KR20180082980A

KR20180082980A - 나노그를 도입한 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포로부터 획득한 엑소좀 내 포함된 육모 촉진용 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR20180082980A
Application number: KR1020180003922A
Authority: KR
Inventors: 유승권; 박정현; 장지훈; 전은경
Original assignee: 주식회사 스템랩
Priority date: 2017-01-11
Filing date: 2018-01-11
Publication date: 2018-07-19
Also published as: KR102037038B1; CN110191714A; US20190330594A1; WO2018131900A3; EP3569239A2; JP2020505058A; WO2018131900A2; EP3569239A4; JP7015316B2

Abstract

본 발명은 역분화 인자 나노그(Nanog)를 과발현시킨 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포의 배양액 내의 엑소좀 분리를 통한 육모 촉진용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

나노그를 도입한 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포로부터 획득한 엑소좀 내 포함된 육모 촉진용 조성물의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING EXOSOME COMPOSITION FOR PROMOTING HAIR GROWTH FROM HUMAN AMNIOTIC FLUID-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS WITH NANOG}

줄기 세포(stem cell)란 신체 내에서의 특징적인 조건 및 환경이 주어지거나 자체 내에서의 필요에 의해서 정도에 따른 무한 자가 증식 능력 및 신체 내에서 필요하는 특정 세포 및 조직으로의 분화능을 가지고 있는 세포를 뜻한다. 줄기 세포는 그 종류를 3가지로 분류하고 있으며, 그 종류로는 초기 배아에서 분리한 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ES 세포), 배아기의 원시 생식세포에서 분리한 배아 생식세포(embryonic germ cell. EG 세포), 및 성체의 골수에서 분리한 다능성 성체 줄기세포(multipotent adult progenitor cell, MAPC 세포)가 있다.

그 중 성체 줄기세포로 잘 알려진 중간엽 줄기세포는 이미 임상적으로 세포 치료제 및 배양액 치료제로써 다양하게 활용되고 있으며 그 효과 또한 상당수 입증되었다. 이 중간엽 세포는 여러 가지 신체 조직에서 분리가 가능한 것으로 확인되었으며 대표적으로는 골수, 지방, 제대혈, 양수 등에서 동정이 가능하다. 또한 그 세포들의 성격 및 특성이 상당수 일치하고 있으며 치료제로써의 활용 가치 또한 비슷하거나 동등함이 이미 잘 알려져 있다.

그 중 양수 중간엽 줄기세포는 여러 가지로 장점을 가지고 있기 때문에 연구적, 상업적 활용 가치가 뛰어나다. 양수 중간엽 줄기세포는 산모의 양수에서부터 분리해 체외 배양이 가능한데, 양수는 산모에게서부터 쉽게 획득할 수 있다. 또한 양수는 태아의 건강에 대한 여러 정보들을 알아볼 수 있는 검사용으로 사용이 되는데 이를 환자의 동의에 의해 연구용 목적으로 사용이 가능하며 획득하는 방법 또한 상당히 간단하여 양수를 획득한 당일 체외 배양이 가능하다. 이러한 장점들로 인해 양수 유래 중간엽 줄기세포를 치료용 제재로써 활용하는 것이 합당하다고 판단할 수 있다.

사람의 모발은 필요 부위에 일정한 수의 모발을 유지하게 된다. 모발의 성장은 그 조직에 따라 각각의 독자적인 성장 주기가 있는데 이를 모주기(hair cycle)이라 하며 발생기 -> 성장기 -> 퇴행기 -> 휴지기의 단계를 가지고 있다. 이러한 기작을 모근 부근에 위치한 모유두 세포(dermal papilla)가 주위 세포에 신호를 전달함으로써 관장하게 되는데 이 세포가 받아들이는 성장 인자 및 자체의 수가 모발 성장에 큰 역할을 수행하게 된다. 탈모가 진행이 시작되면 모유두가 작아지고, 모유두가 작아지면 머리털의 굵기도 가늘어지고 동시에 모주기도 짧아지며, 새로 자라나온 털은 가늘어지기 시작된다. 이러한 진행 과정으로 대머리가 진행되면 머리털은 솜털로 변하며 모발의 성장주기는 더욱 짧아져 조금 자란 후 모발은 탈락한다. 대머리의 가장 큰 원인은 유전이고, 남성호르몬인 테스토스테론이 모유두 세포의 성장을 억제하여 탈모를 유도한다는 보고도 있다. 이러한 신체 내의 원인 이외에도 환경에 의한 탈모도 다수 존재한다. 특히 노화는 두피 세포의 감소와 두피 지방질의 축적량이 증가함에 따라 모낭 조직으로의 산소 공급이 원활하지 않게 되고 이에 따라 모낭 조직이 영양 공급을 받는 것에 문제가 생겨 탈모가 생성된다고 알려져 있다. 그와 더불어 스트레스, 불규칙한 생활, 환경 오염 등 외적인 요인들도 탈모의 원인이 될 수 있다는 견해도 다수 존재한다.

대머리나 탈모 현상으로 당사자들이 느끼는 정신적인 고통은 매우 크나, 현재 개발되어 판매되고 있는 발모제들은 대부분 발모 효과가 일시적이거나 제한적이어서 사용자의 욕구를 충분히 만족시키지 못하고 있다. 어느 정도 효과가 검증되어 사용되고 있는 바르는 발모제인 미녹시딜은 혈관 확장작용에 의해, 경구용인 프로페시아는 피나스테라이드를 주제로 한 남성 호르몬의 활성화 억제작용에 의해 탈모방지 효과가 우수한 제제로 많이 이용되고 있다. 그러나 전술한 발모제들은 탈모의 방지에는 어느 정도의 효과를 나타내지만 발모와 관련된 효과는 미미하다. 즉, 상기 발모제들을 사용하다가 중단할 시에는 다시 탈모 현상이 일어나게 되고, 장기 사용시에는 부작용의 우려가 크며, 또한 장기 사용에 따른 비용문제도 있어 대부분의 환자들이 치료를 포기하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 나노그(Nanog)를 도입하여 세포의 생장 및 수명을 연장한 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포에서 분리한 컨디션드 배지를 엑소좀 단위로까지 분리, 획득한 뒤, 발모 효능을 평가하고 그에 대한 주요인자를 선별하였다.

한국공개특허 제2013-0116972호 한국등록특허 제1422559호

본 발명의 다른 목적은 나노그(Nanog)가 과발현된 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포로부터 생산된 인간 성장인자가 함유된 엑소좀의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 나노그(Nanog)가 과발현된 양수 내 태아유래 중간엽 줄기세포로부터 생산된 인간 성장인자가 함유된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 육모 촉진용 조성물, 및 이의 화장료 조성물 또는 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 (a) 산모로부터 얻은 양수에서 태아 유래 세포를 분리하는 단계;

(b) 상기 분리된 태아 유래 세포를 FBS(fetal bovine serum) 및, bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계;

(c) 상기 수득된 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포에 나노그(Nanog)를 도입하여 나노그(Nanog)가 과발현된 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계;

(d) 상기 수득된 나노그(Nanog)가 과발현된 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 1 내지 5일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및

(e) 상기 컨디션드 배지로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)"라 함은 골, 연골, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 산모로부터 얻은 양수에는 태아의 몸으로부터 나온 여러 가지 화학물질들이 포함되어 인체에 있는 대부분의 세포를 생성할 수 있고 채취가 쉬운 편이다. 또한, 양수에는 이종(heterogenous) 모양의 세포들이 존재하는데, 본 발명자들은 그 중에서 중간엽 줄기세포의 특징인 섬유아세포(fibroblast)와 같은 모양을 가지는 동종(homogenous)의 중간엽 줄기세포가 존재한다는 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어, 역분화 인자 Nanog"는 2006년 Yamanaka 교수팀에 의해 도입된 개념인 역분화(Reprogramming)에서부터 시작되었다. 성체의 모든 조직은 정상 발달 과정을 거치면서 분화되지 않은 상태에서 점차적으로 분화되어 각 기증이 전문화된 세포로 변화한다. 그 중 수정란의 세포들은 전능성(Totipotent)을 가지고 있고 이 후 발달 단계가 진행되면서 배반포가 되면 내부 세포괴(inner cell mass)와 바깥쪽 세포들로 구분이 가능한데 이때의 내부세포괴 세포들이 배아 체세포와 생식세포로 발생할 수 있으며 이를 만능성(pluripotent)라 부른다. 이 배아 줄기세포는 만능성 특유의 유전자 발현 양상을 보여주는데 그 대표적인 예가 Oct4, Sox2, Nanog, Lin28 등 이다. 역분화는 체세포에 이러한 특이적인 유전자 발현을 유도하여 배아 줄기세포와 유사한 성질로 되돌리는 기술이라 할 수 있다. Nanog는 그에 따른 일련의 연구들에서 사용되어 왔던 다양한 인자들 중 하나로써 Viral vector를 이용하여 세포 내에 유전자를 도입하여 과발현시키는 기술로 본 연구진은 활용하였다.

본 발명에서 용어, "배지(culture medium)"는 in vitro 상에서 양수 내 태아 유래 세포들의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 양수 내 태아 유래 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지 및 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 및 IMEM( Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포는 양수에서 분리한 세포들을 FBS 및 bFGF를 함유하는 기본 배지에서 배양함으로써 수득할 수 있으며, 바람직하게는 10% FBS가 포함된 로우 글루코즈 DMEM 배지에 bFGF 4ng/ml , Selenium 5ng/ml, 아스코브산 50㎍/ml를 첨가하여 배양함으로써 수득할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예로서, 상기 로우 글루코즈 DMEM 배지는 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 bFGF 4ng/ml , Selenium 5ng/ml, 아스코브산 50㎍/ml용액을 추가로 포함할 수 있다.

상기 (c) 단계의 Nanog 도입의 방법은 Retroviral vector를 이용할 수 있다.

더 구체적으로, (d) 단계에서, (c)단계에서 수득된 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 3일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조할 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 Nanog가 도입된 태아 유래 중간엽 줄기세포를 적정한 배지에서 배양하여 Apo-1/Fas, 표피세포 성장인자(EGF), IP-10(Interferon-γ inducible protein-10), 렙틴(Leptin), MIP4, MMP3, 란테스(Rantes), 인터페론-감마(IFNγ), 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNFα), 종양괴사인자 수용체 Ⅰ(TNFRⅠ), 종양괴사인자 수용체Ⅱ(TNFRⅡ), 세포부착인자-1(ICAM-1), 혈관세포부착인자-1(VCAM-1), 맥관내피세포 성장인자(VEGF), 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-1 수용체 알파(IL-1Rα), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 및 IL-15 등을 합성하며 더욱 바람직하게는 모발 성장 촉진 성장인자인 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), IGF(Insulin-like Growth Factor), PDGF-AA(Platelet-derived Growth Factor), Wnt7a등을 합성할 수 있도록 조작하는 방법을 제공한다. 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포의 컨디션드 배지를 이용하여 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)를 통하여 성분을 밝히고, in vitro 상에서 확인이 가능하다.

본 발명에서는 태아 유래 중간엽 줄기세포의 컨디션드 배지를 얻기 위하여, 양수에서 분리하여 수득한 중간엽 줄기세포를 아미노산 또는 그 유사체 및 비타민 또는 그 유사체를 포함하는 DMEM 영양소 혼합액을 함유하는 무혈청 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 이때 L-글루타민 등의 산화영양원, 소디움 피루베이트 등의 에너지 대사물질, 소디움 바이카보네이트 등의 탄소조절원을 첨가하는 것이 가능하다. 본 혼합액은 세포의 성장과 항상성 유지를 돕고 중간엽 줄기세포의 초기 배양 후 계대 배양에 있어 세포의 안정성 및 유지력 증진에 관여되는 여러 가지의 무기질 및 아미노산, 태아 유래 중간엽 줄기세포에서 분비되는 성장인자의 더 높은 생산을 촉진할 수 있는 비타민 계열의 영양소들과 다른 인자들을 일정한 비율로 혼합하여 형성된다.

본 발명에서 용어, "컨디션드 배지(conditioned medium)" 란 세포를 액체현탁배양하여 세포분열최성기인 대수성장기에 도달했을 때 분열세포를 원심분리 또는 여과하여 제거하고 배양액만 채취하여 이를 배양기질에 혼합한 배지를 말한다. 이는 분열중인 세포로부터 배지 내에서 추출되어 나오는 미지의 성장요소(growth factor)를 이용하는 것으로서, 저밀도의 세포 플레이팅이나 원형질체 배양에 많이 이용된다.

본 발명의 컨디션드 배지에는 태아 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 성장인자 등의 물질이 풍부하게 함유되어 있으며, 바람직하게는 Apo-1/Fas, 표피세포 성장인자(EGF), IP-10(Interferon-γ inducible protein-10), 렙틴(Leptin), MIP4, MMP3, 란테스(Rantes), 인터페론-감마(IFNγ), 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNFα), 종양괴사인자 수용체 Ⅰ(TNFRⅠ), 종양괴사인자 수용체Ⅱ(TNFRⅡ), 세포부착인자-1(ICAM-1), 혈관세포부착인자-1(VCAM-1), 맥관내피세포 성장인자(VEGF), 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-1 수용체 알파(IL-1Rα), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 및 IL-15 을 포함한다. 가장 바람직하게는 모발 성장 촉진 성장인자인 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), IGF(Insulin-like Growth Factor), PDGF-AA(Platelet-derived Growth Factor), Wnt7a등을 포함한다.

중간엽 줄기세포의 컨디션드 배지 생산에 있어 주된 한계점은 줄기세포의 노화와 크게 연관이 있다. 세포의 노화는 세포 성장 저조를 유발하고 분비하는 성장인자 및 사이토카인(cytokine)의 양을 감소시키며 세포의 사멸을 야기한다. 또한, 세포 유래 컨디션드 배지의 양 및 질적 손실을 유발하고 균일한 조성을 유지하기 어렵게 하며, 이는 결국 컨디션드 배지 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 대량생산 및 산업화 시 어려움을 초래한다. 이에, 본 발명자들은 이전 연구에서 중간엽 줄기세포 배양에 역분화 기술을 도입하였다. 상기 선행 연구에 의하면, 양수 유래 중간엽 줄기세포에 다양한 만능성 인자들인 Oct4, 나노그(Nanog), Lin28을 도입하였고, 그 중 나노그(Nanog)를 도입한 양수 유래 중간엽 줄기세포는 세포주를 확립 가능하며 지속적인 배양이 가능함에 반해 타 유전자의 도입은 세포 사멸이 유래되었으며 지속적인 세포 배양이 어려움을 확인하였다. 더욱이 나노그(Nanog)를 도입한 양수 줄기세포에서 세포 성장의 증대 및 줄기세포능의 보존 효과가 기존 양수 줄기세포보다 향상되었음을 확인하였다. 이를 통해서 나노그가 도입된 양수 유래 줄기세포의 컨디션드 배지 생산이 지속될 수 있고 컨디션드 배지를 통해 배지에 포함된 다량의 성장인자 등을 획득할 수 있음을 증명하였다.

본 발명에서 용어, 엑소좀(exosome)이란 세포간 상호 작용을 위한 하나의 전달 체계 물질로써, 인지질의 막으로 원 형태를 이루고 있는 nano size의 주머니이다. 엑소좀 내부는 일반적으로 mRNA, shRNA, Protein 등이 포함되어 있으며 이러한 물질들이 세포 내부, 외부에서 전달되어 그 기능을 수행한다. 세포 외부로 배출되는 엑소좀은 타 세포에게 물질들을 전달하게 되고, 제공받은 세포는 그에 맞는 반응 기작을 보여주게 된다. 현재까지 엑소좀의 다양한 기능들이 연구되어 왔으며 일반적으로 암의 바이오마커, 상처 치유, Protein 전달, shRNA의 전달 등이 알려져 있다. 세포의 secretome들과 비교하였을 때, 세포 외부환경에 대한 저항성이 상당히 높으며, 타 세포에게의 흡착성 또한 우수하다. 그에 더불어 농도 조절이 수월하여 기능성 제재로 활용할 수 있는 가치가 충분하다.

구체적으로, 상기 (e) 단계에서 분리된 엑소좀은 bFGF(basic fibroblast growth factor, 기본 섬유아세포성장인자), IGF(Insulin-like Growth Factor), Wnt7a(Wingless-type MMTV integration site family member 7A) 및 PDGF-AA(Platelet-derived Growth Factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 인간 성장인자를 함유할 수 있고, 이제 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 분리된 엑소좀 내부에는 모발 성장 인자와 관련하는 mRNA, 성장 인자 등이 다수 포함되어 있으며, 모유두 세포에 처리하였을 시, 모유두 세포의 성장을 촉진시킬 뿐 아니라 모발 성장 신호 체계 또한 활성화 된다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 일실시예에서, 컨디션드 배지로부터 엑소좀을 제거한 후 성장 인자 등을 분석한 결과, 엑소좀 제거 후 성장인자 등이 대폭 감소함을 확인하였고, 엑소좀 내부에 다량의 성장 인자 등이 포함되어 있음을 확인하였다. 이에 따라, 엑소좀을 분리하여 이용하는 경우, 엑소좀에 함유된 성장 인자 등을 보다 효율적으로 활용할 수 있는 가능성을 확인하였다.

또한, 본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 육모 촉진, 모발 재생 및 탈모 방지 효과를 갖는 모발 화장품에 다양하게 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 전체 화장료 조성물 100 중량부에 대해 0.001 내지 10 중량부를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

상기 화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.

상술한 바와 같은 화장료 조성물은 피부에 바르는 형태로 적용될 수 있고, 마이크로 니들 등을 이용하여 피부 내부로 흡수되는 형태로 적용될 수도 있다.

또한, 본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 육모 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 육모 촉진, 모발 재생 및 탈모 방지 효과를 갖는 모발 의약품에 다양하게 이용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 전체 약학적 조성물 100 중량부에 대해 0.001 내지 10 중량부를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 육모 촉진용 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 주사제, 젤, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 패취, 분무제, 크림, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 형태의 약학 조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염, 단독 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포에 역분화 인자인 나노그(Nanog)를 도입하여 과발현함으로써 중간엽 줄기세포의 성장, 줄기세포능, 수명을 증대하고, 이로부터 분비되는 성장인자의 발현을 증대하였다. 또한, 나노그(Nanog)가 도입된 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 컨디션드 배지로부터 분리한 엑소좀도 모발 성장 촉진 효과를 나타내므로, 육모 촉진용 화장료 조성물 및 약학적 조성물로써 활용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예 따라 세포주에서 Nanog의 과발현 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 양수 유래 중간엽 줄기세포 및 나노그 양수 유래 중간엽 줄기세포의 평균 사이즈 및 개수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 엑소좀 내부의 물질들을 PCR을 통하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 엑소좀 내부의 물질들을 ELISA를 통하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 획득된 엑소좀의 기능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 얻어진 엑소좀의 모유두 성장과 더불어 모발 생성 마커의 변화를 AP staining을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 얻어진 엑소좀의 마커의 변화를 확인한 결과를 나타낸다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

[ 실시예 ]

실시예 1: Nanog가 도입된 양수 유래 중간엽 줄기세포주 확립

본 발명자들는 세포 확장에 용이한 양수 유래 중간엽 줄기세포주를 획득하기 위해 양수 유래 중간엽 줄기세포에 Retroviral vector system을 이용하여 나노그(Nanog) 유전자를 도입, Nanog의 과발현을 유도하였으며 이로써 Nanog 도입 양수 유래 중간엽 줄기세포주를 확립하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.

산모로부터 얻은 양수 내에서 분리한 태아 유래 세포를 10% FBS(Fetal bovine serum, 소태아혈청), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민, bFGF(basic fibroblast growth factor, 기본 섬유아세포성장인자) 4ng/ml, 셀레늄(Selenium) 5ng/ml, 아스코르브산(Ascorbic acid) 50㎍/ml이 포함된 로우 글루코오스(low glucose) DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 수득하였다.

레트로바이러스 벡터 시스템(Retroviral vector system)을 이용해 상기 수득한 양수 유래 중간엽 줄기세포에 나노그(Nanog) 유전자를 도입하여 나노그(Nanog)의 과발현을 유도함으로써 나노그(Nanog) 도입 양수 유래 중간엽 줄기세포주들을 제조하였다.

구체적으로, pBS-Nanog 벡터(Yamanaka lab's plasmid stock #A4, JAPAN)에서 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 나노그 유전자(NCBI GenBank Accession number NM_024865.3)(서열번호 1)를 분리하였다. 분리한 나노그 유전자를 pMXs 벡터(Cell biolab, JAPAN)에 T4 연결효소(ligase)로 라이게이션(ligation)하여 pMXs-Nanog를 제작하였다. pMXs-Nanog 벡터를 293GPG cell로 형질도입 시약(transfection reagent)을 이용하여 6시간 동안 형질도입(transfection)하였다. 72시간 동안 나노그 유전자를 가진 바이러스를 생산하고, 상층액을 분리한 후, 2000rpm에서 10분간 원심 분리한 뒤 그 상층액을 0.45um 필터에 필터링하였다. 이 바이러스를 80% confluence 상태의 양수 유래 중간엽 줄기세포에 6시간 동안 처리하여 세포 내로 감염(Infection)시켰다.

실시예 2: 나노그(Nanog)가 도입된 양수 유래 중간엽 줄기세포의 나노그 ( Nanog ) 발현 검정

RT-PCR 수행을 위해, 나노그(Nanog) 도입 양수 유래 중간엽 줄기세포를 트리졸(TRIzol) 시약(Invitrogen, USA)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 총 RNA를 분리하였다. 분리된 총 RNA 500ug을 cDNA 제조 믹스(Bioneer)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 실험 튜브들을 45℃에서 60 분간 정치한 후, 95℃에서 5분간 정치하였고, 이후 사용시까지 -20℃에서 보관되었다. cDNA는 Taq 합성효소(Promega)와 나노그(Nanog) mRNA에 특이적인 프라이머(Exo-Nanog foward: 5'-GCTTGGATACACGCCGC-3' (서열번호 2); 및 Exo-Nanog reverse: 5'-GATTGTTCCAGGATTGGGTG-3' (서열번호 3))를 통해 증폭되었다. RT-PCR은 94℃ 20초, 60℃ 30초, 및 72℃로 2분의 사이클을 35회 반복한 후, 최종 합성을 위해 72℃로 10분간 진행하였다. PCR 결과물을 1% 아가로즈 젤에 전기영동하고 이를 분석하였다.

Nanog 과발현을 확인할 Western blot실험 수행을 위해, 나노그(Nanog) 도입 양수 유래 중간엽 줄기세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에서 100% 포화될 때까지 배양한 후 수득하고, 세포를 파쇄한 후 단백질이 함유된 상층액 30 ㎍을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 전개하여 분리하고, 니트로셀룰로오즈 막(nitrocellulose membrane)으로 이동하여 4% 스킴밀크(skim milk)로 블로킹(blocking)하였다. 이후, 막에 1차 항체로 나노그(Nanog) 수용체를 탐지하는 항체(AF1997, R&D)를 처리하여 4℃에서 밤새 배양하고 TBST(0.1% Tween 20 첨가된 Tris-Buffered Saline(TBS))로 세척하였다. 2차 항체로 염소 유래의 HRP 항체(goat HRP antibody)(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1% BSA(소혈청알부민, bovine serum albumin)을 포함하는 TBST와 함께 막에 처리하고 한 시간 동안 반응하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-α-튜불린(tubulin) 항체(R&D, USA)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 α-튜불린의 발현을 확인하였다.

그 결과, 나노그(Nanog) 도입 양수 유래 중간엽 줄기세포가 mRNA 수준에서의 외인성(exogenous) 나노그(Nanog) 유전자 발현량과 단백질 수준에서의 나노그(Nanog) 발현량이 양수 유래 중간엽 줄기세포보다 현저히 향상되어, 과발현되었음을 확인하였다(도 1).

상기한 태아 유래 중간엽 줄기세포는 DMEM low Glucose + 10% Fatal bovine serum +1% 페니실린/스트렙토마이신 +1% 비필수아미노산 + basic FGF(bFGF) 4ng/ml + Selenium 5ng/ml + 아스코브산 50㎍/ml)에서 배양하였을 때, 지속적으로 세포 성장이 일어났다.

실시예 3: 나노그(Nanog)가 도입된 양수 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 컨디션드 배지 내 엑소좀 분석

실시예 1 및 2에서 확립된 양수 유래 중간엽 줄기 세포주 중 각각 하나씩의 세포부를 선택, 컨디션드 배지 100ml을 생산한 뒤 엑소좀을 분리하였다.

컨디션드 배지로부터 엑소좀을 추출은 태아 유래 중간엽 줄기세포에서부터 생산해낸 컨디션드 배지를 일정 molecular weight의 protein을 걸러내는 것이 가능하도록 고안된 Amicon Ultra-15 10K Centrifugal filter device(Millipore)를 사용하였다. 컨디션드 배지 14.8ml를 device의 upper cap에 넣어준 뒤 5,000 x g에서 15~40분 동안 원심 분리를 시켰다. 이러한 방식으로 컨디션드 배지 100ml을 농축시킨 후, 농축된 배지에 Exosome isolation kit(Invitrogen)을 최조 볼륨의 1/2를 넣어준 뒤 잘 섞어주었다. 완성된 sample은 4℃에서 12시간동안 보관하였다. 이후 13,2000rpm에서 30분간 원심 분리를 한 뒤, 상층액은 제거하고 남아있는 흰색 pellet을 PBS 또는 DMEM에 녹여주어 엑소좀 sample을 완성하였다.

Nanosight를 이용하여 엑소좀의 평균 size 및 개수를 측정한 결과, 양수 유래 중간엽 줄기세포 및 나노그 양수 유래 중간엽 줄기세포 각각 직경 156nm, 147nm를 기록하였으며 그 개수는 20.0 x 10⁸, 20.1 x 10⁸ 로 측정되었다(도 2). 즉, 실험에 사용된 줄기 세포주에서 엑소좀의 분리는 정상적으로 이루어졌으며, 나노그가 도입된 양수 유래 중간엽 줄기 세포주에서 또한 동일한 양의 엑소좀이 분리가 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 엑소좀 내부의 물질 분석

실시예 3에서 분리한 엑소좀 내부의 물질들을 분석하기 위하여 첫 번째로 RT-PCR을 통해 mRNA의 함유를 조사하였다.

qRT-PCR은 위의 RT-PCR시 RNA prep과 동일하게 RNA를 수득하였으며 동일하게 cDNA를 제작하였다. 이렇게 준비된 cDNA는 CFX-96 PCR system을 통해 qRT-PCR을 수행하였으며, cDNA는 bFGF, IGF, Wnt7a 및 PDGF-AA의 mRNA에 특이적인 프라이머를 이용하여 증폭하였다. bFGF 특이적 프라이머는 bFGF forward: 5'-CAGATTAGCGGACGCGGTGC-3' (서열번호 4) 및 bFGF reverse: 5'-TCACGGATGGGTGTCTCCGC-3' (서열번호 5)를 사용하였고, IGF 특이적 프라이머는 IGF forward: 5'-CCATGTCCTCCTCGCATCTCTTCT-3' (서열번호 6) 및 IGF reverse: 5'-CCATACCCTGTGGGCTTGTTGAA-3' (서열번호 7)를 사용하였으며, Wnt7a 특이적 프라이머는 Wnt7a forward: 5'-TCTTTCTCAGCCTGGGCATGGT-3' (서열번호 8) 및 Wnt7a reverse: 5'-TCCTATGACGATGATGGCGTCG-3' (서열번호 9)를 사용하였고, PDFG-AA 특이적 프라이머는 PDGF-AA forward: 5'-CTGCCCATTCGGAGGAAGAGAA-3' (서열번호 10) 및 PDGF-AA reverse: 5'-TGGCACTTGACACTGCTCGTGTT-3' (서열번호 11)를 사용하였다. 표적 mRNA의 상대적 정량은 CT 방법으로 분석하였다.

bFGF, Wnt7a 및 PDGF-AA 단백질들의 분비 정도를 알아보기 위해, 나노그(Nanog) 도입 양수 유래 중간엽 줄기세포에서 분리된 엑소좀에 대하여 효소면역측정법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA assay)을 수행하였다. 엑소좀 내 bFGF, Wnt7a, PDGF-AA 단백질의 양은 ELISA 키트(Raybiotech)를 사용하여 각각의 엑소좀 내 단백질 함량을 확인하였다. ELISA는 엑소좀을 준비한 뒤 standard 및 샘플에 biotin 항체를 1시간 동안 처리를 한 뒤 streptavidin을 45분간 처리하였다. 이후 30분간 TMB substrate reagent를 처리한 후 stop solution을 더하여 반응을 중지시켰다. 결과는 Microplate Spectrophotometer를 통해 450nm 흡광도를 측정한 뒤 정량 분석하였다.

RT-PCR을 통해 모발 성장 관련 유전자의 발현을 비교해본 결과, Wnt7a를 제외한 bFGF, PDGF, IGF에서 나노그 양수 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀이 더 높은 발현양을 보였다. 이는 나노그 양수 유래 중간엽 줄기세포에서의 엑소좀의 양이 기존의 줄기세포와 수가 비슷하기는 하나 내부의 물질에서 조금의 차이가 있다는 것을 보여준다. RT-PCR 데이터를 조금 더 확실히 하기 위해서, qRT-PCR을 통해 정량 분석하였다. RT-PCR과 동일하게도 Wnt7a를 제외한 나머지 성장 인자들의 mRNA 양이 상당히 다수 존재한다는 것을 알 수 있었다(도 3). 결론적으로 엑소좀 내부에는 모발 성장 관련 인자들의 mRNA가 포함되어 있으며 이는 모발 성장 촉진에 도움을 줄 수 있다고 해석할 수 있다.진 기능성을 예측하고자 하였다. Protein의 양은 ELISA를 이용하여 분석하였으며 Wnt7a, PDGF-AA, bFGF의 농도를 측정하였다(도 4). 측정에 의하면 Wnt7a은 약 8pg/mL, PDGF-AA는 2.5pg/mL, bFGF는 약 5.5pg/mL이 존재하고 있었다. 이는 엑소좀 내부에 모발 성장 관련 protein 또한 포함되어 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 엑소좀 처리를 통한 모유두 세포의 성장 및 마커 변화

획득한 엑소좀을 여러 농도로 구별한 뒤, 모유두 세포에 처리하여 모발 생성에 결정적인 역할을 하는 두 가지, 즉, 모유두 세포의 성장 및 모발 생성 마커의 변화를 확인하였다. 농도는 100X 에서부터 1X 까지 나누었으며 컨디션드 배지와 엑소좀을 제외한 컨디션드 배지를 함께 비교 분석하였다.

구체적으로, 쥐의 피부 조직을 채취하여 세포를 분리하고 실시예 2과 동일한 방법으로 세포의 총 RNA를 분리하여 cDNA로 역전사하였으며, cDNA는 Taq 합성효소(Promega)와 ALP, LEF 및 베르시칸(Versican)의 mRNA에 특이적인 프라이머를 통해 증폭되었다. ALP 특이적 프라이머는 ALP forward: 5'-TGGCCCTCTCCAAGACGTACAA-3' (서열번호 12) 및 ALP reverse: 5'-TGGTTCACTCTCGTGGTGGTCA-3' (서열번호 13)를 사용하였고, LEF 특이적 프라이머는 LEF forward: 5'-CTTCCTTGGTGAACGAGTCTG-3' (서열번호 14) 및 LEF reverse: 5'-GTGTTCTCTGGCCTTGTCGT-3' (서열번호 15)를 사용하였으며, 베르시칸 특이적 프라이머는 Versican forward: 5'-AACTAGCCGTTGGAGTGGATTC-3' (서열번호 16) 및 Versican reverse: 5'-AAATGCTCTGTGGCTCTGGA-3' (서열번호 17)를 사용하였다. 결과물을 1% 아가로즈 젤에 전기영동하여, GAPDH mRNA를 기준으로 하여 상대적인 mRNA 발현량을 CT값 기준의 분석을 이용하여 정량화하였다.

결과에 따르면 농도가 증가함에 따라 모유두 세포의 성장률은 점차적으로 증가하였으며, 일정 농도 이상은 컨디션드 배지보다 훨씬 더 좋은 성장 촉진 능력을 발휘하였다. 그와 더불어 엑소좀을 제거한 컨디션드 배지는 그 기능성이 현저하게 낮아짐을 확인할 수 있었는데 이는 컨디션드 배지 내에서도 엑소좀의 기능이 많은 부분을 차지하고 있음을 반증하고 있다(도 5).

모유두 성장과 더불어 모발 생성 마커의 변화를 qRT-PCR 및 AP staining을 통해 확인하였다. 모유두 세포가 모발 생성을 유도하기 위해서는 모유두 세포 고유의 줄기 세포능을 유지하고 있어야 하는데, 이 줄기 세포능을 대변하는 마커가 대표적으로 ALP, LEF 및 베르시칸(Versican)으로 알려져 있다. 따라서 이 마커들의 발현양을 엑소좀이 없는 배지(Control) 및 각각의 농도(10X, 50X)로 구별하여 처리한 결과, ALP 및 LEF의 발현양이 1.5배에서 2배가량 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 6, 상단). 베르시칸(Versican)의 경우에는 소량 증가하는 것처럼 보이지만 크게 다르지는 않았다. 이 데이터에 신빙성을 얻기 위하여, ALP를 staining으로 확인할 수 있는 AP staining을 진행하였으며, qRT-PCR과 유사하게 엑소좀의 농도가 증가함에 따라 파란색으로 staining이 되는 세포의 수가 증가함을 확인할 수 있다(도 6, 하단).

추가적으로, 모유두 세포 또한 중간엽 줄기세포로의 기능을 어느 정도 가지고 있다는 것이 알려져 있기 때문에 일반적인 줄기 세포 마커인 Oct4, Sox2가 발현한다. 이러한 일반적인 줄기 세포 마커의 변화를 확인한 결과 ALP, LEF와 같이 점진적으로 증가함을 알 수 있다(도 7). 특히 Oct4의 경우에는 5배 이상 차이가 나는 양상을 보여주어서 엑소좀이 Oct4 발현에 큰 영향력을 가지고 있다고 해석할 수 있다.

이 결과들을 보았을 때, 엑소좀은 모유두 세포의 모발 생성 능력을 촉진시켜 발모 및 육모에 효율적인 효과를 보여줄 수 있다고 판단할 수 있다.

<제제예 1> 헤어로션의 제조

통상적인 헤어로션의 제조방법에 따라, 본 발명의 나노그(Nanog)를 도입한 양수 유래 중간엽 줄기세포 컨디션드 배지내 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 헤어로션을 표 1과 같이 제조하였다.

배합성분	함량( 중량% )
나노그(Nanog)를 도입한 양수 유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀	5.0
렌조시놀	2.0
판테놀	0.5
피록톤올아민	0.1
색소	적량
향료	적량
정제수	잔량
계	100

<제제예 2> 친수성 연고제의 제조

통상적인 친수성 연고제의 제조방법에 따라, 본 발명의 나노그(Nanog)를 도입한 양수 유래 중간엽 줄기세포 컨디션드 배지 내 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 친수성 연고제를 표 2와 같이 제조하였다.

배합성분	함량( 중량% )
나노그(Nanog)를 도입한 양수 유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀	0.5
에틸(또는 메틸) p-옥시벤조에이트	0.25
라우릴 황산 나트륨	15
프로필 p-옥시벤조에이트	0.15
백색 바세린	적량
스테아릴 알콜	적량
프로필렌 글리콜	잔량
계	100

<110> StemLab, Inc. <120> METHOD FOR PRODUCING EXOSOME COMPOSITION FOR PROMOTING HAIR GROWTH FROM HUMAN AMNIOTIC FLUID-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS WITH NANOG <130> P17E10C1786 <150> KR 10-2017-0004242 <151> 2017-01-11 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 918 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgagtgtgg atccagcttg tccccaaagc ttgccttgct ttgaagcatc cgactgtaaa 60 gaatcttcac ctatgcctgt gatttgtggg cctgaagaaa actatccatc cttgcaaatg 120 tcttctgctg agatgcctca cacggagact gtctctcctc ttccttcctc catggatctg 180 cttattcagg acagccctga ttcttccacc agtcccaaag gcaaacaacc cacttctgca 240 gagaagagtg tcgcaaaaaa ggaagacaag gtcccggtca agaaacagaa gaccagaact 300 gtgttctctt ccacccagct gtgtgtactc aatgatagat ttcagagaca gaaatacctc 360 agcctccagc agatgcaaga actctccaac atcctgaacc tcagctacaa acaggtgaag 420 acctggttcc agaaccagag aatgaaatct aagaggtggc agaaaaacaa ctggccgaag 480 aatagcaatg gtgtgacgca gaaggcctca gcacctacct accccagcct ttactcttcc 540 taccaccagg gatgcctggt gaacccgact gggaaccttc caatgtggag caaccagacc 600 tggaacaatt caacctggag caaccagacc cagaacatcc agtcctggag caaccactcc 660 tggaacactc agacctggtg cacccaatcc tggaacaatc aggcctggaa cagtcccttc 720 tataactgtg gagaggaatc tctgcagtcc tgcatgcagt tccagccaaa ttctcctgcc 780 agtgacttgg aggctgcctt ggaagctgct ggggaaggcc ttaatgtaat acagcagacc 840 actaggtatt ttagtactcc acaaaccatg gatttattcc taaactactc catgaacatg 900 caacctgaag acgtgtga 918 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exo-Nanog foward <400> 2 gcttggatac acgccgc 17 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exo-Nanog reverse <400> 3 gattgttcca ggattgggtg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bFGF forward <400> 4 cagattagcg gacgcggtgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bFGF reverse <400> 5 tcacggatgg gtgtctccgc 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF forward <400> 6 ccatgtcctc ctcgcatctc ttct 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF reverse <400> 7 ccataccctg tgggcttgtt gaa 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wnt7a forward <400> 8 tctttctcag cctgggcatg gt 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wnt7a reverse <400> 9 tcctatgacg atgatggcgt cg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGF-AA forward <400> 10 ctgcccattc ggaggaagag aa 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGF-AA reverse <400> 11 tggcacttga cactgctcgt gtt 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP forward <400> 12 tggccctctc caagacgtac aa 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP reverse <400> 13 tggttcactc tcgtggtggt ca 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LEF forward <400> 14 cttccttggt gaacgagtct g 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LEF reverse <400> 15 gtgttctctg gccttgtcgt 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Versican forward <400> 16 aactagccgt tggagtggat tc 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Versican reverse <400> 17 aaatgctctg tggctctgga 20

Claims

(a) 산모로부터 얻은 양수에서 태아 유래 세포를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 태아 유래 세포를 FBS(fetal bovine serum) 및, bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계;
(c) 상기 수득된 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포에 나노그(Nanog)를 도입하여 나노그(Nanog)가 과발현된 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계;
(d) 상기 수득된 나노그(Nanog)가 과발현된 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 1 내지 5일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및
(e) 상기 컨디션드 배지로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고,
상기 분리된 엑소좀은 bFGF(basic fibroblast growth factor, 기본 섬유아세포성장인자), IGF(Insulin-like Growth Factor), Wnt7a(Wingless-type MMTV integration site family member 7A) 및 PDGF-AA(Platelet-derived Growth Factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 인간 성장인자를 함유하는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 나노그(Nanog)는 레트로바이러스 벡터를 이용하여 도입하는 것인, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 생산하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 셀레늄(selenium) 및 아스코르브산(ascorbic acid)을 더 포함하는 배지에서 계대배양하는 것인, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 생산하는 방법.
제 1항 내지 제 3항의 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 육모 촉진용 화장료 조성물.
제 1항 내지 제 3항의 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 육모 촉진용 약학적 조성물.