CN114588100A - 大量含有愈伤组织代谢产物的愈伤组织溶解产物及其制备方法 - Google Patents

大量含有愈伤组织代谢产物的愈伤组织溶解产物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在愈伤组织代谢产物的无散失状态下含有愈伤组织代谢产物的愈伤组织溶解产物及其制备方法、含有用天然高分子材料被覆上述愈伤组织溶解产物而胶囊化的愈伤组织溶解产物的胶囊及其制备方法、包含含有上述愈伤组织溶解产物或愈伤组织溶解产物的胶囊作为有效成分的皮肤外用剂及化妆品组合物等。本发明的愈伤组织溶解产物的愈伤组织代谢产物无散失且大量含有，由此可直接而快速地将愈伤组织代谢产物浸透及吸收到皮肤中，由此通过愈伤组织代谢产物可预防及改善皮肤的多种症状及疾病。

Description

大量含有愈伤组织代谢产物的愈伤组织溶解产物及其制备 方法
技术领域
本发明涉及大量含有愈伤组织代谢产物的愈伤组织溶解产物、上述愈伤组织溶解产物的制备方法及包含上述愈伤组织溶解产物的组合物。
背景技术
愈伤组织通常是指植物中未分化的无定形的柔细胞团块。这种愈伤组织具有通过植物生长调节物质等的处理可分化为整体植物的全能性，因此还可被称为植物干细胞。最近，在无植物体损坏的情况下通过组织培养技术来大量培养愈伤组织细胞，可生产多种植物来源的代谢产物，因此愈伤组织培养具有很大的工业实用性。
由于愈伤组织是植物来源的细胞，因此被由人体内不分解的纤维素、果胶、木质素等形成的细胞壁包围。即使因这种理由将愈伤组织本身涂布于皮肤上，人体皮肤也没有纤维素分解酶，难以分解细胞壁，愈伤组织是微小尺寸，因此通过用手按压涂抹的物理力很难分解细胞壁，由此不能将愈伤组织内的代谢产物吸收到皮肤中。即，仅通过愈伤组织本身不能将愈伤组织内的代谢产物作为有用成分直接利用于人体皮肤。
对此，试图采用用于将愈伤组织内的代谢产物作为有用成分利用于人体的多种方法。有一种方法是利用对特定成分的溶解性高的有机溶剂，从愈伤组织中提取及分离纯化有用成分的方法。但是，上述方法存在如下问题，不容易以高效率提取有用成分，为了实现规定程度的有用成分含量而重复进行分馏及浓缩的过程中不适于皮肤的有机溶剂被大量使用。并且，使用了未使用有机溶剂的超临界提取等方法。但是，对于超临界提取方式而言，需要昂贵的设备，或者在开动工序时的耗能量大，因此在工业上很难实现有优点的经济性。
而且，上述以往的提取法不能均利用植物的所有营养成分，而是一种仅高集成化一部分有用成分的方法，因此除了未被高集成化的有用成分以外的成分被消失或废弃，无法充分利用愈伤组织内的代谢产物，相比于费用所获得的利益并不大。
以往愈伤组织相关授权或公开专利(韩国授权专利第10-1791641号、韩国授权专利第10-0931768号、韩国公开专利第10-2020-0011239号等)中，均对愈伤组织进行溶剂提取或超临界提取，来将愈伤组织内的有用成分适用于人体皮肤，如上问题依然成为要解决的问题。
对此，本发明人为了开发出将愈伤组织内的代谢产物作为有用成分利用于人体的方法而锐意努力的结果显示，在特定压力下对愈伤组织进行机械均质破碎时，在愈伤组织内的代谢产物无散失的情况下，不仅可将愈伤组织内的代谢产物作为有用成分适用于人体，而且显著提高人体皮肤的渗透力及吸收力，由此可显著提高对人体皮肤的多种效果，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一目的在于，提供如下的在愈伤组织代谢产物无散失的状态下含有愈伤组织代谢产物的愈伤组织溶解产物制备方法，包括：在特定压力下对愈伤组织进行机械均质破碎的愈伤组织的机械均质破碎步骤。
本发明的另一目的在于，提供通过上述方法制备的愈伤组织溶解产物。
本发明的另一目的在于，提供用于提高上述愈伤组织溶解产物的保存力及稳定性的上述愈伤组织溶解产物的胶囊化方法。
本发明的另一目的在于，提供含有上述胶囊化的愈伤组织溶解产物的胶囊。
本发明的又一目的在于，提供包含上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊的愈伤组织代谢产物的皮肤渗透力及皮肤吸收力得到提高的组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含上述组合物的皮肤保湿增进、皮肤皱纹预防或改善、皮肤美白、皮肤弹性增进或肤色改善用皮肤外用剂组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含上述组合物的皮肤保湿增进、皮肤皱纹预防或改善化妆品组合物、皮肤美白、皮肤弹性增进或肤色改善用化妆品组合物。
本发明的又一目的在于，提供一种皮肤保湿增进、皮肤皱纹预防或改善、皮肤美白、皮肤弹性增进或肤色改善方法，其包括：将上述皮肤外用剂或化妆品组合物给药到对象的步骤。
作为一个实施方式，本发明提供在愈伤组织代谢产物无散失的状态下含有愈伤组织代谢产物的愈伤组织溶解产物制备方法，其特征在于，包括：在特定压力下对愈伤组织进行机械均质破碎的愈伤组织的机械均质破碎步骤。
在本发明中，术语“愈伤组织”是指植物中未分化的无定形的柔细胞团块，可以是从植物组织中分离的愈伤组织、通过诱导植物外植体的脱分化过程而获得的愈伤组织或培养上述愈伤组织而增殖的愈伤组织。
上述植物统称木本植物或草本植物。作为例子，有苹果树、梨树、柿子树、葡萄树、银杏树等果树；松树、果松树、落叶松等针叶树；连翘、木莲、樱树等阔叶树；大波斯菊、大花马齿苋、豆等一年生草本树；大麦、小麦、荠菜、拟南芥等二年生草本树；蒲公英、桔梗、艾蒿等多年生草本树等。
作为一个具体例，杀菌植物的枝子之后，置床于愈伤组织诱导用培养基之后，诱导愈伤组织，并对该诱导的愈伤组织进行继代培养，由此可制备大量的愈伤组织。
上述愈伤组织诱导用培养基可使用本领域公知的基本培养基等，诸如可使用MS培养基、SH培养基、N6培养基、B5培养基等。上述愈伤组织诱导用培养基为固体培养基，在上述基本培养基中可追加琼脂或蛋白石(gelite)等。并且，上述愈伤组织诱导用培养基根据需要还可包含糖(sugar)、无机盐类、维生素、氨基酸、生长调节物质等。上述生长调节物质并不是务必局限于次，诸如有吲哚乙酸(A A，indole acetic acid)、萘乙酸(NAA，naphthalene acetic acid)、玉米素(Zeatin)、6-苄基氨基嘌呤(BA，6-Benzylaminopurine)、激动素(kinetin)等。上述生长调节物质可混合使用1种或2种以上。
上述愈伤组织诱导，可在本领域公知的温度条件诸如在20至30℃以及诱导期间诸如5周至10周内执行。
上述愈伤组织继代培养，可在本领域公知的愈伤组织生长培养用培养基中执行，优选地可在气浮型生物反应器内的液体培养基中执行。上述液体培养基有MS培养基、SH培养基等，根据需要还可包含糖(sugar)、无机盐类、维生素、氨基酸、生长调节物质等。
上述愈伤组织继代培养，在本领域公知的温度条件诸如在20至30℃及继代培养周期可以为诸如2周至6周。
因此，含有本发明的愈伤组织代谢产物的愈伤组织溶解产物制备方法，在高温状态下对愈伤组织进行机械均质破碎的愈伤组织机械均质破碎步骤之前，还可包括愈伤组织收集步骤。
上述愈伤组织收集步骤如上所述包括：从植物组织中分离愈伤组织来收集的步骤和/或收集通过诱导植物外植体的脱分化过程而生成的愈伤组织的步骤。
并且，上述愈伤组织收集步骤可以是通过培养从植物组织中分离愈伤组织来收集的愈伤组织或通过诱导植物外植体的脱分化过程而生成的愈伤组织并使其增殖的愈伤组织的收集步骤。
上述愈伤组织培养如上所述可在本领域通知的愈伤组织生长培养用培养基，尤其在气浮型生物反应器内的液体培养基中执行。上述液体培养基有MS培养基、SH培养基等，根据需要还可包含糖(sugar)、无机盐类、维生素、氨基酸、生长调节物质等。
并且，本发明的上述愈伤组织还包含从愈伤组织中分化的体细胞胚(somaticembryo)，只要本说明书中没有不同规定的情况下，上述愈伤组织包含从愈伤组织中分化的体细胞胚。
在本发明的愈伤组织代谢产物无散失的状态下含有愈伤组织代谢产物的愈伤组织溶解产物制备方法，包括：在高压状态下对愈伤组织进行机械均质破碎的步骤。
上述“机械均质破碎”是指利用球磨机(ball mill)或珠磨机(bead mill)式、转子/定子(rotor/stator)式或浆(blade)式的均质机，将所目的的物质通过机械装置破碎及均质的过程。
上述机械均质破碎在高压状态，即在200至2000bar的压力条件，更优选地在300bar至1800bar的压力条件、更优选地在500bar至1500bar的压力条件下执行。上述压力范围小于200bar时，愈伤组织内的代谢产物向细胞壁外露出的效率低，由此无法期待基于愈伤组织代谢产物的效果。当上述压力范围超过2000bar时，愈伤组织内的代谢产物，尤其有用成分被过度的压力发生性状变异或破坏，无法期待愈伤组织代谢产物带来的效果，发生变色及变味，由此不适合用作以下描述的组合物。
并且，上述机械均质破碎在高压状态下每1次执行15分至30分钟，优选地执行18至22分钟，更优选地执行19分钟至21分钟，最优选地执行20分钟。并且，上述机械均质破碎执行2次至5次，优选地执行2次至4次，更优选地执行3次。当上述执行次数及每1次执行时间小于上述范围时，防止愈伤组织代谢产物的洗脱及分散的细胞壁不充分破坏，愈伤组织代谢产物的洗脱及分散甚微，当上述执行次数及每1次执行时间超过上述范围时，上述范围内充分破坏细胞壁，因此不再发生细胞壁的破坏，由此不有效。
如上所述在高压状态下，愈伤组织的机械均质破碎因机械剪切力及空蚀现象(cavitation)等来使防止愈伤组织的代谢产物的洗脱的细胞壁结构成分(纤维素、果胶及木质素或角质等)的结合力弱化及破坏，由此不仅容易洗脱及分散愈伤组织的代谢产物，而且与破坏的细胞壁结构成分的残留物一起自然存在为愈伤组织溶解产物。并且，上述细胞壁的破坏，因机械均质破碎而致使细胞壁的50％以上，优选为60％以上，更优选为70％以上，进而优选为80％以上，最优选为90％以上破坏，而不是细胞壁的一部分破坏，因此在短时间内可实现愈伤组织的代谢产物的洗脱及分散，与破坏的细胞壁结构成分的残留物一起自然存在为愈伤组织溶解产物。
上述“愈伤组织代谢产物”是指含有通过愈伤组织的小器官生成的对人体皮肤有用的成分的物质。对上述人体皮肤有用的成分并不是务必限定于此，包括增进皮肤保湿的成分、预防或改善皮肤皱纹的成分、增进皮肤弹性的成分、增进皮肤美白的成分、改善肤色的成分等。
上述“愈伤组织代谢产物的散失”是指本发明的方法的愈伤组织溶解产物中含有的特定基准物质的含量，相比于与本发明的方法不同的方法，诸如与本发明的方法相同且在100bar压力下对愈伤组织进行机械均质破碎的情况或者与本发明的方法不同的愈伤组织的热水提取物等中含有的特定基准物质的含量，以1.3倍以下，优选地以1.25倍以下，更优选地以1.2倍以下含有的情况。因此，上述“愈伤组织代谢产物的无散失”是指本发明的方法的愈伤组织溶解产物中含有的特定的基准物质的含量，相比于与本发明的方法不同的方法，诸如与本发明的方法相同且在100bar压力下对愈伤组织进行机械均质破碎的情况或者与本发明的方法不同的愈伤组织的热水提取物等中含有的特定基准物质的含量，以1.2倍以上，优选地以1.25倍以上，更优选地以1.3倍以上含有的情况。上述特定的基准物质并不是务必限定于此，可列举类黄酮、萜类化合物等。
上述“愈伤组织溶解产物”是指通过上述方法使愈伤组织代谢产物及细胞壁破坏的愈伤组织(优选为愈伤组织小器官)以分散或溶解的状态存在。在本发明中，上述愈伤组织溶解产物具有通过上述方法制备的特征，便于说明，可称作愈伤组织高压均质破碎物。
另一方面，含有本发明的愈伤组织代谢产物的愈伤组织溶解产物制备方法在高压状态下对上述愈伤组织进行机械均质破碎的步骤之后，根据需要还可包括在愈伤组织溶解产物中去除对人体皮肤无效的成分诸如核、线粒体、液胞等细胞小器官等的步骤。
从上述愈伤组织溶解产物中去除无效成分，可根据所目的的成分去除来选择适合的方法，诸如可通过过滤、离心分离、酶处理、柱色谱等方法来实现。
作为另一实施方式，本发明提供上述制备的愈伤组织溶解产物。
本发明的愈伤组织溶解产物，其特征在于，在高压状态下对愈伤组织进行机械均质破碎而制备。尤其，本发明的愈伤组织溶解产物是对形成愈伤组织的细胞壁的结构成分的结合使用机械剪切力及空蚀现象来切断细胞壁的多个部分，在愈伤组织代谢产物无散失的状态下容易洗脱的物质。
上述“愈伤组织代谢产物的散失”是指本发明的方法的愈伤组织溶解产物中含有的特定的基准物质的含量，相比于与本发明的方法不同的方法，诸如与本发明的方法相同且在100bar压力下对愈伤组织进行机械均质破碎的情况或者与本发明的方法不同的愈伤组织的热水提取物等中含有的特定基准物质的含量，以1.3倍以下，优选地以1.25倍以下，更优选地以1.2倍以下含有的情况。因此，上述“愈伤组织代谢产物的无散失”是指本发明的方法的愈伤组织溶解产物中含有的特定的基准物质的含量，相比于与本发明的方法不同的方法，诸如与本发明的方法相同且在100bar压力下对愈伤组织进行机械均质破碎的情况或者与本发明的方法不同的愈伤组织的热水提取物等中含有的特定基准特质的含量，以1.2倍以上，优选地以1.25倍以上，更优选地以1.3倍以上含有的情况。上述特定的基准物质并不是务必限定于此，可列举类黄酮、萜类化合物等。
更具体地，以往愈伤组织提取物仅提取溶解于特定溶剂的有用成分，因此不溶于特定溶剂的有用成分存在不可利用的问题。并且，以往愈伤组织超临界提取对细胞壁的破坏有可能甚微，不容易洗脱愈伤组织代谢产物或者为了容易洗脱愈伤组织代谢产物，破坏细胞壁时需要很多的能量，并且存在需要昂贵的装备的问题。并且，通过以往愈伤组织超声波破碎，很难将植物细胞制备成被人的皮肤可吸收的大小，即使可制备也需要很长的处理时间，而且处理商业上可利用的量时受限。
与此不同的是，通过本发明的方法制备的愈伤组织溶解产物相比于上述以往愈伤组织利用技术，存在如下优点。
(1)根据本发明的制备的愈伤组织溶解产物以低能量在短时间内破坏愈伤组织细胞壁的多个部分，容易洗脱愈伤组织代谢产物。
作为一个具体例，本发明的愈伤组织溶解产物在类黄酮及萜类化合物含量中，相比于以往方法(例如，愈伤组织的热水提取物)及压力条件不同的愈伤组织溶解产物，呈现显著高的含量。
(2)根据本发明制备的愈伤组织溶解产物，与因愈伤组织细胞壁的破坏而破坏愈伤组织代谢产物的细胞壁结构成分一起以自然分散或溶解的状态存在，由此存在均可利用愈伤组织代谢产物内对人体皮肤有用的成分的优点。
作为一个具体例，本发明的愈伤组织溶解产物，相比于以往的方法(例如，愈伤组织的热水提取物)及压力条件不同的愈伤组织溶解产物，皮肤保湿力、皮肤皱纹预防及改善、皮肤美白、皮肤弹性预防及改善及肤色改善效果显著优秀。
(3)根据本发明制备的愈伤组织溶解产物，因愈伤组织细胞壁的破坏而使愈伤组织代谢产物以分散或溶解的状态存在，因此对人体皮肤的渗透力及皮肤吸收力优秀。
作为一个具体例，本发明的愈伤组织溶解产物，相比于以往方法(例如，愈伤组织的热水提取物)及压力条件不同的愈伤组织溶解产物，皮肤渗透量显著优秀为2.04倍至8倍。
作为另一实施例方式，本发明提供含有用天然高分子材料被覆上述愈伤组织溶解产物而胶囊化的愈伤组织溶解产物的胶囊。
本发明的上述胶囊中含有的愈伤组织溶解产物如上所述。
在本发明的上述胶囊中，上述天然高分子材料是来源于植物、矿物或微生物的物质，虽然在常温下是固体，但是适用于皮肤时优选为借助体温、摩擦热或压力而被融化的热软化性物质。上述天然高分子材料并不是务必限定于此，诸如可包含琼脂、果胶、海藻酸、海藻酸盐、卡拉胶、可得然胶、淀粉、结冷胶、葡甘露聚糖、槐豆胶、瓜尔豆胶、他拉胶、阿拉伯树胶、黄原胶、透明质酸、刺槐树胶、黄芪胶(trangacanth gum)、松胶(larch gum)、葡聚糖、纤维素及它们的混合物中的1种以上。
本发明的上述胶囊化，其特征在于，对上述愈伤组织溶解产物进行乳化，并分散于液态的天然高分子材料中。
上述乳化可将上述愈伤组织溶解产物制备为可溶化剂型或油中水型(W/O)、水中油型(O/W)、水中油中水型(W/O/W)或油中水中油型(O/W/O)等乳化剂型。
上述乳化可使用表面活性剂或乳化剂，这些表面活性剂或乳化剂可以是离子性或非离子性的。其例子有泊洛沙姆或普流罗尼、聚乙二醇、聚乙二醇单硬脂酸酯、聚山梨糖醇酯、十二烷基硫酸钠、聚乙氧基化蓖麻油及氢化蓖麻油等。其中，上述表面活性剂或乳化剂以上述愈伤组织溶解产物100重量份为基准，可使用为5至30重量份，优选地可使用5至20重量份。
上述天然高分子材料为热软化性物质，因此可在50℃以上、优选地在50至90℃，更优选地在60至90℃，进而优选地在70至90℃，最优选地在80至90℃下加热而进行液态化。
本发明的胶囊中，上述天然高分子材料和上述愈伤组织溶解产物的重量比可以为1:0.001至1:10，具体地可以为1:0.005至1:10，更优选地可以为1:0.05至1:10。在上述范围内，上述胶囊提高有效成分愈伤组织溶解产物的保存力及稳定性，在储存环境下即提高愈伤组织溶解产物的保存力，适用于皮肤时又能呈现有利于涂布皮肤的特性。
本发明的上述胶囊的平均粒子大小可以为0.1mm至30mm，具体地可以为0.5mm至10mm，更具体地可以为1mm至10mm。在上述范围内对于胶囊所含的愈伤组织溶解产物的保存力及稳定性会更优秀。
本发明的上述胶囊在适用于皮肤时，能够以易融化涂布的方式，具有30至50℃的融化点，其融化点优选为35至45℃之间，考虑胶囊的稳定性时，其融化点更优选为36℃以上，考虑胶囊的相容性及涂抹性时，融化点优选为45℃以下。
本发明的含有上述愈伤组织溶解产物的胶囊，对于有效成分愈伤组织溶解产物的保存力及稳定性更优秀，在储存环境下即提高有效成分愈伤组织溶解产物的保存力，适用于皮肤时又具有有利于涂布皮肤的特性。
作为另一实施方式，本发明提供如下的含有愈伤组织溶解产物的胶囊制备方法，制备上述愈伤组织溶解产物的步骤之后，包括用天然高分子材料被覆上述制备的愈伤组织溶解产物而胶囊化的步骤。
上述愈伤组织溶解产物如上所述，故而以下要省略说明。
上述愈伤组织溶解产物制备步骤如上所述，包括：在200至2000bar的压力下对愈伤组织进行机械均质破碎的愈伤组织的机械均质破碎步骤；或者愈伤组织的机械均质破碎步骤；以及从上述愈伤组织机械均质破碎物中去除对人体皮肤无效的成分的步骤；或者愈伤组织收集步骤；上述收集的愈伤组织的机械均质破碎步骤；以及从上述愈伤组织机械均质破碎物中去除对人体皮肤无效的成分的步骤。这种愈伤组织溶解产物制备步骤如上所述，因此参照上述内容。
用天然高分子材料被覆上述制备的愈伤组织溶解产物而胶囊化的步骤是对上述愈伤组织溶解产物进行乳化，并分散于液态的天然高分子材料中进行胶囊化的步骤。
上述乳化可将上述愈伤组织溶解产物制备为可溶化剂型或油中水型(W/O)、水中油型(O/W)、水中油中水型(W/O/W)或油中水中油型(O/W/O)等乳化剂型。
上述乳化可使用表面活性剂或乳化剂，这些表面活性剂或乳化剂可以是离子性或非离子性的。其例子有泊洛沙姆或普流罗尼、聚乙二醇、聚乙二醇单硬脂酸酯、聚山梨糖醇酯、十二烷基硫酸钠、聚乙氧基化蓖麻油及氢化蓖麻油等。其中，上述表面活性剂或乳化剂以上述愈伤组织溶解产物100重量份为基准，可使用为5至30重量份，优选地可使用5至20重量份。
上述天然高分子材料是来源于植物、矿物或微生物的物质，虽然在常温下是固体，但是适用于皮肤时优选为借助体温、摩擦热或压力而被融化的热软化性物质。上述天然高分子材料并不是务必限定于此，诸如可包含琼脂、果胶、海藻酸、海藻酸盐、卡拉胶、可得然胶、淀粉、结冷胶、葡甘露聚糖、槐豆胶、瓜尔豆胶、他拉胶、阿拉伯树胶、黄原胶、透明质酸、刺槐树胶、黄芪胶(trangacanth gum)、松胶(larch gum)、葡聚糖、纤维素及它们的混合物中的1种以上。
上述液态的天然高分子材料，可将具有上述特征的天然高分子材料在50℃以上，优选地在50至90℃，更优选地在60至90℃，进而优选地在70至90℃，最优选地在80至90℃下加热而进行液态化。
上述天然高分子材料和上述愈伤组织溶解产物的重量比可以为1:0.001至1:10，具体地可以为1:0.005至1:10，更具体地可以为1:0.05至1:10。在上述范围内，上述胶囊提高作为有效成分的愈伤组织溶解产物的保存力及稳定性，在储存环境下即可提高作为有效成分的愈伤组织溶解产物的保存力，又能呈现适用于皮肤时有利于涂布皮肤的特性。
上述胶囊化步骤还可包括：为了提高胶囊的稳定性，将上述愈伤组织溶解产物的乳液分散于液态的天然高分子材料之后，将外部温度调节至20℃以下，具体地调节至-10℃至15℃，更具体地调节至0℃至10℃的步骤。此时，温度调节方式不受限定，诸如，在反应器外部具有包含硅油、矿物油、石蜡油、液氮、液氧、液体空气等之类的冷冻制冷剂的装置，由此可调节温度。这种情况下，不仅容易调节形成胶囊的天然高分子材料和胶囊内的愈伤组织溶解产物的重量比，而且可制备形象性优秀的含有愈伤组织溶解产物的胶囊。
上述制备的胶囊的平均粒子大小可以为0.1mm至30mm，具体地可以为0.5mm至10mm，更具体地可以为1mm至10mm。在上述范围内对于胶囊所含的愈伤组织溶解产物的保存力及稳定性会更优秀。
作为另一实施方式，本发明提供包含上述的愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊的愈伤组织代谢产物的皮肤渗透力及皮肤吸收力得到提高的组合物。
本发明的组合物中所含的愈伤组织溶解产物及含有愈伤组织溶解产物的胶囊如上所述。
本发明的上述愈伤组织代谢产物的皮肤渗透力及皮肤吸收力得到提高的组合物，以整体组合物的重量百分比为基准，可包含愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织的胶囊作为有效成分，即包含0.01至100重量百分比，优选地包含1至90重量百分比，更优选地包含5至80重量百分比。
在一个具体实施方式中，作为有效成分的愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊中包含的愈伤组织溶解产物如上所述，是一种在愈伤组织代谢产物无散失的情况下容易洗脱或分散的物质，因此在人工皮肤的渗透力实验中相比于以往的愈伤组织热水提取物等，对皮肤的渗透量显著提高为2.04倍至8倍。
因此，本发明的组合物可将愈伤组织代谢产物被洗脱或分散的愈伤组织溶解产物大量地快速渗透至皮肤中，并可提高皮肤吸收力，由此并不是务必限定于洗脱及分散于愈伤组织溶解产物的愈伤组织代谢产物对于皮肤的作用，可有效改善皮肤的保湿、皮肤的美白、皮肤的皱纹、皮肤的弹性及肤色。
作为一个具体实施方式，本发明提供包含上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊的皮肤外用剂组合物。
本发明的愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊如上所述。
本发明的皮肤外用剂组合物可单独包含愈伤组织代谢产物的皮肤渗透力及皮肤吸收力得到提高的组合物作为有效成分，根据需要可包含上述愈伤组织代谢产物的皮肤渗透力及皮肤吸收力得到提高的组合物和赋形剂。
上述赋形剂，只要是可用作外用剂的赋形剂就不受特别限制。诸如，上述赋形剂可以是包含纯化水、乙醇等的亲水性溶剂；包含荷荷巴油等的植物油；包含角鲨烷等的动物油；包含液体石蜡等的滑剂；包含十六烷基芳基醇等的脂肪酸醇；包含丙二醇、丁二醇、丙三醇、生育酚乙酸酯、聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯等的皮肤调理剂；包含三乙醇胺、甘油硬脂酸酯等的表面活性剂；包含羧乙烯基聚合物等的增粘剂；乳化剂；防腐剂；香料等。
本发明的皮肤外用剂组合物中，将愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊可包含为0.1重量百分比至80重量百分比，具体地可包含为1重量百分比至50重量百分比，更具体地可包含为10重量百分比至50重量百分比。上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊的含量小于0.1重量百分比时，上述愈伤组织溶解产物带来的效果甚微，大于80重量百分比时，效果的增加相比于含量甚微。
上述外用剂组合物并不是务必限定于愈伤组织溶解产物中所含的愈伤组织代谢产物，对皮肤保湿增减、皮肤皱纹预防或改善、皮肤美白、皮肤弹性增加或肤色改善非常有效。
作为另一具体实施方式，本发明提供包含上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊的医药外品组合物。
本发明的愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊如上所述。
本发明的术语“医药外品”是指以诊断、治疗、改善、减轻、处置或预防人或动物的疾病为目的使用的物品中的作用比起医药品微小的物品。诸如，基于药事法的医药外品除外以医药品的用途使用的物品，包括用于治疗或预防人/动物的疾病的产品、对人体的作用微小或不直接起作用的产品等。
具体地，上述医药外品可包含皮肤外用剂及个人卫生用品。更具体地可以为消毒清洁剂、沐浴露、漱口水、洗涤皂、洗手液或软膏剂，但不限定于此。
将本发明的上述组合物使用为医药外品添加物时，可以直接添加上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊，或者可与其他医药外品或医药外品成分一起使用，可根据常规的方法适当使用。有效成分的混合量可根据使用目的适当确定。
本发明的医药外品组合物将愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊可包含为0.1重量百分比至80重量百分比，具体地可包含为1重量百分比至50重量百分比，更具体地可包含为10重量百分比至50重量百分比。当上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊的含量小于0.1重量百分比时，上述愈伤组织溶解产物带来的效果甚微，当大于80重量百分比时，效果的增加相比于含量甚微。
上述医药外品组合物并不是务必限定于愈伤组织溶解产物中所含的愈伤组织代谢产物，对皮肤保湿增进、皮肤皱纹预防或改善、皮肤美白、皮肤弹性增进或肤色改善非常有效。
作为另一具体实施方式，本发明提供包含上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊的化妆品组合物。
本发明的化妆品组合物除了愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊以外，还可包含化妆品组合物中通常利用的成分。诸如，可包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料之类的常规补助剂及载体。
本发明的化妆品组合物以本领域通常制备的任何剂型都可以制备，诸如，能够以溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、乳霜、乳液、粉底、香皂、含表面活性剂的洁面油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡状粉底及喷雾剂等进行剂型化，但并不限定于此。更详细地，能够以营养霜、收敛化妆水、柔软化妆水、乳液、精华液、营养啫喱或按摩霜等剂型制备。
上述化妆品组合物的剂型为糊剂、乳霜或凝胶时，作为载体成分可利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。
上述化妆品组合物的剂型为粉底或喷雾剂时，作为载体成分可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉底，尤其为喷雾剂时，还可包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲基醚之类的推进剂。
上述化妆品组合物的剂型为溶液或乳浊液时，作为载体成分可利用溶剂、增溶剂或乳浊剂，诸如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇润滑油、丙三醇脂肪族酯、聚乙二醇或山梨聚糖的脂肪酸酯。
上述化妆品组合物的剂型为悬浮液时，作为载体成分可利用水、乙醇或丙二醇之类的液态的稀释剂；乙氧基化异硬脂醇，聚氧乙烯山梨糖醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯之类的悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等。
上述化妆品组合物的剂型为含表面活性剂的洁面油时，作为载体成分可利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙磺酸盐、咪唑啉鎓衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化丙三醇脂肪酸酯等。
本发明的化妆品组合物，将愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊可包含为0.1重量百分比至80重量百分比，具体地可包含为1重量百分比至50重量百分比，更具体地可包含为10重量百分比至50重量百分比。当上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊的含量小于0.1重量百分比时，上述愈伤组织溶解产物带来的效果甚微，当大于80重量百分比时，效果的增加相比于含量甚微。
上述化妆品组合物并不是务必限定于愈伤组织溶解产物所含的愈伤组织代谢产物，对皮肤保湿增进、皮肤皱纹预防或改善、皮肤美白、皮肤弹性增进或肤色改善非常有效。
作为另一实施方式，本发明提供包括将包含上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊作为有效成分的组合物给药到对象的步骤的皮肤保湿增进、皮肤皱纹预防或改善、皮肤美白、皮肤弹性增进或肤色改善方法。
在本发明中，术语“预防”是指抑制虽然未被诊断为患有上述疾病或症状但具有容易患上这种疾病或症状的倾向的对象身上发生上述疾病或症状的情况。
在本发明中，术语“改善”或“治疗”是指抑制对象患上的(a)疾病或症状或者减轻(b)疾病或症状的情况。
在本发明中，术语“对象”是指通过给药包含本发明的愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊作为有效成分的组合物而可实现上述目的的包括人的哺乳动物，诸如，猴子、牛、马、猪、羊、狗、猫、大鼠、小鼠、黑猩猩等。
在本发明中，术语“给药”是指通过某种适当的方法给对象导入指定物质的情况，本发明的组合物的给药途径，只要可达到目的组织就能通过任何一般途径来进行口服给药或胃肠外给药，优选地可进行胃肠外给药。并且，本发明的组合物可通过目标对象例如可移动至细胞的任何装置来给药活性物质。
本发明的组合物的适当的给药量随着对象的病状及体重、疾病的严重程度、药物形态、时间而不同，但可由本领域的技术人员适当选择。上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊的每日给药量以成人为基准时，为1.0ml至3.0ml，根据需要每日可涂布给药1次或5次。
包含上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊作为有效成分的组合物，以整体组合物的总重量为基准，可包含为0.1重量百分比至80重量百分比，具体地可包含为1重量百分比至50重量百分比，更具体地可包含为10重量百分比至50重量百分比。当上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织溶解产物的胶囊的含量小于0.1重量百分比时，上述愈伤组织溶解产物带来的效果甚微，当大于80重量百分比时，效果的增加相比于含量甚微。
本发明的愈伤组织溶解产物制备方法是比起以往的愈伤组织即使不使用对人体有害的溶剂也不会散失愈伤组织代谢产物且可大量包含的制备方法，通过上述方法制备的愈伤组织溶解产物中的愈伤组织代谢产物可从愈伤组织洗脱及分散，由此可将上述愈伤组织代谢产物直接而快速地渗透及吸收到皮肤中。并且，含有上述愈伤组织溶解产物的胶囊也可将上述愈伤组织代谢产物直接而快速地渗透及吸收到皮肤中，而且提高对有效成分愈伤组织溶解产物的保存力及稳定性，在储存环境下提高有效成分愈伤组织溶解产物的保存力，在适用于皮肤时可提供有利于涂布皮肤的特性。并且，包含上述愈伤组织溶解产物或含有愈伤组织的胶囊的组合物中，愈伤组织代谢产物被洗脱及分散，借助愈伤组织代谢产物来使皮肤保湿能力、皮肤皱纹预防能力、皮肤皱纹改善能力、皮肤美白能力、皮肤弹性提高能力及肤色改善能力变得优秀，由此可有用地使用为皮肤外用剂、皮肤医药外品及化妆品。
具体实施方式
以下，为了有助于理解本发明，列举实施例等进行详细说明。但是，本发明的实施例能够以多种不同形态变形，本发明的范围不得被解释为限定于以下实施例。本发明的实施例是为了给本发明的普通技术人员更完整地说明本发明而提供的。
制备例1
在35v/v％过氧化氢中将苹果树的当年生枝(学名：Malus pumila，品种名：富士，采集部位：包括枝的形成层的部分，生长月数：1～6个月)浸渍10分钟，接着在70v/v％乙醇中浸渍1分钟之后，在2v/v％次氯酸钠(Sodium hypochlorite)溶液中振荡30分钟，杀菌。
接着，用灭菌水5次以上洗涤已杀菌的苹果树枝之后，切割为1cm左右的小切片。将上述外植体置床于包含蔗糖(Sucrose)30g/L、蛋白石(Gelite)4.0g/L、生长调节物质NAA1ppm、MS粉末4.4g/L及余量的纯化水的基本培养基之后，在25℃的培养室培养8周，诱导愈伤组织(callus)。
诱导的愈伤组织隔5周进行继代培养，增殖及驯化。如上所述诱导的愈伤组织接种于气浮型生物反应器内，在25℃的培养室，在暗状态下悬浮培养6周之后收获。此时，对于培养基而言，利用了上述基本培养基中除了蛋白石(Gelite)以外，代替为同量的MS培养基(medium)来制备的培养基，在25℃的培养室，在暗状态下悬浮培养6周。
制备例2
使用枸杞树的当年生枝(学名：Lycium chinense，采集部位：包括枝的形成层的部分，生长月数：1～6个月)来代替上述制备例1中的苹果树的当年生枝，除此之外，与制备例1相同地执行。
制备例3
使用葡萄树的当年生枝(学名：Vitis vinifera L.，品种名：坎贝尔，采集部位：包括枝的形成层的部分，生长月数：1～6个月)来代替上述制备例1中的苹果树的当年生枝，除此之外，与制备例1相同地执行。
实施例1
采取制备例1中制备的苹果愈伤组织500ml，利用高压均质机(产品名：Scientz-150，制造商：宁波新芝生物科技股份有限公司(Ning bo Scientz Biotechnology Co.，Ltd))，在200bar下，每1次处理20分钟，如此总共处理3次，破碎愈伤组织。如此制备的苹果愈伤组织高压均质破碎物在75℃下处理30分钟，执行低温杀菌及酶的钝化后处理之后利用。
实施例2
将高压均质机的压力变更为500bar，除此之外，以与实施例1相同的方法制备了苹果愈伤组织高压均质破碎物。
实施例3
将高压均质机的压力变更为1000bar，除此之外，以与实施例1相同的方法制备了苹果愈伤组织高压均质破碎物。
实施例4
将高压均质机的压力变更为2000bar，除此之外，以与实施例1相同的方法制备了苹果愈伤组织高压均质破碎物。
实施例5
采取制备例2中制备的枸杞愈伤组织培养物500ml，利用高压均质机(产品名：Scientz-150，制造商：Ningbo Scientz Biotechnology Co.，Ltd)，在200bar下，每1次处理20分钟，如此总共处理3次，破碎愈伤组织。如此制备的植物愈伤组织高压均质破碎物在75℃下处理30分钟，执行低温杀菌及酶的钝化后处理之后利用。
实施例6
将高压均质机的压力变更为500bar，除此之外，以与实施例5相同的方法制备了枸杞愈伤组织高压均质破碎物。
实施例7
将高压均质机的压力变更为1000bar，除此之外，以与实施例5相同的方法制备了枸杞愈伤组织高压均质破碎物。
实施例8
将高压均质机的压力变更为2000bar，除此之外，以与实施例5相同的方法制备了枸杞愈伤组织高压均质破碎物。
实施例9
采取制备例3中制备的葡萄愈伤组织培养物500ml，利用高压均质机(产品名：Scientz-150，制造商：Ningbo Scientz Biotechnology Co.，Ltd)，在200bar下，每1次处理20分钟，如此总共处理3次，破碎愈伤组织。如此制备的枸杞愈伤组织高压均质破碎物在75℃下处理30分钟，执行低温杀菌及酶的钝化后处理之后利用。
实施例10
将高压均质机的压力变更为500bar，除此之外，以与实施例9相同的方法制备了葡萄愈伤组织高压均质破碎物。
实施例11
将高压均质机的压力变更为1000bar，除此之外，以与实施例9相同的方法制备了葡萄愈伤组织高压均质破碎物。
实施例12
将高压均质机的压力变更为2000bar，除此之外，以与实施例9相同的方法制备了葡萄愈伤组织高压均质破碎物。
比较例1
采取制备例1中制备的苹果愈伤组织培养物500ml，去除培养液，浸渍于1L的灭菌水中，在80℃下热水提取60分钟。然后利用滤纸(Advantes，No.2)来过滤所获得的提取液，由此制备了植物愈伤组织热水提取物。
比较例2
采取制备例2中制备的枸杞愈伤组织培养物500ml，去除培养液，浸渍于1L的灭菌水中，在80℃下热水提取60分钟。然后利用滤纸(Advantes，No.2)来过滤所获得的提取液，由此制备了枸杞愈伤组织热水提取物。
比较例3
采取制备例3中制备的葡萄愈伤组织培养物500ml，去除培养液，浸渍于1L的灭菌水中，在80℃下热水提取60分钟。然后利用滤纸(Advantes，No.2)来过滤所获得的提取液，由此制备了葡萄愈伤组织热水提取物。
比较例4
将高压均质机的压力变更为100bar，除此之外，以与实施例9相同的方法制备了葡萄愈伤组织高压均质破碎物。
比较例5
将高压均质机的压力变更为2100bar，除此之外，以与实施例9相同的方法制备了葡萄愈伤组织高压均质破碎物。
实施例13
混合上述实施例12中制备的葡萄愈伤组织高压均质破碎物30重量百分比、纯化水65重量百分比及乳化剂5重量百分比之后，在60℃～70℃下进行乳化来制备了水中油型(O/W)乳液。
将上述乳液20ml投入到将天然高分子材料琼脂2重量百分比在80℃～90℃下加热溶解于纯化水98重量百分比中的溶液80ml之后，一边保持温度一边分散2小时，由此进行胶囊化。制备的胶囊的平均粒子大小为约5mm。
实施例14
在反应器投入下列表1所示的组成成分之后，以70℃加热来乳化。乳化结束之后，将上述反应器的温度冷却至45℃，添加含有上述实施例13中制备的葡萄愈伤组织的胶囊，分散之后冷却至30℃，由此制备了营养霜剂型的化妆品。
比较例6
在反应器投入下列表1所示的组成成分之后，以70℃加热来乳化。乳化结束之后，将上述反应器的温度冷却至45℃，添加上述比较例3中制备的葡萄愈伤组织提取物，分散之后冷却至30℃，由此制备了营养霜剂型的化妆品。
比较例7
在反应器投入下列表1所示的组成成分之后，以70℃加热来乳化。乳化结束之后，将上述反应器的温度冷却至45℃，分散之后冷却至30℃，由此制备了营养霜剂型的化妆品。
表1
Figure BDA0002817562470000241
Figure BDA0002817562470000251
实验例1：皮肤渗透有效性评价
利用人工皮肤(DE，Dermal Equivalent)，对上述实施例1至12及比较例1至5的样品测定了皮肤渗透效果。
上述人工皮肤将正常人成纤维细胞(Human normal fibroblast)放入含有胶原蛋白及达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbeco’s Modified Eagle’s Media)的培养基中，在5％浓度的CO2培养器中以37℃培养24小时之后，将表皮角质形成细胞在含有表皮生长因子(EGF，Epidermal Growth Factor)和牛垂体提取物(BPE，Bovine PituitaryExtract)的角质形成细胞无血清培养基(K-SFM，Keratinocyte Serum Free Medium)培养基中培养7天，通过如上方式，在表面上形成多层的表皮和真皮结构而制备。
将实施例1至12及比较例1至5中准备的各个样品涂布于相同培养条件下制备的上述人工皮肤的顶层，培养4小时之后，通过HPLC分析所渗透的样品的量。试验结果如下列表2所示。以上述HPLC分析时的渗透量为基准使用的物质是绿原酸(Chlorogenic acid)、芦丁(Rutin)、白藜芦醇(Resveratrol)等。
表2
Figure BDA0002817562470000252
Figure BDA0002817562470000261
由上述表2可知，如本发明的实施例1至12所述，包含分别将苹果愈伤组织、枸杞愈伤组织、葡萄愈伤组织在200bar至2000bar下利用高压均质机破碎的植物愈伤组织均质破碎物时，相比于使用相同植物愈伤组织的热水提取物的比较例1至3，对人工皮肤的渗透量显著提高到2.04倍(10.4/5.1)至8倍(38.4/4.8)。
并且，对于均质破碎时压力小于200bar的比较例4而言，样品的渗透量达不到本发明的实施例，并且大量产生包含细胞壁未被破碎的状态的残留物。对于均质破碎时压力大于2000bar的比较例5而言，样品的渗透量充分优秀，但是样品发生变色及变味等性状变异，由此不适合适用为外用剂用组合物。
实验例2：皮肤保湿有效性评价
募集年龄20多岁至50多岁的男性和女性，总共募集30名的对象，执行皮肤保湿能力评价。
各对象分别在宽度为2.5cm×2.5cm的腹部部位皮肤表面涂布实施例1至13及比较例1至5中制备的样品各10g，经过24小时之后，使用TEWA蒸发计(Tewameter TM210，Germany)测定了经皮水分散失量(transepidermal water loss，TEWL)。上述TEWA蒸发计自动将规定设定的测定时间内的测定结果计算为平均值来提供。
上述经皮水分散失量在没有空气流动且没有直射光线的室内温度保持22℃、相对湿度保湿40％的恒温恒湿室中进行测定。并且，针对各实施例及比较例样品，对总共30名的对象的相关测定值进行平均化，其结果示于下列表3中。
表3
Figure BDA0002817562470000271
由上述表3可知，如本发明的实施例1至12所述，包含分别将苹果愈伤组织、枸杞愈伤组织、葡萄愈伤组织在200bar至2000bar下利用高压均质机破碎的植物愈伤组织均质破碎物时，相比于使用相同植物愈伤组织的热水提取物的比较例1至3及破碎压力超过本发明的范围的比较例4及5，皮肤保湿能力显著优秀。
尤其，对于用琼脂被覆葡萄愈伤组织破碎物的胶囊剂型的实施例13而言，涂布样品时也涂布在外皮，由此借助复合作用体现出更优秀的经皮水分散失量。
实验例3：皮肤皱纹预防能力评价
为了测定作为分解胶原蛋白的酶的胶原酶的活性程度，利用了抗体。
将正常人成纤维细胞(Human normal fibroblast，(株)太平洋)接种于装上DMEM培养基的6-孔微板(2×105细胞/孔)，在5％浓度的CO2培养器中以37℃培养24小时。经过24小时之后，从各孔中去除培养基，按不同浓度处理样品之后，重新培养24小时。经过24小时之后，收集细胞培养基，制备样品。
将作为诱导胶原酶活性的物质的肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor，TNF-alpha，Sigma，USA)以10ng/mL的含量处理在培养上述成纤维细胞的6-孔微板之后，利用I型胶原酶检测试剂盒(安玛西亚，Amersham Biosciences，RPN2629)，使用酶联免疫检测仪(ELISAReader，Bio-Tek ELx808TM Series Ultra Microplate Reader，英国)在450nm下测定吸光度。作为对照组使用了蒸馏水，将测定的吸光度代入到以下式1，计算胶原酶活性抑制率，其结果示于下列表4。
<式1>
胶原酶抑制率(％)＝100-{[(A1-B1)-(C1-D1)]/(A1-B1)}×100
A1：对照组的吸光度
B1：对照组的空白组吸光度
C1：实验组的吸光度
D1：实验组的空白组吸光度
表4
Figure BDA0002817562470000291
Figure BDA0002817562470000301
由上述表4可知，如本发明的实施例1至12所述，包含分别将苹果愈伤组织、枸杞愈伤组织、葡萄愈伤组织在200bar至2000bar下利用高压均质机破碎的植物愈伤组织均质破碎物时，相比于使用相同植物愈伤组织的热水提取物的比较例1至3及破碎压力超过本发明的范围的比较例4及5，皮肤皱纹预防能力显著优秀。
尤其，对于用琼脂被覆葡萄愈伤组织破碎物的胶囊剂型的实施例13而言，涂布样品时也涂布在外皮，由此借助复合作用体现出更优秀的胶原酶抑制能力。
实验例4：酪氨酸酶抑制能力评价
本实验将小鼠黑素瘤(murine melanoma)(B-16F1)细胞(韩国细胞株银行)放入含有10％的胎牛血清(fetal bovine serum)(FBS)的DMEM培养基，在6-孔板上接种，每孔接种1×105个，在5％CO2及37℃下培养，直到细胞附着于孔板底部约80％以上为止。接着，去除培养基，将样品替换在以适当浓度稀释的培养基之后，在5％CO2及37℃下培养3天。利用磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffered saline)洗涤去除培养基的细胞，用胰蛋白酶处理该细胞，回收细胞。利用血细胞计数器(hematocytometer，Tiefe Depth Profondeur0.100mm，Paul Marienfeld GmbH&Co.KG，德国)测定回收的细胞的细胞数，以5000至10000rpm离心分离10分钟之后，去除上清液，获得团块。利用裂解缓冲液(lysis buffer)粉碎该细胞团块，以12000rpm离心分离10分钟，收集上清液。
利用酶标仪(microplate reader)(Bio-Tek ELx8081U，美利坚合众国)在492nm下测定吸光度，求出每细胞规定数的酪氨酸酶活性。将上述吸光度代入到以下式2中，计算酪氨酸酶活性抑制率，其结果示于下列表5中。
实验组的空白组(blank)是除了酪氨酸酶溶液之外的反应物，即为由酪氨酸、愈伤组织破碎物及提取物以及磷酸钠缓冲溶液形成的反应物，对照组的空白组在实验组的空白组中添加甲醇来代替愈伤组织破碎物及提取物。
<式2>
酪氨酸酶抑制率(％)＝100-{[(A2-B2)-(C2-D2)]/(A2-B2)}×100
A2：对照组的吸光度
B2：对照组的空白组吸光度
C2：实验组的吸光度
D2：实验组的空白组吸光度
表5
Figure BDA0002817562470000311
Figure BDA0002817562470000321
由上述表5可知，如本发明的实施例1至12所述，包含分别将苹果愈伤组织、枸杞愈伤组织、葡萄愈伤组织在200bar至2000bar下利用高压均质机破碎的植物愈伤组织均质破碎物时，相比于使用相同植物愈伤组织的热水提取物的比较例1至3及均质破碎时压力小于200bar的比较例4，酪氨酸酶抑制能力显著优秀。并且，对于均质破碎时压力大于2000bar的比较例5而言，样品的酪氨酸酶抑制能力充分，但是样品发生变色及变味等性状变异，由此不适合适用为外用剂及化妆品组合物。
此外，对于用琼脂被覆葡萄愈伤组织破碎物的胶囊剂型的实施例13而言，也呈现优秀的酪氨酸酶抑制能力。
实验例5：皮肤美白能力评价
将通过实施例14及比较例6至7的方法制备的营养霜涂布于有暗斑、雀斑或色素沉着症的健康的成人男女100名作为对象，观察肤色变化，具体利用色彩照度计(MinoltaCR300)测定了肤色的亮度变化(ΔL)。
将有暗斑、雀斑或色素沉着症的健康成人男女100名随机分为3个组(A、B、C)，每组有20名，然后，将A组作为对象涂布实施例14，将B组作为对象涂布比较例6，将C组作为对象涂布比较组7，如此分别1天2次涂布12周之后测定皮肤亮度变化。其结果示于表6中。
表6
Figure BDA0002817562470000331
Figure BDA0002817562470000341
由上述表6可知，如本发明的实施例14所述，包含将葡萄愈伤组织在200bar至2000bar下利用高压均质机破碎的植物愈伤组织均质破碎物来制备的营养霜，相比于仅处理媒介物(Vehicle)的对照组(比较例7)呈现显著高的美白改善能力，尤其相比于使用葡萄植物愈伤组织的热水提取物的比较例6，皮肤美白功能还是显著优秀。
实验例6：抗氧化能力评价
测定对于自由基1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)的清除能力，评价抗氧化能力。DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)是显色的自由基，利用其可直接确认样品的自由基清除能力。
将实施例1至13及比较例1至5的样品50μl和100μM DPPH1ml(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)溶液混合之后，在20℃(常温)下反应及保持恒温(incubation)30分钟。通过517nm的吸光度测定来掌握所剩的DPPH的量。
等反应结束后，根据以下式3计算样品的自由基清除能力(freeradicalscavenging activity，％)，结果示于表7中。此时，作为阳性对照组使用抗坏血酸(ascorbic acid)400μg/ml。并且，空白组使用纯化水。
<式3>
自由基清除能力(％)＝{1-(样品添加组的吸光度/无添加组的吸光度)×100}
表7
Figure BDA0002817562470000351
Figure BDA0002817562470000361
由上述表7可知，如本发明的实施例1至12所述，包含分别将苹果愈伤组织、枸杞愈伤组织、葡萄愈伤组织在200bar至2000bar下利用高压均质机破碎的植物愈伤组织均质破碎物的情况及胶囊剂型实施例13时，相比于使用相同植物愈伤组织的热水提取物的比较例1至3及破碎压力超过本发明的范围的比较例4及5，抗氧化能力显著优秀。
尤其，本发明的实施例1至13的样品相比于阳性对照组抗坏血酸均呈现显著优秀的自由基清除能力。
实验例7：类黄酮含量评价
分别准备实施例1至13及比较例1至5的样品各10ml之后，利用0.2μm注射器过滤器(syringe filter)来过滤所获得的提取液，由此制备了试料。总多酚含量应用了佛林-顿尼斯(Folin-Denis)法(Gutfinger R.1981)。将各样品的1mg溶解于蒸馏水1mL中，用蒸馏水稀释10倍的稀释液2mL中加入0.2mL福林酚试剂(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)混合之后，在室温下静置3分钟之后，加入2M Na2CO3 2mL，反应1小时之后，利用酶标仪(microplate reader)在725nm下测定上清液，从利用没食子酸(gallic acid)制作的标准曲线中求出含量。其结果示于下列表8中。
实验例8：萜类化合物含量评价
分别准备实施例1至13及比较例1至5的样品各10ml之后，利用0.2μm注射器过滤器(syringe filter)来过滤所获得的提取液，由此制备了试料。将各个样品在-20℃下冷冻干燥48小时之后，利用石油醚(60～80"C)提取冷冻干燥物。将提取物过滤、浓缩之后，将苯乙酸乙酯(99:1)作为溶剂，在硅胶C相通过TLC分析浓缩物的分取量。使用玻璃柱(2m×5mmOD)并通过气相色谱法(Shimadzu GC-7A，Kyoto，Japan)分析样品。使用青蒿素(artemisinin)并通过标准曲线进行定量化，在HPLC中，将甲醇-水(80:20)作为洗脱液(0.8mL/min)测定了总萜类化合物含量。其结果示于下列表8中。
表8
Figure BDA0002817562470000371
Figure BDA0002817562470000381
由上述表8可知，本发明的实施例1至13相比于比较例1至5，类黄酮及萜类化合物之类的皮肤有效成分的含量均显著优秀。
实验例9：剂型稳定性评价
通过如下方法评价了实施例12和13及比较例3样品对于光的稳定性。将各样品分取每30ml，准备4个之后装进遮光及透光容器中，保管在照度为1000±200lux、温度保持为25±2℃(常温)的恒温器中，间隔2周使用高速液相色谱法来分析。为了基于高速液相色谱法来分析白藜芦醇(resveratrol)，各取样品0.1g，溶解于10mL的100％纯度的甲醇之后，使用超声波粉碎机每10秒粉碎提取3次，如此提取12小时，离心分离，经由0.2μm的有机溶剂用尼龙过滤器来制备试料液。
取试料液及标准液各10μL，按照以下操作条件，根据液相色谱法做试验，来测定白藜芦醇的峰面积AT(test area：受试样品的峰曲线面积)及AS(AS：standard area：标准样品的峰曲线面积)。
<式4>
白藜芦醇(C14H12NO3)的量(mg)＝白藜芦醇标准品的量(mg)×AT/AS
[操作条件]
检测仪：紫外部吸光光度计(测定波长305nm)
色谱柱：内径4.6mm、长度15cm的不锈钢管中填充约5μm的液相色谱法用十八烷基甲硅烷基化的硅胶的色谱柱或与其等同的色谱柱
色谱柱温度：室温
流动相：0.1％三氟乙酸水(TFAwater)：乙腈＝70:30
流量：1.0mL/min
表9
Figure BDA0002817562470000391
由上述表9可观察到实施例12制备的葡萄愈伤组织破碎物中的白藜芦醇残存量高于比较例3的葡萄愈伤组织热水提取物的白藜芦醇残存量。并且，如实施例13所述，当将植物愈伤组织破碎物适用于用琼脂被覆的胶囊剂型时，可确认到白藜芦醇稳定性显著改善。
本发明的简单变形乃至变更可由本发明的普通技术人员容易实施，这种变形或变更均可被视为包括在本发明的领域。

Claims (18)

1.一种在愈伤组织代谢产物无散失的状态下含有愈伤组织代谢产物的愈伤组织溶解产物制备方法，其特征在于，包括：
在200至2000bar的压力下对愈伤组织进行机械均质破碎的愈伤组织的机械均质破碎步骤。
2.根据权利要求1所述的愈伤组织溶解产物制备方法，其特征在于，在所述愈伤组织的机械均质破碎步骤之前，还包括由如下步骤中的一个以上组成的愈伤组织收集步骤：
步骤(a)，从植物组织中分离愈伤组织而收集的步骤；
步骤(b)，收集通过诱导植物外植体的脱分化过程而生成的愈伤组织的步骤；以及
步骤(c)，收集通过培养所述步骤(a)或步骤(b)中收集的愈伤组织而使其增殖的愈伤组织的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的愈伤组织溶解产物制备方法，其特征在于，在所述愈伤组织的机械均质破碎步骤之后，还包括：在愈伤组织机械均质破碎物中去除对人体皮肤无用的成分的步骤。
4.根据权利要求1所述的愈伤组织溶解产物制备方法，其特征在于，所述愈伤组织代谢产物的散失是指愈伤组织溶解产物中所含的特定的基准物质的含量相比于通过与权利要求1的方法不同的方法制备的情况低1.3倍以下。
5.根据权利要求1所述的愈伤组织溶解产物制备方法，其特征在于，所述愈伤组织代谢产物是含有通过愈伤组织的小器官生成的对人体皮肤有用的成分的物质。
6.根据权利要求5所述的愈伤组织溶解产物制备方法，其特征在于，根据对所述人体皮肤有用的成分，呈现选自由皮肤保湿增进、皮肤皱纹预防或改善、皮肤弹性增进、皮肤美白增进以及肤色改善组成的组中的一种以上。
7.一种愈伤组织溶解产物，其特征在于，通过在200至2000bar的压力下对愈伤组织进行机械均质破碎的愈伤组织的机械均质破碎制备，在愈伤组织代谢产物无散失的状态下含有愈伤组织代谢产物。
8.根据权利要求7所述的愈伤组织溶解产物，其特征在于，所述愈伤组织代谢产物的散失是指愈伤组织溶解产物中所含的特定的基准物质的含量相比于通过与权利要求1的方法不同的方法制备的情况低1.3倍以下。
9.根据权利要求7所述的愈伤组织溶解产物，其特征在于，所述愈伤组织代谢产物是含有通过愈伤组织的小器官生成的对人体皮肤有用的成分的物质。
10.根据权利要求9所述的愈伤组织溶解产物，其特征在于，根据对所述人体皮肤有用的成分，呈现选自由皮肤保湿增加、皮肤皱纹预防或改善、皮肤弹性增加、皮肤美白增加以及肤色改善组成的组中的一种以上。
11.一种含有愈伤组织溶解产物的胶囊，其特征在于，用天然高分子材料被覆权利要求7所述的愈伤组织溶解产物而胶囊化。
12.根据权利要求11所述的含有愈伤组织溶解产物的胶囊，其特征在于，所述天然高分子材料与所述愈伤组织溶解产物的重量比为1:0.001至1:10。
13.根据权利要求11所述的含有愈伤组织溶解产物的胶囊，其特征在于，所述天然高分子材料为选自由琼脂、果胶、海藻酸、海藻酸盐、卡拉胶、可得然胶、淀粉、结冷胶、葡甘露聚糖、槐豆胶、瓜尔豆胶、他拉胶、阿拉伯树胶、黄原胶、透明质酸、刺槐树胶、黄芪胶、松胶、葡聚糖、纤维素及它们的混合物组成的组中的1种以上。
14.一种含有愈伤组织溶解产物的胶囊的制备方法，其特征在于，包括：用天然高分子材料被覆权利要求7所述的愈伤组织溶解产物而胶囊化的步骤。
15.根据权利要求14所述的含有愈伤组织溶解产物的胶囊的制备方法，其特征在于，所述天然高分子材料为琼脂、果胶、海藻酸、海藻酸盐、卡拉胶、可得然胶、淀粉、结冷胶、葡甘露聚糖、槐豆胶、瓜尔豆胶、他拉胶、阿拉伯树胶、黄原胶、透明质酸、刺槐树胶、黄芪胶、松胶、葡聚糖、纤维素及它们的混合物中的1种以上。
16.根据权利要求14所述的含有愈伤组织溶解产物的胶囊的制备方法，其特征在于，所述胶囊化的步骤中，天然高分子材料与所述愈伤组织溶解产物的重量比为1:0.001至1:10。
17.一种皮肤保湿增进、皮肤皱纹预防或改善、皮肤美白、皮肤弹性增进或肤色改善用皮肤外用剂组合物，其特征在于，包含含有权利要求7所述的愈伤组织溶解产物或权利要求11所的愈伤组织溶解产物的胶囊。
18.一种皮肤保湿增进、皮肤皱纹预防或改善、皮肤美白、皮肤弹性增进或肤色改善用化妆品组合物，其特征在于，包含含有权利要求7所述的愈伤组织溶解产物或权利要求11所述的愈伤组织溶解产物的胶囊。
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