KR20080096411A

KR20080096411A - 화장 제제 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20080096411A
Application number: KR1020080038068A
Authority: KR
Inventors: 페터 블룸; 코르넬리아 쉬르흐; 다빌 쉬미트; 프레드 쮤리
Original assignee: 미벨레 아게
Priority date: 2007-04-27
Filing date: 2008-04-24
Publication date: 2008-10-30
Also published as: US20140072619A1; EP1985280A3; EP1985280A2; US20080299092A1; CH715456B1; US9155916B2; KR101470632B1; EP1985280B1; US8580320B2; US20120195948A1

Abstract

본 발명은 내부 및 외부 스트레스 인자에 대항하여 줄기 세포(stem cell)를 보호하기 위한, 특히 줄기 세포의 증식을 촉진하고 아폽토시스에 대항하여 이를 보호하기 위한, 화장 제제에서의 역분화 식물 세포의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 말루스 도메스티카(Malus domestica) (사과) 컬티바 우트윌러 스파에트라우버(cultivar Uttwiler Spaetlauber)의 과실로부터 얻은 역분화 식물 세포의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 역분화 식물 세포의 배양 방법 및 상기 적용에 적합한 식물 세포 배양물의 추출물 제제에 관한 것이다.

Description

화장 제제 및 이의 제조 방법 {Cosmetic Preparation and Method for Preparing the Same}

본 발명은 내부 및 외부 스트레스 인자에 대항하여 줄기 세포를 보호하기 위한, 특히 줄기 세포의 증식을 촉진하고 아폽토시스에 대항하여 이를 보호하기 위한, 화장 제제에서의 역분화 식물 세포의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 말루스 도메스티카(Malus domestica) (사과) 컬티바 우트윌러 스파에트라우버(cultivar Uttwiler Spaetlauber)의 과실로부터 얻은 역분화 식물 세포의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 역분화 식물 세포의 배양 방법 및 상기 적용에 적합한 식물 세포 배양물의 추출물 제제에 관한 것이다.

줄기 세포 (SC)는 끊임없는 재생성, 및 절단 및 분화에 의해 임의의 다른 세포 유형으로 변하는 독특한 능력을 갖는 동형 미분화 세포이다. 상기 잠재능력에 의해, SC는 인간 조직의 회복가능한 근원이다. 따라서, SC는 다양한 적용, 예를 들어 유전자 요법, 기관 이식, 당뇨 및 성형 수술을 위한 의료 연구의 중요한 대상이 되었다.

SC는 2개의 군, 즉 배아 및 성체로 나눌 수 있다. 배아 줄기 세포 (EC)는 유기체의 1차 발달 단계에 중요한 역할을 한다. 배아 줄기 세포는 끝없이 절단되어 모든 필수 유형의 조직으로 발달한다. 따라서, 배아 줄기 세포는 이것이 유래되는 곳이 식물 형태이든 동물 형태이든 단일 세포로부터 전신을 형성할 수 있다. 이러한 능력 때문에, 이는 다분화능(pluripotent) 세포라고도 불리운다. 유감스럽게도, 인간의 경우에는 이러한 능력이 배아 상태에 국한된다. 대상체 일생의 나중 시기에는 EC가 더이상 존재하지 않는다.

줄기 세포의 두번째 유형은 성체 줄기 세포이다. 지금까지, 이들 세포는 다수의 완전히 성장한 조직 및 기관, 예를 들어 골수, 췌장, 척수, 뇌, 중추 신경계, 말초 혈액, 치수(dental pulp), 혈관, 골격근, 각막, 망막, 간, 제대혈, 심장, 장관 상피 및 진피에서 확인될 수 있었다.

EC와 비교해 볼 때, 상기 조직으로부터 유도된 성체 SC는 단지 제한된 분화 선택성만을 가진다. 이들 중 일부는 하나의 조직 유형, 대부분은 이들 주위의 조직으로만 분화될 수 있다. 따라서, 이는 단분화능 SC라고 불리운다. 다른 SC는 다양한 조직 유형으로 분화될 수 있으므로, 다분화능이라고 불리운다.

성체 SC의 두 유형은 보다 쉽게 이용가능하며 이들의 회수는 ES의 회수보다 윤리적으로 덜 문제가 되기 때문에, 상기 두 유형 모두 의료적 적용에 전도유망하다. SC 및 이들의 가능성에 대한 개론은 [Lemoni et al., 2005, Stem Cell Plasticity: Time for a Reappraisal, Hematologica / The Hematology Journal, 90 (3), 360-381]에서 찾을 수 있다.

포유동물의 피부는 연속적으로 순환하는 다층 시스템이다. 외부 세계와 끊임없이 접촉하고 있는 부분을 표피라고 부른다. 이들 특수화된 조직의 주요 업무는 신체를 탈수, 손상 및 감염으로부터 보호하는 것이다. 이는 모두 소위 각질형성세포라 불리는 단일 세포 유형에 의해 형성되는 4가지 상이한 층으로 이루어진다. 상기 세포 유형은 많이 분화되지는 않지만, 특정된 피부 줄기 세포로부터 유래된다. 이는 표피의 최저 층인 기저층에 위치한다.

몇몇 논문에는 이들 피부 줄기 세포의 성공적인 단리가 보고되어 있다. 심지어 피부 줄기 세포가 피부의 하부 조직, 즉 소위 모낭 돌출부에서 발견될 수 있음이 증명될 수도 있었다. 기저층에서의 SC와 반대로, 상기 SC는 다분화능이고, 즉 모든 피부 조직 유형으로 분화될 수 있다. 이에 대한 개론은 문헌 [Roh et al., 2006, Cutaneous Stem Cells and Wound Healing, Pediatric Research, 59 (4), Pt 2, 100-103R]; [Morasso et al., 2005, Epidermal Stem Cells; The Cradle of Epidermal Determination, Differentiation and Wound Healing, Biol. Cell., 97, 173-183]; 및 [Alonso et al., 2003, Colloquium: Stem Cells of the Skin Epithelium, PNAS, 100, Suppl. 1, 11830-11835]에서 찾을 수 있다.

피부 줄기 세포는 상처 치유 및 피부 및 모발의 재생에 결정적이다. 그러나, 상기 능력의 역량은 유전적 문제, 환경적 영향 및 노화 과정에 의해 교란될 수 있다. 따라서, 상기 SC의 보호는 대단히 중요하다. 그러므로, 하기 더욱 상세하게 설명할 것이지만, 본 발명의 목적은 화장 제제에서 상기 SC를 보호하고 촉진할 수 있는 식물 추출물을 개발하는 것이다.

화장 및 의료적 적용을 위한 식물 추출물 및 식물의 일부, 예를 들어 잎, 과실, 꽃, 줄기, 나무껍질, 꽃차례(inflorescence) 및 뿌리의 용도는 고대부터 공지되어 있다. 이로부터 유도된 산물은 예를 들어 정유, 섬유, 전분, 향, 색소, 항생제, 단백질, 페놀, 산 또는 지방일 수 있다. 화장품에서의 식물 또는 식물 추출물의 용도는 널리 알려져 있다. 습윤, 미백제, 태닝 로션, 메이크업, 햇빛 필터, 스캐빈저, 항산화제, 면역 촉진제, 세제, 보존제 또는 증점제와 같은 매우 다수의 상이한 용도들이 존재한다. 최근 발견된 용도의 예는 KR20040091178, KR20040059007, US20062400129, WO2006099930, WO2006086707, US2006153792, JP2006151934, WO2006068777, WO2006053761, WO2006008418, LV13345, UA73556, CN1679498 및 기타 다수의 문헌에 기재되어 있다.

유용한 식물 및 식물 성분의 범위는 광범위하며, 예를 들어 조류, 다육식물, 베리류, 식충 식물, 허브, 곡식 및 나무를 포함한다. 통상의 공지된 식물의 예는 스피루리나(Spirulina) 조류, 알로에 베라, 카렌둘라, 은행, 인삼, 붓꽃, 쥐오줌풀, 세이지, 라벤더, 타임, 페퍼민트, 성 요한 풀(Saint-John's-wort), 시트론, 복숭아, 구아바, 아보카도, 밀 및 오트 등이나 이에 제한되지 않는다.

그러나, 식물 또는 식물 성분의 사용에 대해서는 제한이 있다. 즉,

- 예컨대 계절, 제한된 저장 용량, 종의 보호, 재배상의 문제점 또는 불량한 수확에 의하여 이용성이 제한될 수 있고,

- 예컨대 계절적 변화, 상이한 배양법, 지형적 차이, 상이한 공급원, 클론, 환경 오염 또는 물리적 상태로 인하여 품질이 변한다.

이러한 사실은 종종 화장품 적용에 식물을 사용하는 것을 불가능하게 만든다.

그러므로, 식물 세포 배양 기술의 방법들을 이용하는 것은 이러한 문제를 해결하는 데 도움을 줄 수 있다. 상기 이용은 특정한 공지된 방법 단계를 관찰해 볼 때 균일한 역분화 세포를 얻게 해 주는 기술을 포함하며, 배양된 전체 식물과 비교시 하기의 장점을 나타낸다:

- 계절로부터의 독립성;

- 연속적 생산:

- 환경 오염 및 기타 불순불로부터의 자유;

- 양과 질 면에서, 관리가능하고 재현가능한 대사체의 생산;

- 희귀하거나 제한된 식물 자원의 보호;

- 시장 이용성에 제한이 없음.

다양한 종의 식물 세포 배양물의 용도, 이의 배양 및 화장 제제에서의 그의 용도에 대한 예는 예를 들어 EP1244464, FR2837385, US2006021084, WO2005108596, WO2005070066에서 발견할 수 있다.

상기 역분화 식물 세포의 배양의 기본 원칙은, 모든 식물 세포는 그 세포가 유래되는 전체 식물을 건설하는 능력을 갖는다는 생물학적 사실을 이용한다. 이 능력은 분화전능성(totipotency)이라고 불리우며, 동물 ES의 다분화성과 비교가능하다. 그러므로, 역분화 식물 세포가 피부 줄기 세포의 보호 및 활성화에 대한 긍정적 영향을 준다는 것을 받아들일 수 있다.

상기 효과를 달성하기 위하여, 다양한 역분화 식물 세포를 사용할 수 있다. 그러나, 추가의 유용한 효과도 또한 상기 식물 추출물을 이용하여 달성할 수 있다. 몇몇 식물군 내에서의 연구로부터 장미과(Rosaceae)의 말로이다에(Maloidae) 아과에 속하는 과실 및 사과가 매우 유망하다는 것이 나타났다. 상기 과에서 잘 알려진 대표물질은 배양된 사과 나무 (말루스 도메스티카)이다. 사과는 화장품 적용에 오랜 전통을 갖고 있다. 원래부터, 이는 수분 및 피부 긴장감을 제공하는 압착 펄프 또는 필링제의 마스크 형태로 적용되었다. 또다른 적용은 모든 종류의 화장 제제, 예를 들어 샴푸, 로션, 비누, 바디 에센스 또는 치약에 사과 방향 및 추출물을 사용하는 것이다.

사과의 주성분은 다양한 당, 비타민, 산, 오일, 왁스 및 폴리페놀이다. 최근 공개된 연구는 특히 폴리페놀이 풍부한 사과 추출물 또는 사과 쥬스에서의 전체 폴리페놀이 결장암을 예방하고 결장암과 싸우는 데 유용할 수 있음을 증명할 수 있었다 (Eberhart et al., 2000, Antioxidant Activity of Fresh Apples, Nature, 405, 903-904; Liu et al., 2003, Antiproliferative Activity of Apples is not due to Phenolic-induced Hydrogen Peroxide Formation, J. Agric. Food Chem., 51, 1718-1723; Kern et al., 2005, Inhibitors of the Epidermal Growth Factor Receptor in Apple Juice Extract, Mol. Nutr. Food Res., 49, 317-328). 이로써, 어느 정도까지는, 폴리페놀이 풍부한 쥬스는 Wnt-경로에 영향을 주었다. 상기 경로는 β-카테닌이 주 단백질인 세포생물학 신호화 캐스케이드이다. 정상 상황에서, 상기 단백질은 세포에 일정한 수준으로 존재한다. 암 세포에서와 같이 상기 수준이 교란되면, β-카테닌 수준은 증가하고, β-카테닌은 세포핵으로 이동하는데, 여기서 이는 유전자 전사를 개시하여 제어되지 않는 절단을 야기한다. 커른(Kern) 등은 시험관내 배양된 결장암 세포에서 세포내 β-카테닌 수준이 사과 쥬스의 투여로 감소되었음을 보여줄 수 있었다 (2006, Modulation of Key Elements of the Wnt-Pathway by Apple Polyphenols, J. Agric. Food. Chem., 54, 7041-7046).

또한, 사과는 큰 항산화 활성을 나타내고, 혈액 중의 항산화 용량을 증가시킬 수 있음이 밝혀졌다 (Rezk et al., 2002, The Antioxidant Activity of Phloretin: The Disclosure of a new Antioxidant Pharmacophore in Flavonoids, Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 9-13; Lee et al., 2003, Major Phenolics in Apple and their Contribution to the Total Antioxidant Capacity, J. Agric. Food Chem., 51, 6516-6520; Vrohovsek et al., 2004, Quantitation of Polyphenols in Different Apple Varieties, J. Agric. Food Chem., 52, 6532-6538; Lotito et al., 2004, Relevance of Apple Polyphenols as Antioxidants in Human Plasma: Contrasting in-vitro and in-vivo Effects, Free Rad. Biol. Med., 36, 201-211; Bitsch et al., 2000, Bioavailability of Antioxidant Compounds from Brettacher Apple Juice in Humans, Food Sci. Emerg. Technol., 1, 245-249). 이러한 이유로, 사과는 역분화 세포 배양물 및 화장 제제에서의 이의 후속 용도를 확립하기 위해 매우 관심있는 대상이다.

역분화 식물 세포는 염, 산, 폴리페놀, 당, 지방, 단백질 및 기타 성분으로 구성된 복잡한 매트릭스를 갖는다. 공지된 성분 이외에, 화장품 적용을 위해 매우 가치있을 수 있는 미공지 성분 분획이 존재한다. 미가공(raw) 식물 추출물은 종종 확인되고 단리된 개별 성분보다 더 양호한 효과를 나타낸다고 공지되어 있다. 그러므로, 상기 적용을 위해 전세포 용균액을 사용하는 것이 합리적이다.

상기 모든 성분들의 총 분획을 얻기 위해서는, 이들 중 일부는 수용성인 반면 다른 부분은 지용성이므로 특별한 기술이 요구된다, 동결건조를 이용한 식물 세포 배양액 제조 방법이 제안되었었다 (예를 들어 WO2005072697, US20050265953). 이후에, 상기 동결건조된 세포를 분쇄하고, 국소 제제에 사용하였다.

피부 장벽을 통한 물질의 이동은 매우 제한되기 때문에, 많은 화장품 적용을 위한 리포좀 생산 기술이 발달되었다 (예를 들어 KR20050091162, KR920005639B, GB2415375, WO2004067012, EP1498420, US2002160064, AU2388099). 상기 기술의 적용으로 물질은 하부 피부층으로 더 잘 침투하게 된다. 또한, 리포좀의 추가의 장점은 막에서의 지용성 성분의 캡슐화 및 이로 인한 수상에서의 이들의 분산이다.

다양한 리포좀 생산 방법이 존재한다. 상기 생산의 주요 단계는 인지질 혼합물을 적합한 용매 (예를 들어 글리세롤 또는 알콜)에 용해시키고, 용해된 지질을 수상과 상호혼합하고, 에너지를 적용시켜 (예를 들어 교반, 진탕, 가압 또는 열에 의해) 리포좀을 형성하는 것을 포함한다. 상기에서와 같이, 에너지의 형태는 가압에 의한 것일 수 있다. 고압 균질화에 의한 리포좀 형성은 공지된 기술이다. 제약 또는 화장 제제에 대한 예는 예를 들어 WO9949716, NZ502840 또는 EP0782847에서 발견할 수 있다. 흥미롭게도, 세포 용해 및 그의 용균액 수득을 위해서 동일한 기술을 사용할 수 있다 (예를 들어 DE19918619). 그러므로, 현탁 배양액의 식물 세포를 용해시키는 동시에 지용성 및 수용성 약제를 비어있는 리포좀으로 추출하는 것이 가능하다. 이로써, 약제의 안정화 및 그의 피부로의 이동이 개선될 수 있다.

상기 언급된 공보 WO 2005/072697 A1에는, 피부를 탈색소화하기 위해 역분화 식물 세포의 동결건조물을 사용하는 것이 공지되어 있다. 상기 기술은 역분화 식물 세포, 특히 호염성 식물 세포의 동결건조물의 사용을 요구한다. 피부 줄기 세포의 자극 및 보호를 위한 용도는 파악되지 않는다.

공보 EP 1,174,120 A1에는, 면역을 자극하기 위해 붓꽃과(Iridaceae) (붓꽃 계통) 식물의 역분화 세포의 추출물, 특히 동결건조물을 사용하는 것이 공지되어 있다. 다른 식물 또는 용도는 제안되어 있지 않다.

공보 EP 1,064,932 A1은 데오도란트에서의 역분화 식물 세포의 추출물의 용도를 제안한다. 다른 용도는 개시되어 있지 않다.

공보 WO 03/077881 A는 복잡한 방법으로 얻어지는 포도나무의 역분화 세포의 대사체의 용균액을 화장품 제조를 위해 사용하는 것을 개시하고 있다. 상기 기술은 동결건조물의 사용을 요구한다. 피부 줄기 세포의 자극 및 보호를 위한 사용은 파악되지 않는다. 또한, 다른 종의 식물은 개시되어 있지 않다.

또한, 공보 WO 01/47538 A1은 레온토포디움(Leontopodium) (에델바이스) 속 식물의 역분화 세포의 추출물을 UV 필터로 사용하는 것을 개시하고 있다. 다른 용도 또는 다른 식물은 제안되어 있지 않다.

발명의 목적

본 발명의 주요 목적은 내부 및 외부 스트레스 인자에 대항하여 줄기 세포를 보호하는, 특히 줄기 세포의 증식을 촉진하고 아폽토시스에 대항하여 줄기 세포를 보호하는 화장 제제를 제조하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장 제제에 사용하기에 적합한 추출물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

상기 목적은 역분화 식물 세포, 바람직하게는 장미과(Rosaceae) (장미 계통), 특히 말로이다에 아과 (이과(Pome) 과실), 더욱 특히, 오래되고 희귀한 사과 종류인 말루스 도메스티카 컬티바 우트윌러 스파에트라우버의 역분화 식물 세포의 현탁액의 추출물을 사용함으로써 달성된다.

바람직한 실시양태의 기술

적합한 추출물의 제조 방법은 하기 주요 단계:

(a) 안정한 역분화 세포주를 실험실 규모로 확립하는 단계;

(b) 원-웨이 백(bag) 반응기 시스템 (소위 웨이브(Wave) 반응기)에서 세포를 대량 배양하는 단계, 및

(c) 비어있는 리포좀을 이용하여 고압 균질화로 총-추출물을 회수하는 단계

를 포함한다.

유리하게는, 단계 (c)에서 하기 절차:

- 고압 균질화에 의한 식물 세포의 분해;

- 리포좀에 의한 내용물 성분의 추출 및 안정화

가 후속되며, 여기서 상기 두 단계를 하나의 단일 단계로 동시에 수행한다.

본 발명에 따라 내부 및 외부 스트레스 인자에 대항하여 줄기 세포를 보호하는 화장 제제를 수득할 수 있다. 또한 본 발명에 따라 상기 화장 제제에 사용하기에 적합한 식물 세포 배양물의 추출물을 제조할 수 있다.

첨부된 도면에서:

도 1은 컬티바 우트윌러 스파에트라우버 사과의 역분화 세포로부터 유래된 리포좀 추출물의 여러가지 농도에 따른 제대 줄기 세포의 세포수 증가를 나타낸다. 상기 연구를 위해, 추출물을 원심분리하고 여과로 멸균하였다.

도 2는 컬티바 우트윌러 스파에트라우버 사과의 역분화 세포로부터 유래된 리포좀 추출물의 여러가지 농도에 따른 제대 줄기 세포의 MTS-분석에서의 증식 능력 증가를 나타낸다. 상기 연구를 위해, 추출물을 원심분리하고 여과로 멸균하였다.

도 3은 제대 줄기 세포의 현미경 사진을 나타낸다. 좌측 사진은 추출물 없는 배지에서 배양된 세포를 나타내며, 우측 사진은 컬티바 우트윌러 스파에트라우버 사과의 역분화 세포로부터 유래된 리포좀 추출물 0.1％와 함께 배양된 세포를 나타낸다. 상기 연구를 위해, 추출물을 원심분리하고 여과로 멸균하였다.

도 4는 UV 조사(irradiation) 후 48시간에 대조군 제제의 제대 줄기 세포의 증식 능력 및 컬티바 우트윌러 스파에트라우버 사과의 역분화 세포로부터 유래된 여러가지 농도의 리포좀 추출물의 증식 능력을 나타낸다. 상기 연구를 위해, 추출물을 원심분리하고 여과로 멸균하였다.

도 5는 모낭의 길이에 대한 실시예 10에 따른 리포좀 추출물의 일시적 효과를 나타낸다.

도 6은 상기 기재된 시험 1에서의 주름개선 크림으로서 본 발명에 따른 제제의 효과를 나타낸다.

도 7은 상기 기재된 시험 2에서의 스트레스 받은 피부에 대한 본 발명에 따른 제제의 효과를 나타내다.

도 2 및 4에서 "OD"는 "광학 밀도"의 약자이다.

발명의 상세한 설명

세포주의 유도 및 안정화 (a)

하기 단계는 식물 조직으로부터 역분화 세포주를 제공한다:

(a1) 유도에 적합한 조직의 선택.

(a2) 표면 멸균.

(a3) 캘러스 유도에 적합한 고체 배지에서 식물추출물(explantate)의 클래딩.

(a4) 식물추출물의 손상된 표면에서 성장한 캘러스의 수확.

(a5) 수득된 캘러스를 세포가 완전히 역분화될 때까지 동일한 배지에서 계대배양.

(a6) 역분화 세포를 적합한 액체 배지에 첨가.

(a7) 큰 세포 덩어리가 더이상 존재하지 않을 때까지 세포를 현탁액에 균질화; 및

(a8) 계대배양 및 세포 현탁액의 연속적 특징규명.

식물 세포 배양물에 대한 기본적 작업 프로토콜은 표준 문헌 (예를 들어 [Plant Cell Culture: A Practical Approach, Editor P.A. Dixon, 1994, Oxford University Press])에서 발견할 수 있다. 사과의 식물 세포 배양을 개시하기 위한 작업 프로토콜 및 적합한 배지는 문헌 [Nitsch et al., 1970, Bases physiologiques de la production de chair de pomme et de poire in vitro, Bull. Soc. Bot. Fr., 117, 479-492]; 및 [Pech et al., 1975, Croissance in vitro de tissues et de suspensions cellulaires de pomme, Bull. Soc. Bot. Fr., 122, 183-194]에 기재되어 있다. 상기 프로토콜에 따르면, 이러한 배양의 개시 및 유지는 문제를 일으켜서는 안된다.

바이오매스 생산 (b)

하기 공정에서는, 수득된 현탁액 배양액을 작은 실험실용 플라스크 (보통 200 ml 용량을 갖는 에를렌마이어 플라스크)로부터의 몇가지 연속 단계를 거쳐 50 내지 100 L의 생산 규모로 추가로 배양한다. 이 공정에서는, 완전히 성장한 세포 현탁액의 다음 배양 부피의 5 내지 10％, 바람직하게는 10％를 접종물로 사용한다. 예를 들어 0.1 / 1 / 10 / 100 L의 단계로 정률-증가(scale-up)를 수행할 수 있다.

1 L를 초과하는 배양 부피는 이전에 사용된 배양 플라스크 대신에 특별한 생반응기를 사용할 것을 필요로 한다. 다수의 상이한 시스템이 시판되고 있다. 교반 반응기, 버블 컬럼, 루프 반응기 또는 식물 세포 배양에 적합한 새로 개발된 원웨이 시스템에서 (그러나 이에 제한되지 않음) 배양을 수행한다. 배양물을 손상시킬 수 있는 전단 응력의 영향이 상기 모든 배양물에 결정적이다. 따라서, 적합한 반응기 시스템을 선택하기 위한 가장 중요한 파라미터는 보통 배양물을 균질화하는 방식이다.

더욱이, 배양물의 제어가 매우 중요하다. 효모 또는 박테리아의 배양과 비교할 때, 바이오매스의 측정은 난해하며, 바이오매스의 성장은 간접적 파라미터, 예를 들어 탄소 소비, 전도율 또는 pH 값의 강하 또는 광학 밀도의 증가에 의해 측정되어야 한다. 일단 이러한 제어가 확립되면, 각각 종말점 또는 수확 시점을 정할 수 있다.

또한, 세포 배양물에 대해 특징적인 2차 대사물질의 조사 분석도 중요하다. 이러한 물질의 측정은 HPLC-VIS/UV/MC, LC, GC-MS에 의해, 예컨대 효소적으로 또는 광학적으로 수행할 수 있다. 이로써, 전체 공정 동안의 상기 대사체의 안정하고 연속적인 발현이 결정된다.

바이오매스 프로세싱 (c)

배양된 세포의 전체 실체(essence)를 함유하는 추출물을 수득하기 위하여, 리포좀을 이용하여 세포를 가용화한다. 상기 방법의 주요 요소는 리포좀 제조와 더불어 전세포 브로쓰의 고압 균질화의 사용이다. 상기 방법의 가장 큰 장점은 간단한 저비용 적용이다.

상세하게는, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

(c1) 적합한 리포좀 제제를 세포 브로쓰에 첨가;

(c2) 적합한 보존제의 첨가;

(c3) 적합한 항산화제의 첨가;

(c4) 물질들의 혼합; 및

(c5) 고압 균질화.

화장품에 허용되는 천연 또는 합성 기원의 모든 보존제, 예를 들어 페녹시에탄올, 벤조산, 프로피온산, 알콜 또는 염화은을 보존제로 사용할 수 있다.

추출물을 산화로부터 추가로 보호하기 위하여, 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 또는 토코페롤을 첨가할 수 있다.

기재된 방법은 상기 제제 또는 화장품에 유용한 추가 성분의 첨가를 허용한다. 모든 화합물을 첨가하면, 보존제 및 기타 성분들을 용해시키기 위하여 혼합물을 교반해야 한다. 이는 예를 들어 패들 믹서, 균질화 막대기를 이용하여 또는 정적 혼합 부재를 통한 펌핑에 의해 수행할 수 있다.

후속적 고압 균질화에 의해 하기 목적을 달성한다:

- 추출가능한 물질을 방출하기 위한 세포막의 파괴; 및

- 지용성 및 수용성 세포 분획을 함유하는 미세하게 분산된 리포좀의 생성.

적합한 고압 균질화기는 시판되고 있다. 반응 챔버의 원칙은 상이한 가능성으로부터 선택되어야 하며, 미리 시험되어야 한다. 모든 세포막의 붕해 또는 추출물의 원하는 동질성에 도달하기 위해 필요한 반응 챔버 통과 횟수도 또한 시험되어야 한다.

그 후, 상기 방식으로 수득된 추출물을 화장 제제, 예를 들어 크림, 비누, 로션, 겔 또는 헤어 세럼에 직접 혼입시킬 수 있다. 추출물을 반완료 제품으로 사용해야 한다면, 보조 증점제가 가능하다. 화장품에 허용되는 천연 또는 합성 기원의 모든 증점제를 증점제로 사용할 수 있다.

실시예

실시예 1

역분화 식물 세포 배양물의 제조

컬티바 우트윌러 스파에트라우버의 숙성된 사과를 수돗물로 세정하였다. 코르크 천공기를 이용하여 축을 따라 약 1 cm 직경의 원통형 조각을 도려내었다. 표면 멸균을 위해, 원통형 조각을 30초 동안 70％ 에탄올에 담근 후, 계면활성제 트윈 40을 0.1％ 함유하는 2.5％ 차아염소산에 10분 동안 담갔다. 그 후, 멸균된 원통형 조각을 증류수로 3회 세척하고, 약 3 mm 두께의 슬라이스로 절단하고, 1 L 당 하기 조성을 갖는 고체 배지에 놓았다:

염화칼슘 332 mg

인산이수소칼륨 170 mg

질산칼륨 1900 mg

황산마그네슘 180.54 mg

질산암모늄 1650 mg

염화코발트 6수화물 0.025 mg

황산구리 5수화물 0.025 mg

철-나트륨-EDTA 36.7 mg

붕산 6.2 mg

요오드화칼륨 83 mg

황산망간 수화물 16.9 mg

몰리브덴이나트륨 2수화물 0.25 mg

황산아연 7수화물 8.6 mg

미오-이노시톨 100 mg

니코틴산 5 mg

글리신 2 mg

피리독신 히드로클로라이드 0.5 mg

티아미딘 히드로클로라이드 0.5 mg

엽산 0.5 mg

비오틴 0.05 mg

아스코르브산 50 mg

티오우레아 25 mg

L-아스파라긴 180 mg

사카로스 30000 mg

수산화나트륨 용액으로 pH 값을 5.6으로 조정하였다. 한천을 겔화제로서 0.8％ 농도로 첨가하였다. 모든 성분을 함께 혼합하고, 121℃에서 15분 동안 멸균하였다.

1차 캘러스의 유도를 25℃의 암소에서 수행하였다. 2 내지 3주 후에 형성된 캘러스를 수확하고, 동일한 배지에서 추가로 인큐베이션하였다. 캘러스가 완전히 분화될 때까지 몇개의 계대배양을 수행하였다.

실시예 2

현탁 배양액의 제조

상기 고체 배지에서 성장하는 역분화 세포 덩어리를 취해 균질화하고, 겔화제가 없는 동일한 배지에 놓았다. 미세하게 분산된 현탁액을 수득하였고, 이를 보다 큰 배양 시스템에 사용할 수 있었다. 현탁액을 25℃의 암소에서 약 100 rpm의 진탕 속도에서 성장시켰다.

실시예 3

대량 배양

완전히 성장한 배양물의 10분의 1 (배양물의 총중량의 약 50％가 되는 세포의 비율)을 다음 부피 단계의 시딩에 사용하였다. 웨이브 바이오테크 아게(Wave Biotech AG; 스위스 타겔스방겐(Tagelswangen) 소재)의 원웨이 백 반응기 시스템 (소위 웨이브 반응기)에서 정률-증가를 수행하였다. 1 / 10 / 25 L의 단계로 정률-증가를 수행하였다. 온도를 25℃에서 유지하고, 약 0.1 vvm로 통기(aeration)하였다. 사용된 백에 따라 다양한 혼합 속도를 적용하였다. 암소에서 배양을 수행하였으며, 백이 완전히 성장할 때까지 약 20일이 소요되었다.

실시예 4

리포좀 추출물의 제조

배양 후, 전세포 브로쓰를 약 50 ㎚ 크기의 비어있는 리포좀을 함유하는 분산액과 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 약 1200 bar (1,2＊10⁸ N m^-2)의 압력에서 4회 고압 균질화하여 미세하게 분산된 추출물을 수득하였다.

실시예 5

배니싱 크림

％는 총량에 대한 것이다 (중량/중량).

유상 1:	알킬 벤조에이트	10％
	디메티콘	3％
	아르키딜 글리코시드	3％
	미리스틸 글리코시드	2％
유상 2:	폴리아크릴아미드	1％
수상:	탈염수	71％
	글리세롤	5％
	페녹시에탄올	1％

유상 1 및 수상을 80℃에서 가열하고 블렌딩하였다. 혼합물을 60℃로 냉각시켰다. 이어서, 유상 2를 첨가하고, 혼합물을 블렌딩하였다. 혼합물을 30℃로 냉각시켰다. 실시예 4에 기재된 추출물 4％를 첨가하고, 혼합물을 다시 블렌딩하였다.

실시예 6

두피용 액체 밤(balm)

％는 총량에 대한 것이다 (중량/중량).

에탄올 0.5％

우레아 5％

프로필렌 글리콜 0.5％

카르보머 0.4％

비사보롤렌 0.1％

PEG-60 0.6％

D-판테놀 75％ 0.5％

수산화나트륨 30％ 0.4％

실시예 4의 식물 세포 추출물 1％

물 100％가 될 때까지

실시예 7

집중 헤어 마스크

％는 총량에 대한 것이다 (중량/중량).

상	성분	양
수상 1 (W1)	물	100％가 될 때까지
	시트르산	0.6％
	벤조산나트륨	0.5％
수상 2 (W2)	D-판테놀 75％	0.7％
유상 1 (O1)	세테아릴 알콜	4.5％
	디코코일에틸 히드록시에틸모니움 메토설페이트	3％
	디스테아로일에틸 히드록시에틸모니움 메토설페이트	1.5％
	디카프리릴 에테르	1％
	글리세롤 스테아레이트	1％
유상 2 (O2)	아미노 디메티콘	0.3％
식물 추출물 (A)	실시예 4의 식물 세포 추출물	2％

실행:

수상 1을 혼합하고 75℃로 가열하였다. 유상 2와 혼합하기 직전에 수상 2 (판테놀)를 첨가하였다. 유상 1을 75℃로 가열하고, 혼합하기 직전에 유상 2 (아미노디메티콘)를 첨가하였다. 합한 수상 및 유상을 혼합하고, 균질화하였다. 혼합물을 30℃로 냉각하고, 상 A (식물 추출물)를 첨가하였다.

실시예 8

아이 크림

％는 총량에 대한 것이다 (중량/중량).

상	성분	양
수상 1 (W1)	물	100％가 될 때까지
	시트르산	0.6％
	글리세롤	5％
	부틸렌 글리콜	5％
	갈락토 아라비난	0.3％
	페녹시에탄올 중의 파라벤	0.8％
유상 1 (O1)	폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트	2.5％
	수소화 폴리이소부텐	3％
	식물유	4％
	디카프리릴 에테르	3％
	베헤닐 알콜	2％
	디메티콘	0.5％
유상 2 (O2)	옥수수 인산염	1％
유상 2 (O2)	디메티콘	0.5％
식물 추출물 (A)	실시예 4의 식물 세포 추출물	2％

실행:

수상을 혼합하고 80℃로 가열하였다. 유상 1을 80℃로 가열하고, 유상 2를 첨가하였다. 합한 수상 및 유상을 혼합하고, 균질화하였다. 혼합물을 30℃로 냉각하고, 상 A (식물 추출물)를 첨가하고, 블렌드를 다시 혼합하였다.

실시예 9

줄기 세포에서의 시험관내 시험

제대로부터 유래된 줄기 세포에서 시험을 수행하였다. 소 태아 혈청 10％를 함유하는 복합 배지에서 세포를 성장시켰다. 세포 부스러기가 없는 상등액을 시험에 사용하였다. 시험 전에, 추출물을 여과로 멸균하였다.

추출물 0.1％의 첨가로, 약 44％의 세포수 증가를 얻었다 (도 1 및 3).

또한, 추출물 0.1％의 첨가에 대한 후속 MTS-분석에서, 20％의 세포 증식 능력 증가가 증명될 수 있었다 (도 2).

상기 성장 및 증식 연구 이외에, 컬티바 우트윌러 스파에트라우버 사과의 역분화 세포의 리포좀 추출물과 함께 제대 세포를 UV 조사의 효과에 대해 시험하였다. 추출물 0.1％의 적용으로 약 7％의 증식 능력 감소를 얻은 반면, 대조군 제제는 42％의 증식 능력 소실을 나타내었다 (도 4).

실시예 10

단리된 모낭에서의 생체외 시험

모근의 상피는 각질형성세포 줄기 세포 영역인 기저위 돌출부로 돌출되어 있다. 이는 피부 및 모낭을 재생시키는 한무리의 하위집단으로 이루어진다. 따라서, 단리된 모낭은 줄기 세포의 기대 수명을 분석하기 위한 적합한 모델이다.

모낭을 미용 수술로 얻은 피부 물질로부터 단리하였다. 이어서, 이를 영양소 용액에 넣었고, 여기서 이는 생존하여 성장을 시작하였다. 상기 방식으로, 모낭을 약 14일 동안 생존상태로 유지될 수 있었다. 그 후, 세포는 사멸하기 시작하였고, 새로 형성된 머리카락은 수축하기 시작하였다. 12개 모낭의 대조군 분석물은 영양소 용액에서만 인큐베이션한 반면, 제2 시리즈는 컬티바 우트윌러 스파에트라우버 사과의 역분화 세포의 리포좀 추출물 0.2％를 함유하는 영양소 용액에서 인큐베이션하였다. 16일, 18일 및 20일째에, 모낭의 길이를 측정하였다.

생체외 시험은 예상한 바와 같이, 대조군 분석물의 모낭이 16일에 이미 그 길이의 약 6％가 손실되었음을 나타내었다. 유사한 수축이 18일에 나타날 수 있었다. 이어서, 20일에, 52％라는 상당량의 사멸이 측정가능하였다. 추출물로 처리한 모낭은 성장기에 더 오래 존재하였다. 16일에, 8％의 길이 증가를 여전히 측정할 수 있었다. 18일까지는 약간의 수축도 발생하지 않았다. 20일에서의 사멸은 대조군 분석물보다 명백히 더 적었다.

상세하게는, 하기와 같은 길이 변화가 검출되었다. 이는 도 5에 도식으로 나타낸다.

	대조군	추출물
16일	-5.7％	7.8％
18일	-5.3％	-4.8％
20일	-52％	-35％

따라서, 실시예 10은 컬티바 우트윌러 스파에트라우버 사과의 역분화 세포의 리포좀 추출물이 각질형성세포 줄기 세포의 기대 수명을 연장시킬 수 있음을 나타낸다.

피부 시험

시험 1

피토셀테크(PhytoCellTec) ^TM 말루스 도메스티카의 주름개선 효과

더마 컨설트 게엠베하 (Derma Consult GmbH; 독일 D-53347 알프테르 소재)의 에이치. 피. 니센(H. P. Nissen) 박사는 하기 피부 시험을 수행하였다. 피토셀테크^TM 말루스 도메스티카는 본 발명에 따라 제조된 제품에 대한 출원인의 상표명이다.

시험 제품

· 피토셀테크^TM 말루스 도메스티카 2.0％를 함유하는 크림

시험 영역

· 눈가 주름(Crow's feet) 영역

지원자

· 개인수: 20명

· 연령: 37 내지 64세

· 성별: 여

적용

· 기간: 28일

· 빈도: 1일 2회

시험 파라미터

· GF메스테크니크 게엠베하 (GFMesstechnik GmbH; 독일 D 14513 텔토우 소재)의 기구 프리모스(PRIMOS)® 5.5를 이용한 주름 깊이

연구 고안

· 0일

시험 영역에서의 시험 파라미터의 측정; 시험 제품의 제1 적용

· 1일 내지 13일

1일 2회 시험 제품의 적용

· 14일

매일의 시험 제품 적용의 마지막 적용 후 8 내지 12시간에서 시험 파라미터 측정

· 15일 내지 27일:

1일 2회 시험 제품의 적용

· 28일:

결과

28일 동안 피토셀테크^TM 말루스 도메스티카 2％를 함유하는 시험 크림을 2개 매일 적용한 결과, 시험한 지원자의 모두에서 주름 깊이의 상당한 감소가 얻어졌다. 상기 결과를 도 6에 나타낸다.

시험 2

스트레스 받은 피부에 대한 피토셀테크 ^TM 말루스 도메스티카의 효과

바이오얼터너티브즈(BIOalternatives; 프랑스 F 86160 소재)의 에프. 주호(F. Juchaux)씨는 하기 피부 시험을 수행하였다. 피토셀테크^TM 말루스 도메스티카는 본 발명에 따라 제조된 제품에 대한 출원인의 상표명이다.

소개

정상 피부에서, 종양 억제 유전자 p53은 몇몇 유형의 스트레스, 예를 들어 DNA 손상 (UV 조사, IR 조사 또는 과산화수소와 같은 화학 약제로 유도됨), 산화 스트레스 또는 삼투압 쇼크에 의해 상향조절된다. 단백질 p53은 전사 조절자로서 세포 주기에서 중요한 역할을 한다. 나이 든 피부에서는, 상기 유전자가 더이상 상향조절되지 않고 스트레스에 의해 하향조절된다.

시험 제품

피토셀테크^TM 말루스 도메스티카 2.0％

세포

· 정상 인간 피부 섬유모세포 (NHDF)를 10번째 계대접종으로 사용함

분석

섬유모세포에 H₂O₂ 600 μmole을 함유하는 세포 배지로 2시간 동안 스트레스를 주었다. 회복을 위해, 세포를 72시간 동안 피토셀테크^TM 말루스 도메스티카 2％를 함유하는 배지 또는 함유하지 않는 (대조군) 배지에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 후, mRNA를 추출하고, 역전사를 통해 ³³P-표지된 cDNA로 전사시켰다. 상기 표지된 cDNA 표적을 "나이 든 피부" 특이적 미니칩과 혼성화하였다. 상기 미니칩은 피부 노화에 특이적인 약 150개의 유전자를 함유하였다. 미니칩에서 표지된 유전자의 함량을 측정하였다.

결과

H₂O₂-스트레스 받은 섬유모세포에서, p53은 하향조절되었다. 2％ 피토셀테크^TM 말루스 도메스티카로 처리한 H₂O₂-스트레스 받은 세포는 p53의 상향조절을 나타내었다. 상기 결과를 도 7에 나타낸다.

Claims

내부 및 외부 스트레스 인자에 대항하여 줄기 세포(stem cell)를 보호하는 하나 이상의 활성 성분을 포함하며, 상기 활성 성분은 역분화 식물 줄기 세포 현탁액으로부터 유래된 것인 화장 제제.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 활성 성분이 줄기 세포의 증식을 촉진하는 것인 화장 제제.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 활성 성분이 아폽토시스에 대항하여 줄기 세포를 보호하는 것인 화장 제제.
제1항에 있어서, 상기 보호될 줄기 세포가 피부 줄기 세포인 화장 제제.
제1항에 있어서, 상기 보호될 역분화 식물 줄기 세포가 모낭 줄기 세포인 화장 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역분화 식물 줄기 세포가 장미과(Rosaceae) 식물로부터 유래된 것인 화장 제제.
제6항에 있어서, 상기 역분화 식물 줄기 세포가 말로이다에(Maloidae) 아과(subfamily) 식물로부터 유래된 것인 화장 제제.
제7항에 있어서, 상기 역분화 식물 줄기 세포가 말루스 도메스티카 컬티바 우트윌러 스파에트라우버(Malus domestica cultivar Uttwiler Spaetlauber) 식물로부터 유래된 것인 화장 제제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역분화 식물 줄기 세포 현탁액이 리포좀과의 고압 균질화로 수득되는 것인 화장 제제.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 역분화 식물 줄기 세포 현탁액 0.01 내지 100 중량％를 포함하는 화장 제제.
제10항에 있어서, 역분화 식물 줄기 세포 현탁액 0.1 내지 10 중량％를 포함하는 화장 제제.
- 고압 균질화에 의한 식물 세포의 분해; 및

- 리포좀에 의한 성분들의 추출 및 안정화

절차를 포함하며, 상기 두 절차 모두를 단일 단계로 동시에 수행하는 것인, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 화장 제제에 사용하기 위한 역분화 식물 줄기 세포 현탁액의 제조 방법.