CN110538197A - 一种外泌体在治疗脱发的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种外泌体在治疗脱发的药物中的应用，该外泌体是将胶原蛋白转导入间充质干细胞外泌体中，试验证实，本发明提供的外泌体对脱发具有较好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞技术领域，特别涉及一种外泌体在治疗脱发的药物中的应用。
背景技术
外泌体是一类细胞外小囊泡，大小在30-100nm之间，几乎存在于所有的真核生物的体液中，并具有促进一系列细胞功能的作用。它们将DNAs、RNA和蛋白质等遗传信号平行转移到其它临近和远处的细胞，从而改变靶细胞的功能，外泌体通过交换遗传信息来充当干细胞的旁分泌调节因子，在干细胞治疗方面扮演着十分重要的作用，研究发现，外泌体具有促进皮肤创伤愈合的能力，但其治疗脱发的功效还未被研究过。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种外泌体在治疗脱发的药物中的应用。
一种外泌体在治疗脱发的药物中的应用，该外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入间充质干细胞外泌体内。
间充质干细胞外泌体包括人胎盘间充质干细胞外泌体、人脐带间充质干细胞外泌体和人羊水间充质干细胞外泌体中的一种或多种
进一步的改进，该外泌体由以下步骤制备而成：
(1)取间充质干细胞外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与胶原蛋白分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为240V-300V，电容为120μF-200μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体。
进一步的改进，电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾、脱氧核苷酸钠和HEPES，其中氯化钾在RPMI-1640培养基中的浓度为10-20mMol/L，脱氧核苷酸钠在RPMI-1640培养基中的浓度为5-7mMol/L，HEPES在RPMI-1640培养基中的浓度为30-50mMol/L。
本发明通过具体限定电转染缓冲液，能够进一步地提高外泌体的功效；其中，HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，RPMI-1640培养基的成分如下：
本发明还提供了一种生发剂，所述生发剂包括质量比为1-3:50-80的外泌体与辅料，所述外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入间充质干细胞外泌体内。
进一步地，外泌体在制备成生发剂前进行预处理制得外泌体纳米粒，所述预处理方法包括以下步骤：
S1通过冷冻干燥技术将外泌体处理为外泌体粉末；
S2取质量比为6-8:18-20的角鲨烷和碳酸二辛酯，混合均匀制得混合油相，将外泌体粉末加入混合油相中混合均匀，外泌体粉末在混合油相中的浓度为5-9mg/ml，制得油相溶液；
S3将酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱溶于90℃-95℃的水中，酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度分别为1-3mg/ml、8-10mg/ml、1-3mg/ml，制得水相溶液；
S4将油相溶液加入水相溶液中，所述油相与所述水相的体积比为2-6:10-12，用高剪切乳化剂以1000-1500rpm的转速乳化20-40min，制得初乳；
S5将初乳在40-50℃条件下高压乳匀，压力为500-1000bar，循环次数为3-5次，冷却至室温，干燥至粉末，即得外泌体纳米粒。
根据大量的临床试验证明：冻干粉中的细胞外泌体活性成分在破皮导入的条件下能达到最大的应用效果，破皮导入的方法包括微针、滚针、电光以及CO2介导法来在肌肤上产生微小伤口，当干细胞外泌体直接涂抹在肌肤表面上的时候，由于表面肌肤的角质层的阻隔作用而进入不了肌肤内层的目标细胞，即表皮层的肌底细胞，因此只有用介导方法破皮之后，外泌体才可以直接顺着细胞通道直达肌底细胞，发挥功效，但该操作过于麻烦，且大部分使用者无法自己使用介导方法破皮，因此在将外泌体制备成生发剂时存在较大的技术障碍，本发明在研究过程中发现，先将外泌体冻干成粉末，再将该外泌体粉末制备成纳米粒，不但增加了外泌体的稳定性，还提高了其透皮率，无需使用者进行破皮，正常使用即可达到较高的透皮率。
进一步地，辅料包括质量比为4-8:22-40:6-10:18-22的乳酸钠、维生素E、酪朊酸钠和水。
进一步的改进，生发剂还包括天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、免疫调节因子和抗氧因子，外泌体纳米粒与天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、免疫调节因子和抗氧因子的质量比为1-3:6-10:1-2:12-16:8-10。
其中，免疫调节因子包括转移因子、卡舒宁、胸腺肽、干扰素、白介素12、左旋咪唑中的一种或多种，抗氧因子包括超氧化物歧化酶、儿茶酚类、类黄酮中的一种或多种。
本发明通过加入以上成分，各成分与外泌体纳米粒配合，能够进一步提高生发剂的清洁能力，去屑效果好。
进一步的改进，生发剂的制备方法包括以下步骤：
A.将规定质量比的外泌体纳米粒、乳酸钠、酪朊酸钠、水、天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、免疫调节因子和抗氧因子在10-12℃条件下搅拌18-22min，搅拌速度为300-400r/min，制得混合液；
B.将维生素E加入步骤A制得的混合液中，常温下搅拌5-10min，搅拌速度为600-800r/min，升温至90-98℃继续搅拌40-50min，冷却至室温，即得生发剂。
本发明提供的外泌体可用于制备具有治疗脱发的生发剂。
本发明提供的外泌体对脱发具有较好的效果。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种外泌体，该外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入间充质干细胞外泌体内，该外泌体通过如下方法培养获得：
(1)取间充质干细胞外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与胶原蛋白分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为240V，电容为120μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体；
其中，电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾、脱氧核苷酸钠和HEPES，其中氯化钾在RPMI-1640培养基中的浓度为10mMol/L，脱氧核苷酸钠在RPMI-1640培养基中的浓度为5mMol/L，HEPES在RPMI-1640培养基中的浓度为30mMol/L；
其中，间充质干细胞外泌体为人羊水间充质干细胞外泌体。
实施例2
本实施例提供了一种外泌体，该外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入间充质干细胞外泌体内，该外泌体通过如下方法培养获得：
(1)取间充质干细胞外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与胶原蛋白分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为270V，电容为160μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体；
其中，电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾、脱氧核苷酸钠和HEPES，其中氯化钾在RPMI-1640培养基中的浓度为15mMol/L，脱氧核苷酸钠在RPMI-1640培养基中的浓度为6mMol/L，HEPES在RPMI-1640培养基中的浓度为40mMol/L；
其中，间充质干细胞外泌体为人胎盘间充质干细胞外泌体。
实施例3
本实施例提供了一种外泌体，该外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入间充质干细胞外泌体内，该外泌体通过如下方法培养获得：
(1)取间充质干细胞外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与胶原蛋白分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为300V，电容为200μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体；
其中，电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾、脱氧核苷酸钠和HEPES，其中氯化钾在RPMI-1640培养基中的浓度为20mMol/L，脱氧核苷酸钠在RPMI-1640培养基中的浓度为7mMol/L，HEPES在RPMI-1640培养基中的浓度为50mMol/L；
其中，间充质干细胞外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体。
实施例4
本实施例提供了一种生发剂，该生发剂为生发剂，由1g外泌体和50g辅料制备而成，辅料包括4g乳酸钠、22g维生素E、6g酪朊酸钠和18g水；
其中，外泌体是由实施例1的方法制得的；
其中，外泌体在制备成生发剂前进行预处理制得外泌体纳米粒，所述外泌体纳米粒包括外泌体、角鲨烷、碳酸二辛酯、酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱，所述预处理方法包括以下步骤：
S1通过冷冻干燥技术将外泌体处理为外泌体粉末；
S2取质量比为3:10的角鲨烷和碳酸二辛酯，混合均匀制得混合油相，将外泌体粉末加入混合油相中混合均匀，外泌体粉末在混合油相中的浓度为5mg/ml，制得油相溶液；
S3将酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱溶于90℃的水中，酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度分别为1mg/ml、8mg/ml、1mg/ml，制得水相溶液；
S4将油相溶液加入水相溶液中，所述油相与所述水相的体积比为1:6，用高剪切乳化剂以1000rpm的转速乳化20min，制得初乳；
S5将初乳在40℃条件下高压乳匀，压力为500bar，循环次数为3次，冷却至室温，干燥至粉末，即得外泌体纳米粒；
该生发剂的制备方法包括以下步骤：
A.将规定质量的外泌体纳米粒、乳酸钠、酪朊酸钠、水在10℃条件下搅拌18min，搅拌速度为300r/min，制得混合液；
B.将维生素E加入步骤A制得的混合液中，常温下搅拌5min，搅拌速度为600r/min，升温至90℃继续搅拌40min，冷却至室温，即得生发剂。
实施例5
本实施例提供了一种生发剂，该生发剂为生发剂，由2g外泌体和65g辅料制备而成，辅料包括6g乳酸钠、31g维生素E、8g酪朊酸钠和20g水；
其中，外泌体是由实施例2的方法制得的；
其中，外泌体在制备成生发剂前进行预处理制得外泌体纳米粒，外泌体纳米粒包括外泌体、角鲨烷、碳酸二辛酯、酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱，所述预处理方法包括以下步骤：
S1通过冷冻干燥技术将外泌体处理为外泌体粉末；
S2取质量比为7:19的角鲨烷和碳酸二辛酯，混合均匀制得混合油相，将外泌体粉末加入混合油相中混合均匀，外泌体粉末在混合油相中的浓度为7mg/ml，制得油相溶液；
S3将酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱溶于92℃的水中，酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度分别为2mg/ml、9mg/ml、2mg/ml，制得水相溶液；
S4将油相溶液加入水相溶液中，所述油相与所述水相的体积比为3:5，用高剪切乳化剂以1200rpm的转速乳化30min，制得初乳；
S5将初乳在45℃条件下高压乳匀，压力为800bar，循环次数为4次，冷却至室温，干燥至粉末，即得外泌体纳米粒；
该生发剂的制备方法包括以下步骤：
A.将规定质量的外泌体、乳酸钠、酪朊酸钠、水在11℃条件下搅拌20min，搅拌速度为350r/min，制得混合液；
B.将维生素E加入步骤A制得的混合液中，常温下搅拌8min，搅拌速度为700r/min，升温至94℃继续搅拌45min，冷却至室温，即得生发剂。
实施例6
本实施例提供了一种生发剂，该生发剂为生发剂，由3g外泌体和80g的辅料制备而成，辅料包括8g乳酸钠、40g维生素E、10g酪朊酸钠和22g水；
其中，外泌体是由实施例3的方法制得的；
其中，外泌体在制备成生发剂前进行预处理制得外泌体纳米粒，外泌体纳米粒包括外泌体、角鲨烷、碳酸二辛酯、酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱，所述预处理方法包括以下步骤：
S1通过冷冻干燥技术将外泌体处理为外泌体粉末；
S2取质量比为4:9的角鲨烷和碳酸二辛酯，混合均匀制得混合油相，将外泌体粉末加入混合油相中混合均匀，外泌体粉末在混合油相中的浓度为9mg/ml，制得油相溶液；
S3将酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱溶于95℃的水中，酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度分别为3mg/ml、10mg/ml、3mg/ml，制得水相溶液；
S4将油相溶液加入水相溶液中，所述油相与所述水相的体积比为3:5，用高剪切乳化剂以1500rpm的转速乳化40min，制得初乳；
S5将初乳在50℃条件下高压乳匀，压力为1000bar，循环次数为5次，冷却至室温，干燥至粉末，即得外泌体纳米粒；
该生发剂的制备方法包括以下步骤：
A.将规定质量的外泌体、乳酸钠、酪朊酸钠、水在12℃条件下搅拌22min，搅拌速度为400r/min，制得混合液；
B.将维生素E加入步骤A制得的混合液中，常温下搅拌10min，搅拌速度为800r/min，升温至98℃继续搅拌50min，冷却至室温，即得生发剂。
实施例7
本实施例提供了一种生发剂，该生发剂为生发剂，由1g外泌体纳米粒和50g辅料制备而成，辅料包括4g乳酸钠、22g维生素E、6g酪朊酸钠和18g水；
其中，外泌体是由实施例1的方法制得的；
外泌体纳米粒是由实施例4的方法制得的；
该生发剂还包括6g天然玻璃酸钠、1g成纤维细胞生长因子、12g转移因子和8g超氧化物歧化酶；
该生发剂的制备方法包括以下步骤：
A.将规定质量的外泌体、乳酸钠、酪朊酸钠、水、天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、白介素12和儿茶酚在10℃条件下搅拌18min，搅拌速度为300r/min，制得混合液；
B.将维生素E加入步骤A制得的混合液中，常温下搅拌5min，搅拌速度为60r/min，升温至90℃继续搅拌40min，冷却至室温，即得生发剂。
实施例8
本实施例提供了一种生发剂，该生发剂为生发剂，由2g外泌体纳米粒和65g辅料制备而成，辅料包括6g乳酸钠、31g维生素E、8g酪朊酸钠和20g水；
其中，外泌体是由实施例2的方法制得的；
外泌体纳米粒是由实施例5的方法制得的；
该生发剂还包括8g天然玻璃酸钠、1.5g成纤维细胞生长因子、14g卡舒宁和9g儿茶酚；
该生发剂的制备方法包括以下步骤：
A.将规定质量的外泌体、乳酸钠、酪朊酸钠、水、天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、白介素12和儿茶酚在11℃条件下搅拌20min，搅拌速度为350r/min，制得混合液；
B.将维生素E加入步骤A制得的混合液中，常温下搅拌8min，搅拌速度为700r/min，升温至94℃继续搅拌45min，冷却至室温，即得生发剂。
实施例9
本实施例提供了一种生发剂，该生发剂为生发剂，由3g外泌体纳米粒和80g的辅料制备而成，辅料包括8g乳酸钠、40g维生素E、10g酪朊酸钠和22g水；
其中，外泌体是由实施例3的方法制得的；
外泌体纳米粒是由实施例6的方法制得的；
该生发剂还包括10g天然玻璃酸钠、2g成纤维细胞生长因子、16g卡舒宁和10g儿茶酚；
该生发剂的制备方法包括以下步骤：
A.将规定质量的外泌体、乳酸钠、酪朊酸钠、水、天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、白介素12和儿茶酚在12℃条件下搅拌22min，搅拌速度为400r/min，制得混合液；
B.将维生素E加入步骤A制得的混合液中，常温下搅拌10min，搅拌速度为800r/min，升温至98℃继续搅拌50min，冷却至室温，即得生发剂。
对照例1
本对照例提供了一种外泌体，该外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入间充质干细胞外泌体内，该外泌体通过如下方法培养获得：
(1)取间充质干细胞外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与十肽-12分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为240V，电容为120μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体；
其中，电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾、脱氧核苷酸钠和HEPES，其中氯化钾在RPMI-1640培养基中的浓度为15mMol/L，脱氧核苷酸钠在RPMI-1640培养基中的浓度为6mMol/L，HEPES在RPMI-1640培养基中的浓度为40mMol/L；
其中，间充质干细胞为人胎盘间充质干细胞。
对照例2
本对照例提供了一种外泌体，该外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入间充质干细胞外泌体内，该外泌体通过如下方法培养获得：
(1)取间充质干细胞外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与胶原蛋白分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为240V，电容为120μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体；
其中，电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾、脱氧核苷酸钠和HEPES，其中氯化钾在RPMI-1640培养基中的浓度为15mMol/L，脱氧核苷酸钠在RPMI-1640培养基中的浓度为6mMol/L，HEPES在RPMI-1640培养基中的浓度为40mMol/L；
其中，间充质干细胞外泌体为骨髓间充质干细胞外泌体。
对照例3
本对照例提供了一种外泌体，该外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入间充质干细胞外泌体内，该外泌体通过如下方法培养获得：
(1)取间充质干细胞外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与胶原蛋白分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为240V-300V，电容为120μF-200μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体；
其中，电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾、脱氧核苷酸钠和HEPES，其中氯化钾在RPMI-1640培养基中的浓度为15mMol/L，脱氧核苷酸钠在RPMI-1640培养基中的浓度为6mMol/L，HEPES在RPMI-1640培养基中的浓度为40mMol/L；
其中，间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
对照例4
本对照例提供了一种外泌体，该外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入毛乳头细胞外泌体内，该外泌体通过如下方法培养获得：
(1)取毛乳头细胞外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与胶原蛋白分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为240V-300V，电容为120μF-200μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体；
其中，电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾、脱氧核苷酸钠和HEPES，其中氯化钾在RPMI-1640培养基中的浓度为15mMol/L，脱氧核苷酸钠在RPMI-1640培养基中的浓度为6mMol/L，HEPES在RPMI-1640培养基中的浓度为40mMol/L。
对照例5
本对照例提供了一种外泌体，该外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入人胚胎干细胞来源的外泌体内，该外泌体通过如下方法培养获得：
(1)取人胚胎干细胞来源的外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与胶原蛋白分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为240V-300V，电容为120μF-200μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体；
其中，电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾、脱氧核苷酸钠和HEPES，其中氯化钾在RPMI-1640培养基中的浓度为15mMol/L，脱氧核苷酸钠在RPMI-1640培养基中的浓度为6mMol/L，HEPES在RPMI-1640培养基中的浓度为40mMol/L。
对照例6
本对照例提供了一种外泌体，该外泌体通过如下方法培养获得：
(1)取间充质干细胞外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与胶原蛋白分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为240V，电容为120μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体；
其中，电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾、三磷酸腺苷和PBS，其中氯化钾在RPMI-1640培养基中的浓度为15mMol/L，三磷酸腺苷在RPMI-1640培养基中的浓度为6mMol/L，PBS在RPMI-1640培养基中的浓度为40mMol/L；
其中，间充质干细胞为人胎盘间充质干细胞。
对照例7
本对照例提供了一种外泌体，该外泌体通过如下方法培养获得：
(1)取间充质干细胞外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与胶原蛋白分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为200V，电容为100μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体；
其中，电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾、脱氧核苷酸钠和HEPES，其中氯化钾在RPMI-1640培养基中的浓度为15mMol/L，脱氧核苷酸钠在RPMI-1640培养基中的浓度为6mMol/L，HEPES在RPMI-1640培养基中的浓度为40mMol/L；
其中，间充质干细胞为人胎盘间充质干细胞。
对照例8
本对照例提供了一种生发剂，该生发剂为生发剂，由2g外泌体纳米粒和65g辅料制备而成，辅料包括6g乳酸钠、31g维生素E、8g酪朊酸钠和20g水；
其中，外泌体是由实施例2的方法制得的；
外泌体纳米粒是由实施例4的方法制得的；
该生发剂还包括8g天然玻璃酸钠、1.5g成纤维细胞生长因子、14g白介素12；
该生发剂的制备方法包括以下步骤：
A.将规定质量的外泌体、乳酸钠、酪朊酸钠、水、天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、白介素12在11℃条件下搅拌20min，搅拌速度为350r/min，制得混合液；
B.将维生素E加入步骤A制得的混合液中，常温下搅拌8min，搅拌速度为700r/min，升温至94℃继续搅拌45min，冷却至室温，即得生发剂。
对照例9
本对照例提供了一种生发剂，该生发剂为生发剂，由2g外泌体和65g辅料制备而成，辅料包括6g乳酸钠、31g维生素E、8g酪朊酸钠和20g水；
其中，外泌体是由实施例2的方法制得的；
外泌体纳米粒是由实施例4的方法制得的；
该生发剂还包括8g天然玻璃酸钠、1.5g成纤维细胞生长因子和9g儿茶酚，；
该生发剂的制备方法包括以下步骤：
A.将规定质量的外泌体、乳酸钠、酪朊酸钠、水、天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子和儿茶酚在11℃条件下搅拌20min，搅拌速度为350r/min，制得混合液；
B.将维生素E加入步骤A制得的混合液中，常温下搅拌8min，搅拌速度为700r/min，升温至94℃继续搅拌45min，冷却至室温，即得生发剂。
对照例10
本对照例提供了一种生发剂，该生发剂为生发剂，由2g外泌体和65g辅料制备而成，辅料包括6g乳酸钠、31g维生素E、8g酪朊酸钠和20g水；
其中，外泌体是由实施例2的方法制得的；
外泌体纳米粒是由实施例4的方法制得的；
该生发剂还包括8g天然玻璃酸钠和9g儿茶酚；
该生发剂的制备方法包括以下步骤：
A.将规定质量的外泌体、乳酸钠、酪朊酸钠、水、天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、白介素12和儿茶酚在11℃条件下搅拌20min，搅拌速度为350r/min，制得混合液；
B.将维生素E加入步骤A制得的混合液中，常温下搅拌8min，搅拌速度为700r/min，升温至94℃继续搅拌45min，冷却至室温，即得生发剂。
试验例1治疗脱发效果测定
随机选取60名正在脱发的一般性脱发患者，男女各半，分为试验1-5组，对照1-7组，阳性1-3组，每组4个人，两男两女，试验1-5组分别使用时实施例2-6的生发剂和对照例的1-5的外泌体涂抹头皮，对照1-7组分别使用对照例1-7的外泌体，对照例1-7的外泌体使用前使用实施例4的方法制备成生发剂，阳性1-3组分别使用中国专利CN201810135519、中国专利CN201811161456、中国专利CN201680070188提供的产品，试验1-5组和对照1-7组生发剂的使用方法为：使用前将头发和头皮洗干净，实施例2的外泌体使用时将患者的头皮通过介导方法破皮，再将外泌体涂抹在头皮上，其他各组均是将外泌体或生发剂均匀地涂抹于头皮上，并按摩头皮20min，最后用清水将头皮冲洗干净，每隔3天使用一次，阳性1-3组分别按照其各自的使用方法操作，各组试验时间均为60天，观察各组志愿者头发的生长情况，各组均取平均值，结果见表1。
表1.各组外泌体或生发剂对脱发的治疗效果
由表1可知，由于实施例2采用介导方法破皮，因此，对脱发的治疗效果与实施例4-6的生发剂相差不大，而实施例3则是直接将外泌体涂抹于头皮上并按摩，其对脱发的治疗效果较实施例2相差较大，证明本发明提供的外泌体具有治疗脱发的效果，但患者使用时需配合破皮，否则疗程将会延长，而本发明通过进一步将外泌体制备成生发剂，能够提高外泌体的透皮率，显著地提高其治疗脱发的效果；对照例1用十肽-12代替了本发明的胶原蛋白，其治疗脱发的效果随之消失，可见，外泌体必须在导入胶原蛋白时才具有治疗脱发的功效，而对照例2和3分别使用骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞代替了本发明的人胎盘间充质干细胞、人脐带间充质干细胞或人羊水间充质干细胞，其治疗效果也微乎其微，证明只有特定的这三种细胞来源的外泌体中导入胶原蛋白才具有治疗脱发的功效，对照例4-5分别将间充质干细胞外泌体用其他外泌体代替，其治疗脱发的效果大幅度降低，对照例6-7分别改变了本发明的外泌体的制备方法，制得的外泌体治疗脱发的功效也大打折扣，且阳性1-3组治疗脱发的效果也显著低于试验1-5组的效果，由此可见，本发明提供的外泌体的制备方法也能够显著提高转导的效果，进而提高外泌体治疗脱发的效果。
试验例2外泌体的稳定性测定
取实施例1-3的外泌体和实施例4-6的生发剂，测定各组外泌体或生发剂的CD29和CD73的表达，常温下放置6个月，再次分别测定各组外泌体和生发剂的CD29和CD73的表达，结果发现，实施例4-6的生发剂的CD29和CD73表达基本不变，而实施例1-3的外泌体的CD29和CD73表达有明显变化，证明本发明将外泌体制备成生发剂后能够显著提高其稳定性。
试验例3各组生发剂去屑效果的测定
取实施例6-9和对照例8-10的生发剂各3个平行样品，测试各组生发剂的去屑效果，测试结果见表2。
表2.各组生发剂去屑效果测试结果
由表2可知，实施例7-9的生发剂的去屑等级由于实施例6，证明本申请通过加入天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、免疫调节因子和抗氧因子，能够显著提高生发剂的去屑效果，而对照例8-10删除个别成分后，其去屑效果均有下降。
综上，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。
Claims (10)
1.一种外泌体在治疗脱发的药物中的应用，其特征在于，所述外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入间充质干细胞外泌体内。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体包括人胎盘间充质干细胞外泌体、人脐带间充质干细胞外泌体和人羊水间充质干细胞外泌体中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外泌体由以下步骤制备而成：
(1)取间充质干细胞外泌体，均匀地溶解于PBS缓冲液中，制得A液；
(2)将步骤(1)制得的A液与胶原蛋白分别加入到电穿孔皿中，采用电穿孔仪对其进行电穿孔转导，制得B液；
(3)将步骤(2)制得的B液用PBS缓冲液进行洗涤，再用电转染缓冲液重悬沉淀，转染时的电压为240V-300V，电容为120μF-200μF，即得具有治疗脱发功效的外泌体。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述电转染缓冲液包括RPMI-1640培养基和添加入所述RPMI-1640培养基中的氯化钾、脱氧核苷酸钠和HEPES，其中所述氯化钾在所述RPMI-1640培养基中的浓度为10-20mMol/L，所述脱氧核苷酸钠在所述RPMI-1640培养基中的浓度为5-7mMol/L，所述HEPES在所述RPMI-1640培养基中的浓度为30-50mMol/L。
5.一种生发剂，其特征在于，所述生发剂包括质量比为1-3:50-80的外泌体与辅料，所述外泌体的制备方法是将胶原蛋白转导入间充质干细胞外泌体内。
6.如权利要求5所述的生发剂，其特征在于，所述外泌体在制备成生发剂前进行预处理制得外泌体纳米粒，所述外泌体纳米粒包括外泌体、角鲨烷、碳酸二辛酯、酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱，所述预处理方法包括以下步骤：
S1通过冷冻干燥技术将外泌体处理为外泌体粉末；
S2取质量比为6-8:18-20的角鲨烷和碳酸二辛酯，混合均匀制得混合油相，将外泌体粉末加入混合油相中混合均匀，外泌体粉末在混合油相中的浓度为5-9mg/ml，制得油相溶液；
S3将酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱溶于90℃-95℃的水中，酚醚磷酸酯、甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度分别为1-3mg/ml、8-10mg/ml、1-3mg/ml，制得水相溶液；
S4将油相溶液加入水相溶液中，所述油相与所述水相的体积比为2-6:10-12，用高剪切乳化剂以1000-1500rpm的转速乳化20-40min，制得初乳；
S5将初乳在40-50℃条件下高压乳匀，压力为500-1000bar，循环次数为3-5次，冷却至室温，干燥至粉末，即得外泌体纳米粒。
7.如权利要求6所述的生发剂，其特征在于，所述辅料包括质量比为4-8:22-40:6-10:18-22的乳酸钠、维生素E、酪朊酸钠和水。
8.如权利要求7所述的生发剂，其特征在于，所述生发剂还包括天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、免疫调节因子和抗氧因子，所述外泌体纳米粒与所述天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、免疫调节因子和抗氧因子的质量比为1-3:6-10:1-2:12-16:8-10。
9.如权利要求8所述的生发剂，其特征在于，所述生发剂的制备方法包括以下步骤：
A.将规定质量比的外泌体纳米粒、乳酸钠、酪朊酸钠、水、天然玻璃酸钠、成纤维细胞生长因子、免疫调节因子和抗氧因子在10-12℃条件下搅拌18-22min，搅拌速度为300-400r/min，制得混合液；
B.将维生素E加入步骤A制得的混合液中，常温下搅拌5-10min，搅拌速度为600-800r/min，升温至90-98℃继续搅拌40-50min，冷却至室温，即得生发剂。
10.权利要求1所述的外泌体在制备具有治疗脱发的生发剂中的应用。
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