CN112656836A - 透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂在制备抗皮肤衰老产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂在制备抗皮肤衰老产品中的应用。经透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂能有效穿透皮肤角质层，并被皮肤细胞如皮肤成纤维细胞高效摄取，从而发挥显著的抗皮肤(细胞)衰老的功能，为皮肤抗衰老提供了新的策略，所制备的透皮肽修饰的粉葛外泌体可作为一种高效、安全、制备方便的新型皮肤抗衰老美容产品，同时还可以应用于其它细胞、组织的抗衰老，用于延缓机体组织、器官的老化和功能衰退，在医疗产品和美容化妆品领域均具有巨大的市场开发前景。

Description

透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂在制备抗皮肤衰老产品中 的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂在抗皮肤衰老中的应用。

背景技术

衰老是任何生物生命过程的必然规律，随着现在世界范围内人口老龄化问题日渐突出，抗衰老领域已成为全球关注的焦点。人体器官老细胞逐渐死去，而新细胞不再产生。死去的老细胞被酶分解，然后被新细胞吸收，供给新细胞生长所需的营养，不能促使旧细胞继续分裂产生更多新的细胞。长此以往，人体器官新的细胞不再产生，而原来的旧细胞不断的死亡，这样就会造成人体器官功能的不断衰退，引起各种老年疾病，到最后直至人体器官功能完全衰竭，导致人因为人体器官功能不断衰退直至衰竭而死亡。因此，有效防护器官衰老，可减少老年疾病的发生，对于实现健康老龄化，延长寿命非常重要。皮肤作为人体最大的器官，其衰老具有特殊意义。皮肤衰老不仅影响美观，还对人们生活、工作有着心理与生理影响，可能会引发抑郁、自卑等心理问题。因此，对皮肤的抗衰老治疗，是目前的研究焦点之一。

端粒酶是一种逆转录酶，由RNA和蛋白质组成，是以自身RNA为模板，合成端粒重复序列，加到新合成DNA链末端，把DNA复制损失的端粒填补起来，使端粒修复延长，可以让端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂的次数增加。但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控，大多出现在造血细胞、干细胞和生殖细胞这些不断分裂的细胞之中。当细胞分化成熟后，端粒酶的活性就会渐渐的消失，细胞每有丝分裂一次，就有一段端粒序列丢失，当端粒长度缩短到一定程度，会使细胞停止分裂，导致衰老与死亡。因此，端粒酶在细胞中的活性，是抗衰老中的具有重要意义的指标。

皮肤真皮中最重要的细胞成分是成纤维细胞，其数量减少、形态改变、分泌合成功能减弱或衰退与皮肤衰老密切相关。现已发现成纤维细胞诱导皮肤衰老的作用机制既有单个特定基因或蛋白的调控机制，也包含了涉及多个组合调控的作用机制。因此，将成纤维细胞应用于皮肤衰老模型的建立和研究中，可以为探讨预防和延缓皮肤老化提供新思路与研究方向，为评价抗皮肤老化药物的疗效积累经验。

因此本发明以皮肤为组织模型，以皮肤中所含的主要细胞之一(成纤维细胞)为模型细胞，对所构建的纳米制剂在对抗细胞、组织以及器官衰老方面的效果进行鉴定与评价。

但是，皮肤致密的角质层限制了绝大部分药物的经皮渗透，只有一小部分小分子药物才能直接进入表皮层。近些年来，许多研究报道了使用纳米药物载体携带药物促进药物透皮的方法，但这些纳米粒子的透皮效果往往不是很理想，生物相容性较差，对皮肤造成一定的刺激，细胞对游离药物的摄取量也很低。因此，亟需发明一种透皮效果理想，生物相容性好的纳米粒子携带抗衰老药物穿透角质层，到达表皮层、真皮层，对皮肤细胞实施干预，发挥抗皮肤衰老的美容/治疗作用。

外泌体是指由细胞分泌到细胞外微环境的一种具有膜结构的囊泡，其中含有蛋白质、核酸等多种关键组分，参与细胞间的通讯并调控细胞功能。由于外泌体是来源于细胞膜的纳米囊泡，其成分与细胞膜具有相似性，因此根据相似相溶原理，外泌体具有细胞和组织穿透的独特优势，且相较人工合成的脂质体，外泌体具备更好的生物相容性，生物可降解性，更高的包装率，低毒性，稳定性以及低免疫原性。因此，外泌体在经皮给药上可能具有巨大的潜力，目前也很少有将外泌体应用于经皮给药的报道。基于此，在外泌体上修饰透皮肽，可以在不增加纳米粒尺寸下，能够更加高效地穿透皮肤角质层，增强外泌体穿透细胞膜的作用，进而更容易被细胞所摄取。

近年来，植物外泌体的制备，通过物理粉碎中药以后，不断高速离心分离，能够包含大部分植物中的活性成分，同时制备过程中无需添加有机溶剂，加热等步骤，对中药活性成分具有显著的保护作用，相较过去的中药水煎法，能够大大降低提取、纯化等过程导致的对中药活性成分的破坏作用。

粉葛(PuerariaeThomsonii Radix)，为豆科葛属植物。粉葛以根入药，中药名为葛根，具有解肌退热，生津，升阳止泻，透疹；主治外感发热头痛，项强，口渴，消渴，泻泄，热痢，高血压颈项强痛，麻疹不透。葛花可制成葛花茶，具有解酒功效，同时具有美容效果。截至目前，对于粉葛外泌体在皮肤抗衰老，增强端粒酶活性方面的作用，未见全面的文章及研究成果。

发明内容

针对上述不足，本发明提供透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂在制备抗皮肤衰老产品中的应用，该发明可以使得纳米制剂高效穿透皮肤角质层，并加强皮肤细胞对纳米制剂的摄取，提高细胞端粒酶活性，发挥显著的抗皮肤(细胞)衰老的美容与治疗作用，为延缓衰老的医疗与美容化妆品的研发提供了新策略与新制剂。

本发明首先公开了一种透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂在制备抗皮肤衰老产品中的应用。

本发明还公开了一种透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂在制备提高细胞端粒酶活性的制剂中的应用。

所述的透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂，其制备方法包括如下步骤：

1)将清水洗净的粉葛，在室温环境下榨出汁液，榨出的汁液经滤网过滤，收集过滤的液体；将粗滤过的粉葛汁在0～10℃，3000～20000g条件下离心0.5～3h，弃沉淀，收集上清；

2)上清液在0～10℃，5000～40000g条件下离心0.5～4h，收集沉淀，用磷酸缓冲液重悬沉淀得到粉葛外泌体重悬液；

3)将粉葛外泌体重悬液置于置于20～35℃摇床中，90～200rpm条件下振荡1～3h，然后再加入棕榈酸修饰的透皮肽，其中透皮肽与外泌体质量比为0.5:1-4:1，置于20～35℃摇床中，90～200rpm共同振荡1～3h，于0～10℃，100000～200000g条件下离心0.5～4h，弃去上清，得到透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂。

步骤2)离心过程所采用的离心力应大于步骤1)所述的离心力。

优选的，所述透皮肽氨基酸序列为ACTGSTQHQCG、RRRRRRR、CASSSKSRHCG、AGTCKSNQSQCG或HIITPQHGSYL。

进一步的，本发明的抗皮肤衰老产品和提高细胞端粒酶活性的制剂的给药方式为透皮给药。

本发明的有益效果是：本发明的给药方式为经皮给药，将外泌体应用于透皮制剂。透皮肽可以使外泌体有效地渗入皮肤成纤维细胞，外泌体抑制皮肤衰老，同时该发明生产快捷方便，应用于保养皮肤的化妆品简单高效方便。

附图说明

图1是透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂在电镜检查下得到的透皮肽修饰后的外泌体形态、大小电镜图；

图2是透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂在电镜检查下得到的透皮肽修饰后的外泌体粒径；

图3是透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂应用于小鼠透皮实验得到的皮肤切片图；

图4是透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂体外培养成纤维细胞的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色光镜拍照实验结果；

图5是透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂体外培养成纤维细胞的端粒酶活性实验结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

1.材料方法

1.1试药DMEM低糖培养液(Gibco BRL，美国)；胎牛血清(FBS，Gibco BRL，美国)；0.25wt.％胰酶(含0.02wt.％EDTA，Gibco BRL，美国)；青霉素一链霉素溶液(Gibco BRL，美国)；Cell Counting Kit-8(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；实时荧光定量PCR端粒酶检测试剂盒(大鼠)(江苏凯基生物技术股份有限公司，中国)；Trizol总RNA提取试剂(江苏凯基生物技术股份有限公司，中国)；

1.2仪器电子天平(AL204，Mettler Toledo，瑞士)；二氧化碳细胞孵箱(HF90，Health Force，中国)；生物安全柜(Type A2，北京东联哈尔仪器制造有限公司，中国)；超纯水仪(Milli-Q，Millipore Co.，美国)；台式高速冷冻离心机(Allegra 64R，Beckman，美国)；落地式超速离心机(Optima XPN-100，Beckman，美国)；Malvern Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments Ltd.,Worcestershire,英国)；透射电子显微镜(Hitachi H-7650,日本)；高通量实时荧光定量PCR(20263lc480，Roache，德国)；

1.3粉葛外泌体提取将清水洗净的粉葛，在室温环境下，通过压榨机榨出汁液，榨出的汁液经滤网过滤，收集过滤的液体；将粗滤过的粉葛汁在4℃下以9000g离心1小时，弃沉淀，收集上清；之后再以4℃，30000g转速超离心2h，收集沉淀，用磷酸缓冲液重悬沉淀得到粉葛外泌体重悬液。

1.4插入透皮肽修饰外泌体将透皮肽与叔丁醇按质量-体积比为1g：4mL混合均匀，加入氢氧化钠水溶液，搅拌至澄清；降温至5℃，滴加棕榈酰氯和氢氧化钠溶液，透皮肽与棕榈酰率摩尔比为1:1.2，保持反应体系ph在8～9之间；滴加完毕撤去冰浴，自然升温至室温搅拌2个小时，用盐酸溶液调ph至2～3，过滤。将粉葛外泌体重悬液置于33℃摇床中，100rpm振荡1h，然后再加入棕榈酸修饰的透皮肽，其中透皮肽与外泌体质量比为2.5:1，置于33℃摇床中，100rpm振荡1h。于4℃，100000g超速离心2h，弃去上清，得到透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂。

1.5透皮实验用4周龄裸鼠皮肤进行透皮肽修饰的粉葛外泌体的体外渗透试验。用10％水合氯醛麻醉小鼠，再用脱毛膏去除小鼠背部毛发，从小鼠身上取下皮肤。将皮肤切成合适的大小，用生理盐水洗净皮肤，将皮肤贴在Franz透皮扩散池的供给室和接受室之间，角质层朝上。接受室注满PBS溶液，供给室加入1mL透皮肽修饰的粉葛外泌体胶束溶液，用封口膜封口，以避免液体扩散。扩散池在37℃(300r/min)的水浴中不断搅拌。24小时后，拆除扩散池装置，用棉签轻轻擦拭皮肤，然后置于玻璃载玻片上，于透射电镜下观察外泌体在皮肤中的分布。

1.6HDF培养取P₀代HDF，用10％的胎牛血清的DMEM低糖培养液在37℃和5％CO₂环境中培养，每隔两天换一次液。当细胞生长密度达到80％-90％时消化传代，第20代的HDF用于细胞衰老β-半乳糖苷酶染色实验

1.7细胞衰老β-半乳糖苷酶染色实验实验设置对照组和给药组。给药组中透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂溶解后经过滤除菌。

取第20代的HDF，分别以2×10⁴/孔的密度种在24孔板上。培养24小时，待细胞贴壁后，向24孔板中分别加入培养液和含有制得的纳米制剂培养液，每个组合12个孔。加药24h后，吸除细胞培养液，用PBS或HBSS洗涤1次，加入250ulβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。吸除细胞固定液，用PBS或HBSS洗涤细胞3次，每次3分钟。吸除PBS或HBSS，每孔加入1毫升染色工作液。染色工作液的配制方法参考细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书。37℃孵育过夜，用parafilm或保鲜膜封住24孔板防止蒸发。普通光学显微镜下观察。

1.8端粒酶活性检测对照组和给药组各取一孔板细胞，提取RNA，并进行逆转录获得cDNA，方法参考凯基RNA提取以及逆转录试剂盒。试剂溶解后，轻轻混匀并低速离心。进行25μL体系的实时定量PCR。

Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2×)	12.5μL
		TERT-F/TERT-R Primer(10μM)	0.6～0.8μM
GAPDH-F/GAPDH-R Primer(10μM)	0.6～0.8μM
		Template DNA	﹤500ng
Water,Nuclease-free	to 25μL

将以上各组分(除DNA模板外)添加并混匀，加入至PCR反应管。添加DNA模板到准备好的PCR反应管。轻轻的混匀PCR管中的各组分，参照一下说明设置实时定量PCR循环仪，放入样品并启动程序。循环反应采用三步法进行实验。参数设置：

1.9统计分析实验数据用x±Sd表示，采用Origin2017软件进行统计学处理分析，两组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析，当P<0.05时认为有统计学差异。

2.结果

2.1电镜检查实验结果显示，透皮肽成功修饰粉葛外泌体(见图1所示)，直径为109±1.7nm(见图2所示)，说明制得的透皮肽修饰的粉葛外泌体为纳米制剂。

2.2小鼠透皮实验结果显示，将透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂应用于小鼠表皮上，透皮效果显著(见图3所示)。

2.3细胞衰老β-半乳糖苷酶染色实验结果在光镜下观察，培养的细胞的β-半乳糖苷酶阳性细胞率降低显著，阳性细胞数目减少，端粒酶活性增强，具有显著的抗衰老作用(见图4、图5所示)。

Claims (9)

1.透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂在制备抗皮肤衰老产品中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述的透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂，其制备方法包括如下步骤：

1)将清水洗净的粉葛，在室温环境下榨出汁液，榨出的汁液经滤网过滤，收集过滤的液体；将粗滤过的粉葛汁在0～10℃，3000～20000g条件下离心0.5～3h，弃沉淀，收集上清；

2)上清液在0～10℃，5000～40000g条件下离心0.5～4h，收集沉淀，用磷酸缓冲液重悬沉淀得到粉葛外泌体重悬液；

3)将粉葛外泌体重悬液置于置于20～35℃摇床中，90～200rpm条件下振荡1～3h，然后再加入棕榈酸修饰的透皮肽，其中透皮肽与外泌体质量比为0.5:1-4:1，置于20～35℃摇床中，90～200rpm共同振荡1～3h，于0～10℃，100000～200000g条件下离心0.5～4h，弃去上清，得到透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，步骤2)离心过程所采用的离心力应大于步骤1)所述的离心力。

4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，步骤1)中，葛汁液在4℃下以9000g离心1小时。

5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，步骤2)中，上清液在4℃，30000g转速超离心2h。

6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，步骤3)中，粉葛外泌体重悬液置于33℃摇床中，100rpm振荡1h，然后再加入棕榈酸修饰的透皮肽，其中透皮肽与外泌体质量比为2.5:1，置于33℃摇床中，100rpm振荡1h；于4℃，100000g超速离心2h，弃去上清，得到透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂。

7.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述透皮肽氨基酸序列为ACTGSTQHQCG、RRRRRRR、CASSSKSRHCG、AGTCKSNQSQCG或HIITPQHGSYL。

8.一种透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂在制备提高细胞端粒酶活性的制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述的透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂，其制备方法包括如下步骤：

1)将清水洗净的粉葛，在室温环境下榨出汁液，榨出的汁液经滤网过滤，收集过滤的液体；将粗滤过的粉葛汁在0～10℃，3000～20000g条件下离心0.5～3h，弃沉淀，收集上清；

2)上清液在0～10℃，5000～40000g条件下离心0.5～4h，收集沉淀，用磷酸缓冲液重悬沉淀得到粉葛外泌体重悬液；

3)将粉葛外泌体重悬液置于置于20～35℃摇床中，90～200rpm条件下振荡1～3h，然后再加入棕榈酸修饰的透皮肽，其中透皮肽与外泌体质量比为0.5:1-4:1，置于20～35℃摇床中，90～200rpm共同振荡1～3h，于0～10℃，100000～200000g条件下离心0.5～4h，弃去上清，得到透皮肽修饰的粉葛外泌体纳米制剂。

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