KR20100008763A - 지방조직 유래 다분화능 줄기세포의 배양물 및 그 추출 단백질을 함유한 화장료용 조성물 - Google Patents

지방조직 유래 다분화능 줄기세포의 배양물 및 그 추출 단백질을 함유한 화장료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물과, 상기 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출된 단백질; 또는 상기 단백질의 가수분해물인 펩타이드나 아미노산을 유효성분으로 함유하는 화장료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화장료용 조성물은 상기 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물과 상기 줄기세포로부터 추출한 단백질 또는 아미노산이 주름 개선 및 노화 방지에 있어서 상승작용적으로 상호작용하므로, 기능성 화장품 제조에 유용하다.
지방유래 줄기세포, 화장료, 성형, 미용, 주름개선

Description

지방조직 유래 다분화능 줄기세포의 배양물 및 그 추출 단백질을 함유한 화장료용 조성물 {Cosmetic Composition Comprising Matrials cultured Multipotent Stem Cells Derived from Adipose Tissue and Proteins extracted therefrom}
본 발명은 (i) 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물 및 (ii) 상기 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출된 단백질; 또는 상기 단백질의 가수분해물인 펩타이드나 아미노산을 함유하는 화장료용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.
최근, 지방 조직이 다분화능 줄기세포의 새로운 소스임이 밝혀졌다 (B. Cousin et al., BBRC, 301:1016, 2003; A. Miranville et al ., Circulation , 110:349, 2004; S. Gronthos et al ., J. Cell Physiol., 189:54, 2001; M.J. Seo et al., BBRC, 328:258, 2005). 인간 지방추출(지방흡입술(liposuction))에 의해 얻어진 지방조직에 미분화 세포군이 포함되어 있고, 이것이 in vitro상에서 지방세포, 골형성세포, 근원세포 및 연골모세포로의 분화능을 갖는다는 것이 보고되었다 (P.A. Zuk et al., Tissue Eng., 7:211, 2001; A.M. Rodriguez et al., BBRC, 315:255, 2004). 아울러 지방 조직 유래 세포가 근육 재생능 및 신경혈관분화를 촉진하는 능력이 있다는 것이 동물 모델 실험을 통하여 알려진 바 있다. 이러한 지방 조직은 대량으로 추출할 수 있다는 장점이 있어, 기존의 단점을 보완하는 새로운 줄기세포의 소스로 주목받고 있다.
지금까지 알려진 지방 유래 줄기세포로는 상피세포로 분화가능한 인간 지방 유래 성체 줄기 세포 (M. Brzoska et al., BBRC, 330:142, 2005), 골 형성 및 지방 세포로 분화가능한 인간 지방 유래 성체 줄기세포 (Y. Cao et al., BBRC, 332:370, 2005), 신경세포로 분화가능한 인간 지방 유래 성체 줄기세포 (K.M. Safford et al., BBRC, 294:371, 2005), 지방세포로 분화가능한 쥐 지방 유래 줄기세포 (R. Ogawa et al ., BBRC, 319:511, 2004), 골 형성 및 연골 형성세포로 분화가능한 쥐 지방 유래 줄기세포 (R. Ogawa et al ., BBRC, 313:871, 2004), 연골세포로 분화가능한 인간 지방 유래 줄기세포 (H.A. Awad et al., Biomaterials, 25:3211, 2004), 신경 세포로 분화가능한 쥐 지방 유래 줄기세포 (J. Fujimura et al ., BBRC, 333:116, 2005) 및 골세포, 연골세포, 신경세포 또는 근육세포로 분화가능한 지방 유래 줄기세포 (미국특허 6,777,231) 등이 있다.
현재까지 이러한 지방 유래 줄기세포는 주로 난치병 등의 치료를 포함한 의 학 분야에서 이용하고자 하는 노력이 계속되었으나, 미용 또는 성형을 목적으로 줄기세포를 이용하고자 하는 시도는 미비하였다.
이에 본 발명자들은 주름 개선, 피부의 처짐 방지 등의 미용 및 성형 분야에 줄기세포를 이용하고자 예의 노력한 결과, 지방흡입술 (liposuction)으로부터 얻어진 지방 조직으로부터 성체 줄기세포를 수득하여 배양한 배양물 및; 상기 지방 조직 유래 줄기세포에서 추출한 단백질 또는 아미노산을 수득한 다음, 이를 함께 함유하는 조성물이 미용 및 성형에 효과적이라는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 (i) 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포의 배양물, 및 (ii) 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출된 단백질; 또는 상기 단백질의 가수분해물인 펩타이드나 아미노산을 유효성분으로 함유하는 화장료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 특정 성분들을 함유하고 있는, 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포의 배양물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Fibronectin, VEGF 및 Procollagen을 함유하고 있는 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물, 및 상기 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출한 단백질 또는 아미노산을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료용 조성물을 제공한다.
이 때, 상기 단백질 또는 아미노산은 Tau, PEA(Phosphoethanolamine), Thr, Ser, Glu, α-AAA(α-Aminoadipic acid), Gly, Ala, α-ABA(α-Amino-n-butyric acid), Val, Cys, Met, Cysthi(Cystathionine), Ile, Leu, Tyr, Phe, β-Ala, β-AiBA(β-amino isobutyric acid), γ-ABA(Gamma Amino-n- Butyric Acid), NH3(Ammonia), Hylys(hydroxylysine), Orn(Ornithine), Lys, His, Car, Arg, Asp 및 Pro로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는, Thr, Ser, Glu, Gly, Ala, Val, Leu, Tyr, Phe, NH3(Ammonia), Lys, Asp 및 Pro인 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출한 단백질 또는 아미노산은, 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물에 부유하여 사용할 수 있다.
특히, 바람직한 화장료용 조성물의 예로는 TGF, bFGF, IGF, KGF, HGF, fibronectin, VEGF 및 Procollagen을 함유한 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물, 및 상기 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출한 단백질 또는 아미노산을 유효성분으로 함유한다.
또한, 상기 화장료용 조성물의 주요한 유효성분으로 사용되고 있는, TGF, bFGF, IGF, KGF, HGF, fibronectin, VEGF 및 Procollagen을 함유하고 있는 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 화장료용 조성물은 도포한 부위의 피부 조직의 재생이 촉진되므로, 특히, 주름 개선 및/또는 노화 방지 효과가 뛰어나다. 따라서, 주름 개선이나 노화 방지용 기능성 화장품 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물 및; 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출한 단백질 또는 아미노산을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 기능성 화장료용 조성물은 그 유효성분의 하나로서 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물을 포함한다.
줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 성체 줄기세포는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "포유류 지방 조직 유래 성체 줄기 세포"는 포유류의 지방 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포로서, 본 명세서에서는 축약하여 "지방 줄기세포"라고 지칭하기도 한다. 이는 지방흡입술로부터 얻어지는 생리 식염수에 부유된 지방 함유 suspension을 배양한 다음, 플라스크 등 배양용기에 부착된 줄기세포 층을 트립신으로 처리한 다음 회수하거나, 스크래퍼로 긁어서 소량의 생리 식염수에 부유되는 것을 직접회수하거나 하는 방법 등을 통해 수득한다. 본 발명의 일 태양으로, 바람직하게는 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물" 또는 "지방 줄기세포 배양물"은, 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기 세포를 특정 성분을 함유하는 배지에 배양시킨 후, 배지를 수거한 다음 세포 데브리 스(debris)를 제거하고 남은 브로스(broth)를 의미한다. 결국 상기 배양물에는 배지가 함유하고 있던 주요 성분 및 지방 줄기세포의 분비물이 포함되어 있다고 할 수 있다. 본 발명의 일 태양으로, 바람직하게는 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포배양물을 사용할 수 있다.
상기 포유류 지방 줄기세포 배양물의 획득에 사용되는 배지로서는 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려져있는 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium) 또는 Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium)을 사용할 수 있다.
지방 줄기세포 배양 배지는 지방 줄기세포의 미분화된 표현형의 증식을 촉진하면서 분화는 억제하는 첨가제로 보충될 수 있다.
또한, 배지는 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.
또한, 배지는 세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발 을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제 (anti-clumping agent), 예컨대 Invitrogen이 판매하는 것들(Cat # 0010057AE)을 포함하는 것이 유익할 수 있다.
그 중에서도, 하기의 1이상의 추가의 첨가제를 사용하는 것이 유리할 수 있다:
ㆍ 줄기 세포 인자(SCF, Steel 인자), c-키트를 이량화하는 다른 리간드 또는 항체, 및 동일한 신호 전달 경로의 다른 활성제
ㆍ 다른 티로신 키나아제 관련 수용체, 예컨대 혈소판-유도된 성장 인자(Platelet-Derived Growth Factor; PDGF), 대식세포 콜로니-자극 인자, Flt-3 리간드 및 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF)의 수용체를 위한 리간드
ㆍ 환형 AMP 농도를 높이는 인자, 예컨대 포르스콜린
ㆍ gp130을 유도하는 인자, 예컨대 LIF 또는 Oncostatin-M
ㆍ 조혈모 성장 인자, 예컨대 트롬보포이에틴(TPO)
ㆍ 변형성 성장 인자, 예컨대 TGFβ1
ㆍ 다른 성장 인자, 예컨대 표피 성장 인자(EGF)
ㆍ 뉴로트로핀, 예컨대 CNTF
ㆍ N-acetyl-L-cysteine (NAC)
ㆍ Hydrocortisone
ㆍ Ascrobic Acid
특히, 본 발명의 포유류 지방 줄기세포 배양을 위한 배지는 NAC, 아스코르브산, 칼슘, 인슐린 및 하이드로코티손을 함유하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는, FBS, NAC, 아스코르브산, 칼슘, rEGF, 인슐린 및 하이드로코티손을 함유할 수 있다.
본 발명의 포유류 지방 줄기세포 배양물을, 예를 들어 인간 지방 줄기세포 배양물인 경우, 이하와 같은 방법으로 획득할 수 있다.
우선, 지방흡입술(Liposuction) 등에 의해 얻어진 인간 지방조직으로부터 인간 지방조직 유래 펠렛을 원심분리 및 필터링하여 데브리스(debris)를 제거한 후, FBS, NAC 및 아스코르브산(ascorbic acid)을 함유하는 DMEM 배지에서 배양한다. 부착되지 않은 세포들을 세척하고, FBS, NAC, 아스코르브산(ascorbic acid),칼슘( calcium), rEGF, 인슐린 및 하이드로코티손(Hydrocortisone)를 함유한 Keratinocyte-SFM media을 약 2일마다 교체하면서 배양하여, 분리한 다분화능 중간엽 줄기세포를 계대 배양한다.
그 다음, Passage 3의 지방조직 유래 다분화능 중간엽 줄기세포를 90% confluency로 배양한 후, NAC, ascorbic acid, calcium, 인슐린 및 Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media에서 약 120시간 배양하고, 배지를 수거한 후 원심분리 및 필터링 하여 세포 debris를 제거함으로써 순수한 인간 지방 줄기세포 배양액을 수득한다.
요컨대, 본 발명의 일태양으로, 예를 들어, 이하와 같은 단계를 포함하는, TGF, bFGF, IGF, KGF, HGF, fibronectin, VEGF 및 Procollagen을 함유하고 있는, 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물의 제조방법을 제공한다:
(a) 인간 지방 조직 펠렛을 FBS, NAC 및 ascorbic acid을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하는 단계;
(b) FBS, NAC, ascorbic acid, calcium, rEGF, 인슐린 및 Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media로 2일마다 교체하면서 계대 배양하는 단계;
(c) 상기 Keratinocyte-SFM 배지에 부착되어 있는 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포를 분리하여 수득하는 단계;
(d) 수득한 상기 줄기세포를, NAC, ascorbic acid, calcium, rEGF, 인슐린 및 Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media에서 추가로 배양하는 단계; 및
(e) 상기 (d)단계의 Keratinocyte-SFM media를 수거한 후, 원심분리 및 필터링하여 순수 세포 배양물을 수득하는 단계.
특히, 종래 지방 줄기세포의 분리 및 배양에 사용된 배지 및 성분과 다른 구성을 이루는 본 발명의 상기 방법에 의해 수득된 본 발명의 지방 줄기세포 배양물은, 상기 배지 성분 이외에도, 함유되어 있는 지방 줄기세포가 고농도로 분비하는 이하와 같은 단백질 성분을 함께 함유하고 있다:
TGF(166.7pg/ml)
bFGF(916.15pg/ml)
IGF(2490pg/ml)
KGF(1054pg/ml)
HGF(20778pg/ml)
fibronectin(2402.3pg/ml)
VEGF(6501.72pg/ml), 및
Procollagen(842.23ng/ml).
상기 TGF-b (Transforming growth factor-beta) 형질변환성장인자는 배아에서 조직발생 형태 형성, 분화와 증식, 세포 사멸 등에 영향을 주며 성체에서는 상처받은 조직의 복구, 면역세포의 증식 조절 등의 기능을 한다. IGF-I (Insunlin-like Growth Factor-1) 인슐린 유사 성장인자는 70개의 아미노산으로 형성된 7.6kD의 단일 사슬 폴리펩타이드 호르몬으로, 성장호르몬에 반응하여 뼈, 근육, 신경 조직을 형성하고 다양한 조직에서 세포의 분화를 자극함으로서 손상된 세포를 재생시키고 성장을 촉진하는 역할을 한다. HGF (hepatocyte growth factor) 간세포성장인자는 대개 피부, 뼈, 혈액, 신경조직의 세포성장, 분열을 조절하기 위해 몸에서 생산하는 호르몬들의 복합군으로 구성되어 있으며, 세포의 분열, 재생 및 세포이동을 조절하여 흉터나 화상, 필링으로 인해 손상된 피부의 회복에 탁월한 효과가 입증되고 있다. HGF는 새로운 세포생산을 활성화하도록 유도하거나, 다른 기능을 가지는 새로운 세포를 생산하여 TGF 와 Epidermal Growth Factor같이 외과적 상처 치 유에 중요한 역할을 한다. VEGF (vascular endothelial growth factor) 혈관내피 성장인자는 모세혈관에서 혈장단백질을 투과를 증가시키는 cytokine으로 세포의 분열과 이동을 촉진시키며 세포의 재구성을 일으키는 단백질분해효소를 유도하는 기능을 가진다. 또한 세포소멸의 억제를 통해 새로 형성된 혈관의 생존을 유지시키며 신경세포의 항원 제공 억제하여 면역조절을 담당하여 세포의 생장 및 분열을 유도한다. 혈관세포의 이동을 촉진시켜 새로운 세포의 발생 및 분화를 촉진시켜 피부의 구성을 증가시킨다. Procollagen은 피부의 진피층을 구성하는 단백질 성분으로 수분과 결합해 피부의 촉촉함과 탄력을 유지하는 기능을 한다.
특히, 상기와 같은 분비 단백질은 포유류 지방 조직 유래의 줄기세포들이 공통적으로 분비하고 있는 단백질들이다. 그 중에서 대표적인 3개의 단백질에 대해서 미국 국립생물 정보센터에서 사람의 단백질과 종(Species) 유사성을 검색한 결과, collagen type 1의 경우 침팬지 99.2%, 개 97.8%, 소 97.5%, 생쥐 92.4%, 쥐 92.8%의 유사도를 가지는 것으로 나타났고, Fibronectin 1의 경우 침팬지 99.7%, 개 95.2%, 소 94.0%, 생쥐 92.2%, 쥐 92.3%의 유사도를 가지는 것으로 나타났으며,VEGF type A의 경우 침팬지 96.7%, 소 94.7%, 생쥐 90.7%, 쥐 90.7%의 유사도를 가지는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 실시예에서는 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포의 경우만을 분석하고 있으나, 포유동물간의 단백질 유사도가 매우 높은 상기와 같은 사실에 근거하여, 본 발명의 효과는 Fibronectin, VEGF 및 Procollagen을 함유하고 있는 포유동물 지방 줄기세포 배양물의 경우를 모두 포함하는 것으로 볼 수 있다.
한편, 본 발명의 기능성 화장료용 조성물은 그 유효성분의 하나로서 상기 Fibronectin, VEGF 및 Procollagen을 함유하고 있는 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물 외에도, 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출된 단백질; 또는 상기 단백질의 가수분해물인 펩타이드나 아미노산을 포함한다. 이는 포유류 지방 줄기세포의 정제물이라고도 할 수 있다.
생명체의 단백질은 22개 아미노산을 근간으로 하고 있고, 상기 살핀 바와 같이 포유동물간 단백질 유사도가 매우 높기 때문에, 본 발명의 일 실시예에서 분석한 인간 지방 줄기세포로부터 파생한 아미노산 역시 포유동물 지방 줄기세포로부터 파생한 아미노산으로 범위를 확대할 수 있다. 즉, 본 발명은 인간 지방 줄기세포뿐만 아니라 다른 포유동물 지방 줄기세포에서 추출한 아미노산의 경우도 포함한다.
본 발명에서, 예를 들어, 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출한 단백질 또는 아미노산을 이하와 같은 방법으로 획득할 수 있다.
이 방법은 지방줄기세포를 구성하는 단백질을 염 침전, 투석하여 활성을 유지한 상태로 제조하는 방법에 관한 것이다. 지방 줄기세포를 세척하여 지방 줄기세포 배양액의 잔류성분이 남지 않도록 한 후, 지방 줄기세포를 파쇄하고 Ammonium Sulfate를 상등액에 조금씩 첨가하여 단백질을 침전시켜 단백질 Pellet을 회수한다. 그 다음, 불순물을 제거하는 수단으로 투석을 실시한다. 상기 투석이 끝나면 단백질을 회수하여 원심분리하고, 상등액을 회수하여 동결건조함으로써 지방 줄기세포의 단백질 성분을 추출한다.
그리고, 상기 지방줄기세포를 구성하는 단백질을 가수분해하여 저분자의 아미노산과 펩타이드를 제조할 수 있다. 지방 줄기세포배양액의 잔류성분이 남지 않도록 하여 수득한 지방줄기세포에 프로테아제를 처리하여 교반하며 효소분해를 실시한다. 이 과정이 끝나면 지방줄기세포를 구성하는 단백질은 펩타이드와 아미노산 상태로 변하게 된다.
상기와 같은 방법에 의해 수득된 본 발명의 지방조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출된 아미노산으로는 이하와 같은 아미노산이 있다. 즉, 상기 단백질 또는 아미노산은 Tau, PEA(Phosphoethanolamine), Thr, Ser, Glu, α-AAA(α-Aminoadipic acid), Gly, Ala, α-ABA(α-Amino-n-butyric acid), Val, Cys, Met, Cysthi(Cystathionine), Ile, Leu, Tyr, Phe, β-Ala, β-AiBA(β-amino isobutyric acid), γ-ABA(Gamma Amino-n- Butyric Acid), NH3(Ammonia), Hylys(hydroxylysine), Orn(Ornithine), Lys, His, Car, Arg, Asp 및 Pro로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는, Thr, Ser, Glu, Gly, Ala, Val, Leu, Tyr, Phe, NH3, Lys, Asp 및 Pro인 것을 특징으로 한다.
유리 아미노산 Name
Tau
PEA
Thr
Ser
Glu
α-AAA
Gly
Ala
α-ABA
Val
Cys
Met
Cysthi
Ile
Leu
Tyr
Phe
β-Ala
β-AiBA
g-ABA
NH3
Hylys
Orn
Lys
His
Car
Arg
구성 아미노산 Asp
Thr
Ser
Glu
Pro
Gly
Ala
Cys
Val
Met
Ile
Leu
Tyr
Phe
Lys
NH3
His
Arg
상기의 방법으로 수득한 동결 건조된 지방줄기세포 추출 단백질, 저분자 펩타이드 또는 아미노산을, 앞서 설명한 지방 줄기세포 배양액으로 부유하여 본 발명의 화장료용 조성물을 만들 수 있다. 본 발명의 상기 배양 혼합물을 유효 성분으로 하여, 기능성 화장료를 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 지방줄기세포 추출 단백질, 저분자 펩타이드 또는 아미노산을 부유시킨, 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양 혼합물은 화장료용 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 100 중량%의 범위로 함유될 수 있고, 바람직하게는 1 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 5중량%의 범위로 함유되는 것이 더욱 바람직하다.
이 때, 화장료로는 화장수, 유액, 크림, 젤, 미용액(엣센스), 팩 화장료 등을 들 수 있다. 본 발명의 조성물을 유효량 포함하는 화장료는 도포한 부위의 피부 조직의 재생이 촉진되므로, 특히, 주름 개선 및/또는 노화 방지 효과에 의해 젊고 건강한 피부를 유지할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 피부 '주름 개선 및/또는 노화 방지’는 피부 보습 증가, 피부 탄력 증진, 피부 두께 증가, 피부 주름 개선, 피부 자극 완화 및 피부 손상 회복 작용을 모두 통칭하는 것이다
"화장수"는 일반적으로 피부를 청결하고 건강하게 유지하기 위해서 피부 표면에 도포하는 투명 액상의 화장료이다. 화장수의 기본 기능은 피부의 각질층에 수분이나 보습 성분을 보급하는 것이며, 화장수는 피부를 유연하게 하는 기능 등도 있다. 화장수에는 물에 녹기 어려운 물질을 용해시키고 안정시켜 외관을 투명상태로 한 것, 마이크로에멀젼이나 리피드나노스피어를 이용한 투명 또는 반투명의 것, 수%의 유분을 O/W형(오일인워터형), W/O형 또는 W/S형으로 유화한 불투명 화장수, 및 수용성 고분자를 배합한 것 등을 들 수 있다. 본 발명의 트리트먼트 방법으로는 공지의“화장수”를 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다.
화장수에는 본 발명의 조성물 이외, 예를 들어 이하의 성분이 포함되어 있다. 즉, 화장수에는 이온 교환수 등, 수용성 성분을 용해하여, 각질층에 수분을 공급하기 위한 정제수； 에탄올, 프로파놀 등, 유용성 성분을 용해하고, 살균하여, 청량감을 주기 위한 알코올； 글리세린, PEG, 히알론산 등, 각질층의 보습을 위한 보습제； 에스테르유, 식물유 등, 보습성이나 사용감의 향상을 위한 에모리엔트제(수분이 증발하는 것을 막는 기름 성분)； 폴리옥시에틸렌오레일알코올 에테르 등, 원료 성분을 가용화하기 위한 가용화제； 구연산, 유산, 아미노산류 등, 제품의 pH를 조정하기 위한 완충제； 바니린, 오렌지플래이버, 레몬플래이버, 밀크후레이버게라니올,리나롤 등 향을 부가하기 위한 향료； 메틸파라벤, 페녹시 에탄올 등의 미생물을 억제하여, 부패를 방지하기위한 방부제； 착색하기 위한 착색제； 금속 이온 봉쇄제, 자외선 흡수제 등, 퇴색이나 변색을 방지하기 위한 퇴색 방지제； 및 수렴제, 살균제, 활력제, 소염제, 또는 미백제 등의 약제가, 2종 이상 혼합되어 포함되어 있을 수 있다.
화장수의 전체량을 100 중량%로 했을 경우에, 본 발명의 조성물을 0.00 ~ 20 중량%, 바람직하게 는 0.01 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 3 중량% 정도 포함할 수 있다.
"유액"은 화장수와 크림의 중간적인 성질을 가지는 것이며, 일반적으로는 유동성이 있는 에멀젼이다. 유액은 주로 피부의 모이스처 밸런스, 보습성 및 유연성을 유지하기 위해서, 피부에 수분, 보습제 및 유분 등을 공급하기 위해 이용되는 화장료이다. 유액에 포함되는 성분은 후술의 크림에 포함되는 성분과 유사하지만, 유액은 유동성이 있으므로, 크림에 비해 고형 유분이나 납류의 양이 적다. 본 발명의 트리트먼트 방법에서는 공지의“유액”을, 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다.
유액은 본 발명의 조성물을 예를 들어, 1 ~ 20 중량%, 바람직하게는 1 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 1 ~ 5 중량% 정도 포함할 수 있다.
"크림"은 물과 기름처럼 서로 섞이지 않는 액체의 한쪽을 분산상으로서, 다른쪽 분산매에 안정적인 상태로 분산시킨 에멀젼의 일종이다. 본 발명의 트리트먼트 방법에서는 공지의“크림”을, 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다. 이러한 크림으로는 피부의 보습이나 유연을 위한 에모리엔트 크림, 혈행을 촉진하기 위한 맛사지 크림, 피부의 세정을 위한 클렌징 크림, 탈모를 위한 헤어 리무버, 냄새제거를 위한 데오도란트 크림, 및 각질연화를 위한 각질연화 크림 등을 들 수 있다.
크림에는 예를 들면 아래의 성분이 포함되어 있다. 즉, 크림에 포함되는 수상성분으로는 이온 교환수 등의 정제수； 에탄올, 프로파놀 등, 유용성 성분을 용해하고 살균하여, 청량감을 주기 위한 알코올； 글리세린, PEG,히알론산 등, 각질층의 보습을 위한 보습제； 및 퀸스시드, 펙틴, 셀룰로오스 유도체 등의 점액질을 들 수 있다. 크림에 포함되는 유상성분으로는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 바셀린, 고형 파라핀 등의 탄화수소； 올리브유, 아몬드유, 카카오지방, 피마자유 등의 유지； 밀납, 라놀린, 호호바유 등의 납； 스테아린산, 올레인산, 팔미틴산 등의 지방산, 세타놀, 스테아릴알코올 등의 고급 알코올； IPM, 글리세린트리에스텔, 펜타에리스리톨테트라에스테르 등의 에스테르； 및 폴리실록산류 등의 실리콘유 등을 들 수 있다. 크림에 포함되는 각 성분의 양은 그 종류나 용도에 따라 크게 다르지만, 본 발명의 트리트먼트 방법에서는 공지의 것을 적절히 이용하면 된다.
크림은 본 발명의 조성물을 1 ~ 100 중량%, 바람직하게는 1 ~ 20 중량%, 1 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 5 ~ 10 중량% 정도 포함할 수 있다.
젤은 겔 또는 졸 등 외관 상태가 균일하고 투명에서부터 반투명의 화장료이다. 본 발명의 트리트먼트 방법으로는 공지의“젤”을, 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다. 피부에 수분을 보급하고, 보습하기 위한 수성젤, 피부의 보습을 유지하고, 유분을 보급하기 위한 유성 젤, 혈행을 촉진하기 위한 맛사지 용수성 젤, 및 세정용의 젤 등을 들 수 있다. 젤로는 카르복시비닐폴리머, 메틸셀룰로오스 등의 수용성 고분자를 포함한 겔화제를 이용해 제조하는 것을 들 수 있다. 또한, 겔상의 맛사지 오일을 이용해도 된다.
"미용액(엣센스)"은 기본적으로는 상기의 화장수, 유액 및 크림과 같은 성분이며, 유제, 가용화제, 보습제, 물, 및 그 외의 약제를 포함하는 것을 들 수 있다. 본 발명의 트리트먼트 방법에서의 공지의 미용액을 이용할 수 있다. 미용액에 포함되는 유제로는 올리브유, 동백유, 참기름, 해바라기유, 스위트아몬드유, 호호바유 등의 천연 식물유；카프린산, 미리스틴산, 올레인산, 이소스테아린산 등의 지방산의 디글리세린 에스테르 또는 트리글리세린에스테르 등을 들 수 있다. 이러한 유제는 주로 에모리엔트제로서 기능한다. 미용액에 포함되는 가용화제로는 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르,솔비탄지방산에스테르, 및 모노스테아린산프로필렌 글리콜 등의 프로필렌글리콜지방산에스테르류, 글리세린,디글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1, 3－부틸렌글리콜 등의 다가(多價)알코올 등을 들 수 있다. 한편, 가용화제는 글리세린 또는 디글리세린을 사용하는 것과, 맛사지에 있어서 온열 효과를 높이므로 바람직하다. 미용액에 포함되는 물로는 증류수, 및 탈이온수를 들 수 있다. 기타 약제로는 살균제, 방부제, 비타민류,식물로부터의 천연 엑기스, 색소, 향료 등을 들 수 있다.
미용액을 구성하는 각 성분의 양은 공지 성분량을 채용할 수 있다. 예를 들면, 미용액 전체량을 100 중량%로 했을 경우에, 본 발명의 조성물을 1 ~ 20 중량%, 바람직하게는 1 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 1 ~ 5 중량% 정도 포함하면 된다. 또한, 유제 65 ~ 90 중량%,가용화제 1 ~ 10 중량%, 보습제 1 ~ 30 중량%, 기타 약제 0 ~ 10 중량% 정도, 및 나머지는 물을 들 수 있다. 미용액은 공지 제조 방법에 따라 제조하면 된다.
"팩 화장료"는 피부의 보습, 혈행 촉진, 청정을 목적으로, 대상 부위에 도포하는 것이다. 팩 화장료에는 일반적으로, 젤리상, 페이스트상, 분말상, 크림상 액상 등을 들 수 있으며, 안면에 도포하여 피막을 형성시킨 후 박리하는 것이나,도포 후에 닦아내는 것, 도포 후 씻어내는 것 등이 있다. 분말상의 것은 사용시에 물 등에 균일하게 녹이던지 현탁해서 사용한다. 또한, 아이마스크 등의 형상의 부직포나 콜라겐 시트에 화장료를 함침시킨 팩 화장료나 상기 부직포 등을 사용시에 화장료에 침지해 이용하는 팩 화장료 등이어도 된다.
팩 화장료는 본 발명의 조성물을 1 ~ 20 중량%, 바람직하게는 1 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 1 ~ 5 중량%, 가장 바람직하게는 2 ~ 3 중량% 정도 포함하면 된다. 기타 조성은 팩 화장료에 이용되는 공지 조성으로 하면 되고, 공지 제조 방법에 따라 제조하면 된다.
그러나, 상기 설명에 제한받지 않고, 상기의 화장료는 각각이 통상 이용되는 방법에 따라 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 본 발명에서는 인간 지방 유래 줄기세포의 경우를 실시하고 있으나, 양 등의 다른 포유동물 지방 유래 줄기세포도 사용할 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
이하 실시한 실시예에서 사용한 각종 배지 및 시약의 입수처는 하기 표에 기재된 바와 같다.
Item Brand
Ascorbic acid Sigma USA
CaCl2 Sigma USA
Collagenase type I Gibco USA
DMEM Gibco USA
DPBS Welgene Korea
EGF Gibco USA
FBS Gibco USA
Hydrocortisone Sigma USA
Insulin Gibco USA
K-SFM Gibco USA
NAC Sigma USA
실시예 1: 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포의 배양물 제조
(1) 지방조직에서 다분화능 중간엽 줄기세포 분리
지방흡입술(Liposuction)에 의해 복부지방으로부터 얻어진 인간 지방조직을 분리하여 PBS로 세척하였다. 조직을 잘게 자른 후 collagenase type1 (1mg/ml)을 첨가한 DMEM media를 이용해 37℃에서 2시간 동안 digestion하였다. PBS로 세척 후 1000rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액은 suction하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 100㎛ mesh에 필터링하여 debris를 제거한 후 PBS로 세척하한 후, DMEM(10% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid) 배지에 배양하였다.
하룻밤 지난 후 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 5% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid, 0.09mM calcium, 5ng/ml rEGF, 5㎍/ml 인슐린 및 74ng/ml Hydrocortisone를 함유한Keratinocyte-SFM media을 2일마다 교체하면서 계대배양하여 지방조직 유래 다분화능 중간엽 줄기세포를 분리하였다.
(2) 지방 줄기세포의 배양
상기에서 수득한, Passage 3, 5, 8, 10의 지방조직 유래 다분화능 중간엽 줄기세포를 T75-flask에서 각각 90% confluency로 배양한 후 passage 별로 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid, 0.09mM calcium, 5㎍/ml 인슐린 및 74ng/ml Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media로 교환하여 120시간 배양하였다. 배양 후 배지를 수거한 후 원심분리 (1500 rpm, 5분)한 후 필터 (0.2um) 하여 세포 debris를 제거하여 순수한 세포배양액 1을 얻었다.
한편, 상기에서 수득한, Passage 3, 5, 8, 10의 지방조직 유래 다분화능 중간엽 줄기세포가 T75-flask에서 각각 90% confluency로 배양한 후 passage별로 1~100ng/ml EGF, 0.5~20% human UCB Plasma-derived Serum, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid, 0.09mM calcium, 5㎍/ml 인슐린 및 74ng/ml Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media로 교환하여 120시간 배양하였다. 배양 후 배지를 수거한 후 원심분리 (1500 rpm, 5분)한 후 필터 (0.2um) 하여 세포 debris를 제거하여 순수한 세포배양액 2를 얻었다
실시예 2: 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포의 배양물의 성분 분석
실시예 1에서 수득한 지방 줄기세포 배양액 1 및 2에서의 성분을 분석하였다.
지방 줄기세포 배양액 1과 2 각각의 상층을 시험샘플로 채취하여 원심분리하여 세포 debris를 제거하고, 즉시 시험하거나 분주하여 -20도에서 샘플을 보관하되 샘플을 얼렸다. 추후 실험과정에서 얼리고 녹이는 과정은 되도록 피하였다.
시험에 사용되는 시약, 표준시약 대조선을 그리기 위한 표준품과 검체를 준비하였다. 표준시약 대조선을 만들기 위해 측정하고자하는 단백질의 표준품 (stock solution)을 폴리프로필렌 튜브에서 serial dilution하여 최고농도와 최저 농도 사이에 총 7개의 농도를 설정하여 만들었다.
항체가 붙어있는 시험용 microplate strips을 준비하고, Serial dilution한 표준시약 대조선과 지방 줄기세포 배양액 상층을 microplate에 분주하여 반응시켰다. 반응이 끝나면 표준시약과 검체를 회수하고 microplate를 washing buffer로 3회 세척하였다. 측정하고자하는 단백질의 항체에 대한 conjugate를 각각의 plate에 첨가하고 반응시켰다. 반응이 끝나면 conjugate를 회수하고 washing buffer로 3회 세척하였다. Substrate solution을 각각의 plate에 첨가하고 반응시켰다.
Substrate solution의 효소반응을 정지하기 위해 stop solution을 첨가하고 30분 이내에 540~570nm의 흡광도를 가지는 분광기를 이용하여 값을 측정하였다. 보다 세밀한 내용은 단백질 측정에 사용된 ELISA　Kit 정보에 따른다.
VEGF (R&D system Cat. No. DVE00)
HGF (R&D system Cat. No. DHG00)
TGF-b1 (R&D system Cat. No. DB100B)
IGF-1 (R&D system Cat. No. DG100)
Procollagen (TAKARA Cat. No. MK101)
지방 줄기세포 분비 단백질 성분들을 분석한 결과, 배양액 1 및 2 모두에서 도 1에 나타난 바와 같이, TGF(166.7pg/ml), bFGF(916.15pg/ml), IGF(2490pg/ml), KGF(1054pg/ml), HGF(20778pg/ml), fibronectin(2402.3pg/ml), VEGF(6501.72pg/ml), Procollagen(842.23ng/ml), Fibronectin(도시 않음) 등이 고농도로 분비되어 있음을 확인할 수 있었다.
참고예 1: 포유동물 지방 줄기세포로부터의 파생 단백질간 유사성
본 발명에서 분석한 인간 지방 줄기세포 분비 단백질 중 대표적인 3개의 단백질에 대해서 미국 국립생물 정보센터에서 사람의 단백질과 종(Species) 유사성을 검색하였다.
collagen type 1의 경우 침팬지 99.2%, 개 97.8%, 소 97.5%, 생쥐 92.4%, 쥐 92.8%의 유사도를 가지는 것으로 나타났다.
Figure 112009042935264-PAT00001
Fibronectin 1의 경우 침팬지 99.7%, 개 95.2%, 소 94.0%, 생쥐 92.2%, 쥐 92.3%의 유사도를 가지는 것으로 나타났다.
Figure 112009042935264-PAT00002
VEGF type A의 경우 침팬지 96.7%, 소 94.7%, 생쥐 90.7%, 쥐 90.7%의 유사도를 가지는 것으로 나타났다.
Figure 112009042935264-PAT00003
따라서, 본 발명의 실시예에서는 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포의 경우만을 분석하고 있으나, 포유동물간의 단백질 유사도가 매우 높은 상기와 같은 사실에 근거하여, 본 발명의 효과는 포유동물 지방 조직 유래 성체 줄기세포의 경우까지 모두 포함하는 것이고, 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포의 경우는 대표적인 일례라고 할 수 있다.
실험예 1: 지방 줄기세포의 계대(Passage)별 배양물 분석
우선, 비교를 위한 대조군으로, "Passage 3"의 지방조직 유래 다분화능 중간엽 줄기세포만을 상기 실시예 2에서처럼, (i) 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid, 0.09mM calcium, 5㎍/ml 인슐린 및 74ng/ml Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media에서 120시간 배양하거나, (ii) 1~100ng/ml EGF, 0.5~20% human UCB Plasma-derived Serum, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid, 0.09mM calcium, 5㎍/ml 인슐린 및 74ng/ml Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media로 교환하여 120시간 배양하였다.
이를, 실시예 2에 따른 Passage 3, 5, 8, 10의 지방조직 유래 다분화능 중간엽 줄기세포를 배양한 경우와 비교하였다.
Passage 단계에 따른 지방줄기세포의 분비 단백질의 성분을 분석하기 위하여 Passage 3, 5, 8, 10에 해당하는 분비단백질을 측정한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, Passage가 증가할수록 VEGF의 농도가 434.62pg/ml에서 940.77pg/ml로 증가하는 경향을 보였지만, HGF (평균값 391.0 pg/ml) , TGF (평균값 552.7 pg/ml), IGF (평균값 207.5 pg/ml), Procollagen (평균값 556.6 ng/ml)은 Passage별로 큰 변화를 보이지 않았다.
실시예 3: 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포로부터 단백질 추출
실시예 1에서 수득한 지방 줄기세포에서 단백질을 추출하였다. 이 때, 지방줄기세포를 구성하는 단백질을 염침전, 투석하여 활성을 유지한 상태로 제조하였다.
1X109의 지방줄기세포에 PBS 50ml을 첨가하고, 원심분리 370 x g 에서 10분간 처리하여 상층액을 제거함으로서 세포를 세척하였다. 위 과정을 총 3회 반복하여 지방줄기세포배양액의 잔류성분이 남지 않도록 하였다. 세포를 유리관으로 옮겨 PBS 10ml을 첨가하여 초음파 파쇄기를 이용하여 온도가 지나치게 높아지지 않도록 30초간 지방줄기세포를 파쇄하는 작업을 10회 반복하였다. 9.44g Ammonium Sulfate를 상등액에 조금씩 첨가하여 단백질을 침전시키고 100,000 x g 에서 5분간 원심분리 실시한 후 단백질 Pellet을 회수하였다.
다음으로, Tri-HCl buffer (pH7.2) 1ml을 첨가 후 불순물을 제거하는 수단으로 투석을 실시하였다. 2% (M/V) Na-bicarbonate와 1mM EDTA(pH8.0)을 넣고 100℃에서 10분간 dialysis bag 전처리한 후 증류수로 세척하고, 1mM EDTA(pH 8.0)로 100℃에서 10분간 처리하여 증류수로 다시 한 번 세척하였다. dialysis bag에 지방줄기세포 침전물을 넣은 후 완전 밀봉하고 Tris Buffer를 넣고 24시간동안 교반하였다.
상기 투석이 끝나면 단백질을 회수하여 370 x g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 동결건조하였다.
실시예 4: 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포로부터 저분자 펩타이드 및 아미노산의 제조
실시예 3에서 수득한, 지방 줄기세포로부터 추출한 단백질을 가수분해하여 저분자의 펩타이드 및 아미노산을 제조하였다.
앞서 했던 방법과 동일하게, 1X10^9의 지방줄기세포에 PBS 50ml을 첨가하고, 원심분리 370 x g 에서 10분간 처리하여 상층액을 제거함으로서 세포를 세척하고, 위 과정을 총 3회 반복하여 지방 줄기세포 배양액의 잔류성분이 남지 않도록 하였다.
그 후, 멸균된 삼각플라스크에서, 수득된 지방 줄기세포에 3% 프로테아제 10ml을 처리하여 37℃에서 72시간동안 교반하며 효소분해를 실시하였다. 효소분해과정을 종료하기 위해 100℃에서 30분간 가열하였다. 이 과정에서 지방줄기세포를 구성하는 단백질은 펩타이드와 아미노산 상태로 변하는데, 회수된 펩타이드와 아미노산은 건조기에서 24시간 건조한 후 121℃에서 30분간 가열하여 무균처리하였다. 산가수분해에 의한 유리아미노산, 구성아미노산 분석결과는 아래와 같다.
유리 아미노산 Name ㎍/㎖
Tau 3.5753
PEA 2.7451
Thr 7.3476
Ser 8.7518
Glu 19.0165
α-AAA 2.7350
Gly 8.6338
Ala 10.0636
α-ABA 1.4631
Val 7.9398
Cys 1.1645
Met 4.7905
Cysthi 1.5782
Ile 4.8973
Leu 15.4217
Tyr 7.1557
Phe 13.7918
β-Ala 2.7693
β-AiBA 3.5767
g-ABA 0.1870
NH3 5.9571
Hylys 2.3544
Orn 1.3308
Lys 5.4099
His 1.8224
Car 1.2732
Arg 3.0841
구성 아미노산 Asp 274.5476
Thr 110.3495
Ser 131.8364
Glu 290.9281
Pro 104.2321
Gly 122.4455
Ala 165.2867
Cys 99.8488
Val 170.3220
Met 87.3369
Ile 81.3470
Leu 251.7423
Tyr 282.8925
Phe 518.9671
Lys 5.4099
NH3 1.8224
His 1.2732
Arg 3.0841
실시예 5: 화장료용 조성물 및 이를 이용한 화장품의 제조
실시예 3에서 수득한, 동결 건조된 지방줄기세포 추출 단백질을, 실시예 1에서 제조한 지방줄기세포 배양액으로 부유한 후 lecitin을 이용하여 단백질을 캡슐화하여 피부 흡수율을 높였다.
상기 부유액을 원재료로 하여 여러가지 형태의 화장품을 만들었다. 화장품을 만드는 방법은 당업계에 알려진 일반적인 방법을 이용하였다. 'Dr. JUCRE SME Age'는 제품명에 해당한다.
생산 제품명 및 형태 부유액(줄기세포 배양액) 함유량
Dr. JUCRE SME Age- Boosting Serum;미용액(세럼) 3%
Dr. JUCRE SME Age- White Intensive Serum ;미용액(세럼) 5%
Dr. JUCRE SME Age- White Intensive Cream ;크림 5%
Dr. JUCRE SME Age- White Intensive Care Neck & Decollete Cream;크림 3%
Dr. JUCRE SME Age- White Intensive Care Hand Cream; 크림 1%
Dr. JUCRE SME Age- White Blemish Balm SPF45 PA+++;크림 1%
Dr. JUCRE SME Age- Intensive Treatment Mask;팩 화장료 3%
Dr. JUCRE Million Stem Cell Magic Concentrate;크림 100%
실험예 2: 화장료 조성물의 피부색, 탄력개선 및 모공수축 효과
상기 실시예 5에서 제조한 크림형태의 Dr.JUCRE Million Stem Cell Magic Concentrate에 대하여 피부색, 탄력개선 및 모공수축 효과 평가시험을 수행하였다. ㈜더마프로/피부과학연구소에서, 18~60세(평균연령 37.2±5.6세)의 건강한 여성 피험자 12명을 대상으로 약 8주동안 상기 시험제품을 1일 1회 사용하도록 한 후 사용 전과 사용 후 (4주 및 8주 후) 각 시점에서 피부 개선상태를 평가하였다.
평가항목으로는 육안평가, 피부 색(L* Value), 모공 수축 및 안면 등고선 촬영을 하였으며, 사용 4주 후 및 8주 후 시점에서는 피험자에 의한 설문 평가를 실시하였다.
2-1. 육안평가
8주간 시험제품을 1일 1회 사용하도록 한 후 사용 전과 사용 후 (4주 및 8주 후) 각 시점에서 육안으로 피부색의 변화를 관찰하였고, 주간 별로 관찰한 결과를 이하 표에 나타내었다. 개선율은 (Initial treatment (0W)-After treatment (4W, 8W))/Initial treatment x 100 으로 계산하였다.
Investigator Week N Mean* SD SEM p-value Improving Rate(%)
1 0W 12 5.17 0.83 0.24 - -
4W 12 4.92 0.67 0.19 0.082 4.84▼
8W 12 4.58 0.79 0.23 0.002* 11.29▼
2 0W 12 5.58 1.16 0.34 - -
4W 12 5.25 1.14 0.33 0.039* 5.97▼
8W 12 5.08 1.16 0.34 0.007* 8.96▼
* Significantly different at p<0.05 compared with before treatment (0W)
그 결과를 도 3에 그래프로 나타내었다. 평균값(mean value)의 감소가 피부색 개선을 의미한다. 즉, 도 3에 나타낸 바와 같이, 육안 평가결과, 제품 사용 전과 비교 시 각 평가시점에서 유의한 피부색 개선효과가 관찰되었다.
2-2 Spectrophotomer를 이용한 피부색 측정(L* value)
8주간 시험제품을 1일 1회 사용하도록 한 후 사용 전과 사용 후 (4주 및 8주 후)의 피부색(skin tone)을 주간 별로 관찰한 결과를 이하 표에 나타내었다. 개선율은 (Initial treatment (0W)-After treatment (4W, 8W))/Initial treatment x 100 으로 계산하였다.
Site Week N Mean* SD SEM p-value Improving Rate(%)
Pigmented 0W 12 60.19 1.86 0.54 - -
4W 12 61.35 2.06 0.60 0.038* 1.93▲
8W 12 61.47 1.91 0.55 0.023* 2.12▲
Non-Pigmented 0W 12 62.90 2.08 0.60 - -
4W 12 63.55 2.30 0.66 0.139 1.03▲
8W 12 64.40 1.92 0.55 0.010* 2.38▲
* Significantly different at p<0.05 compared with before treatment (0W)
그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. 평균값(mean value)의 증가가 피부색 개선을 의미한다. 즉, 도 4에 나타낸 바와 같이, L* value 측정 결과에 의하여도, 제품 사용 전과 비교 시 각 평가시점에서 유의한 피부색(skin tone) 개선효과가 관찰되었다. 그리고, 도 5에 나타낸 바와 같이, Spectrophotomer로 확인한 결과(피험자 한 사람만 예시로 나타냄), 피부색이 점차 맑아졌다.
3-3 Moire topography를 이용한 피부 리프팅(lifteing) 측정
피부 리프팅(lifteing)이란, 피부의 탄력을 증가시키거나(tightening), 처진피부를 개선(face lifting)하는 효과를 총칭하는 용어이다.
8주간 시험제품을 1일 1회 사용하도록 한 후 사용 전과 사용 후 (4주 및 8주 후) 각 시점에서 피부의 탄력을 주간 별로 관찰하여 피부 리프팅 효과를 살펴보았다. 개선율은 (Initial treatment (0W)-After treatment (4W, 8W))/Initial treatment x 100 으로 계산하였다.
Investigator Week N Mean* SD SEM p-value Improving Rate(%)
1 0W 12 1.75 0.62 0.18 - -
4W 12 2.67 1.23 0.36 0.020* 52.38▲
8W 12 2.33 0.98 0.28 0.046* 33.33▲
2 0W 12 1.67 0.65 0.19 - -
4W 12 2.67 0.98 0.28 0.011* 60.00▲
8W 12 2.42 0.90 0.26 0.021* 45.00▲
* Significantly different at p<0.05 compared with before treatment (0W)
그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다. 평균값(mean value)의 증가가 피부리프팅 효과 증가를 의미한다. 즉, 도 6에 나타낸 바와 같이, 제품 사용 전과 비교 시 각 평가시점에서 유의한 피부 리프팅 효과가 관찰되었다. 그리고 도 7에 나타낸 안면 등고선 관찰 결과로부터(피험자 한 사람만 예시로 나타냄), 시험제품 사용 후 안면 등고선이 위로 올라가고 있음(리프팅 효과)을 확인할 수 있었다.
2-4. PRIMOS를 이용한 모공 부피 측정
8주간 시험제품을 1일 1회 사용하도록 한 후 사용 전과 사용 후 (4주 및 8주 후) 각 시점에서 모공의 부피를 주간 별로 관찰하였다. 개선율은 (Initial treatment (0W)-After treatment (4W, 8W))/Initial treatment x 100 으로 계산하였다.
Site Week N Mean* SD SEM p-value Improving Rate(%)
1 0W 12 0.087 0.04 0.01 - -
4W 12 0.075 0.03 0.01 0.060 13.40▼
8W 12 0.070 0.04 0.01 0.019* 19.76▼
* Significantly different at p<0.05 compared with before treatment (0W)
그 결과를 도 8에 및 도 9에 나타내었다. 평균값(mean value)의 감소가 모공(skin pore) 부피가 줄어드는 효과를 의미한다. 즉, 도 8 및 도 9(피험자 한 사람만 예시로 나타냄)에 나타낸 바와 같이, PRIMOS를 이용하여 모공 사이즈를 측정한 결과 제품 사용전과 비교시 8주 시점에서 유의한 모공 부피의 감소효과가 확인되었다.
2-5. 피험자에 의한 설문평가
8주간 시험제품을 1일 1회 사용하도록 한 후 사용 전과 사용 후 (4주 및 8주 후) 각 시점에서 피험자에 의한 설문 평가를 실시하였다. Percentage (%)는 평균 score / 7 × 100 으로 계산하였다.
Investigator Week N Mean Percentage(%)
Elasticity 4W 12 4.25 60.71
8W 12 4.92 70.24
Whitening 4W 12 4.17 59.52
8W 12 4.58 65.48
그 결과를 도 7에 그래프로 나타내었다. 8주 후 시점에서 효능에 관한 설문평가 결과, 7단계 평가 중 탄력 효능은 4.92점, 미백 효능은4.58점으로 나타났다.
실험예 3: 화장료 조성물의 피부주름 개선효과
상기 실시예 5에서 제조한 크림형태의 Dr.JUCRE Million Stem Cell Magic Concentrate에 대하여 피부 주름 평가시험을 수행하였다. ㈜더마프로/피부과학연구소에서, 만 30세 이상의 눈가 주름이 있는 여성피험자 21명을 대상으로, 시험제품을 약 8주간 시험군 제품과 대조군 제품을 눈가 좌, 우측에 무작위로 할당하여 사용하게 하였다. 제품 사용 전과 사용 4주, 8주 후 시점에서 육안평가, Visiometer를 이용한 피부주름 측정(R-value) 및 피험자에 의한 설문 평가를 이용하여 제품의 피부주름 개선효과를 평가하였다.
3-1. 육안평가
8주간 시험군 제품과 대조군 제품을 눈가 좌, 우측에 무작위로 할당하여 사용케 한 후, 사용 전과 사용 4주, 8주 후 시점에서 육안으로 피부 주름의 변화를 관찰하였다.
대조군으로는 Saline solution을 사용하였다.
Group Week p-value
Test group vs control group 4W 0.184
8W 0.053
개선율은 (Initial treatment (0W)-After treatment (4W, 8W))/Initial treatment x 100 으로 계산하였다.
Investigator Group Week N Mean* SD SEM p-value Improving Rate(%)
1 시험군 (A) 0W 21 6.14 1.20 0.26 - -
4W 21 6.05 1.24 0.27 0.162 1.55▼
8W 21 5.86 1.24 0.27 0.010* 4.65▼
대조군 (B) 0W 21 6.10 1.34 0.29 - -
4W 21 6.10 1.34 0.29 - -
8W 21 6.05 1.32 0.29 0.329 0.78▼
Investigator Group Week N Mean* SD SEM p-value Improving Rate(%)
2 시험군 (A) 0W 21 6.10 1.22 0.27 - -
4W 21 6.05 1,20 0.26 0.329 0.78▼
8W 21 5.86 1.24 0.27 0.021* 3.91▼
대조군 (B) 0W 21 6.14 1.35 0.30 - -
4W 21 6.14 1.35 0.30 - -
8W 21 6.10 1.34 0.29 0.329 0.78▼
* Significantly different at p<0.05 compared with before treatment (0W)
그 결과를 도 8에 그래프로 나타내었다. 평균값(mean value)의 감소가 주름(wrinkles) 개선을 의미한다. 즉, 도 8에 나타낸 바와 같이, 육안평가 결과, 제품 사용 4주, 8주 후 시점에서 시험군이 대조군에 비해 피부 주름이 감소되는 경향을 보였다. 또한 제품 사용 전과 비교 시 시험군은 제품 사용 8주 후 시점에서 유의하게 개선되었다(p<0.05).
3-2. Visiometer를 이용한 피부주름 측정(R-value)
8주간 시험군 제품과 대조군 제품을 눈가 좌, 우측에 무작위로 할당하여 사용케 한 후, 사용 전과 사용 4주, 8주 후 시점에서 Visiometer를 이용하여 피부 주름 R-value를 측정하였다.
Parameter Group Week p-value
R1 Test group vs control group 4W 0.034*
8W 0.001*
R2 Test group vs control group 4W 0.009*
8W 0.022*
R3 Test group vs control group 4W 0.167
8W 0.194
R4 Test group vs control group 4W 0.741
8W 0.075
R5 Test group vs control group 4W 0.454
8W 0.040
* Significantly different at p<0.05 compared with control group (B)
대조군으로는 Saline solution을 사용하였고, 개선율은 (Initial treatment (0W)-After treatment (4W, 8W))/Initial treatment x 100 으로 계산하였다.
Investigator Group Week N Mean* SD SEM p-value Improving Rate(%)
R1 시험군 (A) 0W 21 0.61 0.07 0.02 - -
4W 21 0.57 0.07 0.02 0.000* 7.13▼
대조군 (B) 0W 21 0.60 0.07 0.02 - -
4W 21 0.59 0.06 0.01 0.227 2.22▼
R2 시험군 (A) 0W 21 0.45 0.06 0.01 - -
4W 21 0.41 0.05 0.01 0.004* 7.73▼
8W 21 0.40 0.05 0.01 0.000* 10.28▼
대조군 (B) 0W 21 0.45 0.05 0.01 - -
4W 21 0.45 0.04 0.01 0.971 0.10▼
R3 시험군 (A) 0W 21 0.28 0.03 0.01 - -
4W 21 0.28 0.03 0.01 0.357 2.20▼
대조군 (B) 0W 21 0.29 0.03 0.01 - -
4W 21 0.29 0.03 0.01 0.814 0.49▼
R4 시험군 (A) 0W 21 0.09 0.02 0.00 - -
4W 21 0.09 0.03 0.01 0.244 6.19▼
8W 21 0.08 0.03 0.01 0.004* 16.49▼
대조군 (B) 0W 21 0.09 0.02 0.01 - -
4W 21 0.08 0.02 0.00 0.319 5.56▼
Investigator Group Week N Mean* SD SEM p-value Improving Rate(%)
R5 시험군 (A) 0W 21 0.21 0.04 0.01 - -
4W 21 0.19 0.04 0.01 0.079 7.55▼
대조군 (B) 0W 21 0.19 0.05 0.01 - -
4W 21 0.19 0.04 0.01 0.863 0.74▼
* Significantly different at p<0.05 compared with before treatment (0W)
그 결과를 도 9에 그래프로 나타내었다. 평균값(mean value)의 감소가 주름(wrinkles) 개선을 의미한다. 즉, 도 9에 나타낸 바와 같이, 피부주름(R-value) 분석 결과, 제품 R1, R2 파라미터는 제품 사용 4주, 8주 후 시점에서, R5 파라미터는 제품 사용 8주 후 시점에서 시험군이 대조군에 비해 피부 주름이 유의하게 감소되는 경향을 보였다(p<0.05). 또한 제품 사용 전과 비교 시 시험군은 R1와 R2 파라미터가 제품 사용 4주, 8주 후 시점에서, R3, R4, R5는 제품 사용 8주 후 시점에서 유의하게개선되었다(p<0.05).
4-3. 피험자에 의한 설문평가
8주간 시험군 제품과 대조군 제품을 눈가 좌, 우측에 무작위로 할당하여 사용케 한 후, 사용 4주, 8주 후 시점에서 피험자에 의한 설문 평가를 실시하였다. 그 결과를 도 10에 그래프로 나타내었다.
Item 4W 8W
Test group Control group Test group Control group
N1 %2 N1 %2 N1 %2 N1 %2
Moisture 8 38.10 8 38.10 8 38.10 15 71.43
Slipperiness 8 38.10 9 42.86 13 61.90 16 76.19
Gloss 3 14.29 3 14.29 7 33.33 7 33.33
Omprovement of skin elasticity 7 33.33 7 33.33 7 33.33 8 38.10
Decrease(fine) wrinkles 5 23.81 6 28.57 7 33.33 8 38.10
* N: frequency, %: ratio
상기 결과를 통해 본 발명의 화장료 조성물은 피부 주름개선에도 탁월한 효과가 있음을 확인할 수 있다.
도 1은 본 발명의 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물이 함유하고 있는, 상기 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포의 분비 단백질 성분들을 분석한 결과이다.
도 2는 상기 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포의, Passage 단계에 따른 분비 단백질의 성분을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 화장료 조성물 사용에 따른 피부색의 변화를 육안으로 관찰한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 화장료 조성물 사용에 따른 피부색 변화를 Spectrophotomer를 이용하여 측정한 L* value 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 화장료 조성물 사용에 따른 피부색 변화를 Spectrophotomer를 이용하여 찍은 사진이다.
도 6은 본 발명의 화장료 조성물 사용에 따른 피부 리프팅 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 화장료 조성물 사용에 따른 피부 리프팅 효과를 나타낸 안면 등고선 사진이다.
도 8 및 9는 본 발명의 화장료 조성물 사용에 따른 모공의 부피 변화를 관찰한 결과이다.
도 10은 본 발명의 화장료 조성물 사용에 대한 피험자에 의한 설문 평가 결과이다.
도 11은 본 발명의 화장료 조성물 사용에 따른 피부 주름의 변화를 육안으로 관찰한 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 화장료 조성물 사용에 따른 피부 주름 변화를 Visiometer를 이용하여 측정한 R-value 그래프이다.
도 13은 본 발명의 화장료 조성물 사용에 대한 피험자에 의한 설문 평가 결과이다.

Claims (13)

  1. Fibronectin, VEGF 및 Procollagen을 함유하고 있는 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물, 및
    상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출된 단백질; 또는 상기 단백질의 가수분해물인 펩타이드나 아미노산을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물은 TGF, bFGF, IGF, KGF 및 HGF를 추가로 더 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 화장료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출된 단백질의 가수분해물인 펩타이드나 아미노산은 Tau, PEA(Phosphoethanolamine), Thr, Ser, Glu, α-AAA(α-Aminoadipic acid), Gly, Ala, α-ABA(α-Amino-n-butyric acid), Val, Cys, Met, Cysthi(Cystathionine), Ile, Leu, Tyr, Phe, β-Ala, β-AiBA(β-amino isobutyric acid), γ-ABA(Gamma Amino-n- Butyric Acid), NH3(Ammonia), Hylys(hydroxylysine), Orn(Ornithine), Lys, His, Car, Arg, Asp 및 Pro로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화장료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출된 단백질의 가수분해물인 펩타이드나 아미노산은 Thr, Ser, Glu, Gly, Ala, Val, Leu, Tyr, Phe, NH3, Lys, Asp 및 Pro인 것을 특징으로 하는 화장료용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출된 단백질의 가수분해물인 펩타이드나 아미노산은, 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물에 부유시킨 혼합물 형태로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물; 및 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출된 단백질의 가수분해물인 펩타이드나 아미노산을 함유하는 혼합물은
    화장료용 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 100 중량%의 범위로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 혼합물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 10 중량%의 범위로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 혼합물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 5 중량%의 범위로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 포유류 지방 조직 유래 성체 줄기세포는 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는 화장료용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    TGF, bFGF, IGF, KGF, HGF, fibronectin, VEGF 및 Procollagen을 함유한 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물; 및
    상기 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포로부터 추출한 아미노산인 Thr, Ser, Glu, Gly, Ala, Val, Leu, Tyr, Phe, NH3, Lys, Asp 및 Pro을 함유하는 화장료용 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름 개선 및/또는 노화방지용인 것을 특징으로 하는 화장료용 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 화장료는 화장수, 유액, 크림, 젤, 미용액(엣센스) 및 팩 화장료로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료용 조성물.
  13. 다음의 단계를 포함하는, TGF, bFGF, IGF, KGF, HGF, fibronectin, VEGF 및 Procollagen을 함유하고 있는, 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포 배양물의 제조방법:
    (a) 인간 지방 조직 펠렛을 FBS, NAC 및 ascorbic acid을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하는 단계;
    (b) FBS, NAC, ascorbic acid, calcium, rEGF, 인슐린 및 Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media로 2일마다 교체하면서 계대 배양하는 단계;
    (c) 상기 Keratinocyte-SFM 배지에 부착되어 있는 인간 지방 조직 유래 성체 줄기세포를 분리하여 수득하는 단계;
    (d) 수득한 상기 줄기세포를, NAC, ascorbic acid, calcium, rEGF, 인슐린 및 Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media에서 추가로 배양하는 단계; 및
    (e) 상기 (d)단계의 Keratinocyte-SFM media를 수거한 후, 원심분리 및 필터링하여 순수 세포 배양물을 수득하는 단계.
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