi6n de marcadores superficiales celulares especfficos (o combinaciones de los mismos) es otra tecnica aplicada habitualmente, en la que los anticuerpos estan unidos (directamente o indirectamente) a una estructura de soporte de fase s6lida (Geiselhart et al., 1996; Formanek et al., 1998; Graepler et al., 1998; Kobari et al., 2001; Mohr et al., 2001). Esta aproximaci6n tiene aplicaciones evidentes tanto en la selecci6n positiva como en la selecci6n negativa, en las que, por ejemplo, se podrfan eliminar los leucocitos sangufneos residuales mediante el uso del anticuerpo CD45). De forma similar, Reyes et al. han aplicado una mezcla compleja de anticuerpos en la selecci6n de una celula progenitora adulta multipotencial a partir de medula 6sea humana (Reyes et al., 2001). Por ejemplo, se podrfa emplear un anticuerpo tal como AP2 (Joyner et al., 1999), que se une de manera especffica a las celulas adipocfticas, para eliminar de manera preferente las celulas adipocfticas residuales (que incluyen los adipocitos inmaduros y los adipoblastos). La selecci6n positiva se podrfa aplicar mediante el uso de anticuerpos especfficos para la(s) poblaci6n(es) de celula(s) objetivo. Por ejemplo, Quirici et al. han usado anticuerpos hacia el receptor del factor de crecimiento nervioso para enriquecer celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula 6sea (Quirici et al., 2002).

En una realizaci6n de una aproximaci6n basada en anticuerpos, se anadirfa un anticuerpo (por ejemplo AP2) o una mezcla de anticuerpos (por ejemplo AP2, CD3, CD19, CD11b) al lipoaspirado procesado. Un experto en la tecnica reconocera otros muchos anticuerpos y combinaciones de anticuerpos, y estos ejemplos se proporcionan a modo de ejemplo unicamente. Tras la incubaci6n, en condiciones predeterminadas para permitir la uni6n 6ptima de estos anticuerpos a sus antfgenos afines, las celulas se lavarfan haciendolas pasar a traves del filtro de membrana giratorio u otra realizaci6n de la camara de lavado de celulas para eliminar el anticuerpo en exceso sin unir. Las celulas se harfan pasar despues sobre una estructura de fase s6lida similar a la descrita en la realizaci6n anterior, pero en la que la fase s6lida tiene unido un anticuerpo secundario capaz de proporcionar una uni6n de afinidad elevada a los anticuerpos primarios ahora unidos a la superficie celular. Las celulas objetivo, por ejemplo las celulas madre derivadas de tejido adiposo, pasarfan libremente a traves de este filtro debido a la ausencia de expresi6n de los antfgenos superficiales celulares reconocidos por el anticuerpo seleccionado (mezcla de anticuerpos), por lo que se crearfa un sistema de selecci6n negativa. En este sistema, el equipo desechable (Figura 3) y el dispositivo (Figura 4) se someterfan a modificaciones menores muy similares a las descritas en la realizaci6n anterior.

Se podrfa llevar a cabo una realizaci6n de selecci6n positiva mediada por anticuerpos de una manera muy similar incluyendo un tercer aditivo que facilite la separaci6n de las celulas del soporte de fase s6lida. En esta realizaci6n, se podrfa anadir la enzima papafna o quimopapafna para escindir las moleculas de anticuerpo y liberar las celulas del soporte de fase s6lida (Civin et al., 1990). Otra alternativa serfa el uso de peptidos especfficos que competirfan con el antfgeno de la superficie celular por la uni6n a los anticuerpos, tal como describi6 TsengLaw et al., patente en EE.UU. nO 6.017.719.

En otra realizaci6n, se podrfa resuspender el sedimento celular, aplicarlo sobre (o bajo) un material fluido formado en un gradiente de densidad continuo o discontinuo y colocarlo en una centrffuga para la separaci6n de las poblaciones celulares basandose en la densidad celular. Los ejemplos de medios adecuados para la formaci6n de tales gradientes incluyen Percoll y FicollPaque (Qian et al., 1998) (Smits et al., 2000) o FicollPaque (Lehner y Holter, 2002; Van, V et al., 2001). Esta realizaci6n serfa capaz de separar ciertas poblaciones de celulas sangufneas residuales y adipocitos inmaduros (preadipocitos) de la poblaci6n de celulas.

En una realizaci6n similar, tambien se pueden emplear aproximaciones de flujo continuo tales como aferesis (Smith, 1997), y elutriaci6n (con o sin contracorriente) (Lasch et al., 2000) (Ito y Shinomiya, 2001). Tales mecanismos se han usado para fraccionar celulas sangufneas, lo que incluye la separaci6n de eritrocitos sangufneos basandose en la edad (Lasch et al., 2000), y la aplicaci6n de esta aproximaci6n general a la purificaci6n adicional de celulas de inte

res del lipoaspirado procesado sera evidente para un experto en la tecnica. Esta realizaci6n puede requerir la modificaci6n del dispositivo de la Figura 4 y el equipo desechable (Figura 3) de forma que el dispositivo estarfa integrado con un segundo dispositivo que proporcionarfa la capacidad de aferesis o de elutriaci6n.

La adherencia al plastico, seguida por un corto periodo de expansi6n celular, tambien se ha aplicado en poblaciones de celulas madre de adulto derivadas de medula 6sea (Jaiswal et al., 2000). Esta aproximaci6n usa condiciones de cultivo para expandir de manera preferente una poblaci6n, mientras otras poblaciones se mantienen (y por lo tanto se reducen por diluci6n con las celulas seleccionadas en crecimiento) o se pierden debido a la ausencia de condiciones de crecimiento necesarias. Sekiya et al. han descrito condiciones que se podrfan emplear a este respecto para celulas madre derivadas de medula 6sea (Sekiya et al., 2002). Esta aproximaci6n (con o sin adherencia diferencial al plastico de cultivo de tejidos) se podrfa aplicar a una realizaci6n adicional de esta invenci6n. En esta aproximaci6n las celulas se extraen del dispositivo mostrado en la Figura 4 y se colocan en un segundo dispositivo que proporciona el componente de cultivo celular. Este podrfa estar en forma de un incubador de cultivo de tejidos de laboratorio convencional o un dispositivo de tipo biorreactor tal como el descrito por Tsao et al., patente de EE.UU. nO 6.001.642, o por Armstrong et al., patente de EE.UU. nO 6.238.908. En una realizaci6n alternativa, el componente de mezcla (componente 108 del dispositivo mostrado en la Figura 4; componente 30 en la Figura 3) se podrfa sustituir por un componente de biorreactor que posibilita la adherencia y/o el cultivo celular a corto plazo del lipoaspirado procesado. Esta aproximaci6n alternativa permitirfa la integraci6n del componente de biorreactor en el dispositivo, y eliminarfa la necesidad de extraer las celulas de este dispositivo y su colocaci6n en otro.

i. Metodo Ilustrado para Obtener un Lipoaspirado Procesado

Se ilustra un ejemplo de un sistema de extracci6n de tejido para extraer el tejido adiposo de un paciente en la Fig. 1. En una aplicaci6n amplia del sistema usado por la invenci6n, el sistema de extracci6n de tejido 10 incluye un recipiente de recogida de tejido 12 y un recipiente de mezcla 30 acoplado al recipiente de recogida de tejido 12. El acoplamiento entre el recipiente de mezcla 30 y el recipiente de recogida de tejido 12 define preferiblemente un sistema cerrado en el que el tejido que se dirige desde el recipiente de recogida de tejido 12 hacia el recipiente de mezcla 30 no se expone al medio externo. El sistema 10 tambien incluye una salida 32 que esta estructurada para permitir que las celulas madre concentradas se extraigan del sistema de recogida de tejido 10 para ser administradas a un paciente. El recipiente de recogida de tejido 12 incluye un orificio de entrada de recogida de tejido 14 y un filtro 16. El filtro 16 esta dispuesto dentro del recipiente, y esta estructurado para retener el tejido adiposo y dejar pasar el tejido no adiposo a medida que, por ejemplo, los tejidos se extraen del paciente. Mas especfficamente, el filtro 16 permite el paso de lfpidos libres, sangre, y soluci6n salina, a la vez que retiene fragmentos de tejido adiposo durante, o en otra realizaci6n despues de, la recogida inicial del tejido adiposo. A este respecto, el filtro 16 incluye una diversidad de poros, de tamanos iguales o diferentes, pero que oscilan en un tamano de alrededor de 20 �m a 5 mm. En un sistema preferido, el filtro es una malla de poliester de calidad medica de un grosor de alrededor de 200 �m, con un tamano de poro de alrededor de 265 �m y alrededor de un 47% de area expuesta. Este material mantiene el tejido durante el lavado, pero permite que las celulas pasen a traves de la malla tras la disgregaci6n del tejido. Asf, cuando los tejidos se aspiran del paciente, el tejido no adiposo se puede separar del tejido adiposo. El recipiente de mezcla 30 incluye un orificio de aditivo 31 que esta estructurado para permitir que un usuario administre un aditivo al recipiente de mezcla 30 para mezclarlo con las celulas madre contenidas en el recipiente de mezcla 30. En un sistema preferido, las dimensiones del recipiente de recogida de tejido 12 deberfan ser adecuadas para permitir la retenci6n de aproximadamente 1 litro de fragmentos de tejido dentro del filtro. En otros sistemas, el recipiente de recogida de tejido 12 puede tener un tamano para albergar un volumen mayor o menor de fragmentos de tejido; por ejemplo, el recipiente de recogida de tejido puede tener un tamano para almacenar al menos 100 mL de fragmentos de tejido adiposo, y hasta alrededor de 2 L de fragmentos de tejido adiposo.

Con respecto a las caracterfsticas adicionales presentes en el sistema 10 de la Fig. 1, el orificio de entrada de tejido 14 esta acoplado a una canula 24 por medio de un tubo 22 para definir un tubo de extracci6n de tejido. En la realizaci6n ilustrada, la canula 24 es una canula de liposucci6n integrada de un unico uso, y el tubo es un tubo flexible. La canula tiene unas dimensiones adecuadas para ser insertada en un paciente para extraer el tejido adiposo del paciente. El tubo 22 usado en el sistema deberfa ser capaz de resistir la presi6n negativa asociada a la lipoplastia asistida por succi6n para reducir la probabilidad de su colapso. El recipiente de recogida de tejido 12 tambien incluye un orificio de aspiraci6n 18 dispuesto en el lado opuesto del filtro 16 respecto del orificio de entrada de tejido 14. El orificio de aspiraci6n 18 esta estructurado para acoplarse a un dispositivo de succi6n 20, que se puede hacer funcionar de manera manual o automatica. El dispositivo de succi6n 20 puede ser una jeringa o puede ser un dispositivo de vacfo electrico, entre otras cosas. El dispositivo de succi6n 20 deberfa ser capaz de proporcionar una presi6n negativa suficiente al recipiente 12 y la canula 24 para aspirar el tejido de un paciente. Tal como se ilustra, el dispositivo de succi6n 20 esta acoplado a un orificio de aspiraci6n 18 por medio del tubo 22.

Tambien se ilustra que el sistema de extracci6n de tejido 10 incluye un recipiente de recogida de celulas 26 colocado entre el recipiente de recogida de tejido 12 y el recipiente de mezcla 30. El recipiente de recogida de celulas 26 esta colocado en el sistema 10 de manera que las celulas, tales como celulas madre, pasan desde el recipiente de recogida de tejido 12 al recipiente de recogida de celulas 26 antes de pasar al recipiente de mezcla 30. En el sistema ilustrado, el recipiente de recogida de celulas 26 esta acoplado al recipiente de recogida de tejido 12 por medio del orificio de recogida de celulas 48. En una versi6n del sistema 10, el recipiente de recogida de celulas 26 incluye un concentrador de celulas (no mostrado) que facilita la separaci6n de las celulas en una suspensi6n. Un ejemplo de un

concentrador de celulas es un dispositivo de centrffuga que puede separar las celulas de otros materiales basandose, por ejemplo, en el tamano o la densidad de las celulas. Otro ejemplo es un filtro de membrana giratorio, tal como se discuti6 anteriormente. Tambien se ilustra que el sistema 10 incluye un filtro 28 estructurado para dejar pasar las celulas desde el recipiente de recogida de celulas 26 hasta el recipiente de mezcla 30, y para impedir el paso del material que es, por ejemplo, mayor que las celulas. El recipiente de recogida de celulas 26 tambien incluye una salida hacia el recipiente de residuos 36. La direcci6n del flujo del material contenido en el recipiente de recogida de celulas 26 esta determinada por la posici6n de una o mas valvulas que pueden controlar si el material fluye hacia el recipiente de residuos 36 o hacia el recipiente de mezcla 30.

En el sistema ilustrado, el filtro de celulas 28 comprende una diversidad de poros que tienen un diametro o longitud menor de 200 �m. En ciertos sistemas, los poros pueden tener diametros que son menores de 200 �m. En otros sistemas, los poros pueden tener diametros entre 20 y 200 �m. El filtro de celulas 28 puede estar separado del recipiente de recogida de celulas 26 o puede estar contenido dentro del recipiente de recogida de celulas 26. El filtro de celulas 28 tambien puede formar parte integrante del recipiente de recogida de celulas 26. Los sistemas adicionales del sistema 10 no incluyen el filtro 28. El recipiente de recogida de celulas puede estar fabricado de cualquier material adecuado. Por ejemplo, el recipiente de recogida de celulas 26 puede ser una bolsa de plastico, tal como las usadas de manera convencional en el procesamiento de sangre en los bancos de sangre; o en otros sistemas puede ser estructuralmente regida. En ciertos sistemas, el recipiente de recogida de celulas 26 puede incluir una camara de preparaci6n de componentes y una camara de lavado/separaci6n de celulas.

En ciertos sistemas, la camara de preparaci6n de componentes incluye uno o mas orificios para la adici6n de agentes que mejoran el proceso de separaci6n de las celulas madre para la administraci6n a un paciente, tales como factores de crecimiento o tampones para resuspender las celulas, como se discuti6 anteriormente. En estos sistemas, la camara de preparaci6n de componentes incluye preferiblemente un dispositivo de mezcla para mezclar o agitar las celulas y aditivos en el recipiente. La camara de preparaci6n de componentes incluye tambien uno o mas orificios para extraer las celulas recogidas en ella. Se puede proporcionar un orificio para hacer pasar las celulas hacia el recipiente de mezcla 30. Se pueden proporcionar otros orificios para dirigir las celulas, o una porci6n de las celulas, hacia otros objetivos, tales como materiales para implantes, que incluyen fragmentos 6seos, o hacia dispositivos de cultivo o purificaci6n de celulas. En un sistema, la camara de lavado/separaci6n de celulas incluye un componente de filtro de membrana giratorio, que se puede usar como concentrador de celulas ademas de, o preferiblemente, como alternativa a, un dispositivo de centrffuga.

Tambien se ilustra que el sistema 10 incluye un tubo de recuperaci6n de tejido 34 que esta colocado para proporcionar un conducto desde el recipiente de recogida de tejido 12 hasta el recipiente de mezcla 30. Asf, la tuberfa de recuperaci6n de tejido 34 hace pasar o dirige el tejido contenido dentro del recipiente de recogida de tejido 12 hacia el recipiente de mezcla 30, en el que el tejido se puede mezclar con celulas obtenidas desde un recipiente de recogida de celulas 26. En el sistema ilustrado, el tubo de recuperaci6n de tejido 34 se prolonga en el recipiente de tejido 12 para extraer el tejido adiposo que esta contenido en el filtro 16. El tejido se hace pasar o se dirige a traves del tubo de recuperaci6n de tejido 34 mediante el uso de una o mas bombas o dispositivos de succi6n para hacer pasar el tejido adiposo que se ha lavado, pero que no se ha disgregado necesariamente.

En un sistema, el sistema 10 incluye un dispositivo de control de la temperatura que esta colocado con respecto al sistema 10 para ajustar la temperatura del material contenido en el recipiente de recogida de tejido 12. En ciertos sistemas, el dispositivo de control de la temperatura es un calentador, y en otras realizaciones, el dispositivo de control de la temperatura es un enfriador. En los sistemas adicionales, el dispositivo de control de la temperatura puede ser capaz de conmutar entre un calentador y un enfriador. El dispositivo de control de la temperatura puede ser un dispositivo que ajusta la temperatura del tejido adiposo contenido en el recipiente de recogida de tejido 12, o puede ser un dispositivo que esta colocado para cambiar la temperatura del fluido que se comunica al recipiente de recogida de tejido 12. Se ha descubierto que el calentamiento del tejido adiposo facilita la disgregaci6n del tejido para aumentar la separaci6n del componente de celulas activas. Ademas, en ciertos sistemas es deseable enfriar una porci6n del tejido, preferiblemente el componente de celulas activas, para proporcionar una protecci6n a las celulas. Incluso un enfriamiento suave de las celulas puede proporcionar una protecci6n adecuada para mejorar la supervivencia celular durante el procesamiento.

Se ilustra que la salida 32 del sistema de extracci6n de tejido 10 es un componente del recipiente de mezcla 30. En los sistemas adicionales, la salida 32 esta alejada del recipiente de mezcla 30. La salida 32 comprende preferiblemente un cierre que mantiene la configuraci6n sellada del sistema de extracci6n de tejido 10, y, en ciertos sistemas, la salida 32 comprende una membrana impermeable al fluido (p.ej., una membrana que es impermeable a los lfquidos y al aire). La salida 32 deberfa estar estructurada para hacer pasar la composici6n del recipiente de mezcla 30 a un paciente en condiciones adecuadas. Por ejemplo, si se usa una jeringa para retirar la composici6n, la salida 32 deberfa poder alojar la aguja de la jeringa sin comprometer la esterilidad del sistema o de la composici6n. En los sistemas adicionales, si la salida esta acoplada a un dispositivo que esta configurado para administrar la composici6n, pero no para retirar la composici6n, tal como una canula que administra la composici6n aplicando una presi6n positiva para desplazar la composici6n a traves de la canula, la salida 32 deberfa estar configurada para permitir que la composici6n contenida en el recipiente de mezcla 30 pase a la canula. En otras versiones del sistema, la salida 32 puede comprender, o puede estar acoplada en forma de sistema cerrado, un dispositivo para administrar la composici6n, tal como una aguja de una jeringa o una canula para administrar la composici6n aplicando una presi6n posi

tiva.

Tambien se ilustra que el sistema de extracci6n de tejido 10 incluye un recipiente de residuos 36 colocado para recoger los residuos del recipiente de recogida de tejido 12. En el sistema ilustrado, el recipiente de residuos 36 tambien esta acoplado y colocado para recibir los residuos del recipiente de recogida de celulas 26. Se proporciona un recipiente de lavado 38 en comunicaci6n fluida con el tubo de lavado 39 para suministrar un fluido de lavado, tal como soluci6n salina o cualquier otro tamp6n adecuado, a traves del orificio de lavado 46 en el recipiente de recogida 12. El recipiente de recogida de tejido 12 incluye tambien una entrada de aire 40 para controlar la cantidad de presi6n dentro del recipiente de recogida de tejido 12. Se proporciona un tubo de aditivo 42 en el recipiente de recogida de tejido 12 para permitir que se anada un aditivo en el recipiente de recogida de tejido 12. Con referencia a los metodos descritos en la presente memoria, el tubo de aditivo 42 se proporciona para suministrar una o mas enzimas al recipiente de recogida de tejido 12 para facilitar la separaci6n del componente de celulas activas del resto del tejido adiposo contenido en el filtro 16. Tal como se ilustra, el tubo aditivo 42 comprende una aguja 44 que se puede usar para recibir la enzima de un recipiente adecuado.

Una versi6n particular de los componentes del sistema de extracci6n de tejido 10 se ilustra en las Figs. 2 y 3, en las que los numeros similares representan partes similares. En el sistema particular de las Figs. 2 y 3, el recipiente de recogida de tejido 12 incluye un cuerpo que mantiene su forma cuando se aplica la succi6n al recipiente. Mas especfficamente, el recipiente de recogida de tejido 12 incluye un cuerpo rfgido, por ejemplo, un cuerpo construido de un policarbonato de calidad medica que contiene una bolsa de filtraci6n aproximadamente c6nica de un poliester de calidad medica con un tamano de malla de 275 �m. El recipiente de recogida de tejido rfgido puede tener un tamano de aproximadamente 20,3 centfmetros de altura y aproximadamente 12,7 centfmetros de diametro; el grosor de la pared puede ser de alrededor de 0,3 centfmetros. Se accede al interior del cilindro a traves de dos orificios para los tubos de succi6n, dos orificios con tubos para la conexi6n por medio de una tecnica de acoplamientos esteriles, y dos orificios para accesos de punci6n de agujas a traves de un tabique de caucho. Se podrfa conseguir la misma funcionalidad con diferentes materiales, tamanos de malla, y numero y tipo de orificios. Por ejemplo, los tamanos de poro de la malla menores de 100 �m o grandes, como de varias micras, conseguirfan el mismo prop6sito de dejar pasar la soluci6n salina y las celulas sangufneas a la vez que se retendrfan los agregados y fragmentos de tejido adiposo. De forma similar, el prop6sito del dispositivo se podrfa llevar a cabo mediante el uso de un material plastico rfgido alternativo, mediante la sustituci6n de la canula desechable por una canula esteril multiuso no desechable, o mediante otras muchas modificaciones que serfan conocidas para los expertos en la tecnica. Sin embargo, en otras versiones del sistema de extracci6n de tejido 10, el recipiente de recogida de tejido 12 puede incluir un cuerpo comprimible, tal como una bolsa de recogida de tejido. En tales sistemas, la bolsa se proporciona preferiblemente con un soporte, tal como un armaz6n interno o externo, que ayuda a reducir la probabilidad de que la bolsa colapse tras la aplicaci6n de succi6n a la bolsa.

Para reducir la contaminaci6n dentro del sistema de extracci6n de tejido 10, se puede proporcionar una o mas abrazaderas 23 en los diversos tubos o conductos para controlar el flujo de material a traves de los tubos hacia los diversos componentes del sistema. Las abrazaderas 23 permiten que un usuario selle de manera eficaz diversas regiones del sistema de extracci6n de tejido 10. En un sistema preferido, uno o mas de los componentes del sistema 10 son desechables. El evitar la reutilizaci6n de los componentes en esta realizaci6n ayuda a reducir la contaminaci6n que puede estar asociada al uso repetido de diversos componentes. Ademas, el proporcionar los componentes en un equipo desechable proporciona la ventaja de poder esterilizar todos los componentes a la vez, lo que reduce sustancialmente el tiempo necesario para poner en practica los metodos descritos en la presente memoria. En las versiones completamente o parcialmente automatizadas del sistema, se pueden aplicar valvulas controladas por computadora ademas de, o como alternativa a, las abrazaderas 23.

Ademas, el sistema de extracci6n de tejido 10 puede incluir dispositivos o componentes adicionales que permiten, entre otras cosas, la determinaci6n del volumen de material retenido en el filtro 16, para permitir registrar informaci6n escrita relacionada con el procedimiento de extracci6n o de procesamiento, o para llevar a cabo otras funciones complementarias tales como el acoplamiento del dispositivo a un soporte o a la cama durante el funcionamiento.

Los componentes del sistema de extracci6n de tejido 10 deberfan estar fabricados de materiales que no sean reactivos con los fluidos o tejidos biol6gicos, y que no sean reactivos con los agentes usados en el procesamiento de los fluidos y tejidos biol6gicos. Ademas, los materiales de los que estan fabricados los diversos componentes deberfan ser capaces de resistir la esterilizaci6n, tal como mediante autoclavado, e irradiaci6n, lo que incluye, pero sin limitaci6n, la irradiaci6n beta o gamma. El tubo y el asa de la canula pueden estar fabricados de cualquier material adecuado, tal como polietileno. La canula puede estar fabricada de cualquier material adecuado, que incluye acero inoxidable.

De acuerdo con la invenci6n descrita en la presente memoria, el sistema de extracci6n de tejido 10 proporciona un sistema cerrado que es conveniente para la extracci6n, el procesamiento y la administraci6n de celulas madre adultas halladas en el tejido adiposo. El sistema se puede colocar cerca del paciente para la extracci6n del tejido adiposo, y el tejido se puede procesar sin la necesidad de que el tejido se extraiga del sistema. Asf, se describe un sistema que puede proporcionar composiciones mejoradas de celulas madre recientes a un paciente, y que reduce los riesgos potenciales asociados al cultivo o a la conservaci6n de las celulas madre.

Por lo tanto, basandose en la presente descripci6n, la presente invenci6n puede usar un metodo para la extracci6n de tejido de un paciente mediante el uso de las etapas siguientes: (i) preparar al paciente como para una lipoplastia tradicional; (ii) extraer la canula y el sistema de extracci6n de tejido de los materiales de empaquetamiento hasta el campo esteril; (iii) conectar una bomba de liposucci6n (con una valvula convencional y filtros microbianos en serie) al adaptador del tubo flexible que conduce al recipiente de recogida de tejido; (iv) asegurarse de que las abrazaderas de rosca del tubo no estan acopladas en los orificios de succi6n del recipiente de recogida de tejido; (v) usar la canula como una canula de liposucci6n normal para extraer el tejido adiposo indeseado; (vi) aplicar, en una realizaci6n de funcionamiento manual, dos abrazaderas de rosca de tubos para sellar el recipiente de recogida de tejido despues de haber recogido la cantidad deseada de tejido adiposo con el recipiente de recogida de tejido; (vii) asegurarse de que el recipiente de recogida de tejido esta etiquetado de manera adecuada con una etiqueta de identificaci6n del paciente, y registrar cualquier informaci6n adicional en la etiqueta (fecha y hora del procedimiento, etc.) de acuerdo con la practica institucional, y (viii) extraer el tejido adiposo del paciente.

Con respecto al sistema de extracci6n de tejido 10 ilustrado, el tejido se recoge directamente en los componentes de procesamiento uniendo el tubo 22 a la fuente de succi6n 20 con una valvula de fluido en serie e insertando la canula 24 en el sitio de recogida. El tejido adiposo se aspira despues hasta el recipiente de recogida de tejido 12 en el que es retenido por el filtro 16 contenido dentro del recipiente de recogida de tejido 12. Tras la recogida del tejido, el tejido adiposo recogido se puede lavar con un fluido de lavado, tal como soluci6n salina isot6nica esteril, contenido en el recipiente de lavado 38 anadido al recipiente de recogida de tejido 12 a traves del tubo de lavado 39. Cuando el recipiente de recogida de tejido 12 esta hecho de un material rfgido en la realizaci6n ilustrada para soportar la recogida con succi6n, el aire desplazado del alojamiento durante la adici6n de soluci6n salina se puede emitir a traves del orificio de entrada de aire 40. De manera alternativa, el aire se puede desplazar hacia el recipiente de residuos 36 o un lugar de almacenamiento similar. Una vez que se ha lavado el tejido, el material residual se puede dejar fluir hacia el recipiente de residuos 36.

Despues de haber recogido el tejido, se puede insertar la aguja 44 en un vial esteril de una disoluci6n enzimatica que contiene colagenasa que despues se hace pasar al recipiente de recogida de tejido 12, donde se mezcla con el tejido adiposo a una temperatura de, o aproximadamente, 37 �C durante 1560 minutos. Las etapas de lavado se pueden repetir segun sea necesario, y el tejido disgregado se puede lavar tras la eluci6n de la poblaci6n de celulas activas para maximizar el rendimiento. Al final de la disgregaci6n del tejido el recipiente de recogida de tejido 12 se coloca boca arriba para permitir la flotaci6n de los adipocitos. La poblaci6n de celulas activas se deja fluir despues hacia el recipiente de recogida de celulas 26, en el que las celulas se separan de la colagenasa y de los lfpidos libres residuales. Las celulas se pueden lavar y/o concentrar mediante cualquier metodo conocido para las personas de experiencia habitual en la tecnica, que incluye, pero sin limitaci6n, los lavados por centrifugaci6n/resuspensi6n secuencial o los mecanismos de flujo continuo. Las celulas concentradas y lavadas se dejan fluir despues hacia el recipiente de mezcla 30, en el que se pueden mezclar con tejido intacto del tubo de recuperaci6n de tejido 34 y/o cualquier aditivo deseado antes de extraerlas a traves de la salida 32 para la administraci6n a un paciente. El material contenido en el recipiente de recogida de celulas 26 se puede filtrar mediante el uso del filtro de celulas 28 tras el lavado para aumentar la eliminaci6n de agregados de tejido y celulas residuales indeseados que podrfan conducir a un embolismo tras la aplicaci6n.

Durante el procesamiento, se pueden anadir uno o mas aditivos a los diversos recipientes, segun sea necesario, para mejorar los resultados. Algunos ejemplos de aditivos incluyen agentes que optimizan el lavado y la disgregaci6n, aditivos que mejoran la viabilidad de la poblaci6n de celulas activas durante el procesamiento, agentes antimicrobianos (p.ej., antibi6ticos), aditivos que lisan adipocitos y/o eritrocitos, o aditivos que enriquecen las poblaciones celulares de interes (mediante adherencia diferencial a restos en fase s6lida o para favorecer de otra manera la reducci6n o enriquecimiento sustancial de poblaciones celulares).

En el sistema anterior, el recipiente de recogida de tejido 12 es intrfnseco a los componentes de procesamiento del sistema de extracci6n de tejido 10. De manera alternativa, se podrfa emplear un recipiente de recogida de tejido separado, tal como el descrito en la solicitud de patente nO 10/242.094, titulada PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES, presentada el 12 de septiembre de 2002, que reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE.UU. 60/322.070 presentada el 14 de septiembre de 2001, en su totalidad o en parte con la transferencia posterior del material disgregado a los componentes de procesamiento. Se describen recipientes de recogida de tejido potenciales adicionales en las patentes de EE.UU. nOs

6.316.247 y 5.372.945.

Como se indic6 anteriormente, los metodos se pueden automatizar proporcionando uno o mas dispositivos adicionales que pueden llevar a cabo automaticamente las etapas de los metodos. En tales aplicaciones, un dispositivo de procesamiento (p.ej., un microprocesador o un ordenador personal) es un dispositivo para automatizar parcialmente

o completamente las etapas descritas anteriormente. Los ejemplos de etapas susceptibles de tal automatizaci6n incluyen, pero sin limitaci6n, controlar la entrada o la salida de fluidos y tejidos a lo largo de rutas de tubos particulares controlando bombas y valvulas del sistema o del dispositivo de procesamiento; detectar bloqueos con sensores de presi6n; mecanismos de mezcla, medida de la cantidad de tejido y/o fluido a mover por una ruta particular mediante el uso de mecanismos volumetricos; mantenimiento de las temperaturas de los diversos componentes mediante el uso de dispositivos de control de calentamiento; lavado y concentraci6n de las celulas, e integraci6n del proceso con mecanismos de medici6n de tiempo y programas informaticos. En un sistema, el programa informatico

puede controlar los parametros del proceso para permitir la producci6n de una poblaci6n de celulas preparada respecto de parametros especfficos definidos por un operador. Asf, el dispositivo o dispositivos de automatizaci6n mejoran el rendimiento de los procedimientos, y proporcionan una recogida automatica de tejido adiposo y un procesamiento del tejido adiposo para la administraci6n a un paciente.

Se ilustra un dispositivo de automatizaci6n particular en la Fig. 4. Un recipiente de extracci6n de tejido (no mostrado) se coloca en un dispositivo 100 mediante el uso de marcadores de referencia codificados por colores 112118 para alinear e insertar de manera adecuada los tubos en las rutas adecuadas. El dispositivo 100 incluye una diversidad de valvulas 105 y 110, y una diversidad de bombas 104 y 109. Los tubos se colocan en una serie de valvulas 105, 110 y bombas 104, 109 que se controlan mediante un sistema microprocesador integrado para coordinar el flujo de fluido y de tejido de acuerdo con el programa definido por el usuario. La selecci6n del programa esta mediada por un panel de interfaz con el usuario 106. Se coloca un recipiente de soluci6n salina en una estructura de sujeci6n 101 y se une al recipiente de recogida de tejido. Se inserta un vial o un tubo de colagenasa u otro medio o mezcla de disociaci6n de tejidos (no mostrado) en el recipiente de recogida de tejido en el punto 103. Una bolsa de residuos (no mostrada) se inserta en una estructura de sujeci6n 111, la camara de separaci6n de celulas/recipiente de recogida de celulas se coloca en una estructura de sujeci6n 107, y el recipiente de mezcla de tejido/celulas se coloca en la estructura de sujeci6n 108. El recipiente de recogida de tejido se coloca en la camara de agitaci6n/incubaci6n 102.

El tejido adiposo se puede recoger en el recipiente de recogida de tejido mientras el recipiente esta en su posici6n dentro del dispositivo, o antes de la colocaci6n dentro del dispositivo. El dispositivo puede contener una pieza insertada trasparente 119 opcional u otro dispositivo que permita la determinaci6n del volumen de tejido dentro del recipiente de recogida de tejido. De manera alternativa, el volumen se puede determinar mediante la medida del peso del material contenido en la camara de agitaci6n/incubaci6n 102 (que corresponde al recipiente de recogida de tejido 12). Este volumen se puede visualizar en la pantalla de interfaz del usuario 106.

El microprocesador abre despues las valvulas 105 en los tubos 114 y 115 y activa las bombas 104 en el tubo 114 para la introducci6n de soluci6n salina en la camara de recogida 102 y para la extracci6n del material residual 115 hasta la bolsa de residuos 111. Durante este proceso, la camara de recogida se agita mediante balanceo, y se mantiene a una temperatura programada mediante dispositivos de calentamiento integrados en la camara 102. En ciertos sistemas, el procesamiento del tejido puede usar una soluci6n salina precalentada, en cuyo caso el papel del dispositivo de calentamiento de la camara de agitaci6n/incubaci6n es mantener la temperatura en el punto preprogramado, en vez de incrementar la temperatura.

Una vez que el tejido se lava, se puede extraer una fracci6n del 0% al 100% del tejido adiposo intacto lavado de la camara de incubaci6n 102 mediante la activaci6n de la bomba 109 y la valvula 110 del tubo 116. El material extrafdo en este momento se mantiene en la camara de mezcla 108. Se anade medio de disociaci6n 103 al material restante de la camara 102 abriendo la valvula 105 del tubo 113, cerrando otras valvulas y activando la bomba 104 del tubo

113. Tras la adici6n del medio de disociaci6n, la camara 102 se agita y se mantiene a la temperatura descrita anteriormente. Al final del periodo de incubaci6n programado se detiene la agitaci6n para permitir la flotaci6n de los adipocitos. Se puede anadir soluci6n salina adicional para facilitar este proceso. Tras la flotaci6n de los adipocitos, las valvulas de los tubos 112 y 115 se abren para permitir la extracci6n de la poblaci6n de celulas objetivo de la camara 102 hasta la camara de lavado de celulas 107. Las celulas lavadas se extraen a traves del tubo 117 hacia la camara de mezcla 108, el sobrenadante y la disoluci6n de lavado se extraen hacia la camara de residuos 111 a traves del tubo 118. Se hace pasar soluci6n salina adicional al sistema a traves del tubo 114 para completar el proceso de lavado. Las celulas se mezclan en la camara 108 con el tejido intacto extrafdo a traves del tubo 116 anteriormente en el procesamiento. La mezcla se puede llevar a cabo mediante cualquier medio conocido para los expertos en la tecnica, que incluye, pero sin limitaci6n, la agitaci6n por balanceo/inversi6n de la camara, o mediante compresi6n pulsatil o rodillos en movimiento. El material mezclado se puede extraer despues a traves del orificio de la camara de mezcla del equipo desechable.

El dispositivo incluye un mecanismo controlado por microprocesador para automatizar el proceso segun los parametros preprogramados 106. Este sistema incluirfa tambien el uso de sensores de presi6n para la detecci6n de bloqueos y mecanismos de seguridad y de control de calidad similares. En un sistema preferido, el componente informatico del sistema incluirfa la recogida automatizada de "datos de funcionamiento" que incluyen, por ejemplo, los numeros de lote de los componentes desechables, medidas de temperatura y de volumen, parametros sobre el volumen de tejido y el numero de celulas, la dosis de enzimas aplicadas, el tiempo de incubaci6n, la identidad del operador, la fecha y la hora, la identidad del paciente, etc. En una realizaci6n preferida del dispositivo, se integrarfa un sistema de lectura de c6digos de barras para permitir la entrada de datos de estas variables (por ejemplo, el numero de lote del equipo desechable y la fecha de caducidad, el numero de lote y la fecha de caducidad de la colagenasa, los identificadores del paciente/muestra, etc.) en el dispositivo controlador como parte de la documentaci6n de procesamiento. Esto reducirfa la posibilidad de errores en la introducci6n de los datos. Este dispositivo se podrfa incorporar facilmente en el sistema controlador mediante el uso de un puerto y sistema interfaz USB o de otro tipo conocido en la tecnica. De esta manera el dispositivo proporcionarfa un control integrado de la introducci6n de los datos y la documentaci6n del proceso. Un informe impreso de estos parametros serfa parte de los parametros definidos por el usuario de un funcionamiento programado del dispositivo. Naturalmente, esto requerirfa la integraci6n de un componente de impresi6n (equipo ffsico y controlador) o de un controlador de impresi6n en el soporte informatico mas un conector de salida de interfaz para una impresora (p.ej., un puerto USB) en el equipo ffsico del dispositivo.

En un sistema adicional, el soporte informatico incorporado en el controlador avisarfa a los usuarios a traves de las etapas necesarias para la inserci6n adecuada de los tubos y de otros elementos en el dispositivo. El soporte informatico tambien iniciarfa un analisis automatizado para confirmar la inserci6n correcta de los tubos, la ausencia de bloqueos, etc.

La aproximaci6n general de procesamiento de este dispositivo usarfa los mismos parametros que los descritos en otra parte en esta descripci6n para el procesamiento celular manual.

Seran evidentes otras muchas conformaciones de los mecanismos indicados usados para el procesamiento de celulas para un experto en la tecnica, y la presente descripci6n se incluye solamente como un ejemplo. Por ejemplo, la mezcla del tejido y de la soluci6n salina durante el lavado y la disgregaci6n se puede dar mediante agitaci6n como en el presente ejemplo, o mediante recirculaci6n del fluido. El lavado de las celulas puede estar mediado por un mecanismo de flujo continuo tal como la aproximaci6n de membrana giratoria, la adherencia diferencial, la centrifugaci6n diferencial (que incluye, pero sin limitaci6n, la sedimentaci6n diferencial, por velocidad o la separaci6n en gradiente), o mediante una combinaci6n de medios. De forma similar, se pueden usar componentes adicionales para permitir la manipulaci6n adicional de las celulas, lo que incluye la adici6n de factores de crecimiento u otros modificadores de la respuesta biol6gica (Lind, 1998) (Hanada et al., 1997) (Lieberman et al., 1998), la mezcla de las celulas con componentes naturales o sinteticos destinados a implantarlos con las celulas en el receptor (Fukuda, 2001; Sodian et al., 2002; Ye et al., 2000).

La manipulaci6n tras el procesamiento tambien puede incluir la captura de celulas (Caplan y Bruder, 2001; De Ugarte et al., 2003; Zuk et al., 2001), la transferencia genica (Luskey et al., 1990; Morizono et al., 2003), o la purificaci6n celular adicional (Greenberg y Hammer, 2001; Mainwaring y Rowley, 1985; Schweitzer et al., 1995). Los mecanismos para llevar a cabo tales funciones se pueden integrar en el dispositivo mostrado en la Figura 4 o se pueden incorporar en dispositivos diferentes.

En un sistema adicional, el tejido recogido en una valvula de tejido adiposo convencional se podrfa transferir a un equipo de procesamiento disenado para el procesamiento de otros tejidos. Por ejemplo, Baxter Inc. fabrica y comercializa una serie de bolsas de plastico y filtros destinados al uso en el ambito de la recogida para el transplante de medula 6sea ("Bone Marrow Collection Kit with Flexible PreFilters and Inline Filters", C6digo de producto 4R2107, pat. en EE.UU. nOs 4.346.703 y 5.724.988). Este equipo de bolsa contiene una bolsa c6nica grande con un filtro integrado de 800 �m que se podrfa usar para lavar el tejido adiposo recogido. En este ejemplo, los fragmentos de tejido adiposo mayores de 800 �m se retendrfan en la bolsa. Estos fragmentos se podrfan lavar despues mediante la adici6n repetida de soluci6n salina (o de otra disoluci6n de lavado), seguido por la retirada del material residual a traves de orificios situados por debajo del filtro. La mezcla se podrfa llevar a cabo manualmente o mediante el uso de un dispositivo de agitaci6n de mesa, y se podrfa aplicar calentamiento mediante el uso de una placa calefactora. La disgregaci6n se podrfa dar en el interior de esta bolsa. Tras la disgregaci6n, las celulas pasarfan a traves del filtro integrado de 800 �m (y opcionalmente a traves de uno o mas filtros de un tamano de malla mas pequenos proporcionados con el equipo) y se recogerfan en una bolsa de recogida (tambien proporcionada). Esta bolsa se podrfa colocar despues en una centrffuga (p.ej., una Sorval RC3C) en la que las celulas se podrfan lavar en serie y concentrar. Las celulas tambien se podrfan lavar mediante el uso de dispositivos de lavado celular existentes (desarrollados en gran medida para lavar productos sangufneos humanos), tales como los comercializados por Baxter Inc (Cytomate o Baxter CS3000) o por Cobe Inc. (Cobe Spectra). Los elementos desechables se pueden integrar mediante el uso de adaptadores proporcionados por el fabricante, o se pueden unir mediante el uso de un dispositivo de conexi6n esteril tal como los fabricados por Terumo Inc. De forma similar, los mecanismos descritos en esta aproximaci6n menos integrada se podrfan conectar a un controlador central y montarlos como componentes de un dispositivo mas integrado. Se podrfa usar una bomba peristaltica o una baterfa de bombas para automatizar el flujo de los fluidos con el uso de abrazaderas manuales o automatizadas para abrir y cerrar las rutas de fluido.

En una versi6n preferida, el sistema de extracci6n de tejido y el equipo de procesamiento estarfan presentes cerca del paciente que recibe el tratamiento, tal como el quir6fano o la sala de intervenciones ambulatorias (de manera eficaz en la cabecera del paciente). Esto permite la recogida y el procesamiento rapido y eficaz del tejido, elimina la posibilidad de cometer errores de manipulaci6n/etiquetado de las muestras y por lo tanto permite un gran rendimiento del proceso global en el transcurso de un unico procedimiento quirurgico.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar situaciones y ambitos particulares en los que se puede aplicar esta tecnica, y no pretenden limitar el alcance de la invenci6n y de las reivindicaciones incluidas en esta descripci6n.

2. Metodos de Tratamiento de Enfermedades y Trastornos Cardiovasculares Mediante el Uso de un Lipoaspirado Procesado (ADC)

Tal como se demuestra en la presente descripci6n, en una realizaci6n especialmente preferida, las ADC de la invenci6n se pueden usar para tratar enfermedades y trastornos cardiovasculares. Las celulas madre y progenitoras derivadas de tejido adiposo obtenidas poniendo en practica los metodos usados por la invenci6n tienen varias propiedades que pueden contribuir a reducir y/o minimizar la lesi6n y estimular la reparaci6n y regeneraci6n miocardica o cardiovascular tras la lesi6n. Estas incluyen, entre otras cosas, la capacidad de sintetizar y secretar factores de cre

cimiento que estimulan la formaci6n de vasos sangufneos nuevos, la capacidad de sintetizar y secretar factores de crecimiento que estimulan la supervivencia y la proliferaci6n celular, la capacidad de proliferar y diferenciarse hasta celulas que participan directamente en la formaci6n de vasos sangufneos nuevos, la capacidad de injertarse en el miocardio lesionado e inhibir la cicatrizaci6n (deposici6n y reticulaci6n de colageno), la capacidad de proliferar y diferenciarse hasta celulas musculares capaces de contribuir a la contractilidad miocardica, y la capacidad de proliferar y diferenciarse hasta celulas miocardicas.

Los medios anteriores para reducir y/o minimizar la lesi6n y estimular la reparaci6n y regeneraci6n miocardica o cardiovascular tras la lesi6n mediante el uso de celulas madre de adulto derivadas de tejido adiposo de la invenci6n se describen con detalle mas adelante en la secci6n de Ejemplos de la presente descripci6n. De manera especffica, la presente invenci6n demuestra, por primera vez, que las celulas madre derivadas de tejido adiposo (o ADC) de la invenci6n expresan numerosos factores de crecimiento angiogenicos, que incluyen factor de crecimiento de placenta (PIGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), contienen celulas progenitoras endoteliales (EPC) que tienen una funci6n bien establecida en la formaci6n de vasos sangufneos, se desarrollan hasta vasos sangufneos in vitro, mantienen la supervivencia del tejido isquemico in vivo, inducen la reperfusi6n tras la lesi6n por oclusi6n/reperfusi6n de las extremidades posteriores, se dirigen al coraz6n cuando se inyectan en animales tras una lesi6n cardiaca, y se diferencian hasta celulas que expresan marcadores coherentes con su diferenciaci6n en miocitos cardiacos cuando se inyectan en animales tras una lesi6n cardiaca.

Por lo tanto, se obtienen celulas derivadas de tejido adiposo a partir del tejido adiposo de un donante, y se usan para generar un beneficio terapeutico en el miocardio lesionado o degenerado o en otro tejido cardiovascular por medio de uno o mas de los mecanismos demostrados en la presente memoria. En una realizaci6n preferida, las celulas se obtienen a partir del tejido adiposo de la persona en la que se van a implantar, por lo que se reducen las complicaciones potenciales asociadas a las respuestas antigenicas y/o inmunogenicas al trasplante. Los pacientes se estudian generalmente para determinar la lesi6n o enfermedad miocardica mediante uno o mas de los siguientes procedimientos llevados a cabo por un medico u otro profesional sanitario: el historial sanitario el paciente, el examen ffsico, y datos objetivos que incluyen, pero sin limitaci6n, ECG, perfil de enzimas cardiacas en suero, y ecocardiograffa.

El procedimiento de recogida se puede llevar a cabo antes de que el paciente reciba cualquier producto disenado para reducir la coagulaci6n sangufnea en relaci6n con el tratamiento del infarto del miocardio. Sin embargo, en ciertas realizaciones, el paciente puede haber recibido aspirina antes del procedimiento de recogida. Ademas, la recogida de tejido adiposo se produce antes de cualquier intento de procedimiento de revascularizaci6n. Sin embargo, como entienden las personas expertas en la tecnica, se espera que el momento de la recogida varfe, y dependera de varios factores, que incluyen, entre otras cosas, la estabilidad del paciente, el perfil de coagulaci6n del paciente, la disponibilidad del proveedor y los patrones de calidad de los cuidados. Finalmente, el momento de la recogida estara determinado por el medico responsable de administrar los cuidados al paciente afectado.

El volumen de tejido adiposo recogido del paciente puede variar desde aproximadamente 0 cc hasta aproximadamente 2000 cc, y en algunas realizaciones hasta aproximadamente 3000 cc. El volumen de grasa retirada variara de paciente a paciente, y dependera de varios factores que incluyen, pero sin limitaci6n: edad, constituci6n corporal, perfil de coagulaci6n, estabilidad hemodinamica, gravedad del infarto, comorbilidades y preferencia del medico.

Las celulas pueden ser para la administraci6n a un paciente en cualquier situaci6n en la que la funci6n miocardica este comprometida. Los ejemplos de tales situaciones incluyen, pero sin limitaci6n, infarto de miocardio agudo (ataque al coraz6n), insuficiencia cardiaca congestiva (como terapia o como preparaci6n para un trasplante), y complementaci6n de cirugfa de injerto de derivaci6n aortocoronaria, entre otras cosas. Las celulas se pueden extraer antes, y se pueden almacenar de un modo crioconservado, o se pueden extraer en o aproximadamente en el momento de una necesidad definida. Como se describe en la presente memoria, las celulas pueden ser para la administraci6n al paciente, o para la aplicaci6n directamente al tejido lesionado, o en las proximidades del tejido lesionado, sin procesamiento adicional o despues de procedimientos adicionales para purificar, modificar, estimular o cambiar adicionalmente de otro modo las celulas. Por ejemplo, las celulas obtenidas de un paciente pueden ser para la administraci6n a un paciente que lo necesita, sin el cultivo de las celulas antes de administrarlas al paciente. En una realizaci6n, la recogida de tejido adiposo se realiz6 en la cabecera del paciente. Se puede usar la monitorizaci6n hemodinamica para monitorizar el estado clfnico del paciente.

De acuerdo con la invenci6n descrita en la presente memoria, las celulas derivadas de tejido adiposo pueden ser para la administraci6n al paciente poco despues de recoger el tejido adiposo del paciente. Por ejemplo, las celulas pueden ser para la administraci6n inmediatamente despues del procesamiento del tejido adiposo para obtener una composici6n de celulas madre derivadas de tejido adiposo. En una realizaci6n, el momento preferido de la administraci6n deberfa tener lugar del orden de horas a dfas despues del infarto para aprovechar el medio neurohormonal que existe despues de la lesi6n cardiaca. Finalmente, el momento de la administraci6n dependera de la disponibilidad del paciente y del tiempo de procesamiento necesario para procesar el tejido adiposo. En otra realizaci6n, el momento de la administraci6n puede ser relativamente mas largo si las celulas a reinfundir al paciente se someten a modificaci6n adicional, purificaci6n, estimulaci6n u otra manipulaci6n, como se discute en la presente memoria. Ademas, las celulas derivadas de tejido adiposo pueden ser para la administraci6n en multiples momentos tras el infarto. Por ejemplo, las celulas se pueden administrar de forma continua a lo largo de un periodo de tiempo prolon

gado (p.ej., horas), o se pueden administrar en multiples inyecciones rapidas prolongadas a lo largo de un periodo de tiempo. En ciertas realizaciones, se administrara una administraci6n inicial de celulas en un perfodo de alrededor de 12 horas tras el infarto, tal como a las 6 horas, y una o mas dosis de celulas se administraran a intervalos de 12 horas.

El numero de celulas administradas a un paciente puede estar relacionado, por ejemplo, con el rendimiento celular tras el procesamiento del tejido adiposo. Una porci6n del numero total de celulas se puede conservar para su uso posterior o crioconservarse. Ademas, la dosis administrada dependera de la vfa de administraci6n de las celulas al paciente. Pueden ser necesarias menos celulas cuando se emplean sistemas de administraci6n epicardica o endocardica, ya que estos sistemas y metodos pueden proporcionar la vfa mas directa para el tratamiento de afecciones cardiovasculares. En una realizaci6n de la invenci6n, se espera que el numero de celulas, p.ej., celulas sin purificar, para administrar al paciente sea de alrededor de 5,5 x 104 celulas. Sin embargo, este numero se puede ajustar en 6rdenes de magnitud para alcanzar el efecto terapeutico deseado.

Las celulas tambien se pueden aplicar con aditivos para aumentar, controlar o dirigir de otra manera el efecto terapeutico deseado. Por ejemplo, en una realizaci6n, y como se describe en la presente memoria, las celulas se pueden purificar adicionalmente mediante el uso de una selecci6n de celulas positiva y/o negativa mediada por anticuerpos para enriquecer la poblaci6n celular para incrementar la eficacia, reducir la morbilidad, o facilitar la sencillez del procedimiento. De forma similar, las celulas se pueden aplicar con una matriz biocompatible que facilita la ingenierfa tisular in vivo soportando y/o dirigiendo el destino de las celulas implantadas. De la misma manera, las celulas pueden ser para la administraci6n tras la manipulaci6n genetica, de manera que expresen productos genicos que se cree o que estan destinados a estimular la(s) respuesta(s) terapeutica(s) proporcionada(s) por las celulas. Los ejemplos de manipulaciones incluyen las manipulaciones para controlar (incrementar o disminuir) la expresi6n de factores que favorecen la angiogenesis o la vasculogenesis (por ejemplo VEGF), la expresi6n de genes del desarrollo que favorecen la diferenciaci6n hasta linajes celulares especfficos (por ejemplo MyoD) o que estimulan el crecimiento y la proliferaci6n celulares (por ejemplo bFGF1).

Las celulas se pueden someter ademas a un cultivo celular en un material de soporte antes de ser implantadas. Asf, se podrfan sintetizar valvulas modificadas mediante ingenierfa de tejidos, parches ventriculares, pericardio, vasos sangufneos y otras estructuras en matrices o soportes naturales o sinteticos usando ADC antes de la inserci6n o implantaci6n en el receptor (Eschenhagen et al., 2002; Zimmermann et al., 2004; Zimmermann et al., 2002; Nerem y Ensley, 2004). De hecho, se ha demostrado la diferenciaci6n in vitro de celulas madre y progenitoras derivadas de tejido adiposo hasta celulas que expresan marcadores de los miocitos cardiacos (Gaustad et al., 2004; Rangappa et al., 2003).

3. Vfas de Administraci6n de las ADC para el Tratamiento de Enfermedades y Trastornos Cardiovasculares

En una realizaci6n, se prefiere la administraci6n directa de las celulas en el sitio en el que se pretende obtener un beneficio. Esto se puede llevar a cabo mediante inyecci6n directa en la superficie externa del coraz6n (epicardica), inyecci6n directa en el miocardio a traves de la superficie interna (endocardica) por medio de la inserci6n de una canula adecuada, mediante infusi6n arterial o venosa (lo que incluye mecanismos de flujo retr6grado) o mediante otros medios descritos en la presente memoria o conocidos en la tecnica. Las vfas de administraci6n conocidas para el experto en la tecnica incluyen, pero sin limitaci6n, intravenosa, intracoronaria, endomiocardica, epimiocardica, intraventricular, de seno coronario retr6grado o intravenosa.

Como se mencion6 anteriormente, las celulas se pueden administrar mediante varias vfas que incluyen la administraci6n sistemica por infusi6n venosa o arterial (que incluye la infusi6n de flujo retr6grado) o por inyecci6n directa en el coraz6n. La administraci6n sistemica, en particular mediante acceso venoso periferico, tiene la ventaja de ser mfnimamente invasiva y depende de la perfusi6n natural del coraz6n y de la capacidad de las celulas derivadas de tejido adiposo de dirigirse al sitio lesionado. Las celulas se pueden inyectar en una unica inyecci6n rapida, por medio de una infusi6n lenta o por medio de una serie escalonada de aplicaciones separadas por varias horas o, con tal de que las celulas se almacenen de manera adecuada, varios dfas o semanas. Las celulas tambien se pueden administrar mediante el uso de cateteres, de forma que el primer pase de celulas a traves del coraz6n se potencie mediante el uso de globos para controlar el flujo sangufneo miocardico. Como con el acceso venoso periferico, las celulas se pueden inyectar a traves de los cateteres en una unica inyecci6n rapida o en multiples alfcuotas mas pequenas. Las celulas tambien se pueden aplicar directamente al miocardio mediante inyecci6n epicardica. Esta se podrfa emplear bajo visualizaci6n directa en el contexto de un procedimiento a coraz6n abierto (tal como Cirugfa de Injerto de Derivaci6n Aortocoronaria) o mediante la colocaci6n de un dispositivo de asistencia ventricular. Se pueden emplear cateteres equipados con agujas para administrar celulas directamente en el miocardio de una manera endocardica, que permitirfa un medio menos invasivo de aplicaci6n directa.

En una realizaci6n, la vfa de administraci6n incluira la administraci6n intravenosa a traves de un cateter intravenoso periferico convencional, un cateter venoso central o un cateter arterial pulmonar. En otras realizaciones, las celulas se pueden administrar a traves de una vfa intracoronaria a la que se accede mediante metodos actualmente aceptados. El flujo de celulas se puede controlar mediante la inflaci6n/deflaci6n de globos distales y proximales localizados dentro de la vasculatura del paciente, creando asf zonas sin flujo temporales que favorecen el injerto celular o la acci6n terapeutica celular. En otra realizaci6n, las celulas se pueden administrar por medio de un metodo endocar

dico (superficie interior de la camara cardiaca) que puede requerir el uso de un cateter compatible, asf como la capacidad de tomar imagenes o detectar el tejido objetivo deseado. De manera alternativa, las celulas se pueden administrar por medio de un metodo epicardico (superficie externa del coraz6n). Este suministro sepuede conseguir a traves de la visualizaci6n directa en el momento de un procedimiento a coraz6n abierto o a traves de una aproximaci6n mediante toracoscopia que requiere instrumentos de administraci6n de celulas especializados. Ademas, las celulas se podrfan administrar a traves de las siguientes vfas, solas o en combinaci6n con una o mas de las aproximaciones identificadas anteriormente: subcutanea, intramuscular, sublingual, perfusi6n coronaria retr6grada, dispositivos de derivaci6n coronaria, equipamiento de oxigenaci6n de membrana extracorp6rea (ECMO) y mediante una ventana pericardica.

En una realizaci6n, las celulas son para la administraci6n al paciente como una inyecci6n rapida intravascular o una infusi6n temporal. En otra realizaci6n, las celulas se pueden resuspender en un medio natural o artificial o en un soporte de tejido antes de administrarlas al paciente.

La dosis de celulas a administrar al paciente dependera de la cantidad de tejido adiposo recogido y del fndice de masa corporal del donante (como una medida de la cantidad de tejido adiposo disponible). La cantidad de tejido recogido se determinara ademas por el grado de la lesi6n o degeneraci6n miocardica. Los multiples tratamientos que usan multiples recogidas de tejido o que usan una unica recogida con almacenamiento adecuado de las celulas entre las aplicaciones estan dentro del alcance de la presente invenci6n.

Las porciones del lipoaspirado procesado se pueden almacenar antes de administrarlas a un paciente. Para el almacenamiento a corto plazo (menos de 6 horas) las celulas se pueden almacenar a o por debajo de la temperatura ambiente en un recipiente sellado con o sin complementaci6n con una disoluci6n de nutrientes. El almacenamiento a medio plazo (menos de 48 horas) se realiza preferentemente a 28 OC en una disoluci6n tamponada isosm6tica (por ejemplo Plasmalyte®) en un recipiente compuesto de o revestido con un material que impide la adhesi6n celular. El almacenamiento a mas largo plazo se realiza preferentemente mediante crioconservaci6n adecuada y almacenamiento de las celulas en condiciones que favorecen la conservaci6n de la funci6n celular, tal como se describe en la solicitud PCT en copropiedad y cedida en comun numero PCT/US02/29207, presentada el 13 de septiembre de 2002, y la solicitud provisional de EE.UU. numero 60/322.070, presentada el 14 de septiembre de 2001.

De acuerdo con un aspecto de la invenci6n, las celulas derivadas de tejido adiposo que se van a administrar a un paciente pueden actuar como vehfculos de administraci6n de factores de crecimiento. Por ejemplo, modificando las celulas para que expresen uno o mas factores de crecimiento adecuados para aliviar los sfntomas asociados a un trastorno o enfermedad cardiovascular, las celulas se pueden administrar a un paciente y modificarse para liberar uno o mas de los factores de crecimiento. La liberaci6n se puede proporcionar de una manera controlada durante periodos prolongados de tiempo. Por ejemplo, la liberaci6n se puede controlar de manera que el/los factor(es) de crecimiento se libere(n) de una manera pulsatil o peri6dica, de forma que haya elevaciones locales del factor de crecimiento, y/o recesiones locales en la cantidad de factor de crecimiento en las proximidades de un area lesionada de tejido.

Las celulas que se administran al paciente no solamente ayudan a restablecer la funci6n de tejidos lesionados o de otra forma enfermos, sino que tambien facilitan la remodelaci6n de los tejidos lesionados.

La administraci6n de celulas puede tener lugar, pero sin limitaci6n, en los siguientes lugares: clfnica, oficina clfnica, departamento de urgencias, servicio hospitalario, unidad de cuidados intensivos, quir6fano, salas de cateterizaci6n y salas radiol6gicas.

En una realizaci6n, los efectos de la terapia de administraci6n de celulas se demostrarfan, pero sin limitaci6n, mediante una de las siguientes medidas clfnicas: aumento de la fracci6n de eyecci6n cardiaca, tasa disminuida de insuficiencia cardiaca, tamano disminuido de infarto, disminuci6n de la morbilidad asociada (edema pulmonar, insuficiencia renal, arritmias), mejora de la tolerancia al ejercicio u otras medidas de calidad de vida, y reducci6n de la mortalidad. Los efectos de la terapia celular pueden ser evidentes a lo largo del transcurso de dfas a semanas despues del procedimiento. Sin embargo, los efectos beneficiosos se pueden observar tan pronto como varias horas despues del procedimiento, y pueden persistir durante varios anos.

Los pacientes se monitorizan generalmente antes y durante el suministro de las celulas. Los procedimientos de monitorizaci6n incluyen, pero sin limitaci6n: estudios de coagulaci6n, saturaci6n de oxfgeno, monitorizaci6n hemodinamica y monitorizaci6n del ritmo cardiaco. Tras la administraci6n de las celulas, los pacientes pueden necesitar un periodo de aproximadamente 24 horas de monitorizaci6n de acontecimientos adversos. Los estudios de seguimiento para determinar las mejoras funcionales de los procedimientos pueden incluir, sin limitaci6n: capacidad funcional del paciente (p.ej., disnea en el ejercicio, disnea nocturna paroxfstica, angina) ecocardiograffa, estudios de perfusi6n nuclear, imagen de resonancia magnetica, tomograffa de emisi6n de positrones y angiograffa coronaria.

Como se expuso previamente, en una realizaci6n preferida, las ADC, es decir, la poblaci6n de celulas madre derivadas de tejido adiposo activas, se administran directamente al paciente. En otras palabras, la poblaci6n de celulas activas (p.ej., las celulas madre y/o celulas precursoras endoteliales) se administran al paciente sin extraerlas del sistema o exponerlas al ambiente externo del sistema antes de administrarlas al paciente. El proporcionar un sis

tema cerrado reduce la posibilidad de contaminaci6n del material que se administra al paciente. Asf, el procesamiento del tejido adiposo en un sistema cerrado proporciona ventajas sobre los metodos existentes, debido a que es mas probable que la poblaci6n de celulas activas sea esteril. En tal realizaci6n, el unico momento en el que las celulas madre y/o celulas precursoras endoteliales se exponen al ambiente externo, o se extraen del sistema, es cuando las celulas se estan sacando hasta un dispositivo de aplicaci6n y se van a administrar al paciente. En una realizaci6n, el dispositivo de aplicaci6n tambien puede ser parte del sistema cerrado. Asf, las celulas usadas en estas realizaciones no se procesan para cultivo o crioconservaci6n, y se pueden administrar a un paciente sin procesamiento adicional, o se pueden administrar a un paciente despues demezclarlas con otros tejidos o celulas.

En otras realizaciones, al menos una parte de la poblaci6n de celulas activas se almacena para su implantaci6n/infusi6n posterior. La poblaci6n se puede dividir en mas de una alfcuota o unidad, de modo que parte de la poblaci6n de celulas madre y/o celulas precursoras endoteliales se conserva para su aplicaci6n posterior, mientras que parte se aplica inmediatamente al paciente. El almacenamiento de moderado a largo plazo de todas o parte de las celulas en un banco de celulas tambien esta dentro del alcance de la presente invenci6n, como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. nO 10/242.094, titulada PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES, presentada el 12 de septiembre de 2002, que reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE.UU. 60/322.070 presentada el 14 de septiembre de 2001. Al final del procesamiento, las celulas concentradas se pueden cargar en un dispositivo de administraci6n, tal como una jeringa, para su colocaci6n en el receptor mediante cualquier medio conocido para un experto en la tecnica.

II. Composiciones Farmaceuticas

La poblaci6n de celulas activas se puede aplicar sola o en combinaci6n con otras celulas, tejidos, fragmentos de tejido, factores de crecimiento tales como VEGF y otros factores de crecimiento angiogenicos o arteriogenicos conocidos, compuestos biol6gicamente activos o inertes, soportes plasticos reabsorbibles u otros aditivos destinados a mejorar la administraci6n, eficacia, tolerancia o funci6n de la poblaci6n. La poblaci6n celular tambien se puede modificar mediante la inserci6n de ADN o mediante la colocaci6n en cultivo celular de tal manera que cambie, mejore o complemente la funci6n de las celulas para la obtenci6n de un prop6sito estructural o terapeutico. Por ejemplo, los expertos en la tecnica conocen los metodos de transferencia genica para celulas madre, como se describe en (Morizono et al., 2003; Mosca et al., 2000), y pueden incluir tecnicas de transfecci6n virales, y mas especfficamente, tecnicas de transferencia de genes de virus adenoasociados, como se describe en (Walther y Stein, 2000) y (Athanasopoulos et al., 2000). Tambien se pueden llevar a cabo tecnicas que no se basan en virus, como se describe en (Muramatsu et al., 1998).

En otro aspecto, las celulas se podrfan combinar con un gen que codifica factor(es) de crecimiento proangiogenico(s) y/o cardiomiogenico(s) que permitirfa(n) a las celulas actuar como su propia fuente de factor de crecimiento durante la reparaci6n o regeneraci6n cardiaca. Tambien se podrfan aplicar genes que codifican factores o agentes antiapopt6ticos. La adici6n del gen (o combinaci6n de genes) podrfa ser mediante cualquier tecnologfa conocida en la tecnica, lo que incluye, pero sin limitaci6n, la transducci6n adenoviral, "pistolas genicas", transducci6n mediada por liposomas y transducci6n mediada por retrovirus o lentivirus, plasmido, virus adenoasociado. Las celulas se podrfan implantar junto con un material excipiente que albergase un vehfculo de administraci6n genica capaz de liberar y/o presentar genes a las celulas a lo largo del tiempo, de manera que la transducci6n pueda continuar o iniciarse in situ. En particular, cuando las celulas y/o el tejido que contiene las celulas se van a administrar a un paciente distinto del paciente del que se obtuvieron las celulas y/o el tejido, se pueden administrar uno o mas agentes inmunodepresores al paciente que recibe las celulas y/o el tejido para reducir, y preferentemente evitar, el rechazo del trasplante. Tal como se usa en la presente memoria, la expresi6n "farmaco o agente inmunodepresor" pretende incluir agentes farmaceuticos que inhiben o interfieren con la funci6n inmunitaria normal. Los ejemplos de agentes inmunodepresores adecuados con los metodos descritos en la presente memoria incluyen los agentes que inhiben la rutas de coestimulaci6n de celulas T/celulas B, tales como los agentes que interfieren con el acoplamiento de las celulas T y las celulas B mediante las rutas de CTLA4 y B7, como se describe en la pub. de patente de EE.UU. nO 20020182211. Un agente inmunodepresor preferido es ciclosporina A. Otros ejemplos incluyen micofenolato de mofetilo, rapamicina y globulina antitimocitos. En una realizaci6n, el farmaco inmunodepresor se administra con al menos otro agente terapeutico. El farmaco inmunodepresor esta en una formulaci6n que es compatible con la vfa de administraci6n, y se administra a un sujeto a una dosis suficiente para conseguir el efecto terapeutico deseado. En otra realizaci6n, el farmaco inmunodepresor se administra de forma transitoria durante un tiempo suficiente para inducir tolerancia hacia las ADC de la invenci6n.

En ciertas realizaciones de la invenci6n, las celulas son para la administraci6n a un paciente con uno o mas agentes de diferenciaci6n celular, tales como citocinas y factores de crecimiento. Se describen ejemplos de diversos agentes de diferenciaci6n celular en (Gimble et al., 1995; Lennon et al., 1995; Majumdar et al., 1998; Caplan y Goldberg, 1999; Ohgushi y Caplan, 1999; Pittenger et al., 1999; Caplan y Bruder, 2001; Fukuda, 2001; Worster et al., 2001; Zuk et al., 2001).

La presente invenci6n se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no se deberfan interpretar de ningun modo como adicionalmente limitantes.

Ejemplos

Las ADC o la poblaci6n activa de celulas madre derivadas de tejido adiposo usadas a lo largo de los ejemplos expuestos a continuaci6n se obtuvieron mediante el/los metodo(s) descrito(s) en la presente descripci6n y/o el/los metodo(s) descrito(s) en la solicitud de EE.UU. de nO de serie 10/316.127, titulada SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS, presentada el 9 de diciembre de 2002, que reivindica prioridad respecto de la solicitud provisional de EE.UU. de nO de serie 60/338.856, presentada el 7 de diciembre de 2001.

Ejemplo 1: Expresion de un Factor de Crecimiento Angiogenico, VEGF, por ADC

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es uno de los reguladores clave de la angiogenesis (Nagy et al., 2003; Folkman, 1995). El factor de crecimiento de placenta, otro miembro de la familia de VEGF, desempena un papel similar tanto en la angiogenesis como en la arteriogenesis, el proceso mediante el cual se reclutan vasos colaterales y se expanden en respuesta a una perfusi6n y a una fuerza de cizallamiento incrementadas (Nagy et al., 2003; Pipp et al., 2003; Scholz et al., 2003). Especfficamente, el trasplante de celulas de tipo natural (PIGF +/+) a un rat6n con inactivaci6n genica de PIGF restaura la capacidad de inducir la recuperaci6n rapida de la isquemia de las extremidades posteriores (Scholz et al., 2003).

Dada la importancia tanto de la angiogenesis como de la arteriogenesis para el proceso de revascularizaci6n, se examin6 la expresi6n de PIGF y VEGF por las celulas ADC mediante el uso de un ensayo ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) con el uso de celulas de tres donantes. Un donante tenfa un historial de hiperglucemia y diabetes tipo 2 (una afecci6n asociada muy frecuentemente con la enfermedad microvascular y macrovascular, lo que incluye a los pacientes con arteriopatfa coronaria). Las celulas ADC de cada donante se colocaron en placas a 1.000 celulas/cm2 en medio DMEM/F12 complementado con FCS al 10% y HS al 5%, y se cultivaron hasta la confluencia. Se tomaron muestras del sobrenadante y se analiz6 la expresi6n de las protefnas PIGF y VEGF. Como se muestra en las Figuras 5A y 5B, los resultados demuestran una expresi6n s6lida tanto de VEGF (Figura 5A) como de PIGF (Figura 5B) por las celulas madre derivadas de tejido adiposo de la invenci6n.

Estos datos demuestran que las celulas madre y progenitoras derivadas de tejido adiposo tanto de sujetos normales como de pacientes diabeticos expresan factores de crecimiento angiogenicos y arteriogenicos. Esto es importante, ya que los pacientes con diabetes tienen un riesgo incrementado de enfermedad cardiovascular, y estos datos indican que las celulas ADC conservan su capacidad angiogenica en una situaci6n de diabetes. Asf, los pacientes diabeticos pueden obtener un beneficio angiogenico a partir de sus propias celulas ADC.

Ejemplo 2: Las ADC Contienen Poblaciones Celulares que Participan en la Angiogenesis

Se sabe que las celulas progenitoras endoteliales (EPCs) participan en la angiogenesis. Se han detectado celulas precursoras endoteliales circulantes en sangre periferica, sangre de cord6n umbilical, medula 6sea e hfgado fetal (Takahashi, 1999; Asahara, 1999; Asahara, 1997; Loomans, 2004; Shintani, 2001; Vasa, 2001). Para determinar la frecuencia de las EPCs en las celulas madre derivadas de tejido adiposo, se llev6 a cabo un ensayo de EPC. Se colocaron celulas ADC en placas revestidas de fibronectina y se cultivaron en un medio de celulas endoteliales durante tres dfas para eliminar las celulas endoteliales maduras. Las celulas no adherentes se extrajeron y se volvieron a colocar en placas. Despues de 14 dfas se identificaron las colonias mediante tinci6n con Aglutinina1 de Ulex europaeus conjugada a FITC (Vector Labs, Burlingame, CA) y LDL acetilada marcada con DiI (Molecular Probes, Eugene, OR). Como se muestra en la Figura 6, los resultados indican una frecuencia de EPC de aproximadamente 500 EPC/106 celulas ADC.

La presencia de EPCs en la poblaci6n de celulas madre y progenitoras derivadas de tejido adiposo indica que esta poblaci6n puede participar directamente en el desarrollo de vasos sangufneos nuevos y mejorar la angiogenesis y la reperfusi6n, por lo que se reduce la duraci6n de la isquemia tras el infarto de miocardio o en la insuficiencia cardiaca congestiva.

Ejemplo 3: Desarrollo In Vitro de Estructuras Vasculares en ADC

Un ensayo reconocido en la tecnica para la angiogenesis es uno en el que las celulas endoteliales cultivadas en una capa alimentadora de fibroblastos desarrollan una red compleja de tubos positivos para CD31 que recuerdan una red capilar naciente (Donovan et al., 2001). Las ADC forman redes similares en ausencia de una capa alimentadora (Figura 7A). De manera notable, las celulas ADC obtenidas de ratones hiperglucemicos con diabetes tipo 1 inducida mediante estreptozotocina (STZ) ochos semanas despues de la administraci6n de STZ forman estructuras similares con una frecuencia similar a las de los ratones sin tratamiento (Figura 7B).

Esto es importante, ya que los pacientes con diabetes tienen un riesgo incrementado de enfermedad cardiovascular, y estos datos indican que las celulas ADC conservan su capacidad angiogenica en una situaci6n de diabetes. Asf, los pacientes diabeticos pueden obtener un beneficio angiogenico a partir de sus propias celulas ADC.

En resumen, los resultados de los Ejemplos 1 a 3, anteriormente, indican que las celulas madre derivadas de tejido adiposo contienen poblaciones de celulas que pueden estimular la angiogenesis y la arteriogenesis. Los resultados tambien indican que las celulas madre derivadas de tejido adiposo de un donante humano diabetico o de ratones tratados con STZ que exhiben una hiperglucemia mantenida probablemente no tienen deficiencia de celulas que

estimulan la angiogenesis. Asf, el tejido adiposo puede representar un dep6sito de celulas regenerativas que no se ven comprometidas por la situaci6n de diabetes en la que se incrementa sustancialmente el riesgo de enfermedad cardiovascular.

Ejemplo 4: Desarrollo InViio de Estructuras Vasculares en ADC

El potencial angiogenico in vitro, aunque prometedor, es de poco valor si las celulas no ejercen una actividad angiogenica in vivo. La inducci6n quirurgica de isquemia crftica de las extremidades en roedores es un modelo bien reconocido en el que se pueden observar procesos simultaneos de arteriogenesis (reclutamiento y expansi6n de vasos colaterales principalmente en respuesta a una fuerza de cizallamiento aumentada) y angiogenesis (desarrollo de vasos nuevos en respuesta a la isquemia) (Schatteman, 2000; Scholz, 2002; Takahashi, 1999). Este modelo se desarroll6 en ratones inmunodeficientes (NODSCID) en los que se pudo observar la capacidad de las celulas humanas de controlar la reperfusi6n. De manera especffica, se anestesiaron animales con quetamina y xilacina (80 mg/kg; 7,5 mg/kg) y se colocaron sobre la superficie de operaci6n en posici6n supina. Se determinaron los valores preoperatorios del flujo sangufneo para ambas extremidades posteriores como se describe mas adelante. Los animales se prepararon con Betadine y se cubrieron de la manera esteril habitual, y se colocaron en un bano de agua en circulaci6n. Se realiz6 una incisi6n unilateral de 1,5 cm que se extendfa desde el origen de la extremidad posterior hasta la proximidad de la rodilla para exponer la arteria ilfaca, en proximidad a su bifurcaci6n hacia las arterias femorales profunda y superficial. La vasculatura se at6 con una ligadura de seda 30 en los siguientes sitios: 1) arteria iliaca pr6xima a su bifurcaci6n, 2) distal del origen de la arteria femoral profunda, 3) proximal a la ramificaci6n de la arteria femoral superficial. Tras la ligadura, la vasculatura se retir6 en bloque. Despues se hizo un esfuerzo para identificar cualquier circulaci6n colateral evidente, que se lig6 y posteriormente se retir6. La herida y la capa de musculo se cerraron con vicryl 40, y la piel se cerr6 con vicryl 50. Los animales se trataron tras la operaci6n con buprenorfina (0,5 mg/kg) y se recuperaron en el bano de agua en circulaci6n hasta que se colocaron espontaneamente en posici6n recostada. Veinticuatro horas despues de la cirugfa se inyect6 a los animales 5x106 celulas ADC a traves de la vena de la cola. Se inyect6 a los ratones NODSCID celulas de donante humano, y se incluyeron en un estudio celulas de un paciente con diabetes. Se formaron imagenes del flujo 14 dfas tras el tratamiento.

En estos estudios, los animales tratados con ADC mostraron una mejora estadfsticamente significativa en la retenci6n de las estructuras de las extremidades (recuperaci6n de las extremidades; 2/3 ratones sin tratar perdieron todas las estructuras de las extremidades posteriores inferiores, en comparaci6n con 0/5 animales tratados con ADC) y restablecimiento del flujo (Figura 8). De forma muy notable, en los ratones NOD SCID que recibieron celulas de donante humano diabetico, el flujo en el dfa 14 se restableci6 hasta un 50±11% en los animales tratados, en comparaci6n con el 10±10% de animales sin tratar (p 0,05). El dfa 19 se habfa producido un rebote, de manera que la perfusi6n en la extremidad experimental fue mayor que la del control (136±37%). Esta respuesta se halla dentro del intervalo observado con las celulas obtenidas de dos donantes normales (no diabeticos) (5090%).

En un experimento similar en ratones inmunocompetentes (ratones 129S) en los que se pudieron determinar los efectos de la transferencia de celulas aut6logas, los ratones tratados con celulas ADC mostraron un 80±12% de restablecimiento del flujo en el dfa 14, en comparaci6n con el 56±4% en los ratones sin tratar.

En este modelo, el restablecimiento del flujo sangufneo proviene del reclutamiento y la expansi6n de vasos colaterales y de la angiogenesis en la extremidad inferior. Estos procesos tambien son clave para el restablecimiento del flujo en el coraz6n tras un infarto. Asf, la capacidad de las ADC de estimular estos procesos in vivo apoya intensamente la aplicaci6n de las celulas ADC en el ambito del infarto de miocardio. Tambien es importante indicar que las celulas ADC obtenidas de un donante diabetico (un miembro de una poblaci6n de pacientes con un riesgo mayor de enfermedad cardiovascular) tambien demostraron esta actividad.

Ejemplo 5: El Aumento de la dosis de ADC Esta Asociado a una Supervivencia del Injerto y Angiogenesis Mejoradas

El trasplante de tejido adiposo aut6logo es un procedimiento relativamente comun en cirugfa plastica y reconstructiva {Fulton, 1998; Shiffman, 2001}. Sin embargo, este procedimiento esta limitado por el hecho de que los fragmentos de tejido adiposo se transfieren sin un aporte vascular y, como resultado, la supervivencia del injerto depende de la neovascularizaci6n (Coleman, 1995; Eppley et al., 1990). Asf, de una manera limitada, el tejido trasplantado representa un tejido isquemico.

Se llev6 a cabo un estudio con ratas Fisher en el que los fragmentos de tejido adiposo se trasplantaron en el espacio subcutaneo sobre los musculos del muslo externo. La pata derecha se trasplant6 con 0,2 g de fragmentos de tejido adiposo solamente, la pata izquierda con 0,2 g de fragmentos de tejido adiposo complementados mediante la adici6n de celulas madre derivadas de tejido adiposo a tres dosis diferentes (1,7x1051,3x106 celulas/injerto; tres animales por dosis); de esta manera, la pata contralateral actu6 como un control. Los animales se mantuvieron despues durante un mes, tras el cual los animales se sacrificaron y se recuperaron los injertos, se pesaron, se fijaron en formalina y se incrustaron en parafina para su analisis histol6gico.

Como se muestra en la Figura 9A, los resultados muestran una retenci6n mfnima del tejido injertado en la pata de control, y un incremento dependiente de la dosis en la retenci6n de peso del injerto en la pata tratada. Ademas, el

analisis inmunohistoqufmico de los injertos mostr6 una neoangiogenesis considerable y perfusi6n en los injertos tratados con celulas madre derivadas de tejido adiposo (Figura 9B, flechas). Esto tambien se asoci6 a la retenci6n de la morfologfa del tejido adiposo (Figura 9B).

Como se indic6 anteriormente, la demostraci6n de que las celulas ADC favorecen la supervivencia del tejido isquemico, perfundido de manera inadecuada, es un indicador importante de potencial clfnico en la enfermedad cardiovascular.

Ejemplo EMPLO 6: Injerto Miocardico Mediante ADC

La criolesi6n del miocardio es un modelo quirurgico bien establecido para investigar el papel de la terapia celular en la regeneraci6n miocardica (Marchlinski et al., 1987). Para demostrar la capacidad de las celulas ADC de injertarse en el miocardio lesionado y por tanto inhibir la cicatrizaci6n (deposici6n y reticulaci6n de colageno), se llev6 a cabo una criolesi6n miocardica en ratones B6129SF1/J. Inmediatamente tras la lesi6n, se inyect6 1 mill6n (1,0 x 106) de celulas ADC recogidas de ratones ROSA26, que son transgenicos para el gen lacZ mediante una vfa intraventricular. El tejido cardiaco del receptor tenido con Bgalactosidasa detectara la presencia de las celulas madre derivadas de tejido adiposo del donante mediante una tinci6n azul. Los corazones de los ratones se recogieron y se procesaron en los 5 momentos siguientes tras la inyecci6n: dfa 1, dfa 7, dfa 14, dfa 28, dfa 84. Como se muestra en la Figura 10, los resultados demuestran el injerto de celulas madre derivadas de tejido adiposo derivadas del donante en el area de miocardio infartado en todos los momentos a los que se hizo referencia anteriormente. La Figura 10 demuestra una lfnea temporal histol6gica del injerto.

De manera importante, el analisis inmunohistoqufmico de las celulas derivadas de donante (positivas para beta galactosidasa) el dfa 14 indic6 que muchas celulas derivadas de donante expresaban el marcador de miocitos cardiacos, la cadena pesada de miosina (Figura 11). Esto indica que las celulas ADC son capaces de dirigirse al sitio de lesi6n en un coraz6n lesionado, y de diferenciarse hasta miocitos cardiacos. Asf, las celulas ADC pueden ser capaces de reponer los miocitos cardiacos que se pierden tras un ataque al coraz6n (infarto de miocardio).

Para ampliar estos hallazgos entre especies, se estudi6 el injerto de un lipoaspirado procesado derivado de donante en un modelo de oclusi6n/reperfusi6n en rata. En este sistema experimental, se ocluy6 temporalmente la arteria coronaria principal (descendente anterior izquierda) de una rata Wistar inmunocompetente mediante el uso de proleno 70 y un trozo pequeno de tubo silastic que actuaba como un lazo sobre la arteria. Despues de una hora, la oclusi6n se liber6 y se permiti6 que la sangre volviera a perfundir el miocardio isquemico. Este modelo representa mas fielmente los mecanismos de lesi6n y reparaci6n presentes en el paradigma clfnico humano. Inmediatamente tras la reperfusi6n, se inyectaron aproximadamente 1 mill6n (1 x 106) de celulas ADC obtenidas de ratones Rosa 26 a traves de una vfa intraventricular. Los corazones se recogieron una semana despues de la inyecci6n. Como se muestra en la Figura 12, los resultados demuestran el injerto de celulas ADC derivadas de donante.

Ejemplo 7: Tratamiento de la Lesion Cardiaca Aguda

El infarto de miocardio agudo (ataque al coraz6n) da como resultado la lesi6n isquemica del miocardio. La lesi6n del tejido se puede minimizar mediante la reperfusi6n del tejido lesionado y mediante la regeneraci6n del tejido miocardico (Murry et al., 1996; Orlic et al., 2001; Orlic et al., 2003; Rajnoch et al., 2001; Strauer et al., 2002; Assmus et al., 2002). La terapia con celulas derivadas de tejido adiposo, como se describe en la presente memoria, busca proporcionar una fuente superior de celulas regenerativas respecto a las terapias con celulas derivadas de tejido no adiposo, debido, por ejemplo, a al menos uno del uso de un mayor numero de celulas no cultivadas y celulas mas puras con morbilidad atenuada asociada a las terapias con celulas derivadas de tejido no adiposo, tales como la recogida de medula 6sea.

Se sospecha que un paciente ha sufrido un infarto de miocardio. El paciente ingresa en un periodo de una hora desde el inicio del infarto. Se prescribe al paciente una terapia con celulas derivadas de tejido adiposo. Se examina la constituci6n del paciente en busca de un sitio adecuado para la recogida de tejido adiposo. Los sitios de recogida se caracterizan por al menos uno de lo siguiente: espacio(s) potencial(es) limitado(s) por estructuras anat6micas normales, sin estructuras vasculares o viscerales importantes con riesgo de lesi6n, y facilidad de acceso. Se prefieren sitios de recogida vfrgenes, pero un sitio de recogida previo no impide la recogida de tejido adiposo adicional. Los sitios de recogida posibles incluyen, pero sin limitaci6n, los siguientes: regiones del muslo lateral y media de extremidades inferiores bilaterales, panfculo adiposo de la pared abdominal anterior y regiones flanqueantes bilaterales.

El paciente recibe una inyecci6n subcutanea de una disoluci6n fluida tumescente que contiene una combinaci6n de lidocafna, soluci6n salina y epinefrina, por ejemplo, en diferentes regfmenes de dosis normalizados. Mediante el uso de un bisturf (p.ej., un bisturf de hoja 11), se realiza una pequena punci6n en la regi6n media del muslo del paciente en su pierna derecha y/o izquierda para atravesar la dermis. La hoja se gira 360 grados para completar la herida. Se inserta una canula de punta roma (p.ej., una canula de calibre 14) en el plano del tejido adiposo subcutaneo por debajo de la incisi6n. La canula se conecta a un dispositivo de succi6n accionado electricamente. La canula se mueve a traves del plano de tejido adiposo para romper la arquitectura del tejido conectivo. Se obtienen aproximadamente 500 cm3 de aspirado. Despues de la retirada del tejido adiposo, se consigue la hemostasis con tecnicas

quirurgicas convencionales y se cierra la herida.

El lipoaspirado se procesa de acuerdo con los metodos descritos anteriormente en la presente memoria para obtener una unidad de celulas madre derivadas de tejido adiposo concentradas. Aproximadamente seis horas despues del infarto, se administran las celulas madre al paciente. Basandose en el procesamiento del lipoaspirado, se estima que el paciente recibe una dosis inicial de celulas madre en un intervalo de entre aproximadamente 5,5 x 104 celulas madre y 5,5 x 105 celulas madre. El paciente recibe dos dosis complementarias a intervalos de 12 horas tras la administraci6n inicial. Las celulas madre se administran al paciente a traves de un cateter venoso central. Para favorecer el injerto celular en la regi6n objetivo, se controla el flujo de las celulas madre mediante un globo localizado despues del sitio objetivo y mediante un globo localizado antes del sitio objetivo, para crear regiones de flujo sangufneo bajo o mfnimo.

Se observan las mejoras en el paciente en un periodo de aproximadamente seis horas tras el metodo de administraci6n de las celulas. Varios dfas despues del procedimiento de administraci6n de las celulas se observa una mejora adicional del paciente, evidenciada por el aumento de la fracci6n de eyecci6n cardiaca, la reducci6n de la tasa de insuficiencia cardiaca, la reducci6n del tamano del infarto, la mejora de la tolerancia al ejercicio y otras medidas de calidad de vida.

REFERENCIAS

Abbate, A., BiondiZoccai, G.G., y Baldi, A. (2002). "Pathophysiologic role of myocardial apoptosis in postinfarction left ventricular remodeling". J Cell Physiol 193, 14553.

Aharinejad, S., Marks, S.C., Jr., Bock, P., MasonSavas, A., MacKay, C.A., Larson, E.K., Jackson, M.E., Luftensteiner, M., y Wiesbauer, E. (1995). "CSF1 treatment promotes angiogenesis in the metaphysics of osteopetrotic (toothless, tl) rats". Bone 16, 315324.

Alison, M. (1998). "Liver stem cells: a two compartment system" Curr Opin Cell Biol 10, 7105.

AmericanHeartAssociation (2002). Heart Disease and Stroke Statistics2003 Update. (Dallas, Texas: American Heart Association).

Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., y Lindvall, O. (2002). "Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke". Nat Med 8, 96370.

Asahara, T., Takahashi, T., Masuda, H., Kalka, C., Chen, D., Iwaguro, H., Inai, Y., Silver, M., y Isner, J.M. (1999). "VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrowderived endothelial progenitor cells". Embo J 18, 396472.

Ashjian, P.H., Elbarbary, A.S., Edmonds, B., DeUgarte, D., Zhu, M., Zuk, P.A., Lorenz, H.P., Benhaim, P., y Hedrick,

M.H. (2003). "In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors". Plast Reconstr Surg 111, 192231.

Asken, S. (1990). "Microliposuction and autologous fat transplantation for aesthetic enhancement of the aging face". J Dermatol Surg Oncol 16, 96572.

Asou, Y., Rittling, S.R., Yoshitake, H., Tsuji, K., Shinomiya, K., Nifuji, A., Denhardt, D.T., y Noda, M. (2001). "Osteopontin facilitates angiogenesis, accumulation of osteoclasts, and resorption in ectopic bone". Endocrinology 142, 13251332.

Assady, S., Maor, G., Amit, M., ItskovitzEldor, J., Skorecki, K.L., y Tzukerman, M. (2001). "Insulin production by human embryonic stem cells". Diabetes 50, 16917.

Assmus, B., Schachinger, V., Teupe, C., Britten, M., Lehmann, R., Dobert, N., Grunwald, F., Aicher, A., Urbich, C., Martin, H., Hoelzer, D., Dimmeler, S., y Zeiher, A.M. (2002). "Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCAREAMI)". Circulation 106, 300917.

Athanasopoulos, T., Fabb, S., y Dickson, G. (2000). "Gene therapy vectors based on adenoassociated virus: characteristics and applications to acquired and inherited diseases (review)". Int J Mol Med 6, 36375.

Bagnato, A. y Spinella, F. (2003). "Emerging role of endothelin1 in tumor angiogenesis". Trends Endocrinol. Metab 14, 4450.

Banfi, A., Bianchi, G., Galotto, M., Cancedda, R., y Quarto, R. (2001). "Bone marrow stromal damage after chemo/radiotherapy: occurrence, consequences and possibilities of treatment". LeukLymphoma 42, 86370.

Barker, J.N., Davies, S.M., DeFor, T., Ramsay, N.K., Weisdorf, D.J., y Wagner, J.E. (2001). "Survival after transplantation of unrelated donor umbilical cord blood is comparable to that of human leukocyte antigenmatched unrelated donor bone marrow: results of a matchedpair analysis". Blood 97, 295761.

Barry, F.P., Boynton, R.E., Haynesworth, S., Murphy, J.M., y Zaia, J. (1999). "The monoclonal antibody SH2, raised against human mesenchymal stem cells, recognizes an epitope on endoglin (CD105)". Biochem Biophys Res Commun 265, 1349.

Beecken, W.D., Kramer, W., y Jonas, D. (2000). "New molecular mediators in tumor angiogenesis". J Cell Mol Med 4,

262269. Berdel, W.E., Fink, U., Thiel, E., Stunkel, K., Greiner, E., Schwarzkopf, G., Reichert, A., y Rastetter, J. (1982). "Purification of human monocytes by adherence to polymeric fluorocarbon. Characterization of the monocyte enriched cell fraction". Immunobiology 163, 511520.

Bickenbach, J.R y Dunnwald, M. (2000). "Epidermal stem cells: characteristics and use in tissue engineering and gene therapy". Adv Dermatol 16, 15983.

BonnerWeir, S. y Sharma, A. (2002). "Pancreatic stem cells". J Pathol. 197, 519526. Botta, M., Manetti, F., y Corelli, F. (2000). "Fibroblast growth factors and their inhibitors". Curr. Pharm. Des 6, 1897 1924.

Buschmann, IR., Busch, H.J., Mies, G., y Hossmann, K.A. (2003). "Therapeutic induction of arteriogenesis in

hypoperfused rat brain via granulocytemacrophage colonystimulating factor". Circulation 108, 610615. Caplan, A.I. y Bruder, S.P. (2001). "Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21set century". Trends Mol Med 7, 25964.

Caplan, A.I. y Goldberg, V.M. (1999). "Principles of tissue engineered regeneration of skeletal tissues". Clin Orthop 126. Carano, R.A y Filvaroff, E.H. (2003). "Angiogenesis and bone repair". Drug Discov. Today 8, 980989.

Carmeliet, P. (2000). "Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis". Nat Med 6, 389395. Civin, C.I., Strauss, L.C., Fackler, M.J., Trischmann, T.M., Wiley, J.M., y Loken, M.R (1990). "Positive stem cell selectionbasic science". Prog Clin Biol Res 333, 387401.

Clarke, D. y Frisen, J. (2001). "Differentiation potential of adult stem cells". Curr Opin GenetDev 11, 57580.

Coleman, S.R. (1995). "Longterm survival of fat transplants: controlled demonstrations". Aesthetic Plast Surg 19, 4215. Commons, G.W., Halperin, B., y Chang, C.C. (2001). "Largevolume liposuction: a review of 631 consecutive cases

over 12 years". Plast Reconstr Surg 108, 175363. Crosby, H.A. y Strain.A.J. (2001). "Adult liver stem cells: bone marrow, blood, or liver derived?" Gut 48, 1534. D'Ippolito, G., Schiller, P.C., Ricordi, C., Roos, B.A., y Howard, G.A. (1999). "Agerelated osteogenic potential of

mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow". J Bone Miner Res 14, 111522.

De Ugarte, DA., Ashjian, P.H., Elbarbary, A., y Hedrick, M.H. (2003). "Future of fat as raw material for tissue regeneration". Ann Plast Surg 50, 2159. Donovan, D., Brown, N.J., Bishop, E.T., y Lewis, C.E. (2001). "Comparison of three in vitro human 'angiogenesis'

assays with capillaries formed in vivo". Angiogenesis 4, 113121.

Engelholm, S.A., SpangThomsen, M., Brunner, N., Nohr, I., y Vindelov, L.L. (1985). "Disaggregation of human solid tumors by combined mechanical and enzymatic methods". Br J Cancer 51, 938. Eppley, B.L., Smith, P.G., Sadove, A.M., y Delfino, J.J. (1990). "Experimental effects of graft revascularization and

consistency on cervicofacial fat transplant survival". J Oral Maxillofac Surg 48, 5462.

Eschenhagen, T., Didie, M., Munzel, F., Schubert, P., Schneiderbanger, K., y Zimmermann, W.H. (2002). "3D engineered heart tissue for replacement therapy". Basic Res Cardiol 97 Supl. 1, I146I152. Falla, N., Van, V., Bierkens, J., Borremans, B., Schoeters, G., y Van Gorp, U. (1993). "Characterization of a 5fluor

ouracilenriched osteoprogenitor population of the murine bone marrow". Blood 82, 358091. Folkman, J. (1995). "Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease". Nat Med 1, 2731. Formanek, M., Temmel, A., Knerer, B., Willheim, M., Millesi, W., y Kornfehl, J. (1998). "Magnetic cell separation for

purification of human oral keratinocytes: an effective method for functional studies without prior cell subcultivation".

Eur Arch. Otorhinolaryngol. 255, 211215.

Fukuda, K. (2001). "Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering". Artif Organs 25, 18793.

Gaustad, K.G., Boquest, A.C., Anderson, B.E., Gerdes, A.M., y Collas, P. (2004). "Differentiation of human adipose tissue stem cells using extracts of rat cardiomyocytes". Biochem. Biophys. Res Commun. 314, 420427.

Geisellhart, A., Neu, S., Buchholz F., Lang, P., Niethammer, D., y Handgretinger, R. (1996). "Positive selection of CD56+ lymphocytes by magnetic cell sorting". Nat Immun. 15, 227233.

Gimble, J.M., Morgan, C., Kelly, K., Wu, X., Dandapani, V., Wang, C.S., y Rosen, V. (1995). "Bone morphogenetic proteins inhibit adipocyte differentiation by bone marrow stromal cells". J Cell Biochem 58, 393402.

Graepler, F., Lauer, U., y Gregor, M. (1998). "Magnetic cell sorting for parietal cell purification using a new monoclonal antibody without influence on cell function". J Biochem. Biophys. Methods 36, 143155.

Greenberg, A.W. y Hammer, D.A. (2001). "Cell separation mediated by differential rolling adhesion". Biotechnol Bioeng 73, 11124.

Gryn, J., Shadduck, R.K., Lister, J., Zeigler, Z.R., y Raymond, J.M. (2002). "Factors affecting purification of CD34 (+) peripheral blood stem cells using the Baxter Isolex 300i". J Hematother Stem Cell Res 11, 71930.

Hagege, A.A., Camion, C., Menasche, P., Vilquin, J.T., Duboc, D., Marolleau, J.P., Desnos, M., y Bruneval, P. (2003). "Viability and differentiation of autologous skeletal myoblast grafts in ischaemic cardiomyopathy". Lancet 361, 4912.

Hanada, K., Dennis, J.E., y Caplan, A.I. (1997). "Stimulatory effects of basic fibroblast growth factor and bone morphogenetic protein2 on osteogenic differentiation of rat bone marrowderived mesenchymal stem cells". J Bone Miner Res 12, 160614.

Hemstreet, G.P.3., Enoch, P.G., y Pretlow, T.G.2. (1980). "Tissue disaggregation of human renal cell carcinoma with further isopyknic and isokinetic gradient purification". Cancer Res 40, 10439.

Horwitz, E.M., Prockop, D.J., Gordon, P.L., Koo, W.W., Fitzpatrick, L.A., Neel, M.D., McCarville, M.E., Orchard, P.J., Pyeritz, RE., y Brenner, M.K. (2001). "Clinical responses to bone marrow transplantation in children with severe osteogenesis imperfecta". Blood 97, 122731.

Ito, Y. y Shinomiya, K. (2001). "A new continuousflow cell separation method based on cell density: principle, apparatus, and preliminary application to separation of human buffy coat". J Clin Apheresis. 16, 186191.

Jacobson, L., Kahan, B., Djamali, A., Thomson, J., y Odorico, J.S. (2001). "Differentiation of endoderm derivatives, pancreas and intestine, from rhesus embryonic stem cells". Transplant Proc 33, 674.

Jaiswal, R.K., Jaiswal, N., Bruder, S.P., Mbalaviele, G., Marshak, D.R, y Pittenger, M.F. (2000). "Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogenactivated protein kinase". J Biol Chem 275, 964552.

Jiang, Y., Jahagirdar, B.N., Reinhardt, R.L., Schwartz, R.E., Keene, C.D., OrtizGonzalez, X.R., Reyes, M., Lenvik, T., Lund, T., Blackstad, M., Du, J., Aldrich, S., Lisberg, A., Low, W.C., Largaespada, D.A., y Verfaillie, C.M. (2002a). "Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow". Nature 418, 419.

Jiang, Y., Vaessen, B., Lenvik, T., Blackstad, M., Reyes, M., y Verfaillie, C.M. (2002b). "Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain". Exp Hematol 30, 896904.

Joyner, C.J., Triffitt, J., Puddle, B., y Athanasou, N.A. (1999). "Development of a monoclonal antibody to the aP2 protein to identify adipocyte precursors in tumours of adipose differentiation". Pathol. Res Pract. 195, 461466.

Katz, A.J., Hedrick, M.H., Llull, R., y Futrell, J.W. (2001a). "A novel device for the simple and efficient refinement of liposuctioned tissue". Plast Reconstr Surg 107, 5957.

Katz, B.E., Bruck, M.C., y Coleman, W.P.3. (2001b). "The benefits of powered liposuction versus traditional liposuction: a paired comparison analysis". Dermatol Surg 27, 8637.

Kaushal, S., Amiel, G.E., Guleserian, K.J., Shapira, O.M., Perry, T., Sutherland, F.W., Rabkin, E., Moran, A.M., Schoen, F.J., Atala, A., Soker, S., Bischoff, J., y Mayer, J.F., Jr. (2001). "Functional smalldiameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo". Nat Med 7, 103540.

Kawamoto, A., Gwon, H.C., Iwaguro, H., Yamaguchi, J.I., Uchida, S., Masuda, H., Silver, M., Ma, H., Kearney, M., Isner, J.M., y Asahara, T. (2001). "Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for

myocardial ischemia". Circulation 103, 6347.

Kawamoto, A., Tkebuchava, T., Yamaguchi, J., Nishimura, H., Yoon, Y.S., Milliken, C., Uchida, S., Masuo, O., Iwaguro, H., Ma, H., Hanley, A., Silver, M., Kearney, M., Losordo, D.W., Isner, J.M., y Asahara, T. (2003). "Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia". Circulation 107, 4618.

Kobari, L., Giarratana, M.C., Pflumio, F., Izac, B., Coulombel, L., y Douay, L. (2001). "CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells". J Hematother Stem Cell Res 10, 273281.

Lamouille, S., Mallet, C., Feige, J.J., y Bailly, S. (2002). "Activin receptorlike kinase 1 is implicated in the maturation phase of angiogenesis". Blood 100, 44954501.

Lasch, J., Kullertz, G., y Opalka, J.R. (2000). "Separation of erythrocytes into agerelated fractions by density or size? Counterflow centrifugation". Clin Chem Lab Med 38, 629632.

Lehner, M. y Holter, W. (2002). "Endotoxinfree purification of monocytes for dendritic cell generation via discontinuous density gradient centrifugation based on diluted FicollPaque Plus". Int Arch. Allergy Immunol. 128, 7376.

Lennon, D.P., Haynesworth, S.E., Young, RG., Dennis, J.E., y Caplan, A.I. (1995). "A chemically defined medium supports in vitro proliferation and maintains the osteochondral potential of rat marrowderived mesenchymal stem cells". Exp Cell Res 219, 21122.

Lieberman, J.R., Le, L.Q., Wu, L., Finerman, G.A., Berk, A., Witte, O.N., y Stevenson, S. (1998). "Regional gene therapy with a BMP2producing murine stromal cell line induces heterotopic and orthotopic bone formation in rodents". J Orthop Res 16, 3309.

Lind, M. (1998). "Growth factor stimulation of bone healing. Effects on osteoblasts, osteomies, and implants fixation". Acta Orthop Scand Supl. 283, 237.

Luskey, B.D., Lim, B., Apperley, J.F., Orkin, S.H., y Williams, D.A. (1990). "Gene transfer into murine hematopoietic stem cells and bone marrow stromal cells". Ann NY Acad Sci 612, 398406.

Luttun, A., Tjwa, M., Moons, L., Wu, Y., AngelilloScherrer, A., Liao, F., Nagy, J.A., Hooper, A., Priller, J., De Klerck, B., Compernolle, V., Daci, E., Bohlen, P., Dewerchin, M., Herbert, J.M., Fava, R, Matthys, P., Carmeliet, G., Collen, D., Dvorak, H.F., Hicklin, D.J., y Carmeliet, P. (2002). "Revascularization of ischemic tissues by P1GF treatment, and inhibition of tumor angiogenesis, arthritis and atherosclerosis by antiFlt1". Nat Med 8, 83140.

Mainwaring, G. y Rowley, A.F. (1985). "Separation of leucocytes in the dogfish (Scyliorhinus canicula) using density gradient centrifugation and differential adhesion to glass coverslips". Cell Tissue Res 241, 28390.

Majumdar, M.K., Thiede, M.A., Mosca, J.D., Moorman, M., y Gerson, S.L. (1998). "Phenotypic and functional comparison of cultures of marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells". J Cell Physiol 176, 57

66.

Marchlinski, F.E., Falcone, R., Iozzo, R.V., Reichek, N., Vassallo, J.A., y Eysmann, S.B. (1987). "Experimental myocardial cryoinjury: local electromechanical changes, arrhythmogenicity, and methods for determining depth of injury". Pacing Clin Electrophysiol 10, 886901.

Mills, J.D., Fischer, D., y Villanueva, F.S. (2000). "Coronary collateral development during chronic ischemia: serial assessment using harmonic myocardial contrast echocardiography". J Am Coll Cardiol 36, 618624.

Mints, M., Blomgren, B., Falconer, C., y Palmblad, J. (2002). "Expression of the vascular endothelial growth factor (VEGF) family in human endometrial blood vessels". Scand. J Clin Lab Invest 62, 167175.

Mizuno, H., Zuk, P.A., Zhu, M., Lorenz, H.P., Benhaim, P., y Hedrick, M.H. (2002). "Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells". Plast Reconstr Surg 109, 199209.

Mohr, M., Dalmis, F., Hilgenfeld, E., Oelmann, E., Zuhlsdorf, M., KratzAlbers, K., Nolte, A., Schmitmann, C., OnaldiMohr, D., Cassens, U., Serve, H., Sibrowski, W., Kienast, J., y Berdel, W.E. (2001). "Simultaneous immunomagnetic CD34+ cell selection and Bcell depletion in peripheral blood progenitor cell samples of patients suffering from Bcell nonHodgkin's lymphoma". Clin Cancer Res 7, 5157.

Monteiro, P., Antunes, A., Goncalves, L.M., y Providencia, L.A. (2003). "Longterm clinical impact of coronarycollateral vessels after acute myocardial infarction". Rev. Port. Cardiol 22, 10511061.

Morizono, K., De Ugarte, D.A., Zhu, M., Zuk, P., Elbarbary, A., Ashjian, P., Benhaim, P., Chen, I.S., y Hedrick, M.H. (2003). "Multilineage cells from adipose tissue as gene delivery vehicles". Hum. Gene Ther. 14, 5966.

Mosca, J.D., Hendricks, J.K, Buyaner, D., DavisSproul, J., Chuang, L.C., Majumdar, M.K., Chopra, R., Barry, F., Murphy, M., Thiede, M.A., Junker, U., Rigg, R.J., Forestell, S.P., Bohnlein, E., Storb.R., y Sandmaier, B.M. (2000). "Mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery". Clin Orthop 7190.

Muramatsu, T., Nakamura, A., y Park, H.M. (1998). "In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review)". Int J Mol Med 1, 5562.

Murry, C.E., Wiseman, R.W., Schwartz, S.M., y Hauschka, S.D. (1996). "Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis". J Clin Invest 98, 251223.

Muschler, G.F., Nitto, H., Boehm, C.A., y Easley, K.A. (2001). "Age and genderrelated changes in the cellularity of human bone marrow and the prevalence of osteoblastic progenitors". J Orthop Res 19, 11725.

Nagy, J.A., Dvorak, A.M., y Dvorak, H.F. (2003). "VEGFA(164/165) and P1GF: roles in angiogenesis and arteriogenesis". Trends Cardiovasc Med 13, 169175.

Nerem, R.M. y Ensley, A.E. (2004). "The tissue engineering of blood vessels and the heart". Am j Transplant 4 Supl. 6, 3642.

Nishimori, M., Yamada, Y., Hoshi, K., Akiyama, Y., Hoshi, Y., Morishima, Y., Tsuchida, M., Fukuhara, S., y Kodera,

Y. (2002). "Healthrelated quality of life of unrelated bone marrow donors in Japan". Blood 99, 19952001.

Odorico, J.S., Kaufman, D.S., y Thomson, J.A. (2001). "Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines". Stem Cells 19, 193204.

Ohgushi, H. y Caplan, A.I. (1999). "Stem cell technology and bioceramics: from cell to gene engineering". J Biomed Mater Res 48, 91327.

Orlic, D., Kajstura, J., Chimenti, S., Bodine, D.M., Leri, A., y Anversa, P. (2001). "Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice". Ann N Y Acad Sci 938, 2219.

Orlic, D., Kajstura, J., Chimenti, S., Bodine, D.M., Leri, A., y Anversa, P. (2003). "Bone marrow stem cells regenerate infarcted myocardium". Pediatr. Transplant. 7 Supl. 3, 8688.

Pera, M.F., Reubinoff, B., y Trounson,A. (2000). "Human embryonic stem cells". J Cell Sci 113 (Pt 1), 510.

Pipp, F., Heil, M., Issbrucker, K., Ziegelhoeffer, T., Martin, S., van den, H.J., Weich, H., Fernandez, B., Golomb, G., Carmeliet, P., Schaper, W., y Clauss, M. (2003). "VEG FR1selective VEGF homologue P1 GF is arteriogenic: evidence for a monocytemediated mechanism". Circ. Res 92, 378385.

Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, RK., Douglas, R., Mosca, J.D., Moorman, M.A., Simonetti, D.W., Craig, S., y Marshak, D.R. (1999). "Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells". Science 284, 1437.

Prince, H.M., Bashford, J., Wall, D., Rischin, D., Parker, N., Toner, G.C., Seymour, J.F., Blakey, D., Haylock, D., Simmons, P., Francis, P., Wolf, M., Januszewicz, E.H., Richardson, G., Scarlett, J., y Briggs, P. (2002). "Isolex 300i CD34 selected cells to support multiple cycles of highdose therapy". Cytotherapy 4, 13745.

Qian, X., Jin, L., y Lloyd, R.V. (1998). "Percoll Density GradientEnriched Populations of Rat Pituitary Cells: Interleukin 6 Secretion, Proliferative Activity, and Nitric Oxide Synthase Expression". Endocr. Pathol. 9, 339346.

Quirici, N., Soligo, D., Bossolasco, P., Servida, F., Lumini, C., y Deliliers, G.L. (2002). "Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by antinerve growth factor receptor antibodies". Exp Hematol 30, 78391.

Rajnoch, C., Chachques, J.C., Berrebi, A., Bruneval, P., Benoit, M.O., y Carpentier, A. (2001). "Cellular therapy reverses myocardial dysfunction". J Thorac Cardiovasc Surg 121, 8718.

Rangappa, S., Fen, C., Lee, E.H., Bongso, A., y Wei, E.S. (2003). "Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes". Ann Thorac. Surg 75, 775779.

Remme, W.J. (2000). "Overview of the relationship between ischemia and congestive heart failure". Clin Cardiol 23, 48.

Reyes, M., Lund, T., Lenvik, T., Aguiar, D., Koodie, L., y Verfaillie, C.M. (2001). "Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells". Blood 98, 26152625.

Ribatti, D., Vacca, A., Roccaro, A.M., Crivellato, E., y Presta, M. (2003). "Erythropoietin as an angiogenic factor". Eur J Clin Invest 33, 891896.

Russell, S.W., Doe, W.F., Hoskins, R.G., y Cochrane, C.G. (1976). "Inflammatory cells in solid murine neoplasms. I.

Tumor disaggregation and identification of constituent inflammatory cells". Int J Cancer 18, 32230.

Scholz, D., Cai, W.J., y Schaper, W. (2001). "Arteriogenesis, a new concept of vascular adaptation in occlusive disease". Angiogenesis. 4, 247257.

Scholz, D., Elsaesser, H., Sauer, A., Friedrich, C., Luttun, A., Carmeliet, P., y Schaper, W. (2003). "Bone marrow transplantation abolishes inhibition of arteriogenesis in placenta growth factor (P1GF) / mice". J Mol Cell Cardiol 35, 177184.

Scholz, D., Ziegelhoeffer, T., Helisch, A., Wagner, S., Friedrich, C., Podzuweit, T., y Schaper, W. (2002). "Contribution of arteriogenesis and angiogenesis to postocclusive hindlimb perfusion in mice". J Mol Cell Cardiol 34, 775787.

Schwartz, R.E., Reyes, M., Koodie, L., Jiang, Y., Blackstad, M., Lund, T., Lenvik, T., Johnson.S., Hu, W.S., y Verfaillie, C.M. (2002). "Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocytelike cells". J Clin Invest 109, 1291302.

Schweitzer, C.M., van, der, Schoot, Ce, Drager, A.M., van, der, Valk, P, Zevenbergen, A., Hooibrink, B., Westra, A.H., y Langenhuijsen, M.M. (1995). "Isolation and culture of human bone marrow endothelial cells". Exp Hematol 23, 418.

Sekiya, I., Larson, B.L., Smith, J.R., Pochampally, R., Cui, J.G., y Prockop, D.J. (2002). "Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality". Stem Cells 20, 530541.

Sergeant, P., Blackstone, E., y Meyns, B. (1997). "Early and late outcome after CABG in patients with evolving myocardial infarction". Eur J Cardiothorac. Surg 11, 848856.

Shigematsu, S., Yamauchi, K., Nakajima, K., Iijima, S., Aizawa, T., y Hashizume, K. (1999). "IGF1 regulates migration and angiogenesis of human endothelial cells". Endocr. J 46 Supl. S59S62.

Smith, J.W. (1997). "Apheresis techniques and cellular immunomodulation". Ther. Apher. 1, 203206.

Smith, R.J. y Sweetenham, J.W. (1995). "A mononuclear cell dose of 3 x 10(8)/kg predicts early multilineage recovery in patients with malignant lymphoma treated with carmustine, etoposide, AraC and melphalan (BEAM) and peripheral blood progenitor cell transplantation". Exp Hemato1 23, 15818.

Smits, G., Holzgreve, W., y Hahn, S. (2000). "An examination of different Percoll density gradients and magnetic activated cell sorting (MACS) for the enrichment of fetal erythroblasts from maternal blood". Arch. Gynecol. Obstet. 263, 160163.

Sodian, R., Lemke, T., Fritsche, C., Hoerstrup, S.P., Fu, P., Potapov, E.V., Hausmann, H., y Hetzer, R. (2002). "Tissueengineering bioreactors: a new combined cellseeding and perfusion system for vascular tissue engineering". Tissue Eng 8, 863870.

Soli, M., Blanco, L., Riggert, J., MartinezClavel, A., Lucas, C., Lunghi, M., Belloni, M., Wolf, C., van Waeg, G., y Antoon, M. (2001). "A multicentre evaluation of a new filtration protocol for leucocyte depletion ofhighhaematocrit red blood cells collected by an automated blood collection system". Vox Sang. 81, 108112.

Stamm, C., Westphal, B., Kleine, H.D., Petzsch, M., Kittner, C., Klinge, H., Schumichen, C., Nienaber, C.A., Freund, M., y Steinhoff, G. (2003). "Autologous bonemarrow stemcell transplantation for myocardial regeneration". Lancet 4, 4546.

Strauer, B.E., Brehm, M., Zeus, T., Kostering, M., Hernandez, A., Sorg, R.V., Kogler, G., y Wernet, P. (2002). "Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans". Circulation 106, 19138.

Sundberg, C., Kowanetz, M., Brown, L.F., Detmar, M., y Dvorak, H.F. (2002). "Stable expression of angiopoietin1 and other markers by cultured pericytes: phenotypic similarities to a subpopulation of cells in maturing vessels during later stages of angiogenesis in vivo". Lab Invest 82, 387401.

Toma, J.G., Akhavan, M., Fernandes, K.J., BarnabeHeider, F., Sadikot, A., Kaplan, D.R., y Miller, F.D. (2001). "Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin". Nat Cell Biol 3, 77884.

Twentyman, P.R. y Yuhas, J.M. (1980). "Use of bacterial neutral protease for disaggregation of mouse tumours and multicellular tumor spheroids". Cancer Lett 9, 2258.

Van, M., V, Meyer, E., Dosogne, H., y Burvenich, C. (2001). "Separation of bovine bone marrow into maturationrelated myeloid cell fractions". Vet. Immunol. Immunopathol. 83, 1117.

Walther, W. y Stein, U. (2000). "Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases". Drugs 60, 24971.

Wang, L., Zeng, H., Wang, P., Soker, S., y Mukhopadhyay, D. (2003). "Neuropilin1mediated vascular permeability factor/vascular endothelial growth factordependent endothelial cell migration". J Biol Chem 278, 4884848860.

Watts, M.J., Somervaille, T.C., Ings, S.J., Ahmed, F., Khwaja, A., Yong, K., y Linch, D.C. (2002). "Variable product purity and functional capacity after CD34 selection: a direct comparison of the CliniMACS (v2.1) and Isolex 300i (v2.5) clinical scale devices". Br J Haematol 118, 11723.

Williams, S.K., McKenney, S., y Jarrell, B.E. (1995). "Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion". Cell Transplant 4, 2819.

Worster, A.A., BrowerToland, B.D., Fortier, L.A., Bent, S.J., Williams, J., y Nixon, A.J. (2001). "Chondrocytic differentiation of mesenchymal stem cells sequentially exposed to transforming growth factorbetal in monolayer and insulinlike growth factorI in a threedimensional matrix". J Orthop Res 19, 73849.

Xiong, B., Gong, L.L., Zhang, F., Hu, M.B., y Yuan, H.Y. (2002). "TGF beta1 expression and angiogenesis in colorectal cancer tissue". World J Gastroenterol. 8, 496498.

Ye, Q., Zund, G., Benedikt, P., Jockenhoevel, S., Hoerstrup, S.P., Sakyama, S., Hubbell, J.A., y Turina, M. (2000). "Fibrin gel as a three dimensional matrix in cardiovascular tissue engineering". Eur J Cardiothorac Surg 17, 58791.

Young, H.E., Steele, T.A., Bray, R.A., Hudson, J., Floyd, J.A., Hawkins, K., Thomas, K., Austin, T., Edwards, C., Cuzzourt, J., Duenzl, M., Lucas, P.A., y Black, A.C., Jr. (2001). "Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal, adult, and geriatric donors". Anat Rec 264, 5162.

Zimmermann, W.H., Didie, M., Wasmeier, G.H., Nixdorff, U., Hess, A., Melnychenko, I, Boy, O., Neuhuber, W.L., Weyand, M., y Eschenhagen, T. (2002). "Cardiac grafting of engineered heart tissue in syngenic rats". Circulation 106, I151I157.

Zimmermann, W.H., Melnychenko, I., y Eschenhagen, T. (2004). "Engineered heart tissue for regeneration of diseased hearts". Biomaterials 25, 16391647.

Zuk, P.A., Zhu, M., Ashjian, P., De Ugarte, D.A., Huang, J.I., Mizuno, H., Alfonso, Z.C., Fraser, J.K., Benhaim, P., y Hedrick, M.H. (2002). "Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.' Mol Biol Cell 13, 427995.

Zuk, P.A., Zhu, M., Mizuno, H., Huang, J., Futrell, J.W., Katz, A.J., Benhaim, P., Lorenz, H.P., y Hedrick, M.H. (2001). "Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cellbased therapies". Tissue Eng 7, 21128.

Cualquier caracterfstica o combinaci6n de caracterfsticas descritas en la presente memoria estan incluidas dentro del alcance de la presente invenci6n, con tal de que las caracterfsticas incluidas en cualquier combinaci6n no sean mutuamente incoherentes, como sera evidente a partir del contexto, de esta memoria descriptiva y del conocimiento de una persona de experiencia habitual en la tecnica. Con el prop6sito de resumir la presente invenci6n, ciertos aspectos, ventajas y caracterfsticas nuevas de la presente invenci6n se han descrito en la presente memoria. Por supuesto, se debe entender que no necesariamente todos los aspectos, ventajas o caracterfsticas se realizaran en ninguna realizaci6n particular de la presente invenci6n. Las ventajas y aspectos adicionales de la presente invenci6n son evidentes en la descripci6n detallada y reivindicaciones siguientes.

Las realizaciones anteriormente descritas se han proporcionado a modo de ejemplo, y la presente invenci6n no se limita a estos ejemplos. A los expertos en la tecnica se les ocurriran multiples variaciones y modificaciones de las realizaciones descritas, hasta un punto que no sea mutualmente excluyente, tras la consideraci6n de la descripci6n anterior. Ademas, seran evidentes otras combinaciones, omisiones, sustituciones y modificaciones para el tecnico experto a la vista de la descripci6n de la presente memoria. Por lo tanto, la presente invenci6n no pretende estar limitada por las realizaciones descritas, sino que se debe definir mediante referencia a las reivindicaciones adjuntas.

EQUIVALENTES

Los expertos en la tecnica reconoceran, o seran capaces de determinar mediante el uso solamente de experimentaci6n rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones especfficas de la invenci6n descritas en la presente memoria. Las siguientes reivindicaciones pretenden abarcar tales equivalentes.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

El uso de una composici6n que comprende una poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) en la fabricaci6n de un medicamento para restablecer el flujo sangufneo en un sujeto que se ha determinado que tiene una isquemia, en el que dicha poblaci6n concentrada de celulas derivadas de tejido adiposo (ADC) comprende celulas progenitoras derivadas de tejido adiposo y celulas madre de tejido adiposo obtenidas procesando el tejido adiposo de dicho paciente en un sistema que esta configurado para mantener una ruta de fluido/tejido cerrada esteril, y dicho sistema comprende una camara de recogida conectada a una camara de mezcla/procesamiento.
2.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha poblaci6n concentrada de celulas comprende al menos 500 celulas progenitoras endoteliales/mill6n de celulas derivadas de tejido adiposo.
3.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha afecci6n isquemica comprende la insuficiencia cardiaca congestiva.
4.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha afecci6n isquemica es infarto de miocardio.
5.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicho sujeto es diabetico.
6.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicho sujeto es obeso.
7.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha composici6n comprende una inyecci6n rapida de dichas celulas derivadas de tejido adiposo.
8.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha composici6n proporciona entre 55.000 y 550.000 celulas madre derivadas de tejido adiposo.
9.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha composici6n comprende ademas uno o mas factores angiogenicos.
10.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha poblaci6n de celulas se caracteriza por tener expresi6n del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) cuando se cultiva.
11.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha poblaci6n de celulas se caracteriza por tener expresi6n del factor de crecimiento de placenta (PLGF) cuando se cultiva.
12.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha composici6n comprende ademas uno o mas factores arteriogenicos.
13.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha composici6n comprende ademas uno o mas factores inmunodepresores.
14.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dichas celulas derivadas de tejido adiposo no se cultivan en un cultivo.
15.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dichas celulas derivadas de tejido adiposo se cultivan en un cultivo celular.
16.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 15, en el que dichas celulas derivadas de tejido adiposo se cultivan en condiciones de cultivo que favorecen la diferenciaci6n hacia un fenotipo miocftico.
17.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 16, en el que dicho fenotipo miocftico es un fenotipo miocftico cardiaco.
18.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 16, en el que dicho fenotipo miocftico es un fenotipo miocftico esqueletico.
19.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 16, en el que dicho fenotipo miocftico es un fenotipo miocftico de musculo liso vascular.
20.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 15, en el que dichas celulas derivadas de tejido adiposo se cultivan en condiciones de cultivo que favorecen la diferenciaci6n hacia un fenotipo endotelial.
21.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 15, en el que dicho cultivo celular se lleva a cabo en un material de soporte para generar una construcci6n bidimensional o tridimensional que se puede colocar sobre o dentro del coraz6n.
22.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 21, en el que dicho material de soporte es reabsorbible in vivo.
23.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que las celulas progenitoras endoteliales derivadas de tejido adiposo se modifican mediante transferencia genica.
24.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 23, en el que dicha modificaci6n altera la angiogenesis.
25.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 23, en el que dicha modificaci6n altera la arteriogenesis.
26.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 23, en el que dicha modificaci6n altera la apoptosis.
27.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 26, en el que dichas celulas progenitoras endoteliales derivadas de tejido adiposo modificadas se pueden diferenciar hasta miocitos cardiacos con una apoptosis alterada.
28.

El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 23, en el que dicha modificaci6n altera las propiedades de guiado de dichas celulas derivadas de tejido adiposo.

Expresion de VEGF 'pg 106 celulasi

Expresion de VEGF por ADC

Don. Normal 1 Don. Normal 2 Diabetico

Expresion de PIGF 'pg 106 celulasi

Expresion de PIGF por ADC

Don. Normal 1 Don. Normal 2 Diabetico

ID del Donante ID del Donante

FIGURA 6

Figura 6: Tinci6n con UEA1 de una colonia de EPC derivadas de ADC

38

FIGURA 8

Flujo medio de sangre en el modelo de isquemia de las extremidades posteriores en ratones SCID tratados con PLA de humano diabetico

Porcentaje de ;lujo

Contr. Neg. Trat. con PLA