WO2012173458A2

WO2012173458A2 - 식물 세포 내에 안정화된 활성 물질 및 그 제조방법

Info

Publication number: WO2012173458A2
Application number: PCT/KR2012/004818
Authority: WO
Inventors: 김겸손; 권이경; 박홍근; 박성일; 김연준; 한상훈
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2011-06-16
Filing date: 2012-06-18
Publication date: 2012-12-20
Also published as: CN103648481A; KR20120139137A; WO2012173458A9; JP2014530800A; CN103648481B; WO2012173458A3; KR101855919B1; JP6151686B2

Abstract

본 발명은 안정화된 활성 물질을 포함하는 식물 세포를 함유하는 조성물, 활성 물질을 안정화시키는 방법 및 안정화된 활성 물질을 포함하는 식물 세포를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물을 이용하며, 활성 물질의 안정화를 높여줄 수 있으며, 기능성 화장료 및 피부외용제의 성분으로 사용될 때 안정성이 높아, 활성성분의 효과를 극대화 할 수 있다.

Description

식물 세포 내에 안정화된 활성 물질 및 그 제조방법

본 발명은 식물 세포 내에 안정화된 활성 물질을 포함하는 화장료 조성물, 활성 물질을 안정화시킨 후 안정화된 활성 물질을 포함하는 식물 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

천연에 존재하는 동, 식물에는 각기 다른 수많은 활성 물질이 내재되어 있으며, 그 종류 또한 플라보노이드, 플라보놀, 페놀, 아미노산, 리그난, 알칼로이드, 비타민, 카테킨 화합물 등 무수한 종류로 이루어져 있다. 이러한 활성 물질들은 각각 서로 다른 약리적 작용을 가지며, 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 인체 내 생리학적 특성에 있어서 유용한 기능을 가지는 활성성분의 우수한 효과에도 불구하고 대부분의 활성 물질들은 그 안정성 면에서 자유롭지 못하며, 최근 이들의 안정성 및 약물전달 개선을 위해 활성 물질에 인지질 혹은 계면활성제를 이용한 리포좀, 세라마이드를 이용한 안정화된 세라좀, 액정구조로 안정화시킨 액정좀, 모노글리세라이드를 이용한 입방상 큐보좀 적용 등 많은 시도가 이루어지고 있다. 그러나 상기 방법들은 제조방법이 복잡하거나 화합물을 사용하여 생체적합성이 떨어지는 문제점이 있다.

본 발명자들은 보다 간편하면서도 생체 적합성이 높은 활성 물질을 안정화 시키는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 식물 세포 내에 특히 세포벽 내에 활성 물질을 인입시키는 경우 활성 물질의 안정성이 높아진다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 식물 세포 내에 안정화된 활성 물질을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 활성 물질을 안정화시킨 후 안정화된 활성 물질을 포함하는 식물 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 실시예는 안정화된 활성 물질을 포함하는 식물 세포를 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 화장료 조성물의 활성 물질은 친수성 물질 및 소수성 물질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 화장료 조성물의 활성 물질은 갈릭산(Gallic acid), 아미노산, 피트산(Phytic acid), 비타민 C, L-아스코르브산(L-Ascorbic acid), 알부틴, 프룩토스 디포스페이트, 트리소듐 프룩토스, 1, 6-디포스페이트 아데노신, 나이아신아마이드, 제니스테인(Genistein), 플라보노이드, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 레티놀, 헤스페리딘, 올레아노릭산(Oleanolic Acid), 폴리메틸 메타크리레이트, 티몰트리메톡시신나메이트(Thymol Trimethoxycinnamate), 홍삼 사포닌, 하이드롤라이즈드 인삼사포닌 및 아스코빌글루코사이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 식물 세포는 세포벽을 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 다음의 단계를 포함하는 활성 물질을 안정화시킨 후 안정화된 활성 물질을 포함하는 식물 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

(a) 1 - 100 MPa 의 조건에서 식물 세포 내에 활성 물질을 인입시키는 단계.

(b) 활성 물질이 인입된 식물 세포로부터 역삼투화를 이용해 탈수반응을 일으키는 단계 ; 및

(c) 활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하는 단계

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 식물 세포를 제조하는 방법의 활성 물질은 친수성 물질 및 소수성 물질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 식물 세포를 제조하는 방법의 활성 물질은 갈릭산(Gallic acid), 아미노산, 피트산(Phytic acid), 비타민 C, L-아스코르브산(L-Ascorbic acid), 알부틴, 프룩토스 디포스페이트, 트리소듐 프룩토스, 1, 6-디포스페이트 아데노신, 나이아신아마이드, 제니스테인(Genistein), 플라보노이드, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 레티놀, 헤스페리딘, 올레아노릭산(Oleanolic Acid), 폴리메틸 메타크리레이트, 티몰트리메톡시신나메이트(Thymol Trimethoxycinnamate), 홍삼 사포닌, 하이드롤라이즈드 인삼사포닌 및 아스코빌글루코사이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 식물 세포를 제조하는 방법의 식물 세포는 세포벽을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 식물 세포 내에 안정화된 활성 물질을 포함하는 화장료 조성물은 종래의 방법보다 간편한 방법을 사용하여 활성 물질의 안정화를 높여줄 수 있으며, 기능성 화장료 및 피부외용제의 성분으로 사용하면 안정성이 높아, 활성성분의 효과를 극대화 할 수 있다.

도 1은 활성 물질을 식물 세포 내에 인입하여 안정화시키는 과정을 보여주는 프루우 차트이다.

도 2a 내지 2d는 본 발명에 사용된 친수성 활성 물질인 시료 1 내지 시료 4에 대하여 고속액체크로마토그래피를 이용하여 성분분석을 한 결과 각각의 표준시약과 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 3a 내지 도 3c는 본 발명에 사용된 소수성 활성 물질인 시료 5 내지 시료 7에 대하여 HPLC 크로마토그램을 이용하여 성분분석을 한 결과 각각의 표준시약과 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4a 내지 도 4d는 본 발명의 친수성 활성 물질을 식물 세포 내에 인입한 후 제형 안정도 결과를 보여주는 그래프이다.

도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 소수성 활성 물질을 식물 세포 내에 인입한 후 제형 안정도 결과를 보여주는 그래프이다.

도 6은 식물 세포내에서 안정화된 상태로 인입된 갈릭산 시료에 대한 현미경 사진이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 식물 세포 내에 안정화된 활성 물질을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 식물 세포는 당업계에서 선택할 수 있는 어떠한 종류의 식물 세포도 이용될 수 있다.

본 발명에서 식물 세포는 붙어 있는 다 세포를 효소의 조합을 통한 전처리를 통하여 단일 세포로 만든 후 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 효소는 당업계에서 선택할 수 있는 어떠한 종류의 효소도 이용될 수 있다.

본 발명에서 용어 “활성 물질”이란 생체의 기능을 증진시키거나 혹은 억제시키는 물질을 말하며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 활성 물질은 친수성 물질 및 소수성 물질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 활성 물질은 친수성 물질일 수 있다. 본 발명의 친수성 활성 물질은 갈릭산(Gallic acid), 아미노산, 피트산(Phytic acid), 비타민 C, L-아스코르브산(L-Ascorbic acid), 알부틴, 프룩토스 디포스페이트, 트리소듐 프룩토스, 1, 6-디포스페이트 아데노신 및 나이아신아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 갈릭산(Gallic acid), 아미노산, 피트산(Phytic acid) 및 비타민 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 활성 물질은 소수성 물질일 수 있다. 본 발명의 소수성 활성 물질은 제니스테인(Genistein), 플라보노이드, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 레티놀, 헤스페리딘, 올레아노릭산(Oleanolic Acid), 폴리메틸 메타크리레이트, 티몰트리메톡시신나메이트(Thymol Trimethoxycinnamate), 홍삼 사포닌, 하이드롤라이즈드 인삼사포닌 및 아스코빌글루코사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 식물 세포는 세포벽을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 활성 물질을 안정화시킨 후 안정화된 활성 물질을 포함하는 식물 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

(c) 활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하는 단계

본 발명에서 사용되는 용어 ‘가용용매’는 활성 물질을 녹일 수 있는 모든 용매를 지칭하는것으로 물, 에탄올, 에틸아세테이트, 뷰틸렌글라이콜, 메탄올, 프로판다이올등을 말한다.

본 발명의 활성 물질을 가용용매에 용해시키는 단계에 있어서, 상기 가용용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올, 프로판디올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥산디올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 헥산, 페트로레움에테르 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 용매 또는 2이상의 혼합용매일 수 있으며, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올, 더욱 바람직하게는 물, 에탄올이다.

본 발명의 활성 물질 용액을 식물 세포와 함께 혼합하는 단계에 있어서 혼합방법은 당업계에서 2이상의 물질을 혼합하기 위해 통상적으로 사용되는 방법으로 행하여 질 수 있다. 보다 구체적으로는 활성 물질과 식물 세포는 동시에 또는 순차적으로 용기에 투입하여 혼합할 수 있다.

상기 용해공정을 통해 형성된 활성 물질 가용물은 식물 세포와 함께 수용액상에서 혼합되어 교반에 의한 자연 삼투압으로 용액 상태에서 평형화 되는데, 본 발명에 의한 식물 세포의 함량은 총 중량대비 0.1 - 30 중량%의 비율인 것이 바람직하다. 0.1 중량% 이하의 경우 식물 세포 삼투압율 저하문제가 있으며, 30 중량% 이상의 경우 식물 세포로 인입되는 액티브 물질 함량감소의 문제가 있기 때문이다. 활성 물질의 최적의 함량은 총 중량대비 0.01 - 10 중량%인 것이 바람직하다. 활성 물질에 따라서 효능을 나타내는 최적의 농도가 각기 다르고, 이 임계 범위에서 효과를 발휘한다.

상기 활성 물질 용액을 식물 세포와 함께 혼합하는 단계에서 활성 물질이 식물 세포 내로 일부 인입되며, 본 발명의 고압의 조건에서 식물 세포 내에 활성 물질을 인입시키는 단계에서 있어서, 고압을 가함으로써 활성 물질의 인입율이 높아지게 된다.

본 발명에서 사용되는 용어 ‘고압의 조건’은 식물 세포 내에 활성 물질의 인입이 일어나는데 적절한 조건을 의미하며, 구체적으로는 0.01 MPa - 500 MPa, 보다 바람직하게는 0.1 MPa - 100 MPa, 가장 바람직하게는 0.5 MPa - 20 MPa이다. 0.5 MPa 이하일 때에는 활성 물질의 인입이 효과적으로 일어나지 않으며, 20 MPa 이상일 때에는 세포벽의 파괴 문제가 있을 수 있기 때문이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 활성 물질을 안정화시키는 방법에 있어서 활성 물질의 인입율을 보다 높이기 위하여 활성 물질이 인입된 식물 세포로부터 탈수반응을 일으키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 ‘탈수반응’이란 유기화합물의 분자 내에서 물이 분리되는 반응 및 유기화합물 2분자에서 물이 이탈하여 축합하는 반응을 의미한다. 탈수반응은 친수성 물질을 이용하거나 가열하는 등 당업계에서 통상적으로 행해지는 방법에 의해 수행될 수 있으나 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 탈수반응은 역삼투화를 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 ‘역삼투화’란 용질의 농도가 낮은 쪽에 삼투압보다 더 큰 압을 가하여 용매를 용질의 농도가 낮은 쪽으로 보내는 과정을 의미한다(Reverse Osmosis (R/O): Selecting a Reverse Osmosis Unit By Arthur Fisher et. al. 참조). 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 나트륨 또는 칼륨 원소를 포함하는 염을 첨가하여 역삼투화시키는 방법을 이용할 수 있다.

역삼투화를 시키는 과정에서 식물 세포 내에 활성 물질을 남겨둔 채 저농도(식물 세포 내의 액장)에서 고농도(혼합액)로 탈수가 일어나게 되는데, 본 발명에 의한 최적의 가용성 염 첨가는 총 중량대비 0.5 - 40 중량%의 비율로 식물 세포 밖으로의 탈수를 유도하여 세포 내에 인입율을 극대화 한다. 자연상태에서는 바깥에 있는 물이 세포벽안으로 들어가는 것(삼투압)이 정상이지만 인위적으로 세포밖에 염을 첨가하여 세포 내에 있는 물을 탈수 시키는 것이 역삼투압이다.

활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하는 단계는 통상적으로 사용되는 세포수득을 위한 방법을 포함하나 필터 또는/및 원심분리를 통한 수득 방법을 이용할 수 있다. 필터를 사용하는 경우 1.2 - 50 um 및 40 - 200 mesh가 바람직하며, 원심분리를 사용하는 경우 100 - 9,000 rpm, 0 - 25℃가 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 회수 공정을 통해 수득된 활성 물질이 인입된 식물 세포는 표면의 불순물 및 인입되지 못한 활성 물질을 제거하는 세척단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우 증류수에 0.1 - 20 중량%의 염이 포함된 용액을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어 상기 식물 세포 내에 안정화된 활성 물질의 함량은 화장료 조성물 전체 중량 대비 0.001 내지 10 중량%을 함유하는 것이 바람직하며, 0.001% 이하에서는 활성을 나타내지 못하며 10% 이상에서는 제형의 사용감과 안정도에 영향을 미친다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

친수성 활성 물질의 안정화

<실시예 1> 페놀성 화합물 갈릭산의 안정화

갈릭산(>99%, Sigma, USA)을 3차 증류수에 10 중량%로 가하여 30분간 교반하였다. 그 후, 갈릭산 가용물 10 중량%와 식물 세포(Black soybean unicell, Healthy food ingredient Co., Ltd., JPN) 10 중량%를 증류수 80 중량%에 넣고, 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)을 이용하여 800 rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 교반하였다. 교반 뒤 식물 세포 혼합액을 고압 장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., JPN)를 이용하여 20 MPa, 25℃, 1시간 조건으로 고압을 가하였다. 고압을 거친 식물 세포 혼합액에 염화나트륨(Sodium Chloride, NaCl)을 2 중량% 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)을 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 역삼투를 유도, 탈수반응 시켰다. 그 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하였다. 이렇게 얻어진 식물 세포에 100배의 생리식염수(0.9 % NaCl 수용액)를 이용하여 표면을 세척 후 다시 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 시료를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 1"이라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

<실시예 2> 아미노산의 안정화

아미노산(AAS, Agilent, USA)을 3차 증류수에 20 중량%로 가하여 30분간 교반하였다. 그 후, 아미노산 가용물 20 중량%와 식물 세포(Black soybean unicell, Healthy food ingredient Co., Ltd., JPN) 1 중량%를 증류수 79 중량%에 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 교반하였다. 교반 뒤 식물 세포 혼합액을 고압 장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., JPN)를 이용하여 20 MPa, 25℃, 1시간 조건으로 고압을 가하였다. 고압을 거친 식물 세포 혼합액에 염화나트륨(Sodium Chloride, NaCl)을 2 중량% 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 역삼투를 유도, 탈수반응 시켰다. 그 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하였다. 이렇게 얻어진 식물 세포에 100배의 생리식염수(0.9 % NaCl 수용액)를 이용하여 표면을 세척 후 다시 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 시료를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 2"라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

<실시예 3> 유기산 피트산의 안정화

피트산(50 %(w/w), Sigma, USA)을 3차 증류수에 10 중량%로 가하여 30분간 교반하였다. 그 후, 피트산 가용물 10 중량%와 식물 세포(Black soybean unicell, Healthy food ingredient Co., Ltd., JPN) 10 중량%를 증류수 80 중량%에 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 교반하였다. 교반 뒤 식물 세포 혼합액을 고압 장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., JPN)를 이용하여 20 MPa, 25℃ 조건에서 1시간 동안 고압을 가하였다. 고압을 거친 식물 세포 혼합액에 염화나트륨(Sodium Chloride, NaCl)을 2 중량% 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 역삼투를 유도, 탈수반응 시켰다. 그 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하였다. 이렇게 얻어진 식물 세포에 100배의 생리식염수(0.9 % NaCl 수용액)를 이용하여 표면을 세척한 후 다시 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 시료를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 3"이라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

<실시예 4> 수용성 비타민 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)의 안정화

L-아스코르브산(>99%, Samchun, KOR)을 3차 증류수에 20 중량%로 가하여 30분간 교반하였다. 그 후, 아스코르브산 가용물 10 중량%와 식물 세포(Black soybean unicell, Healthy food ingredient Co., Ltd., JPN) 10 중량%를 증류수 80 중량%에 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 교반하였다. 교반 뒤 식물 세포 혼합액을 고압 장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., JPN)를 이용하여 20 MPa, 25℃ 조건에서 1시간 동안 고압을 가하였다. 고압을 거친 식물 세포 혼합액에 염화나트륨(Sodium Chloride, NaCl)을 2 중량% 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 역삼투를 유도, 탈수반응 시켰다. 그 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하였다. 이렇게 얻어진 식물 세포에 100배의 생리식염수(0.9 % NaCl 수용액)를 이용하여 표면을 세척 후 다시 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 시료를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 4"라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

소수성 활성 물질의 안정화

<실시예 5> 이소플라본 제니스테인(Genistein)의 안정화

제니스테인(>99%, Sigma, USA)을 99.5 % 에틸알코올(Ethyl Alcohol,Ethanol)에 5 중량%로 가하여 30분간 교반하였다. 그 후, 제니스테인 가용물 10 중량%와 식물 세포(Black soybean unicell, Healthy food ingredient Co., Ltd., JPN) 10 중량%를 증류수 80 중량%에 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 교반하였다. 교반 뒤 식물 세포 혼합액을 고압 장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., JPN)를 이용하여 20 MPa, 25℃ 조건에서 1시간 동안 고압을 가하였다. 고압을 거친 식물 세포 혼합액에 염화나트륨(Sodium Chloride, NaCl)을 2 중량% 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 역삼투를 유도, 탈수반응 시켰다. 그 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하였다. 이렇게 얻어진 식물 세포에 100배의 생리식염수(0.9 % NaCl 수용액)를 이용하여 표면을 세척 후 다시 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 시료를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 5"라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

<실시예 6> 플라보노이드 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)의 안정화

에피갈로카테킨 갈레이트(>99%, Sigma, USA)를 70% 에틸알코올(Ethyl Alcohol,Ethanol) 수용액에 5 중량%로 가하여 30분간 교반하였다. 그 후, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 가용물 10 중량%와 식물 세포(Black soybean unicell, Healthy food ingredient Co., Ltd., JPN) 10 중량%를 증류수 80 중량%에 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 교반하였다. 교반 뒤 식물 세포 혼합액을 고압 장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., JPN)를 이용하여 20 MPa, 25℃, 1시간 조건으로 고압을 가하였다. 고압을 거친 식물 세포 혼합액에 염화나트륨(Sodium Chloride, NaCl)을 2 중량% 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 역삼투를 유도, 탈수반응 시켰다. 그 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하였다. 이렇게 얻어진 식물 세포에 100배의 생리식염수(0.9 % NaCl 수용액)을 이용하여 표면을 세척 후 다시 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 시료를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 6"이라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

<실시예 7> 지용성 비타민 레티놀의 안정화

레티놀(>99%, Sigma, USA)을 99.5 % 에틸알코올(Ethyl Alcohol,Ethanol) 수용액에 5 중량%로 가하여 30분간 교반하였다. 그 후, 레티놀 가용물 10 중량%와 식물 세포(Black soybean unicell, Healthy food ingredient Co., Ltd., JPN) 10 중량%를 증류수 80 중량%에 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 교반하였다. 교반 뒤 식물 세포 혼합액을 고압 장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., JPN)를 이용하여 20 MPa, 25℃ 조건에서 1시간 동안 고압을 가하였다. 고압을 거친 식물 세포 혼합액에 염화나트륨(Sodium Chloride, NaCl)을 2 중량% 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)을 이용하여 800rpm, 20℃, 조건으로 1시간 동안 역삼투를 유도, 탈수반응 시켰다. 그 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하였다. 이렇게 얻어진 식물 세포에 100배의 생리식염수(0.9 % NaCl 수용액)를 이용하여 표면을 세척 후 다시 원심분리기(Supra 22K, Hanil, KOR)를 이용하여 9,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분간 고속 원심분리하여 시료를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 7"이라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

[시험예 1] 고속액체크로마토그래피(HPLC) 성분분석

본 발명의 식물 세포 내에 안정화된 활성 물질의 봉입효율 및 성분분석을 위해 하기와 같이 분석을 실시하였다.

[친수성 활성 물질]

(1) 페놀성 화합물 갈릭산

본 발명의 식물 세포 내에 안정화된 갈릭산의 봉입효율 및 성분분석을 위하여 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용해 분석을 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조 하여 0.2 um 디스크 필터에 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 사용하여 UV 254 ～ 340 nm영역에서 분석하였으며, C18컬럼(Zorbax XDB-C18 4.6 x 250mm, Agilent, USA)을 사용하여 2% 아세트산용매와 아세토나이트릴(ACN)용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 HPLC급 시약을 사용하였으며, 표준물질로는 갈릭산(>99%, Sigma, USA)를 사용하여 성분분석을 수행하였다. 분석결과는 [도 2a], [표 1]과 같다.

(2) 아미노산

본 발명의 식물 세포 내에 안정화된 아미노산의 봉입효율 및 성분분석을 위하여 시료를 각 용매로 적당 농도를 제조하여 0.2 um 디스크 필터에 여과, 전처리 후 o-프탈알데히드(o-phthalaldehyde, OPA Agilent), 9-풀루오레닐메틸클로로포름(9-fluorenylmethylchloroformate.FMOC) 유도체를 사용하여 형광을 띄는 이소인돌(isoindole)을 형성시킨 후 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 이용한 형광검출기(FLD, Agilent Technologies, USA)에서 아미노산을 검출하였으며 표준물질로 250 pM 표준 아미노산 분석(Amino acid Analysis Standard; AAS, Agilent, USA)을 사용하여 검량선을 작성하고, 성분분석을 수행하였다. 분석결과는 [도 2b], [표 1]에 나타내었다.

(3) 유기산 피트산

본 발명의 식물 세포 내에 안정화된 피트산의 봉입효율 및 성분분석을 위하여 시료를 각 용매로 적당 농도를 제조하여 0.2 um 디스크필터(disk filter)에 여과, 전처리 후 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 이용한 증기화광산란검출기(Eraporative Light Scaterring Detector; ELSD 3300, Alltech, USA)를 통해 피트산을 검출하였으며 용출액은 3차 증류수, 컬럼온도는 25℃, 유속은 0.5 ml/min, 가스유속은 1.4 L/min, 게인(Gain)은 1로 고정하고, 표준물질로 피트산(Sigma, USA)을 사용하여 검량선을 작성하고, 성분분석을 수행하였다. 분석결과는 [도 2c], [표 1]에 나타내었다.

(4) 수용성 비타민 비타민 C

본 발명의 식물 세포 내에 안정화된 비타민 C의 봉입효율 및 성분분석을 위하여 시료를 각 용매로 적당 농도를 제조하여 0.2 um 디스크 필터에 여과, 전처리 후 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 이용하여 다이오드 배열 검출기(Diode Array Detector, DAD; UV, 254nm)로 분석하였고, 이동상은 0.05M KH₂PO₄ : ACN = 60 : 40 (v/v)으로 고정하여 1.0 ml/min의 유속으로 흘려주었다. 표준물질로 L-아스코르브산(>99%, Samchun, KOR)를 사용하여 검량선을 작성하고, 성분분석을 수행하였다. 분석결과는 [도 2d], [표 1]에 나타내었다. 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 이용한 친수성 활성 물질 식물 세포 내에 안정화 시료의 함량은 하기 표 1과 같으며, 봉입효율은 하기 수학식 1에 의거하여 계산하여 나타내었다.

[수학식 1]

※

표 1

시 료	활성 물질 종류	함량 (%)	봉입효율 (%)	비고
시료 1	갈릭산	2.80	28.0
시료 2	아미노산	0.03	37.5
시료 3	피트산	0.54	10.8
시료 4	비타민C	3.11	15.6

[소수성 활성 물질]

(5) 이소플라본 제니스테인(Genistein)

본 발명의 식물 세포 내에 안정화된 제니스테인의 봉입효율 및 성분분석을 위하여 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용해 분석을 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조 하여 0.2 um 디스트 필터에 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 사용하여 UV 254 ～ 340 nm영역에서 분석하였으며, C18컬럼(Zorbax XDB-C18 4.6 x 250mm, Agilent, USA)을 사용하여 2% 아세트산 용매와 아세토나이트릴(Acetonitrile, ACN)용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 고속액체크로마토그래피급 시약을 사용하였으며, 표준물질로는 제니스테인(>99%, Sigma, USA)를 사용하여 성분분석을 수행하였다. 분석결과는 [도 3a], [표 2]과 같다.

(6) 플라보노이드 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)

본 발명의 식물 세포 내에 안정화된 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)의 봉입효율 및 성분분석을 위하여 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용해 분석을 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조 하여 0.2 um 디스크 필터에 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 사용하여 UV 254 ～ 340 nm영역에서 분석하였으며, C18컬럼(Zorbax XDB-C18 4.6 x 250mm, Agilent, USA)을 사용하여 2% 아세트산용매와 아세토나이트릴(Acetonitrile, ACN)용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 고속액체크로마토그래피급 시약을 사용하였으며, 표준물질로는 에피갈로카테킨 갈레이트(>99%, Sigma, USA)를 사용하여 성분분석을 수행하였다. 분석결과는 [도 3b], [표 2]와 같다.

(7) 지용성 비타민 레티놀

본 발명의 식물 세포 내에 안정화된 레티놀의 봉입효율 및 성분분석을 위하여 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용해 분석을 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조 하여 0.2 um 디스크 필터에 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 사용하여 UV 325 nm영역에서 분석하였으며, 유속 1 ml/min, 컬럼온도 25℃, C18컬럼(Zorbax XDB-C18 4.6 x 150mm, Agilent, USA)을 사용하여 90% 메탄올(MeOH) 수용액 용매를 사용하여 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 고속액체크로마토그래피급 시약을 사용하였으며, 표준물질로는 레티놀(>99%, Sigma, USA)를 사용하여 성분분석을 수행하였다. 분석결과는 [도 3c], [표 2]과 같다. 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 이용한 소수성 활성 물질 식물 세포 내에 안정화 시료의 함량은 하기 표 2와 같으며, 봉입효율은 상기 수학식 1에 의거하여 계산하여 나타내었다.

표 2

시 료	활성 물질 종류	함량(%)	봉입효율(%)	비고
시료 5	제니스테인	0.35	7.0
시료 6	에피갈로카테킨 갈레이트	1.21	24.2
시료 7	레티놀	0.41	8.2

[제형실시예 1 및 제형비교예 1]

상기 실시예 1에 따른 식물 세포 내에 안정화된 갈릭산를 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 [표 3]과 같이 구성하여 제조하였다.

표 3

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 1	2.0	-
17	갈릭산	-	2.0
18	증류수	잔량	잔량
19	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 3의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 18의 수성성분을 80 ℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1내지 11을 80 ℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 18의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3000 rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 19를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[제형실시예 2 및 제형비교예 2]

상기 실시예 2에 따른 식물 세포 내에 안정화된 아미노산을 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 [표 4]와 같이 구성하여 제조하였다.

표 4

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 2	2.0	-
17	아미노산 표준물	-	2.0
18	증류수	잔량	잔량
19	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 4의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 18의 수성성분을 80 ℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1내지 11을 80 ℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 18의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3000 rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 19를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[제형실시예 3 및 제형비교예 3]

상기 실시예 3에 따른 식물 세포 내에 안정화된 피트산를 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 [표 5]와 같이 구성하여 제조하였다.

표 5

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 3	2.0	-
17	피트산	-	2.0
18	증류수	잔량	잔량
19	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 5의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 18의 수성성분을 80 ℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1내지 11을 80 ℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 18의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3000 rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 19를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[제형실시예 4 및 제형비교예 4]

상기 실시예 4에 따른 식물 세포 내에 안정화된 비타민C를 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 [표 6]과 같이 구성하여 제조하였다.

표 6

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 4	2.0	-
17	비타민C	-	2.0
18	증류수	잔량	잔량
19	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 6의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 18의 수성성분을 80 ℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1내지 11을 80 ℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 18의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3000 rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 19를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[제형실시예 5 및 제형비교예 5]

상기 실시예 5에 따른 식물 세포 내에 안정화된 제니스테인을 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 [표 7]과 같이 구성하여 제조하였다.

표 7

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 5	2.0	-
17	제니스테인	-	2.0
18	증류수	잔량	잔량
19	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 7의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 16, 18의 수성성분을 80 ℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1내지 11, 17을 80 ℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 16, 18의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3000 rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 19를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[제형실시예 6 및 제형비교예 6]

상기 실시예 6에 따른 식물 세포 내에 안정화된 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 [표 8]과 같이 구성하여 제조하였다.

표 8

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 6	2.0	-
17	EGCG	-	2.0
18	증류수	잔량	잔량
19	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 8의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 18의 수성성분을 80 ℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1내지 11을 80 ℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 18의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3000 rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 19를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[제형실시예 7 및 제형비교예 7]

상기 실시예 7에 따른 식물 세포 내에 안정화된 레티놀을 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 표 9와 같이 구성하여 제조하였다.

표 9

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 7	2.0	-
17	레티놀	-	2.0
18	증류수	잔량	잔량
19	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 9의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 16, 18의 수성성분을 80 ℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1내지 11, 17을 80 ℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 16, 18의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3000 rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 19를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[시험예 2] 제형 안정도 실험

본 발명의 식물 세포 내에 안정화된 활성 물질의 제형 내에 안정도 실험을 위해 상기와 같이 제조된 각 제형실시예 및 제형비교예를 90℃ 가혹조건 하에 시간별로 샘플링하여 고속액체크로마토그래피 분석 후 시간 흐름에 따른 활성성분의 임의적 단위(Arbitary unit. A.U.) 감소로 안정도를 나타내었다(도 4a 내지 도 4d 및 도 5a 내지 도 5c 참조).

[시험예 3] 염색법에 의한 현미경 세포관찰

본 발명의 식물 세포 내에 안정화된 활성 물질의 세포관찰을 위해 하기와 같이 현미경 관찰을 수행하였다. 현미경 관찰은 염색법을 이용하여 수행하였다. 시료 1을 100배의 3차 증류수로 희석, 30초간 실험용 교반기를 이용하여 섞은(Vortexing) 후 메틸렌블루(Sigma, USA)를 이용하여 염색을 하였다. 염색 후 광학 현미경(Eclipse E600, Nikon, JPN)을 이용하여 최종배율 100배에서 관찰하였으며, 영상을 캡쳐하여 [도 6]에 나타내었다.

이하, 본 발명의 제형예로서 유연 화장수, 수렴화장수, 영양 화장수, 마사지 크림, 에센스 및 팩을 예시하나 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

표 10은 유연화장수 제형예를 나타낸다[제형예1].

표 10

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	식물 세포 내에 안정화된 활성 물질	5.0
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

표 11은 수렴화장수의 제형예를 나타낸다[제형예2].

표 11

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	식물 세포 내에 안정화된 활성 물질	3.0
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

표 12는 영양화장수의 제형예를 나타낸다[제형예3].

표 12

번호	성 분	함량(%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	식물 세포 내에 안정화된 활성 물질	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

표 13은 에센스의 제형예를 나타낸다[제형예4].

표 13

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	식물 세포 내에 안정화된 활성 물질	5.00
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

표 14는 팩의 제형예를 나타낸다[제형예5].

표 14

번호	성 분	함량(%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	식물 세포 내에 안정화된 활성 물질	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

Claims

안정화된 활성 물질을 포함하는 식물 세포를 함유하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 활성 물질은 친수성 물질 및 소수성 물질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 활성 물질은 갈릭산(Gallic acid), 아미노산, 피트산(Phytic acid), 비타민 C, L-아스코르브산(L-Ascorbic acid), 알부틴, 프룩토스 디포스페이트, 트리소듐 프룩토스, 1, 6-디포스페이트 아데노신, 나이아신아마이드, 제니스테인(Genistein), 플라보노이드, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 레티놀, 헤스페리딘, 올레아노릭산(Oleanolic Acid), 폴리메틸 메타크리레이트, 티몰트리메톡시신나메이트(Thymol Trimethoxycinnamate), 홍삼 사포닌, 하이드롤라이즈드 인삼사포닌 및 아스코빌글루코사이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 식물 세포는 세포벽임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
다음의 단계를 포함하는 활성 물질을 안정화시킨 후 안정화된 활성 물질을 포함하는 식물 세포를 제조하는 방법.

(a) 1-100 MPa 의 조건에서 식물 세포 내에 활성 물질을 인입시키는 단계 ;

(b) 활성 물질이 인입된 식물 세포로부터 역삼투화를 이용해 탈수반응을 일으키는 단계 ; 및

(c) 활성 물질이 인입된 식물 세포를 수득하는 단계.
제 5 항에 있어서,

상기 활성 물질은 친수성 및 소수성으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 식물 세포를 제조하는 방법.
제 5 항에 있어서,

상기 활성 물질은 갈릭산(Gallic acid), 아미노산, 피트산(Phytic acid), 비타민 C, L-아스코르브산(L-Ascorbic acid), 알부틴, 프룩토스 디포스페이트, 트리소듐 프룩토스, 1, 6-디포스페이트 아데노신, 나이아신아마이드, 제니스테인(Genistein), 플라보노이드, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 레티놀, 헤스페리딘, 올레아노릭산(Oleanolic Acid), 폴리메틸 메타크리레이트, 티몰트리메톡시신나메이트(Thymol Trimethoxycinnamate), 홍삼 사포닌, 하이드롤라이즈드 인삼사포닌 및 아스코빌글루코사이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 식물 세포를 제조하는 방법.
제 5 항에 있어서,

상기 식물 세포는 세포벽임을 특징으로 하는 식물 세포를 제조하는 방법.