KR20230139010A - 섬유아유사세포 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 항노화 및 주름 억제용 조성물 - Google Patents
섬유아유사세포 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 항노화 및 주름 억제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간지방 유래 줄기세포로부터 직접 분화된 섬유아유사세포와 그 무혈청 배양액을 유효성분으로 포함하여, 피부 재생과 상처치유 효능을 나타낼 수 있는 Fibronectin VEGF, FGF 등 세포외기질과 성장인자의 발현이 인간지방 유래 줄기세포와 인간유래 섬유아세포 대비 현저히 우수하고, 섬유아세포의 증식 및 콜라겐 합성능을 높이고, 콜라겐분해효소의 발현을 감소시키는 항노화 및 주름 억제용 조성물 제공하는 것이다.
Description
본 발명은 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 직접 섬유아유사세포 또는 그 무혈청 배양액을 유효성분으로 포함하는 항노화 및 주름 억제용 조성물에 관한 것이다.
상처는 피부 표면의 파괴 유무에 따라, 피부나 점막이 손상되어 내부의 조직이 공기 중에 노출된 절상, 열상, 관통상, 찰과상 등의 개방성 상처(open wound), 및 피부나 점막의 파열은 없으나, 둔기로 인한 타박이나 비꼬임, 충격 당겨지거나, 꺾였을 때 발생할 수 있는 패쇄성 상처(closed wound)로 분류될 수 있다.
상처 치유(wound healing) 과정은 세포 내 인자에 의해 섬유아세포, 혈관내피세포(vascular endothelial cells), 케라티노사이트와 같은 외피세포(epidermal cells)가 증식을 개시하고, 상처 부위로 세포가 이동하여, 육아조직형성 (granulation tissue formation), 신생혈관형성 (angiogenesis) 및 재상피화 (reepithelization)의 과정을 거쳐 조직 재생이 이루어진다.
상처 치유효능을 갖는 인자로는 EGF(epithelial growth factor), aFGF(acid fibroblast growth factor), bFGF(basic fibroblast growth factor), TGF(transforming growth factors) 및 IGF(insulin-like growth factors)와 같은 성장인자, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 비트로넥틴(vitronectin)과 같은 유착인자(adhesion factor), 레티노이드(retinoid)와 같은 화합물을 들 수 있다.
상처가 회복되는 과정은 초기 창상 발생 후 동화(anabolic) 및 이화(catabolic) 과정이 6주 내지 8주간 균형적으로 일어나며, 이 단계에서 일반적으로 30% 내지 40%의 정상피부조직을 포함하는 회복 정도를 나타낸다. 상흔은 콜라겐 섬유가 점진적으로 교차 결합을 일으키면서 항장력(tensile strength)이 증가하여 충혈성의 융기된 상태로 형성되지만, 시간이 지나면서 점차 형태가 피부와 유사한 상태로 돌아간다. 상처 치유과정 중 동화 및 이화단계에서 상호 불균형이 발생한 경우에는 콜라겐이 분해되지 못하여 굳어져 흉터가 융기된 형태로 남아있게 되며, 이러한 조직은 융기형 흉터(hypertrophic scar) 또는 켈로이드(keloids)로 분류된다.
상처 치유에 대한 관심과 이에 따른 여러 시술 또는 약물의 개발은 궁극적으로 흉터 생성을 예방하고자 하는 미용의 목적이 가장 크다. 흉터는 수술적 또는 비수술적 수단을 통하여 치료할 수 있으며, 비수술적 수단은 실리콘 겔, Cordran 및 Scarguard와 같은 밀폐 드레싱(occlusive dressings), 압박을 이용한 치료법, 콜라겐 형성을 억제하는 스테로이드 치료법 등이 있으며, 수술적 수단으로는 냉동치료, 레이저, 수술적 절제방법 등이 사용되고 있다. 수술에 의한 방법은 일반적으로 25% 내지 100%의 흉터 재발률을 나타내기 때문에, 실효성은 없는 것으로 알려져 있다.
그 외에 흉터 부위에 국부적으로 인터페론 또는 베라파밀(verapamil), 블리오마이신(bleomycin), 5-FU(5-fluorouracil), 레티노산(retinoic acid), 이미퀴모드(imiquimod), 테크로리머스(tacrolimus) 또는 보튤리룸 톡신(botulinum toxin)을 주입하는 방법이 있으나, 이러한 방법 또한 치료 효율이 낮고, 흉터 재발률이 높으며, 약물투여에 의한 부작용 때문에 사용이 제한적인 단점이 있다.
상처 치유를 위한 한 방안으로 줄기세포를 이용하는 방안이 제안되고 있다. 줄기세포는 미분화 세포로서 자기 재생을 통해 오랫동안 분열을 할 수 있으며, 특정 환경 하에서는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원이 되는 조직에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 성체 줄기세포(adult stem cell)로 나누어진다. 이를 이용한 연구적인 측면에서 성체 줄기세포의 잠재 능력은 배아줄기세포보다 제한적인 단점이 있으나, 윤리적인 문제가 적어 성체 줄기세포를 대상으로 많은 연구가 진행되고 있다.
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cells)로도 불리는 다능성 세포(multipotent cell)이다. 중간엽 줄기세포는 골모세포, 연골모세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 형태의 세포로 분화될 수 있다.
생체에서와는 달리 체외에서 인위적으로 동물 세포를 배양하기 위해서는, 혈장이나 림프액과 같은 체액을 근거로 한 생체 조건에 가까운 영양분과 pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 충분히 만족시켜 주어야 한다. 따라서, 체액을 근거로 배지 조성을 결정하고 이 결정된 배양 배지를 선택하여 혈청을 적정 비율로 세포에 맞게 첨가한 뒤 세포 배양에 이용하여 왔다. 이에 인간 줄기세포를 배양하기 위한 다양한 배지 조성물이 제시되고 있는데, 우태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)과 같은 동물 혈청을 함유하는 배지를 이용하여 인간 줄기세포를 배양하는 방법이 통상적이다.
하지만, 줄기세포의 분화과정은 다양한 요인에 의해 시일이 오래 소요되거나, 분화된 세포가 충분한 효과를 갖지 못하는 경우가 많다.
예를 들어, 하기 특허문헌 1의 경우에는 물리적 자극에 의한 세포 분화를 유도하고 있으나, 수주간의 in vitro 배양이 필요하므로 비용 및 대량생산 측면에서 적합하지 않다.
한편, 요즘과 같이 환경의 변화나 생활패턴의 변화에 따른 냉난방의 인위적인 온도조절, 사회생활에서 발생되는 각종 스트레스와 환경오염으로 인한 피부 스트레스, 화장 습관에 따른 잦은 세안 및 연령 증가에 따른 자연적인 피부 노화 등의 여러 가지 원인으로 인하여 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되며 피부가 푸석거리고 촉촉함을 잃어 생기가 없어 보이는 등의 현상이 발생하기 때문에 피부 재생 및 주름 개선 등의 필요가 크게 증가하고 있다.
종래기술로서 특허문헌 1 및 특허문헌 3은 인간지방 유래 줄기세포로부터 섬유아유사세포를 분화시키는 방법 중 하나만을 개시하고 있으며, 구체적인 용도에 대한 효과를 입증하기 못하고 있다. 또한, 특허문헌 2는 줄기세포 배양물을 직접적으로 이용하고 있을 뿐이다.
상기 줄기세포를 이용하여 상처를 치료하는 방안은 피부 재생에 도움이 되기 때문에, 미용 측면에서 항노화 및 주름 억제에도 도움이 될 수 있다는 점에 착안하여, 항노화 및 주름 억제에 효과적인 분화된 줄기세포 및 그 배양액을 발명하게 되었다.
본 발명은 인간지방 유래 줄기세포로부터 직접 분화된 섬유아유사세포와 그 무혈청 배양액을 유효성분으로 포함하는 항노화 및 주름 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 피부 재생과 상처치유 효능을 나타낼 수 있는 Fibronectin VEGF, FGF 등 세포외기질과 성장인자의 발현이 인간지방 유래 줄기세포와 인간유래 섬유아세포 대비 현저히 우수한 항노화 및 주름 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 섬유아세포의 증식 및 콜라겐 합성능을 높이고, 콜라겐분해효소의 발현을 감소시키는 항노화 및 주름 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유전자 조작 없이 직접 분화를 유도시켜 얻은 섬유아유사세포와 그 배양액을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물 중 어느 하나를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 항노화 및 주름 억제용 조성물은 섬유아유사세포 및 그의 배양액 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 인간유래 섬유아세포를 증식시키는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 EGF (Epidermal Growth Factor) 대비 2배 이상 섬유아세포를 증식시키는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 EGF (Epidermal Growth Factor) 보다 높은 콜라겐 합성능을 가지는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 콜라겐 분해효소의 발현을 농도의존적으로 감소시키는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 Fibronectin, VEGF, bFGF, KGF, PDGFD 및 CCL2 중 하나 이상의 유전자 발현을 인간유래 섬유아세포에 비해 2배 이상 증가시키는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 Fibronectin, VEGF, bFGF 및 CCL2 중 하나 이상의 단백질 발현을 인간유래 섬유아세포 배양액에 비해 2배 이상 증가시키는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 성장인자인 VEGF, IGFBP-4 및 I GFBP-6 중 하나 이상의 발현을 증가시키는 것이 바람직하다.
상기 섬유아유사세포는 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 직접 분화를 유도시킨 것이 바람직하다.
상기 섬유아유사세포는, 젤라틴이 코팅된 플레이트에서 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하고, 교체가능한 세포분화용 배지를 부가하여 2~4일 간격 및 2~7회 교체하여, 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 것이며, 상기 세포분화용 배지가 전환성장인자(TGF-β: Transforming growth factor-β), 섬유아세포성장인자(FGF: Fibroblast growth factor), 덱사메타손(Dexamethasone), 결합조직성장인자(CTGF: Connective tissue growth factor), 인슐린성장인자(IGF: Insulin growth factor), 표피성장인자(EGF: Epidermal growth factor), 우태아혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 배양액은 우태아혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지에서 2~7일 동안 배양된 것이 바람직하다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 조성물은 팩, 밴드 또는 패치 중 어느 하나에 포함되는 것이 바람직하다.
상기 팩은 국소형 패치, 시트타입, 거즈타입, 크림타입 및 젤타입 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 팩은 마스크팩, 손팩, 발팩, 종아리팩, 헤어팩, 허벅지팩, 복부팩, 옆구리팩, 팔뚝팩, 턱팩 및 목팩 중에서 선택되는 어느 하나인 것이 보다 바람직하다.
상기 조성물은 에어로졸, 액체, 용액, 젤, 페이스트, 크림, 연고, 폼 및 분말 중 어느 하나의 제형으로 되는 것이 바람직하다.
본 발명의 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 섬유아유사세포로의 직접 분화를 유도하는 효과를 발휘할 수 있고, 경제적인 소재를 사용함으로써 저비용으로 체외에서 대량 배양을 효율적으로 가능하게 하는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명은 인간지방 유래 줄기세포로부터 직접 분화된 섬유아유사세포와 그 무혈청 배양액을 유효성분으로 포함하는 항노화 및 주름 억제용 조성물 제공하는 것이다.
본 발명은 피부 재생과 상처치유 효능을 나타낼 수 있는 Fibronectin VEGF, FGF 등 세포외기질과 성장인자의 발현 이 인간지방 유래 줄기세포와 인간유래 섬유아세포 대비 현저히 우수한 항노화 및 주름 억제용 조성물 제공하는 것이다.
본 발명은 섬유아세포의 증식 및 콜라겐 합성능을 높이고 콜라겐분해효소의 발현을 감소시키는 항노화 및 주름 억제용 조성물 제공하는 것이다.
도 1은 실험예 1에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 증식능 평가 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 실험예 2에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 콜라겐 합성능 평가 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 실험예 3에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 콜라겐분해효소 발현능 평가 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 Fibronectin 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 VEGF 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 bFGF 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 7은 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 KGF 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 8은 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 PDGFD 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 9는 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 CCL2 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 10은 실험예 5에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 Fibronectin 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 11은 실험예 5에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 bFGF 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 12는 실험예 5에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 VEGF 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 13은 실험예 5에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 CCL2 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 14는 실험예 6에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 성장인자 특성을 분석한 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 실험예 2에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 콜라겐 합성능 평가 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 실험예 3에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 콜라겐분해효소 발현능 평가 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 Fibronectin 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 VEGF 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 bFGF 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 7은 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 KGF 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 8은 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 PDGFD 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 9는 실험예 4에 따라 실시예 1의 섬유아유사세포의 CCL2 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 10은 실험예 5에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 Fibronectin 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 11은 실험예 5에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 bFGF 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 12는 실험예 5에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 VEGF 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 13은 실험예 5에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 CCL2 발현능 확인 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 14는 실험예 6에 따라 실시예 2의 섬유아유사세포 배양액의 성장인자 특성을 분석한 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 “상에” 또는 “전에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본 발명에 따른 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 섬유아유사세포로의 분화방법은, 젤라틴이 코팅된 플레이트에서 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하고, 교체가능한 세포분화용 배지를 부가하여, 섬유아유사세포로 분화시키는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 상기 플레이트는, 줄기세포의 분화 및 증식을 위해 적절한 세포외기질 분자를 사용하여야 한다. 사용할 수 있는 세포외기질 분자로는, 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(Fibronectin), 마트리겔(Matrigel), 젤라틴(Gelatin) 등이 있으며, 본 발명에서는 바람직하게 세포의 분화 및 증식률이 가장 높았던 젤라틴을 사용하였고, 피더세포(feeder cell)를 포함하지 않고, 젤라틴이 코팅된 배양 플레이트를 사용하였다. 이를 통해 증식 및 분화를 위한 공배양 단계를 거치지 않기 때문에, 분화에 소요되는 시간을 단축하여 환자에게 신속한 적용이 가능하며, 피더세포(feeder cell)의 배양 과정에서 오염으로 인한 질병 전염 가능성을 낮추어 분화세포의 안정성을 높이는 효과를 얻게 된다.
또한, 본 발명의 '젤라틴'이 코팅된 플레이트를 이용할 경우, 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 섬유아유사세포로의 직접 분화를 유도하는 효과를 발휘할 수 있고, 경제적인 소재를 사용함으로써 저비용으로 체외에서 대량 배양을 효율적으로 가능하게 하는 효과를 발휘할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 상기 플레이트는, 폴리스티렌 (Polystyrene) 플레이트인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 상기 플레이트는, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포로부터 섬유아유사세포로의 분화를 유도하기 위한 것일 수 있다.
상기 인간지방 유래 줄기세포는, 바람직하게는 인간지방 유래 중간엽 줄기세포인 것이 좋다. 이때, 상기 중간엽 줄기세포는, 바람직하게는 골수, 지방조직 또는 탯줄에서 유래된 것일 수 있다.
상기 세포분화용 배지는 전환성장인자(TGF-β: Transforming growth factor-β), 섬유아세포성장인자(FGF: Fibroblast growth factor), 덱사메타손(Dexamethasone), 결합조직성장인자(CTGF: Connective tissue growth factor), 인슐린성장인자(IGF: Insulin growth factor), 표피성장인자(EGF: Epidermal growth factor), 우태아혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 것이 바람직하며, 당업계에서 동물세포 분화를 위해 사용되는 것이라면 어느 것이든 추가될 수 있다.
상기 세포분화용 배지에는, 바람직하게는 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신 (streptomycin)이 첨가되어 조성된 것을 사용하는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 상용되는 DMEM/HIGH GLUCOSE 배지에 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신 (streptomycin)이 첨가되어 조성된 것을 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 세포분화용 배지에 포함되는 상기 우태아혈청은, 바람직하게는 1 ~ 15 %인 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 1%인 것이 좋다.
또한, 본 발명의 세포분화용 배지에 포함되는 상기 페니실린/스트렙토마이신은, 바람직하게는 0.05 ~ 2 %인 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 1 %인 것이 좋다.
또한, 본 발명의 세포분화용 배지에 포함되는 상기 전환성장인자 (TGF-β: Transforming growth factor-β)는, 바람직하게는 10 ~ 20 ng/ml인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 15 ng/ml인 것이 좋다.
또한, 본 발명의 세포분화용 배지에 포함되는 상기 섬유아세포성장인자 (FGF: Fibroblast growth factor)는, 바람직하게는 10 ~ 30 ng/ml인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 20 ng/ml인 것이 좋다.
또한, 본 발명의 세포분화용 배지에 포함되는 상기 덱사메타손 (Dexamethasone)은, 바람직하게는 0.05 ~ 0.2 nM인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 0.1 nM인 것이 좋다.
또한, 본 발명의 세포분화용 배지에 포함되는 상기 결합조직성장인자 (CTGF: Connective tissue growth factor)는, 바람직하게는 50 ~ 150 ng/ml인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 100 ng/ml인 것이 좋다.
또한, 본 발명의 세포분화용 배지에 포함되는 상기 인슐린성장인자(IGF: Insulin growth factor)는, 바람직하게는 5 ~ 15 ng/ml인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 10 ng/ml인 것이 좋다.
또한, 본 발명의 세포분화용 배지에 포함되는 상기 표피성장인자(EGF: Epidermal growth factor)는, 바람직하게는 5 ~ 15 ng/ml인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 10 ng/ml인 것이 좋다.
본 발명의 세포분화 방법은, 5% CO2 및 37℃의 온도에서 수행하였다. 이때, 세포 분화를 위한 최적 온도는 주로 세포가 분리된 숙주의 체온에 의존한 조건이고, 5% CO2는 세포 대사와 생장을 모니터링하기 위하여 양분이 한정된 배지에서 양분의 소모시기를 파악하기 위해 첨가한 pH 지시약인 페놀 레드(Phenol red)의 정상적인 작용을 위해 세포 대사 과정에서 발생한 배지 중 CO2가 인큐베이터(Incubator) 내부로 기화되지 않게 하기 위한 조건이다.
본 발명에 따른 세포분화 기간은 5~14일 바람직하며, 본 발명에서는 7일간 분화시켰다.
본 발명에 따른 세포분화용 배지는 2~4일 간격으로 교체하는 것이 바람직하며, 본 발명에서는 3일 간격으로 교체하였다. 이는 배지의 신선함(fresh)을 유지하기 위한 목적이며, 분화배지에 같이 처리하는 인자의 경우 높은 온도에서 오래 유지될 때, 활성이 떨어지기 때문에 배지를 교체하여 사용하는 것이 좋다.
기존 연구들에서는 다른 기원의 세포를 IPS 세포(IPS cell)로 유도한 뒤, 분화시키는 방법을 사용하였다. 하지만 본 발명은 상기 인간지방 유래 줄기세포로부터 섬유아유사세포로의 분화 유도 방법에 있어서, 중간엽 줄기세포로부터 섬유아유사세포로 직접분화(Direct conversion, Trans-differentiation)시킨다는 점에서 차별된다.
한편, 상기 배양액은 우태아혈청이 포함되지 않은 1×페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM/HIGH GLUCOSE에서 2~7일 동안 배양된 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 항노화 및 주름 억제용 조성물은 상기 방법에 따라 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 직접 교차 분화된 섬유아유사세포 및 그의 배양액 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 인간유래 섬유아세포를 증식시키는 것이 바람직하며. EGF (Epidermal Growth Factor) 대비 2배 이상 섬유아세포를 증식시키는 것이 보다 바람직하다.
상기 조성물은 EGF (Epidermal Growth Factor) 보다 높은 콜라겐 합성능을 가지는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 콜라겐 분해효소의 발현을 농도의존적으로 감소시키는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 Fibronectin, VEGF, bFGF, KGF, PDGFD 및 CCL2 중 하나 이상의 유전자 발현을 인간유래 섬유아세포에 비해 2배 이상 증가시키는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 Fibronectin, VEGF, bFGF 및 CCL2 중 하나 이상의 단백질 발현을 인간유래 섬유아세포 배양액에 비해 2배 이상 증가시키는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 성장인자인 VEGF, IGFBP-4 및 I GFBP-6 중 하나 이상의 발현을 증가시키는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
본 발명에서의 약학 조성물은 정제, 캅셀제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 등을 포함하는 군에서 선택되는 제형일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 제제시에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여, 국소투여 등의 방식으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 섭취 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.0001-100 ㎎/kg(체중)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 추가될 수 있는 적합한 성분의 선택은, 당업자에게 자명한 범위에서, 본 발명의 피부 외용제 조성물이 용액, 로션, 림, 연고, 겔, 폼 또는 경피 패치로 제형화 되는지 여부에 어느 정도 의존할 것이다.
예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다. 화장료 조성물에 통상적으로 부가되는 성분이나 함량 등은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 에어로졸, 액체, 용액, 젤, 페이스트, 크림, 연고, 폼 및 분말 중 어느 하나의 제형으로 가능하며, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 로션은 용액과 유사하지만 용액보다 더 진하고 본질적으로 더 완화시키는 경향이 있다. 로션에는 일반적으로 물과 오일이 혼합되어 있으며 용액보다 알코올이 적은 경우가 많다.
예를 들어, 크림은 거의 같은 비율의 오일과 물의 에멀젼을 가지고 있다. 피부의 각질층 외층까지 잘 침투한다. 크림은 로션보다 두껍고 용기에서 꺼낼 때 모양이 유지된다.
또한, 본 발명의 조성물은 팩, 밴드 또는 패치 중 어느 하나에 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 팩은 국소형 패치, 시트타입, 거즈타입, 크림타입 및 젤타입 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
상기 팩은 마스크팩, 손팩, 발팩, 종아리팩, 헤어팩, 허벅지팩, 복부팩, 옆구리팩, 팔뚝팩, 턱팩 및 목팩 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
한편, 식품 조성물에 적용할 경우에는 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 하여 당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 적의 선정하여, 정제, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제, 과립제, 음료(드링크제), 다이어트바, 쵸콜렛, 카라멜 제형 또는 과자류 제형 등으로 제형화하여 사용할 수 있다. 또한 건강식품에 적합한 기능성원료를 부가적으로 적절하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다.
(실시예 1) 인간 지방 유래 줄기세포로부터 섬유아유사세포로의 분화 유도
젤라틴이 코팅된 플레이트(plate)에서 배양된 세포를 섬유아유사세포로 분화시키기 위해, 15 ng/ml 전환성장인자(TGF-β: Transforming growth factor-β), 20 ng/ml 섬유아세포성장인자(FGF: Fibroblast growth factor), 0.1 nM 덱사메타손(Dexamethasone), 100 ng/ml 결합조직성장인자(CTGF: Connective tissue growth factor), 10 ng/ml 인슐린성장인자(IGF: Insulin growth factor), 10 ng/ml 표피성장인자(EGF: Epidermal growth factor), 1% 우태아혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM/HIGH GLUCOSE 세포분화용 배지에서 5% CO2 및 37℃의 온도로 6 well plate 기준 2 ml를 취하여 7일간 배양하였다. 배지 교체는 3일에 한번씩 교체하였으며, 기존 배양배지를 제거(suction)한 뒤, 파이펫을 이용하여 DMEM/HIGH GLUCOSE 분화배지 2 ml로 교체하였다.
(실시예 2) 섬유아유사세포 배양액의 제조
실시예 1에서 얻어진 섬유아유사세포의 배양액을 제조하기 위해 우태아혈청이 포함되지 않은 1×페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM/HIGH GLUCOSE로 교체하여 5% CO2 및 37℃의 온도조건에서 2일간 배양하였다. 상기 배양액을 수거하여 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 배양액에 존재하는 세포 및 세포 잔여물을 제거하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후 최종 배양액을 수득하였으며 사용 전까지 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.
(실험예 1) 섬유아유사세포 배양액의 섬유아세포 증식능 평가
피부노화가 진행됨에 따라 섬유아세포의 수가 감소한다.
인간유래 섬유아세포 (Human dermal fibroblast)를 플레이트에서 24시간 동안 배양한 뒤 실시예 2에서 얻어진 배양액을 1%, 3%, 5% 및 100%의 농도별로 처리하여 24 시간 배양하였다 CCK 8 reagent를 처리하여 무처리군 대비 시료처리에 의한 섬유아세포의 증식능을 평가하였다.
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 실시예 2의 배양액 처리군에서 농도의존적으로 세포증식능이 높아지는 것을 확인하였으며, 3~100% 처리군에서는 양성대조군으로 사용한 EGF (Epidermal Growth Factor) 대비 2배 이상의 증식능을 나타냈다.
(실험예 2) 섬유아유사세포 배양액의 섬유아세포 콜라겐 합성능 평가
피부노화가 진행됨에 따라 섬유아세포의 수가 감소하고 그의 기능인 콜라겐과 엘라스틴, 피브로넥틴과 같은 세포외기질 및 성장인자 등의 발현이 감소한다. 상기 콜라겐은 세포내에서 프로콜라겐(procollagen)으로 합성된 후, 세포외로 분비되어 콜라겐으로 합성된다
본 실험예에서는 세포외로 분비된 PIP (Procollagen Type I C-terminal Peptide)을 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)로 확인하여 실시예 2의 배양액에 의한 섬유아세포 콜라겐 합성능을 평가하였다.
인간유래 섬유아세포를 플레이트에서 24시간 동안 배양시킨 뒤, 실시예 2에서 얻어진 배양액을 1%, 3%, 5% 및 100%의 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. PIP ELISA kit를 이용하여 배양액 내 분비된 콜라겐 발현양을 측정하였다.
그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 실시예 2의 배양액 처리군에서 콜라겐 합성능을 높이는 것을 확인하였으며, 양성대조군으로 사용한 EGF 보다 합성능이 높은 것으로 확인되었다.
(실험예 3) 섬유아유사세포 배양액의 섬유아세포 콜라겐 분해효소 발현 평가
피부노화가 진행됨에 따라 섬유아세포 내 콜라겐 분해 효소인 MMP-1 (Matrix Metallo Proteinase-1)의 발현이 증가한다. 본 실험예에서는 세포외로 분비된 MMP-1을 ELISA로 확인하여 실시예 2의 배양액에 의한 섬유아세포 콜라겐 분해효소 발현능을 평가하였다.
인간유래 섬유아세포를 플레이트에서 24시간 동안 배양한 뒤, 실시예 2의 배양액을 1%, 3%, 5% 및 100%의 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. MMP-1 ELISA kit를 이용하여 배양액 내 분비된 콜라겐 분해효소 발현양을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 실시예 2의 배양액 처리군에서 콜라겐 분해효소 발현이 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
(실험예 4) 섬유아유사세포의 유효성분 발현능 확인 (유전자수준)
분화시킨 인간지방 유래 중간엽 줄기세포(dADSC)인 섬유아유사세포가 인간유래 섬유아세포와 유효성분 발현능 및 기능이 유사한지 확인하기 위해 실험간 중합효소 연쇄반응(real Time-PCR)을 통해 섬유아세포의 대표적인 발현 유전자인 Fibronectin, VEGF, bFGF, KGF, PDGFD 및 CCL2의 유전자 발현양상을 확인하였다.
그 결과, 도 4 내지 도9에 도시된 바와 같이, 인간지방 유래 중간엽 줄기세포(ADSC)와 비교하여 섬유아세포(HDF) 및 섬유아유사세포(dADSC, 실시예 1)에서 Fibronectin, VEGF, bFGF, KGF, PDGFD 및 CCL2의 유전자 발현양상이 증가하는 것을 확인하였다 또한 섬유아유사세포가 섬유아세포에 비해 2배 이상 발현하는 것으로 확인하였다.
(실험예 5) 섬유아유사세포 배양액의 유효성분 발현 확인 (단백질수준)
섬유아유사세포 배양액 (dADSC-CM, 실시예 2) 내 유효성분 발현양을 확인하기 위해 ELISA assay를 통해 섬유아세포 배양액의 대표적인 발현 유전자인 Fibronectin, VEGF, bFGF, CCL2의 단백질 발현양상을 확인하였다.
그 결과, 도 10 내지 도 13에 도시된 바와 같이, 인간지방 유래 중간엽 줄기세포 배양액 배양액(ADSC-CM)과 비교하여 인간유래 섬유아세포 배양액(HDF-CM) 및 섬유아유사세포 배양액(dADSC-CM)에서 Fibronectin, VEGF, bFGF 및 CCL2의 단백질 발현양상이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 섬유아유사세포 배양액이 인간유래 섬유아세포 배양액에 비해 2배 이상 발현하는 것으로 확인하였다.
(실험예 6) 섬유아유사세포 배양액 내 성장인자 특성 분석
본 발명은 배양액에 함유된 성장인자를 분석하였다. 분석방법은 수득한 배양액을 Human Growth factor Array G1 칩을 통해 GenePix 4100A Microarray Scanner (Molecular Devices) 장비를 이용하여 배양액의 단백질 발현 양상을 확인하고 그 결과를 아래 표 2에 개시하였다.
Growth Factor | Intensity score | 평균 | |
1 batch | 2 batch | ||
IGFBP-6 | 3796.5 | 3948.1 | 3872.3 |
IGFBP-4 | 2014 | 1738.5 | 1921.25 |
VEGF | 978.8 | 1135.4 | 1057.1 |
그 결과, 상기 표 1 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 배양액 내 VEGF, IGFBP-4 및 IGFBP-6의 발현이 상대적으로 높은 것으로 확인되었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
Claims (16)
- 섬유아유사세포 및 그의 배양액 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 인간유래 섬유아세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 EGF (Epidermal Growth Factor) 대비 2배 이상 섬유아세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 EGF (Epidermal Growth Factor) 보다 높은 콜라겐 합성능을 가지는 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 콜라겐 분해효소의 발현을 농도의존적으로 감소시키는 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 Fibronectin, VEGF, bFGF, KGF, PDGFD 및 CCL2 중 하나 이상의 유전자 발현을 인간유래 섬유아세포에 비해 2배 이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 Fibronectin, VEGF, bFGF 및 CCL2 중 하나 이상의 단백질 발현을 인간유래 섬유아세포 배양액에 비해 2배 이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 성장인자인 VEGF, IGFBP-4 및 I GFBP-6 중 하나 이상의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 섬유아유사세포가 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 직접 분화를 유도시킨 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 섬유아유사세포가, 젤라틴이 코팅된 플레이트에서 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하고, 교체가능한 세포분화용 배지를 부가하여 2~4일 간격 및 2~7회 교체하여, 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 것이며,
상기 세포분화용 배지가 전환성장인자(TGF-β: Transforming growth factor-β), 섬유아세포성장인자(FGF: Fibroblast growth factor), 덱사메타손(Dexamethasone), 결합조직성장인자(CTGF: Connective tissue growth factor), 인슐린성장인자(IGF: Insulin growth factor), 표피성장인자(EGF: Epidermal growth factor), 우태아혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물. - 제 1 항에 있어서, 상기 배양액이 우태아혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지에서 2~7일 동안 배양된 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 팩, 밴드 또는 패치 중 어느 하나에 포함되는 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 13 항에 있어서, 상기 팩이 국소형 패치, 시트타입, 거즈타입, 크림타입 및 젤타입 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 13 항에 있어서, 상기 팩이 마스크팩, 손팩, 발팩, 종아리팩, 헤어팩, 허벅지팩, 복부팩, 옆구리팩, 팔뚝팩, 턱팩 및 목팩 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 에어로졸, 액체, 용액, 젤, 페이스트, 크림, 연고, 폼 및 분말 중 어느 하나의 제형으로 되는 것을 특징으로 하는 항노화 및 주름 억제용 조성물.
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