CN111617237A - 一种含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液及其制备方法 - Google Patents
一种含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液及其制备方法，所述生发液包括外泌体组合物和辅料，所述外泌体组合物包括毛乳头细胞来源外泌体和包覆其中的胶原蛋白。本发明所涉及的生发液的主要功效成分为毛乳头细胞来源外泌体和包覆其中的胶原蛋白，两者相辅相成，协同增效，能够促进毛母质细胞的增殖活性和迁移活性，能够显著改善脱发严重患者的头油感和脱发现象，促进新生头发的生长。
Description
技术领域
本发明属于生物细胞技术领域，涉及一种生发液及其制备方法，尤其涉及一种含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液及其制备方法。
背景技术
毛囊是一种复杂的微小器官，毛囊的形成和发生是毛囊上皮成分与真皮成分间相互作用的结果，毛囊的生长再生受到自身的干细胞调控。存在于毛囊当中的干细胞主要有：毛囊干细胞(hair follicle stem cell,HFSCs)，毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)和黑素干细胞(Melanocyte stem cells,McSCs)三种细胞。其中DPCs和HFSCs在毛囊形态发生中起重要作用。
外泌体是细胞分泌产物，它是一种直径约为50-15nm的脂质双层膜包围调节蛋白、mRNA、miRNA等结构的微小囊泡。外泌体从母细胞分离而来与母细胞有高度同源性，并携带母细胞合成生物信息，在细胞间信号交流中扮演着重要角色。尽管，在其他领域，干细胞来源的外泌体治疗作用已被大量报道，而在皮肤领域，这一研究还相对欠缺。
随着现代人生活、学业和工作压力的增加，越来越多的人受到脱发的困扰，在所有造成脱发的病因中，雄激素脱发(Androgenic alopecia,AGA)最为常见。目前，针对脱发治疗的手段主要包括药物治疗和手术治疗。其中，FDA批准正式用于雄激素脱发的治疗药物是口服非那雄胺和外用米诺地尔。手术治疗即为毛发移植手术，根据术式分为毛囊单位移植术和毛囊单位提取移植术，原理是将后枕部优势供区的毛囊提取移植到秃发部位。但是传统的脱发治疗手段存在着局限性：比如药物治疗对于某些人效果不佳，非那雄胺可能引起抬举困难、阳痿等副作用；手术治疗受限于供区的毛囊单位，对于终末期脱发无能为力。因此，需要一种新的替代治疗方案来改善这一现状。
CN110339134A公开了一种防治脱发组合物、防治脱发产品及其制备方法，所述组合物的原料包括：油菜花粉、裸麦花粉和非洲臀果木。实验结果表明，上述特定组分和配比的防治脱发组合物能够协同作用达到防治脱发的效果，对皮肤无刺激作用。
CN110123659A公开了一种防脱发组合物及其在制备防脱发洗护产品中的应用，所述防脱发组合物包括肌苷、羽扇豆水解蛋白、咖啡因；将肌苷、羽扇豆水解蛋白、咖啡因三者配合使用，具有显著的止脱发效果，同时，此组合还具有促进毛发生发的作用，原理是刺激头皮上的毛囊细胞，使进入休眠期的毛囊细胞重新生长，增加生长期的毛囊数量，进而起到生发的功效。
现有技术中公开的养发生发类产品虽对激活毛囊和促进头发生长有一定的效果，但效果还很有限，不能实现标本兼治的效果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种生发液及其制备方法，尤其提供一种含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液及其制备方法。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液，所述生发液包括外泌体组合物和辅料，所述外泌体组合物包括毛乳头细胞来源外泌体和包覆其中的胶原蛋白。
本发明所涉及的生发液的主要功效成分为毛乳头细胞来源外泌体和包覆其中的胶原蛋白，两者相辅相成，协同增效，能够促进毛母质细胞的增殖活性和迁移活性，能够显著改善脱发严重患者的头油感和脱发现象，促进新生头发的生长。与现有技术常用的药物米诺地尔相比具有相当或者更好的功效，且生物安全性很高。此处外泌体如同一个载体，将胶原蛋白包覆于其中，提高了胶原蛋白的结构稳定性和功效长效性，进一步增强了上述有益效果。
优选地，所述毛乳头细胞来源外泌体与胶原蛋白的质量比为(5-8):1，例如5:1、6:1、7:1或8:1等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述毛乳头细胞来源外泌体与胶原蛋白若以上述特定的质量比进行配合，无论是对毛母质细胞的增殖和迁移促进效果，还是改善脱发的效果，都是更优的。
优选地，所述毛乳头细胞来源外泌体为1-3代(例如1代、2代或3代)毛乳头细胞来源外泌体。本发明研究发现将低代的毛乳头细胞来源外泌体添加入本发明生发液，相比于高代具有更好的效果。
优选地，所述辅料与所述毛乳头细胞来源外泌体的质量比为(10-40):1，例如10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1或40:1等，优选(15-20):1，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述辅料与所述毛乳头细胞来源外泌体的质量比特定选择为(10-40):1的范围，因为毛乳头细胞来源外泌体所占质量过高或过低，都不利于上述功效的发挥。
优选地，所述辅料包括稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂或抗氧剂中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合例如稳定剂和保湿剂的组合、保湿剂和头皮吸收促进剂的组合、头皮吸收促进剂和抗氧剂的组合等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明所涉及的生发液以包覆于有胶原蛋白的毛乳头细胞来源外泌体为主要功效成分，再搭配以稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂或抗氧剂，各成分科学合理搭配，能使包覆于有胶原蛋白的毛乳头细胞来源外泌体的功效最大化。
优选地，所述辅料包括稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和抗氧剂的组合。
优选地，所述稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和抗氧剂的质量比为(2-10):(1-5):(1-5):1，例如2:1:1:1、2:3:1:1、2:5:1:1、2:1:3:1、2:1:5:1、5:1:1:1、8:1:1:1、10:1:1:1、10:5:1:1、10:5:5:1、10:1:5:1等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明所涉及的生发液中各成分若以上述特定的质量配比进行组合，无论是对毛母质细胞的增殖和迁移促进效果，还是改善脱发的效果，都是更优的。
本发明在众多的稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和抗氧剂中甄选出下述几种特定的类型，研究表明，下述特定类型的配合使得生发液的生发效果更佳。
优选地，所述稳定剂包括透明质酸钠、羧甲基壳聚糖或羟乙基淀粉中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合例如透明质酸钠和羧甲基壳聚糖的组合、羧甲基壳聚糖和羟乙基淀粉的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。优选透明质酸钠和羟乙基淀粉的组合。
优选地，所述保湿剂包括丙二醇和/或甘油。
优选地，所述头皮吸收促进剂包括月桂氮卓酮、二甲基亚砜或薄荷醇中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合例如月桂氮卓酮和二甲基亚砜的组合、二甲基亚砜和薄荷醇的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。优选二甲基亚砜和薄荷醇的组合。
优选地，所述抗氧剂包括柠檬酸、酒石酸或抗坏血酸中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如柠檬酸和酒石酸的组合、酒石酸和抗坏血酸的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明中，外泌体组合物是由如下方法制备得到的：
(1)将毛乳头细胞来源外泌体与电转染缓冲液混合，制得第一溶液；
(2)将步骤(1)得到的第一溶液与胶原蛋白混合，进行电穿孔转导，制得第二溶液；
(3)将步骤(2)制得的第二溶液静置，洗涤，重悬，得到所述外泌体组合物。
所述电转染缓冲液可以为RPMI-1640培养基和添加入RPMI-1640培养基中的氯化钾(10-20mmol/L)、脱氧核苷酸钠(5-7mmol/L)和HEPES(30-50mmol/L)。
优选地，所述外泌体组合物以纳米颗粒的形式存在，由如下方法制备得到：
(Ⅰ)将外泌体组合物经冷冻干燥制成外泌体组合物粉末；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)得到的外泌体组合物粉末与碳酸二辛酯混合，制成油相溶液；将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合，制得水相溶液；
(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)制得的油相溶液与水相溶液混合，并进行高速剪切乳化，制得初乳；
(Ⅳ)将步骤(Ⅲ)制得的初乳进行高压乳化，冷却，干燥，即得外泌体组合物纳米颗粒。
因为当毛乳头细胞来源的外泌体直接作用于头皮表面的时候，由于表面肌肤角质层的阻隔作用相对难以进入表皮层的肌底细胞；同时，外泌体本身的稳定性不佳，其在体内的停留时间较短，需要较高频次使用才能获得显著效果，从而限制了它的应用。基于此，本发明先将外泌体组合物冻干成粉末再将其制备成纳米颗粒应用于生发液中，即能克服上述弊端，正常使用就能获得较高的透皮率、较好的稳定性和技术效果。
优选地，步骤(Ⅱ)所述外泌体组合物粉末在碳酸二辛酯中的浓度为25-35mg/mL，例如25mg/mL、27mg/mL、30mg/mL、33mg/mL或35mg/mL等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(Ⅱ)所述甘草甜素在水中的浓度为3-5mg/mL，例如3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL或5mg/mL等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(Ⅱ)所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为1-3mg/mL，例如1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL或3mg/mL等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(Ⅲ)所述油相溶液与水相溶液的体积比为1:(3-7)，例如1:3、1:4、1:5、1:6或1:7等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(Ⅲ)所述高速剪切乳化的转速为1500-2000r/min，例如1500r/min、1600r/min、1700r/min、1800r/min、1900r/min或2000r/min等，时间为30-40min，例如30min、32min、35min、38min或40min等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(Ⅳ)所述高压乳化的温度为40-50℃，例如40℃、42℃、45℃、48℃或50℃等，压力为800-1000bar，例如800bar、850bar、900bar、950bar或1000bar等，上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第二方面，本发明提供如上所述的含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液的制备方法，所述制备方法包括：
将外泌体组合物、辅料和水混合，搅拌，得到所述含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将外泌体组合物、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合，搅拌，得到混合液；
(2)将步骤(1)得到的混合液与抗氧剂混合，搅拌，得到所述含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液。
优选地，步骤(1)所述搅拌在4-10℃(例如4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃等)下进行，搅拌的时间为30-50min(例如30min、35min、40min、45min或50min等)，搅拌的速度为200-400r/min(例如200r/min、250r/min、300r/min、350r/min或400r/min等)。上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述搅拌是指先在15-25℃(例如15℃、18℃、20℃、22℃或25℃等)下搅拌10-15min(例如10min、11min、12min、13min、14min或15min等)，再升温至70-80℃(例如70℃、72℃、75℃、78℃或80℃等)下搅拌25-40min(例如25min、30min、35min或40min等)，搅拌的速度为600-800r/min(例如600r/min、650r/min、700r/min、750r/min或800r/min等)。上述数值范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
作为本发明的优选技术方案，本发明所涉及的含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液的制备方法包括如下步骤：
(1)将毛乳头细胞来源外泌体与电转染缓冲液混合，制得第一溶液；
(2)将步骤(1)得到的第一溶液与胶原蛋白混合，进行电穿孔转导，制得第二溶液；
(3)将步骤(2)制得的第二溶液静置，洗涤，重悬，得到外泌体组合物；
(4)将外泌体组合物经冷冻干燥制成外泌体组合物粉末；
(5)将步骤(4)得到的外泌体组合物粉末与碳酸二辛酯混合，所述外泌体组合物粉末在碳酸二辛酯中的浓度为20-30mg/mL，制成油相溶液；
(6)将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合，所述甘草甜素在水中的浓度为3-5mg/mL，所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为1-3mg/mL，制得水相溶液；
(7)将制得的油相溶液与水相溶液以体积比为1:(3-7)混合，并进行高速剪切乳化，转速为1500-2000r/min，时间为30-40min，制得初乳；
(8)将步骤(7)制得的初乳进行高压乳化，温度为40-50℃，压力为800-1000bar，冷却，干燥，得到外泌体组合物纳米粒；
(9)将外泌体组合物纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合，在4-10℃下搅拌30-50min，搅拌的速度为200-400r/min，得到混合液；
(10)将步骤(9)得到的混合液与抗氧剂混合，先在15-25℃下搅拌10-15min，再升温至70-80℃下搅拌25-40min，搅拌的速度为600-800r/min，得到所述含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所涉及的生发液的主要功效成分为毛乳头细胞来源外泌体和包覆其中的胶原蛋白，两者相辅相成，协同增效，能够促进毛母质细胞的增殖活性和迁移活性，能够显著改善脱发严重患者的头油感和脱发现象，促进新生头发的生长。使用本发明所涉及的产品最快11天脱发处即可长出新生头发，第60天平均脱发量为69根，头油感第5天得到明显改善。与现有技术常用的药物米诺地尔相比具有相当或者更好的功效，且生物安全性很高。此处外泌体如同一个载体，将胶原蛋白包覆于其中，提高了胶原蛋白的结构稳定性和功效长效性，进一步增强了上述有益效果。
(2)本发明所涉及的生发液的主要功效成分搭配以稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂或抗氧剂，各成分科学合理搭配，能使包覆有胶原蛋白的毛乳头细胞来源外泌体的功效最大化。
(3)进一步地，本发明先将外泌体组合物冻干成粉末再将其制备成纳米颗粒应用于生发液中，正常使用就能获得较高的透皮率、较好的稳定性和上述有益的技术效果。
附图说明
图1是分离得到的人头皮毛乳头细胞的显微观察图(标尺为500μm)；
图2是提取到的人头皮毛乳头细胞外泌体的扫描电镜图(标尺为50nm)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例的组织来源：经南方医科大学医学伦理委员会批准，对经知情同意接受整容手术的患者进行头皮和毛囊标本采集，放入冰林格液中转移至实验室做下一步分离处理。下述实施例所涉及的胶原蛋白购自于西安百川生物科技有限公司。
制备例1
人头皮毛乳头细胞的分离和培养：
(1)取毛发移植术后废弃的人头皮毛囊(患者签字同意)，离体标本获取后立即置入盛有冰生林格液的无菌离心管中，并迅速转移至实验室。人头皮组织需要在显微镜下分离毛囊，用显微剪剪下毛球后移至新的PBS培养皿中。
(2)收集所有切下的毛乳头后用新鲜PBS洗三次。用注射器在显微镜下小心吸弃PBS清洗液，注意不要吸走毛乳头。用0.2％的I型胶原酶消化毛乳头，在37℃的细胞培养箱中消化1.5h后，在显微镜下可以看到部分黑色的毛乳头细胞从白色真皮鞘中分离脱出，这时可用移液枪吹打并继续消化至毛乳头细胞完全脱出。
(3)用完全培养基(DMEM+10％FBS)终止消化，800r/min离心5min，弃上清，用含双抗的PBS重悬，并在1000r/min离心3min并弃上清，重复上一步骤两次，最后用3mL完全培养基重悬后移入25cm2细胞培养瓶中培养，3天后可见细胞完全贴壁，每隔两天换一次液。待培养一周后毛乳头细胞迁出较多，长满培养瓶的70％左右时可以传代培养。
对培养3天的人头皮毛乳头细胞进行显微镜观察，如图1所示(标尺为500μm)：人头皮毛乳头细胞呈同心圆聚集性生长。同心圆中间是折光性差的未迁出毛乳头，周围围绕迁出及增殖的毛乳头细胞。细胞呈半透明的长梭形，在接种3天后完全贴壁，外观类似于真皮成纤维细胞。
制备例2
低代人毛乳头细胞外泌体的提取：
当3代或5代人头皮毛乳头细胞在25cm2培养瓶中长到90％融合时，把培养基换成5mL含无胎牛血清的低糖DMEM培养基培养3天后，将其转移到50mL高速离心机专用离心管中，2000g，4℃离心20min。取出上清液，并将其转移到适用于超离心转子的聚乙二醇管中。用防水标记标记每个超速离心管的一侧，将管子置于转子上，标记面朝上，并以10000g，4℃离心30min，然后将上清液转移到与上述相同尺寸的聚乙二醇管中，4℃离心1h，离心力为100000g，彻底清除上清液，使用微量移液器将每个管中的沉淀重悬于l mL PBS中。
对提取到的3代人毛乳头细胞外泌体进行扫描电镜观察，如图2所示(标尺为50nm)。并采用Nanosight NS300(Malvern PanaCyticcC英国)对外泌体的粒径进行检测，获得并分析了三个单独的测量结果，重复实验3次，结果显示：平均直径在93.2±15.6nm。
实施例1
本实施例提供一种生发液，其包括外泌体组合物和辅料，外泌体组合物为质量比7:1的毛乳头细胞来源外泌体和包覆其中的胶原蛋白；辅料与毛乳头细胞来源外泌体的质量比为20:1；辅料为稳定剂2份(透明质酸钠1份、羟乙基淀粉1份)、保湿剂(丙二醇)3份、头皮吸收促进剂2份(二甲基亚砜1份、薄荷醇1份)、抗氧剂1份(柠檬酸)和水100份。
该生发液的制备方法为如下步骤：
(1)将制备例2制得的3代毛乳头细胞来源外泌体与电转染缓冲液混合，制得第一溶液；
(2)将步骤(1)得到的第一溶液与胶原蛋白混合，进行电穿孔转导，制得第二溶液；
(3)将步骤(2)制得的第二溶液静置，洗涤，重悬，得到外泌体组合物；
(4)将外泌体组合物经冷冻干燥制成外泌体组合物粉末；
(5)将步骤(4)得到的外泌体组合物粉末与碳酸二辛酯混合，所述外泌体组合物粉末在碳酸二辛酯中的浓度为25mg/mL，制成油相溶液；
(6)将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合，所述甘草甜素在水中的浓度为4mg/mL，所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为2mg/mL，制得水相溶液；
(7)将制得的油相溶液与水相溶液以体积比为1:5混合，并进行高速剪切乳化，转速为1800r/min，时间为35min，制得初乳；
(8)将步骤(7)制得的初乳进行高压乳化，温度为45℃，压力为1000bar，冷却，干燥，得到外泌体组合物纳米粒；
(9)将外泌体组合物纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合，在10℃下搅拌30min，搅拌的速度为300r/min，得到混合液；
(10)将步骤(9)得到的混合液与抗氧剂混合，先在20℃下搅拌15min，再升温至80℃下搅拌25min，搅拌的速度为800r/min，得到所述含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液。
实施例2
本实施例提供一种生发液，其包括外泌体组合物和辅料，外泌体组合物为质量比5:1的毛乳头细胞来源外泌体和包覆其中的胶原蛋白；辅料与毛乳头细胞来源外泌体的质量比为15:1；辅料为稳定剂5份(透明质酸钠3份、羟乙基淀粉2份)、保湿剂(丙二醇)2份、头皮吸收促进剂3份(二甲基亚砜2份、薄荷醇1份)、抗氧剂1份(柠檬酸)和水100份。
该生发液的制备方法为如下步骤：
(1)将制备例2制得的3代毛乳头细胞来源外泌体与电转染缓冲液混合，制得第一溶液；
(2)将步骤(1)得到的第一溶液与胶原蛋白混合，进行电穿孔转导，制得第二溶液；
(3)将步骤(2)制得的第二溶液静置，洗涤，重悬，得到外泌体组合物；
(4)将外泌体组合物经冷冻干燥制成外泌体组合物粉末；
(5)将步骤(4)得到的外泌体组合物粉末与碳酸二辛酯混合，所述外泌体组合物粉末在碳酸二辛酯中的浓度为20mg/mL，制成油相溶液；
(6)将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合，所述甘草甜素在水中的浓度为5mg/mL，所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为2mg/mL，制得水相溶液；
(7)将制得的油相溶液与水相溶液以体积比为1:7混合，并进行高速剪切乳化，转速为2000r/min，时间为30min，制得初乳；
(8)将步骤(7)制得的初乳进行高压乳化，温度为40℃，压力为1000bar，冷却，干燥，得到外泌体组合物纳米粒；
(9)将外泌体组合物纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合，在5℃下搅拌40min，搅拌的速度为200r/min，得到混合液；
(10)将步骤(9)得到的混合液与抗氧剂混合，先在20℃下搅拌15min，再升温至70℃下搅拌45min，搅拌的速度为700r/min，得到所述含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液。
实施例3
本实施例提供一种生发液，其组成配方与实施例1的差别仅在于：采用制备例2提取到的5代毛乳头细胞来源外泌体进行制备，其他条件均保持一致。
所述生发液的制备方法与实施例1保持一致。
实施例4
本实施例提供一种生发液，其组成配方与实施例1的差别仅在于：外泌体组合物中毛乳头细胞来源外泌体与胶原蛋白的质量比为10:1，其他条件均保持一致。
所述生发液的制备方法与实施例1保持一致。
实施例5
本实施例提供一种生发液，其组成配方与实施例1的差别仅在于：外泌体组合物中毛乳头细胞来源外泌体与胶原蛋白的质量比为2:1，其他条件均保持一致。
所述生发液的制备方法与实施例1保持一致。
实施例6
本实施例提供一种生发液，其组成配方与实施例1的差别仅在于：辅料与所述毛乳头细胞来源外泌体的质量比为8:1，其他条件均保持一致。
所述生发液的制备方法与实施例1保持一致。
实施例7
本实施例提供一种生发液，其组成配方与实施例1的差别仅在于：辅料与所述毛乳头细胞来源外泌体的质量比为50:1，其他条件均保持一致。
所述生发液的制备方法与实施例1保持一致。
实施例8
本实施例提供一种生发液，其组成配方与实施例1的差别仅在于：稳定剂成分为透明质酸钠2份，其他条件均保持一致。
所述生发液的制备方法与实施例1保持一致。
实施例9
本实施例提供一种生发液，其组成配方与实施例1的差别仅在于：头皮吸收促进剂的成分为二甲基亚砜2份，其他条件均保持一致。
所述生发液的制备方法与实施例1保持一致。
实施例10
本实施例提供一种生发液，其配方组成与实施例1的区别仅在于：不将外泌体组合物预处理成纳米颗粒形式，而是直接使用外泌体组合物进行制备，外泌体和胶原蛋白的有效添加量与实施例1保持一致。其他成分和添加量均保持一致。
所述生发液的制备方法为：
(1)将制备例2制得的3代毛乳头细胞来源外泌体与电转染缓冲液混合，制得第一溶液；
(2)将步骤(1)得到的第一溶液与胶原蛋白混合，进行电穿孔转导，制得第二溶液；
(3)将步骤(2)制得的第二溶液静置，洗涤，重悬，得到外泌体组合物；
(4)将外泌体组合物、稳定剂2份(透明质酸钠1份、羟乙基淀粉1份)、保湿剂(丙二醇)3份、头皮吸收促进剂2份(二甲基亚砜1份、薄荷醇1份)、表面活性剂(椰油酰胺基丙基甜菜碱)2份和水混合，在10℃下搅拌30min，搅拌的速度为300r/min，得到混合液；
(2)将步骤(1)得到的混合液与抗氧剂1份(柠檬酸)混合，先在20℃下搅拌15min，再升温至80℃下搅拌25min，搅拌的速度为800r/min，得到所述生发液。
对比例1
本对比例提供一种生发液，其配方组成与实施例1的区别仅在于：外泌体不包覆胶原蛋白，其他成分和添加量均保持一致。
所述生发液的制备方法为：
(1)将制备例2制得的3代毛乳头细胞来源外泌体经冷冻干燥制成毛乳头细胞来源外泌体粉末；
(2)将步骤(1)得到的毛乳头细胞来源外泌体粉末与碳酸二辛酯混合，所述毛乳头细胞来源外泌体粉末在碳酸二辛酯中的浓度为25mg/mL，制成油相溶液；
(3)将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合，所述甘草甜素在水中的浓度为4mg/mL，所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为2mg/mL，制得水相溶液；
(4)将制得的油相溶液与水相溶液以体积比为1:5混合，并进行高速剪切乳化，转速为1800r/min，时间为35min，制得初乳；
(5)将步骤(4)制得的初乳进行高压乳化，温度为45℃，压力为1000bar，冷却，干燥，得到毛乳头细胞来源外泌体纳米粒；
(6)将上述毛乳头细胞来源外泌体纳米粒、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合，在10℃下搅拌25min，搅拌的速度为300r/min，得到混合液；
(7)将步骤(6)得到的混合液与抗氧剂混合，先在20℃下搅拌15min，再升温至80℃下搅拌25min，搅拌的速度为800r/min，得到所述生发液。
评价试验：
(1)对人毛母质细胞增殖促进效果的评价
将3代人毛母质细胞(购于ScienCe∣L美国)接种至96孔酶标板中培养，每孔接种1×105个细胞，分别将100μL实施例1-6和对比例1-2制得的生发液产品与人毛母质细胞(100μL培养基)在37℃进行共孵育。用CCK8试剂盒检测细胞活性，以添加PBS缓冲液为阴性对照，分别于培养24h、36h、48h后进行检测。检测前将板内溶液更换成DMEM培养基(200μL/孔)加入CCK8检测剂(10μL/孔)后将酶标板置于37℃孵箱避光孵育l h。在酶标仪上测量450nm处吸光度即OD值，每组测6个复孔。记录数据并根据所得数据进行统计学分析，实验重复3次，最终结果以平均值来呈现。
细胞增殖活力的计算公式为：[(A1-A0)/(A2-A0)]×100％，其中A1表示具有细胞和样品液的孔的吸光度；A0表示具有培养基而没有细胞的孔的吸光度；A2表示具有细胞和PBS缓冲液的孔的吸光度。结果如表1所示(结果以平均值呈现)：
表1
| 组别 | 24h | 36h | 48h |
| 实施例1 | 173％ | 195％ | 205％ |
| 实施例2 | 178％ | 202％ | 227％ |
| 实施例3 | 152％ | 161％ | 170％ |
| 实施例4 | 169％ | 188％ | 191％ |
| 实施例5 | 161％ | 179％ | 184％ |
| 实施例6 | 173％ | 185％ | 189％ |
| 实施例7 | 167％ | 192％ | 202％ |
| 实施例8 | 148％ | 168％ | 175％ |
| 实施例9 | 152％ | 169％ | 185％ |
| 实施例10 | 139％ | 145％ | 150％ |
| 对比例1 | 154％ | 179％ | 181％ |
由表1数据可知：本发明所涉及的生发液对人毛母质细胞具有显著的增殖促进效果，且生发液中毛乳头细胞来源外泌体的存在形式、外泌体与胶原蛋白或辅料的比例、稳定剂和头皮吸收剂类型、毛乳头细胞代数等因素均会影响增殖促进效果。
(2)对人毛母质细胞细胞迁移活性的影响评价
将人毛母质细胞(购于ScienCe∣L美国)以6.0×105细胞/孔的密度接种到6孔板中。划痕是在融合单层细胞上用塑料吸管尖造成的。做划痕时应用1mL枪头靠在消毒后的直尺旁做垂直于细胞的划痕。分别用实施例1-6产品、对比例1-2产品或PBS孵育人毛母质细胞，立即、12h后和24h后三个时间点用倒置相差显微镜(IX61 FL,Olympus,日本)对划痕区域成像，并量化检测划痕面积的变化，数据以12h或24h时的划痕减少面积与0h时的划痕面积之比来呈现。结果如表2所示(每组试验平行测定3次，结果以平均值呈现)：
表2
由表2数据可知：本发明所涉及的生发液对人毛母质细胞细胞具有显著的促进迁移活性，12h的划痕面积降低率最高可达57％，24h的划痕面积降低率最高可达93％，且生发液中毛乳头细胞来源外泌体的存在形式、外泌体与胶原蛋白或辅料的比例、稳定剂和头皮吸收剂类型、毛乳头细胞代数等因素均会影响促进迁移活性。
(3)生发效果评价
随机选取120名正在脱发的一般性脱发患者志愿者(每天平均脱发200根左右)，男女各半，20-50岁，分为实验组1-10组，对比组1组，阳性组1组，每组10人，5男5女，实验组1-10组和对比组1组分别使用实施例1-10和对比例1的产品。使用方法为：使用前将头发和头皮洗干净，将5mL各组产品均匀地擦拭于头皮上，并按摩头皮20min，最后用清水将头皮冲洗干净，每隔2天使用一次，试验时间均为60天，观察各组志愿者头发的生长情况，各组均取平均值，结果如表3所示(结果以平均值呈现)：
表3
由表3数据可知：本发明所涉及的生发液具有显著的防脱发和生发效果，且能缓解头油感，使用本发明所涉及的产品最快11天脱发处即可长出新生头发，第60天平均脱发量为69根，头油感第5天得到明显改善；且生发液中毛乳头细胞来源外泌体的存在形式、外泌体与胶原蛋白或辅料的比例、稳定剂和头皮吸收剂类型、毛乳头细胞代数等因素均会影响上述有益效果。
(4)皮肤刺激性评价
随机选取110名正在脱发的一般性脱发患者志愿者(每天平均脱发200根左右)，男女各半，20-50岁，分为实验组1-10组，对比组1组，每组10人，5男5女，实验组1-10组和对比组1组分别使用实施例1-10和对比例1的产品。以洗发后用毛巾擦干的状态，将2mL各组产品均匀地擦拭于头皮上，并按摩头皮20min，最后用清水将头皮冲洗干净，评价擦拭后有无刺激感并进行打分。
评价基准如下：
4-5分：完全没有感受到刺激；
3-4分：几乎没有感受到刺激；
2-3份：感受到刺激；
1-2：强烈感受到刺激。
结果如表4所示(结果以平均值呈现)：
表4
| 组别 | 分数 |
| 实验组1 | 4.8 |
| 实验组2 | 4.9 |
| 实验组3 | 4.4 |
| 实验组4 | 4.7 |
| 实验组5 | 4.2 |
| 实验组6 | 4.8 |
| 实施例7 | 4.5 |
| 实施例8 | 4.4 |
| 实施例9 | 4.7 |
| 实施例10 | 4.8 |
| 对比组1 | 4.6 |
由表4数据可知：本发明所涉及的生发液有良好的舒适度和体验感，使用时头皮没有刺激感。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液及其制备方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液，其特征在于，所述生发液包括外泌体组合物和辅料，所述外泌体组合物包括毛乳头细胞来源外泌体和包覆其中的胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液，其特征在于，所述毛乳头细胞来源外泌体与胶原蛋白的质量比为(5-8):1；
优选地，所述毛乳头细胞来源外泌体为1-3代毛乳头细胞来源外泌体。
3.如权利要求1或2所述的含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液，其特征在于，所述辅料与所述毛乳头细胞来源外泌体的质量比为(10-40):1，优选(15-20):1。
4.如权利要求1-3中任一项所述的含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液，其特征在于，所述辅料包括稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂或抗氧剂中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述辅料包括稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和抗氧剂的组合；
优选地，所述稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和抗氧剂的质量比为(2-10):(1-5):(1-5):1。
5.如权利要求4所述的含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液，其特征在于，所述稳定剂包括透明质酸钠、羧甲基壳聚糖或羟乙基淀粉中的任意一种或至少两种的组合；优选透明质酸钠和羟乙基淀粉的组合；
优选地，所述保湿剂包括丙二醇和/或甘油；
优选地，所述头皮吸收促进剂包括月桂氮卓酮、二甲基亚砜或薄荷醇中的任意一种或至少两种的组合；优选二甲基亚砜和薄荷醇的组合；
优选地，所述抗氧剂包括柠檬酸、酒石酸或抗坏血酸中的任意一种或至少两种的组合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液，其特征在于，所述外泌体组合物是由如下方法制备得到的：
(1)将毛乳头细胞来源外泌体与电转染缓冲液混合，制得第一溶液；
(2)将步骤(1)得到的第一溶液与胶原蛋白混合，进行电穿孔转导，制得第二溶液；
(3)将步骤(2)制得的第二溶液静置，洗涤，重悬，得到所述外泌体组合物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液，其特征在于，所述外泌体组合物以纳米颗粒的形式存在，由如下方法制备得到：
(Ⅰ)将外泌体组合物经冷冻干燥制成外泌体组合物粉末；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)得到的外泌体组合物粉末与碳酸二辛酯混合，制成油相溶液；将甘草甜素、椰油酰胺基丙基甜菜碱和水混合，制得水相溶液；
(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)制得的油相溶液与水相溶液混合，并进行高速剪切乳化，制得初乳；
(Ⅳ)将步骤(Ⅲ)制得的初乳进行高压乳化，冷却，干燥，即得外泌体组合物纳米颗粒。
8.如权利要求7所述的含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液，其特征在于，步骤(Ⅱ)所述外泌体组合物粉末在碳酸二辛酯中的浓度为25-35mg/mL；
优选地，步骤(Ⅱ)所述甘草甜素在水中的浓度为3-5mg/mL；
优选地，步骤(Ⅱ)所述椰油酰胺基丙基甜菜碱在水中的浓度为1-3mg/mL；
优选地，步骤(Ⅲ)所述油相溶液与水相溶液的体积比为1:(3-7)；
优选地，步骤(Ⅲ)所述高速剪切乳化的转速为1500-2000r/min，时间为30-40min；
优选地，步骤(Ⅳ)所述高压乳化的温度为40-50℃，压力为800-1000bar。
9.如权利要求1-8中任一项所述的含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将外泌体组合物、辅料和水混合，搅拌，得到所述含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液。
10.如权利要求9所述的含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将外泌体组合物、稳定剂、保湿剂、头皮吸收促进剂和水混合，搅拌，得到混合液；
(2)将步骤(1)得到的混合液与抗氧剂混合，搅拌，得到所述含有毛乳头细胞来源外泌体和胶原蛋白的生发液；
优选地，步骤(1)所述搅拌在4-10℃下进行，搅拌的时间为30-50min，搅拌的速度为200-400r/min；
优选地，步骤(2)所述搅拌是指先在15-25℃下搅拌10-15min，再升温至70-80℃下搅拌25-40min，搅拌的速度为600-800r/min。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200904 |