CN111544373A - 一种含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液及其制备方法,包括毛乳头细胞来源外泌体纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂、抗氧剂和水。该生发液以毛乳头细胞来源的外泌体纳米粒为主要功效成分,搭配稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂、抗氧剂等,能使毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的功效最大化。本发明先将外泌体冻干成粉末再将其制备成纳米颗粒应用于生发液中,正常使用就能获得较高的透皮率、较好的稳定性和技术效果,其中稳定剂和头皮吸收促进剂的添加,能与毛乳头细胞来源的外泌体纳米颗粒在增加透皮率和稳定性方面产生协同增效效果。与现有技术常用的药物米诺地尔相比具有相当或者更好的功效,生物安全性很高。
Description
技术领域
本发明属于生物细胞技术领域,涉及一种生发液及其制备方法,尤其涉及一种含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液及其制备方法。
背景技术
头发是个人美的象征,在日常生活中起着至关重要的作用。然而,随着现代人生活、学业和工作压力的增加,越来越多的人受到脱发的困扰,在所有造成脱发的病因中,雄激素脱发(Androgenic alopecia,AGA)最为常见。目前,针对脱发治疗的手段主要包括药物治疗和手术治疗。其中,FDA批准正式用于雄激素脱发的治疗药物是口服非那雄胺和外用米诺地尔。手术治疗即为毛发移植手术,根据术式分为毛囊单位移植术和毛囊单位提取移植术,原理是将后枕部优势供区的毛囊提取移植到秃发部位。但是传统的脱发治疗手段存在着局限性:比如药物治疗对于某些人效果不佳,非那雄胺可能引起抬举困难、阳痿等副作用;手术治疗受限于供区的毛囊单位,对于终末期脱发无能为力。因此,需要一种新的替代治疗方案来改善这一现状。
CN105078827A公开了一种含有苦参提取物的养发生发液,配方为:含具有占养发生发液重量0.0001%至10%的苦参提取物;占养发生发液重量0.001%至5%的日扁柏素;占养发生发液重量0.01%至10%的烟酰胺。通过以上三种活性物质的组合起到活化发根,强健发根,促进头发生长和防脱发的效果。三种活性成份具有协同促进头发生长和防脱发的效果,与单一活性成份相比具有更好的养发生发的效果。
CN104435358A公开了一种植物防脱育发生发液,包括以下重量份原料的有效成分:人参50-100份、银杏叶50-100份、菟丝子30-150份、补骨脂40-200份、甘草20-90份、枸杞子60-150份、绞股蓝30-110份、川芎30-100份、啤酒花40-100份和灵芝30-60份。该植物防脱育发生发液利用各种中药成份的相互协同作用,能够改变头部血液循环、激活毛囊、实现头发的快速止脱、修复。
现有技术中公开的养发生发类产品主要以中药或中药提取物为有效活性成分,虽对激活毛囊和促进头发生长有一定的效果,但效果还很有限,不能实现标本兼治的效果。
外泌体是细胞分泌产物,它是一种直径约为50-15nm的脂质双层膜包围调节蛋白、mRNA、miRNA等结构的微小囊泡。外泌体从母细胞分离而来与母细胞有高度同源性,并携带母细胞合成生物信息,在细胞间信号交流中扮演着重要角色。尽管,在其他领域,干细胞来源的外泌体治疗作用已被大量报道,而在皮肤领域,这一研究还相对欠缺。有研究报道,上皮角质细胞来源的外泌体可以促进皮肤色素沉着,促进创伤修复和抑制瘢痕形成。在毛囊方向,间充质干细胞来源的外泌体能促进鼠背毛从休止期进入生长期。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种生发液及其制备方法,尤其提供一种含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液及其制备方法。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液,所述生发液包括毛乳头细胞来源外泌体纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂、抗氧剂和水。
本发明所涉及的生发液以毛乳头细胞来源的外泌体纳米粒为主要功效成分,搭配以稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂、抗氧剂,各成分科学合理搭配,能使毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的功效最大化。该生发液能够促进毛母质细胞的增殖活性和迁移活性,能够显著改善脱发严重患者的头油感和脱发现象,促进新生头发的生长。与现有技术常用的药物米诺地尔相比具有相当或者更好的功效,且生物安全性很高。
当毛乳头细胞来源的外泌体直接涂抹于头皮表面的时候,由于表面肌肤角质层的阻隔作用进入不了表皮层的肌底细胞;同时,外泌体本身的稳定性不佳,其在体内的停留时间较短,需要高频次给药,从而限制了它的应用。基于此,本发明先将外泌体冻干成粉末再将其制备成纳米颗粒应用于生发液中,即能克服上述弊端,正常使用就能获得较高的透皮率、较好的稳定性和技术效果。
另外,本发明所涉及的生发液还添加有稳定剂和头皮吸收促进剂,在增加透皮率和稳定性与毛乳头细胞来源的外泌体纳米颗粒协同增效,以获得更好的生发效果。
优选地,所述生发液以质量份数计包括毛乳头细胞来源外泌体纳米粒1-10份、稳定剂2-10份、保湿剂1-5份、头皮吸收促进剂1-5份、氧化剂1-2份和水100份。
本发明所涉及的生发液中各成分若以上述特定的质量配比进行组合,无论是对毛母质细胞的增殖和迁移促进效果,还是改善脱发的效果,都是更优的。
所述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的质量份数可以为1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或10份等,上述范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
所述稳定剂的质量份数可以为2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或10份等,上述范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
所述保湿剂的质量份数可以为1份、2份、3份、4份或5份等,上述范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
所述头皮吸收促进剂的质量份数可以为1份、2份、3份、4份或5份等,上述范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
所述氧化剂的质量份数可以为1份、1.2份、1.5份、1.8份或2份等,上述范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒为低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒,所述低代指1-3代,例如1代、2代或3代。本发明研究发现将低代的毛乳头细胞来源外泌体添加入本发明生发液,相比于高代具有更好的效果。
优选地,所述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的制备原料包括毛乳头细胞来源外泌体、碳酸二辛酯、甘草甜素和椰油酰胺基丙基甜菜碱。
本发明在众多的稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和抗氧剂中甄选出下述几种特定的类型,研究表明,下述特定类型的配合使得生发液的生发效果更佳。
优选地,所述稳定剂包括透明质酸钠、羧甲基壳聚糖或羟乙基淀粉中的任意一种或至少两种的组合;所述至少两种的组合例如透明质酸钠和羧甲基壳聚糖的组合、羧甲基壳聚糖和羟乙基淀粉的组合等,其他任意的组合方式均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述保湿剂包括丙二醇和/或甘油。
优选地,所述头皮吸收促进剂包括月桂氮卓酮、二甲基亚砜或薄荷醇中的任意一种或至少两种的组合;所述至少两种的组合例如月桂氮卓酮和二甲基亚砜的组合、二甲基亚砜和薄荷醇的组合等,其他任意的组合方式均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述抗氧剂包括柠檬酸、酒石酸或抗坏血酸中的任意一种或至少两种的组合,所述至少两种的组合例如柠檬酸和酒石酸的组合、酒石酸和抗坏血酸的组合等,其他任意的组合方式均可选择,在此便不再一一赘述。
另一方面,本发明提供一种如上所述的含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
(1)将毛乳头细胞来源外泌体纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合,搅拌,得到混合液;
(2)将步骤(1)得到的混合液与抗氧剂混合,搅拌,得到所述含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液。
优选地,步骤(1)所述搅拌在4-10℃(例如4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃等)下进行,搅拌的时间为30-50min(例如30min、35min、40min、45min或50min等),搅拌的速度为200-400r/min(例如200r/min、250r/min、300r/min、350r/min或400r/min等);上述数值范围内的具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,步骤(2)所述搅拌是指先在15-25℃(例如15℃、18℃、20℃、22℃或25℃等)下搅拌10-15min(例如10min、11min、12min、13min、14min或15min等),再升温至70-80℃(例如70℃、72℃、75℃、78℃或80℃等)下搅拌25-40min(例如25min、30min、35min或40min等),搅拌的速度为600-800r/min(例如600r/min、650r/min、700r/min、750r/min或800r/min等)。上述数值范围内的具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
在本发明中,步骤(1)所述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的制备方法包括如下步骤:
(Ⅰ)将毛乳头细胞来源外泌体经冷冻干燥制成毛乳头细胞来源外泌体粉末;
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)得到的毛乳头细胞来源外泌体粉末与碳酸二辛酯混合,制成油相溶液;将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合,制得水相溶液;
(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)制得的油相溶液与水相溶液混合,并进行高速剪切乳化,制得初乳;
(Ⅳ)将步骤(Ⅲ)制得的初乳进行高压乳化,冷却,干燥,得到所述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒。
优选地,步骤(Ⅱ)所述毛乳头细胞来源外泌体粉末在碳酸二辛酯中的浓度为20-30mg/mL,例如20mg/mL、22mg/mL、25mg/mL、28mg/mL或30mg/mL等,上述数值范围内的具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,步骤(Ⅱ)所述甘草甜素在水中的浓度为3-5mg/mL,例如3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL或5mg/mL等,上述数值范围内的具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,步骤(Ⅱ)所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为1-3mg/mL,例如1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL或3mg/mL等,上述数值范围内的具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,步骤(Ⅲ)所述油相溶液与水相溶液的体积比为1:(3-7),例如1:3、1:4、1:5、1:6或1:7等,上述数值范围内的具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,步骤(Ⅲ)所述高速剪切乳化的转速为1500-2000r/min,例如1500r/min、1600r/min、1700r/min、1800r/min、1900r/min或2000r/min等,时间为30-40min,例如30min、32min、35min、38min或40min等,上述数值范围内的具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,步骤(Ⅳ)所述高压乳化的温度为40-50℃,例如40℃、42℃、45℃、48℃或50℃等,压力为800-1000bar,例如800bar、850bar、900bar、950bar或1000bar等,上述数值范围内的具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
作为本发明的优选技术方案,所述含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液的制备方法具体包括如下步骤:
(1)将毛乳头细胞来源外泌体经冷冻干燥制成毛乳头细胞来源外泌体粉末;
(2)将步骤(1)得到的毛乳头细胞来源外泌体粉末与碳酸二辛酯混合,所述毛乳头细胞来源外泌体粉末在碳酸二辛酯中的浓度为20-30mg/mL,制成油相溶液;
(3)将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合,所述甘草甜素在水中的浓度为3-5mg/mL,所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为1-3mg/mL,制得水相溶液;
(4)将制得的油相溶液与水相溶液以体积比为1:(3-7)混合,并进行高速剪切乳化,转速为1500-2000r/min,时间为30-40min,制得初乳;
(5)将步骤(4)制得的初乳进行高压乳化,温度为40-50℃,压力为800-1000bar,冷却,干燥,得到毛乳头细胞来源外泌体纳米粒;
(6)将毛乳头细胞来源外泌体纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合,在4-10℃下搅拌30-50min,搅拌的速度为200-400r/min,得到混合液;
(7)将步骤(6)得到的混合液与抗氧剂混合,先在15-25℃下搅拌10-15min,再升温至70-80℃下搅拌25-40min,搅拌的速度为600-800r/min,得到所述含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明所涉及的生发液以毛乳头细胞来源的外泌体纳米粒为主要功效成分,搭配以稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂、抗氧剂,各成分科学合理搭配,能使毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的功效最大化。本发明先将外泌体冻干成粉末再将其制备成纳米颗粒应用于生发液中,正常使用就能获得较高的透皮率、较好的稳定性和技术效果,其中稳定剂和头皮吸收促进剂的添加,能与毛乳头细胞来源的外泌体纳米颗粒在增加透皮率和稳定性方面产生协同增效效果。该生发液能够促进毛母质细胞的增殖活性和迁移活性,能够显著改善脱发严重患者的头油感和脱发现象,促进新生头发的生长。使用本发明所涉及的产品最快15天脱发处即可长出新生头发,第60天平均脱发量为84根,头油感第7天得到明显改善。与现有技术常用的药物米诺地尔相比具有相当或者更好的功效,且生物安全性很高。
附图说明
图1是分离得到的人头皮毛乳头细胞的显微观察图(标尺为500μm);
图2是提取到的人头皮毛乳头细胞外泌体的扫描电镜图(标尺为50nm)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
组织来源:经南方医科大学医学伦理委员会批准,对经知情同意接受整容手术的患者进行头皮和毛囊标本采集,放入冰林格液中转移至实验室做下一步分离处理。
制备例1
人头皮毛乳头细胞的分离和培养:
(1)取毛发移植术后废弃的人头皮毛囊(患者签字同意),离体标本获取后立即置入盛有冰生林格液的无菌离心管中,并迅速转移至实验室。人头皮组织需要在显微镜下分离毛囊,用显微剪剪下毛球后移至新的PBS培养皿中。
(2)收集所有切下的毛乳头后用新鲜PBS洗三次。用注射器在显微镜下小心吸弃PBS清洗液,注意不要吸走毛乳头。用0.2%的I型胶原酶消化毛乳头,在37℃的细胞培养箱中消化1.5h后,在显微镜下可以看到部分黑色的毛乳头细胞从白色真皮鞘中分离脱出,这时可用移液枪吹打并继续消化至毛乳头细胞完全脱出。
(3)用完全培养基(DMEM+10%FBS)终止消化,800r/min离心5min,弃上清,用含双抗的PBS重悬,并在1000r/min离心3min并弃上清,重复上一步骤两次,最后用3mL完全培养基重悬后移入25cm2细胞培养瓶中培养,3天后可见细胞完全贴壁,每隔两天换一次液。待培养一周后毛乳头细胞迁出较多,长满培养瓶的70%左右时可以传代培养。
对培养3天的人头皮毛乳头细胞进行显微镜观察,如图1所示(标尺为500μm):人头皮毛乳头细胞呈同心圆聚集性生长。同心圆中间是折光性差的未迁出毛乳头,周围围绕迁出及增殖的毛乳头细胞。细胞呈半透明的长梭形,在接种3天后完全贴壁,外观类似于真皮成纤维细胞。
制备例2
低代人毛乳头细胞外泌体的提取:
当3代或5代人头皮毛乳头细胞在25cm2培养瓶中长到90%融合时,把培养基换成5mL含无胎牛血清的低糖DMEM培养基培养3天后,将其转移到50mL高速离心机专用离心管中,2000g,4℃离心20min。取出上清液,并将其转移到适用于超离心转子的聚乙二醇管中。用防水标记标记每个超速离心管的一侧,将管子置于转子上,标记面朝上,并以10000g,4℃离心30min,然后将上清液转移到与上述相同尺寸的聚乙二醇管中,4℃离心1h,离心力为100000g,彻底清除上清液,使用微量移液器将每个管中的沉淀重悬于l mL PBS中。
对提取到的3代人毛乳头细胞外泌体进行扫描电镜观察,如图2所示(标尺为50nm)。并采用Nanosight NS300(Malvern PanaCyticcC英国)对外泌体的粒径进行检测,获得并分析了三个单独的测量结果,重复实验3次,结果显示:平均直径在93.2±15.6nm。
实施例1
本实施例提供一种生发液,其包括低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒5份、稳定剂2份(透明质酸钠1份、羧甲基壳聚糖1份)、保湿剂(丙二醇)3份、头皮吸收促进剂2份(二甲基亚砜1份、薄荷醇1份)、抗氧剂1份(柠檬酸)和水100份。
其中,低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的制备方法为:
(1)将制备例2制得的3代毛乳头细胞来源外泌体经冷冻干燥制成毛乳头细胞来源外泌体粉末;
(2)将步骤(1)得到的毛乳头细胞来源外泌体粉末与碳酸二辛酯混合,所述毛乳头细胞来源外泌体粉末在碳酸二辛酯中的浓度为25mg/mL,制成油相溶液;
(3)将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合,所述甘草甜素在水中的浓度为4mg/mL,所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为2mg/mL,制得水相溶液;
(4)将制得的油相溶液与水相溶液以体积比为1:5混合,并进行高速剪切乳化,转速为2000r/min,时间为30min,制得初乳;
(5)将步骤(4)制得的初乳进行高压乳化,温度为45℃,压力为1000bar,冷却,干燥,得到毛乳头细胞来源外泌体纳米粒。
所述生发液的制备方法为:
(1)将上述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合,在8℃下搅拌40min,搅拌的速度为200r/min,得到混合液;
(2)将步骤(1)得到的混合液与抗氧剂混合,先在20℃下搅拌10min,再升温至80℃下搅拌30min,搅拌的速度为800r/min,得到所述生发液。
实施例2
本实施例提供一种生发液,其包括低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒10份、稳定剂10份(羟乙基淀粉5份、羧甲基壳聚糖5份)、保湿剂4份(丙二醇2份、甘油2份)、头皮吸收促进剂4份(二甲基亚砜1份、薄荷醇3份)、抗氧剂1份(柠檬酸)和水100份。
其中,低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的制备方法为:
(1)将制备例2制得的3代毛乳头细胞来源外泌体经冷冻干燥制成毛乳头细胞来源外泌体粉末;
(2)将步骤(1)得到的毛乳头细胞来源外泌体粉末与碳酸二辛酯混合,所述毛乳头细胞来源外泌体粉末在碳酸二辛酯中的浓度为30mg/mL,制成油相溶液;
(3)将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合,所述甘草甜素在水中的浓度为5mg/mL,所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为1mg/mL,制得水相溶液;
(4)将制得的油相溶液与水相溶液以体积比为1:6混合,并进行高速剪切乳化,转速为1500r/min,时间为40min,制得初乳;
(5)将步骤(4)制得的初乳进行高压乳化,温度为50℃,压力为800bar,冷却,干燥,得到毛乳头细胞来源外泌体纳米粒。
所述生发液的制备方法为:
(1)将上述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合,在10℃下搅拌30min,搅拌的速度为400r/min,得到混合液;
(2)将步骤(1)得到的混合液与抗氧剂混合,先在25℃下搅拌10min,再升温至75℃下搅拌40min,搅拌的速度为700r/min,得到所述生发液。
实施例3
本实施例提供一种生发液,其包括低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒2份、稳定剂1份(羟乙基淀粉1份)、保湿剂2份(丙二醇2份)、头皮吸收促进剂2份(月桂氮卓酮1份、薄荷醇1份)、抗氧剂1份(酒石酸)和水100份。
其中,低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的制备方法为:
(1)将制备例2制得的3代毛乳头细胞来源外泌体经冷冻干燥制成毛乳头细胞来源外泌体粉末;
(2)将步骤(1)得到的毛乳头细胞来源外泌体粉末与碳酸二辛酯混合,所述毛乳头细胞来源外泌体粉末在碳酸二辛酯中的浓度为20mg/mL,制成油相溶液;
(3)将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合,所述甘草甜素在水中的浓度为3mg/mL,所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为3mg/mL,制得水相溶液;
(4)将制得的油相溶液与水相溶液以体积比为1:5混合,并进行高速剪切乳化,转速为1500r/min,时间为30min,制得初乳;
(5)将步骤(4)制得的初乳进行高压乳化,温度为40℃,压力为800bar,冷却,干燥,得到毛乳头细胞来源外泌体纳米粒。
所述生发液的制备方法为:
(1)将上述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合,在10℃下搅拌30min,搅拌的速度为400r/min,得到混合液;
(2)将步骤(1)得到的混合液与抗氧剂混合,先在25℃下搅拌10min,再升温至75℃下搅拌40min,搅拌的速度为700r/min,得到所述生发液。
实施例4
本实施例提供一种生发液,其包括毛乳头细胞来源外泌体纳米粒5份、稳定剂2份(透明质酸钠1份、羧甲基壳聚糖1份)、保湿剂(丙二醇)3份、头皮吸收促进剂2份(二甲基亚砜1份、薄荷醇1份)、抗氧剂1份(柠檬酸)和水100份。
其中,毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的制备方法与实施例1的区别仅在于:采用制备例2提取到的5代毛乳头细胞来源外泌体进行制备,其他条件均保持一致。
所述生发液的制备方法与实施例1保持一致。
实施例5
本实施例提供一种生发液,其包括低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒15份、稳定剂2份(透明质酸钠1份、羧甲基壳聚糖1份)、保湿剂(丙二醇)3份、头皮吸收促进剂2份(二甲基亚砜1份、薄荷醇1份)、抗氧剂1份(柠檬酸)和水100份。
其中,低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的制备方法参照实施例1。
所述生发液的制备方法参照实施例1。
实施例6
本实施例提供一种生发液,其包括低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒0.3份、稳定剂2份(透明质酸钠1份、羧甲基壳聚糖1份)、保湿剂(丙二醇)3份、头皮吸收促进剂2份(二甲基亚砜1份、薄荷醇1份)、抗氧剂1份(柠檬酸)和水100份。
其中,低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的制备方法参照实施例1。
所述生发液的制备方法参照实施例1。
对比例1
本对比例提供一种生发液,其配方组成与实施例1的区别仅在于:不将低代毛乳头细胞来源外泌体预处理成纳米颗粒形式,而是直接使用低代毛乳头细胞来源外泌体进行制备,外泌体有效添加量与实施例1保持一致。其他成分和添加量均保持一致。
所述生发液的制备方法为:
(1)将制备例2制得的3代毛乳头细胞来源外泌体(与实施例1的有效添加量一致)、稳定剂2份(透明质酸钠1份、羧甲基壳聚糖1份)、保湿剂(丙二醇)3份、头皮吸收促进剂2份(二甲基亚砜1份、薄荷醇1份)、表面活性剂(椰油酰胺基丙基甜菜碱)2份和水混合,在8℃下搅拌40min,搅拌的速度为200r/min,得到混合液;
(2)将步骤(1)得到的混合液与抗氧剂1份(柠檬酸)混合,先在20℃下搅拌10min,再升温至80℃下搅拌30min,搅拌的速度为800r/min,得到所述生发液。
对比例2
本对比例提供一种生发液,其配方组成与实施例1的区别仅在于:不含有头皮吸收促进剂,其他成分及添加量均保持一致。
其中,低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的制备方法参照实施例1。
所述生发液的制备方法参照实施例1。
评价试验:
(1)对人毛母质细胞增殖促进效果的评价
将3代人毛母质细胞(购于ScienCe∣L美国)接种至96孔酶标板中培养,每孔接种1×105个细胞,分别将100μL实施例1-6和对比例1-2制得的生发液产品与人毛母质细胞(100μL培养基)在37℃进行共孵育。用CCK8试剂盒检测细胞活性,以添加PBS缓冲液为阴性对照,分别于培养24h、36h、48h后进行检测。检测前将板内溶液更换成DMEM培养基(200μL/孔)加入CCK8检测剂(10μL/孔)后将酶标板置于37℃孵箱避光孵育1h。在酶标仪上测量450nm处吸光度即OD值,每组测6个复孔。记录数据并根据所得数据进行统计学分析,实验重复3次,最终结果以平均值来呈现。
细胞增殖活力的计算公式为:[(A1-A0)/(A2-A0)]×100%,其中A1表示具有细胞和样品液的孔的吸光度;A0表示具有培养基而没有细胞的孔的吸光度;A2表示具有细胞和PBS缓冲液的孔的吸光度。结果如表1所示:
表1
由表1数据可知:本发明所涉及的生发液对人毛母质细胞具有显著的增殖促进效果,且生发液中毛乳头细胞来源外泌体的含量、存在形式,毛乳头细胞代数等因素均会影响增殖促进效果。
(2)对人毛母质细胞细胞迁移活性的影响评价
将人毛母质细胞(购于ScienCe∣L美国)以6.0×105细胞/孔的密度接种到6孔板中。划痕是在融合单层细胞上用塑料吸管尖造成的。做划痕时应用1mL枪头靠在消毒后的直尺旁做垂直于细胞的划痕。分别用实施例1-6产品、对比例1-2产品或PBS孵育人毛母质细胞,12h后和24h后用倒置相差显微镜(IX61FL,Olympus,日本)对划痕区域成像,并量化检测划痕面积的变化,数据以12h或24h时的划痕减少面积与0h时的划痕面积之比来呈现。结果如表2所示:
表2
由表2数据可知:本发明所涉及的生发液对人毛母质细胞细胞具有显著的促进迁移活性,12h的划痕面积降低率最高可达50%,24h的划痕面积降低率最高可达94%,且生发液中毛乳头细胞来源外泌体的含量、存在形式,毛乳头细胞代数等因素均会影响促进迁移活性。
(3)生发效果评价
随机选取90名正在脱发的一般性脱发患者志愿者(每天平均脱发200根左右),男女各半,20-50岁,分为实验组1-6组,对比组1-2组,阳性组1组,每组10人,5男5女,实验组1-6组和对比组1-2组分别使用实施例1-6和对比例1-2的产品。使用方法为:使用前将头发和头皮洗干净,将5mL各组产品均匀地擦拭于头皮上,并按摩头皮20min,最后用清水将头皮冲洗干净,每隔2天使用一次,试验时间均为60天,观察各组志愿者头发的生长情况,各组均取平均值,结果如表3所示:
表3
由表3数据可知:本发明所涉及的生发液具有显著的防脱发和生发效果,且能缓解头油感,使用本发明所涉及的产品最快15天脱发处即可长出新生头发,第60天平均脱发量为84根,头油感第7天得到明显改善;且生发液中毛乳头细胞来源外泌体的含量、存在形式,毛乳头细胞代数等因素均会影响上述有益效果。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的一种含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液及其制备方法,但本发明并不局限于上述实施例,即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液,其特征在于,所述生发液包括毛乳头细胞来源外泌体纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂、抗氧剂和水。
2.如权利要求1所述的含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液,其特征在于,所述生发液以质量份数计包括毛乳头细胞来源外泌体纳米粒1-10份、稳定剂2-10份、保湿剂1-5份、头皮吸收促进剂1-5份、抗氧剂1-2份和水100份;
优选地,所述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒为低代毛乳头细胞来源外泌体纳米粒,所述低代指1-3代。
3.如权利要求1或2所述的含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液,其特征在于,所述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的制备原料包括毛乳头细胞来源外泌体、碳酸二辛酯、甘草甜素和椰油酰胺基丙基甜菜碱。
4.如权利要求1-3中任一项所述的含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液,其特征在于,所述稳定剂包括透明质酸钠、羧甲基壳聚糖或羟乙基淀粉中的任意一种或至少两种的组合;
优选地,所述保湿剂包括丙二醇和/或甘油;
优选地,所述头皮吸收促进剂包括月桂氮卓酮、二甲基亚砜或薄荷醇中的任意一种或至少两种的组合;
优选地,所述抗氧剂包括柠檬酸、酒石酸或抗坏血酸中的任意一种或至少两种的组合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
(1)将毛乳头细胞来源外泌体纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合,搅拌,得到混合液;
(2)将步骤(1)得到的混合液与抗氧剂混合,搅拌,得到所述含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液。
6.如权利要求5所述的含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述搅拌在4-10℃下进行,搅拌的时间为30-50min,搅拌的速度为200-400r/min;
优选地,步骤(2)所述搅拌是指先在15-25℃下搅拌10-15min,再升温至70-80℃下搅拌25-40min,搅拌的速度为600-800r/min。
7.如权利要求5或6所述的含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒的制备方法包括如下步骤:
(Ⅰ)将毛乳头细胞来源外泌体经冷冻干燥制成毛乳头细胞来源外泌体粉末;
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)得到的毛乳头细胞来源外泌体粉末与碳酸二辛酯混合,制成油相溶液;将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合,制得水相溶液;
(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)制得的油相溶液与水相溶液混合,并进行高速剪切乳化,制得初乳;
(Ⅳ)将步骤(Ⅲ)制得的初乳进行高压乳化,冷却,干燥,得到所述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒。
8.如权利要求7所述的含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液的制备方法,其特征在于,步骤(Ⅱ)所述毛乳头细胞来源外泌体粉末在碳酸二辛酯中的浓度为20-30mg/mL;
优选地,步骤(Ⅱ)所述甘草甜素在水中的浓度为3-5mg/mL;
优选地,步骤(Ⅱ)所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为1-3mg/mL。
9.如权利要求7或8所述的含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液的制备方法,其特征在于,步骤(Ⅲ)所述油相溶液与水相溶液的体积比为1:(3-7);
优选地,步骤(Ⅲ)所述高速剪切乳化的转速为1500-2000r/min,时间为30-40min;
优选地,步骤(Ⅳ)所述高压乳化的温度为40-50℃,压力为800-1000bar。
10.如权利要求5-9中任一项所述的含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液的制备方法,其特征在于,所述制备方法具体包括如下步骤:
(1)将毛乳头细胞来源外泌体经冷冻干燥制成毛乳头细胞来源外泌体粉末;
(2)将步骤(1)得到的毛乳头细胞来源外泌体粉末与碳酸二辛酯混合,所述毛乳头细胞来源外泌体粉末在碳酸二辛酯中的浓度为20-30mg/mL,制成油相溶液;
(3)将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合,所述甘草甜素在水中的浓度为3-5mg/mL,所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为1-3mg/mL,制得水相溶液;
(4)将制得的油相溶液与水相溶液以体积比为1:(3-7)混合,并进行高速剪切乳化,转速为1500-2000r/min,时间为30-40min,制得初乳;
(5)将步骤(4)制得的初乳进行高压乳化,温度为40-50℃,压力为800-1000bar,冷却,干燥,得到毛乳头细胞来源外泌体纳米粒;
(6)将毛乳头细胞来源外泌体纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合,在4-10℃下搅拌30-50min,搅拌的速度为200-400r/min,得到混合液;
(7)将步骤(6)得到的混合液与抗氧剂混合,先在15-25℃下搅拌10-15min,再升温至70-80℃下搅拌25-40min,搅拌的速度为600-800r/min,得到所述含有毛乳头细胞来源外泌体的生发液。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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