KR20060118571A

KR20060118571A - 피부 탈색 및/또는 미백 목적의 탈분화된 식물 세포의동결건조물의 용도

Info

Publication number: KR20060118571A
Application number: KR1020067013677A
Authority: KR
Inventors: 니콜 메키데케
Original assignee: 바이오테크마린
Priority date: 2003-12-29
Filing date: 2004-12-03
Publication date: 2006-11-23
Also published as: EP1699423B1; KR101125918B1; JP2007517005A; US20070098668A1; ATE377411T1; US7604806B2; PL1699423T3; CA2551414C; PT1699423E; CY1108044T1; WO2005072697A1; JP4974679B2; DE602004009964D1; FR2864446B1; ES2297526T3; KR20120004562A; AU2004314922B2; HK1103964A1; UA89487C2; BRPI0418291B1

Abstract

본 발명은 보호 재생 효과와 함께 피부 탈색 및/또는 미백 목적의 미용 또는 약학 조성물에서 탈분화(dedifferentiation)된 식물 세포의 적어도 한가지 동결건조물(lyophilisate)의 용도에 관계한다. 이에 더하여, 본 발명은 이와 같은 동결건조물을 함유하는 국소-투약 미용 또는 약학 조성물에 관계한다.

미용 또는 약학 조성물

Description

피부 탈색 및/또는 미백 목적의 탈분화된 식물 세포의 동결건조물의 용도{USE OF A LYOPHILISATE OF DEDIFFERENTIATED PLANT CELLS FOR SKIN DEPIGMENTATION AND/OR LIGHTENING}

본 발명은 피부 탈색 및/또는 미백, 표피의 보호와 재생 목적의 미용 또는 약학 조성물에서 탈분화(dedifferentiation)된 식물 세포의 적어도 한가지 동결건조물(lyophilisate)의 용도에 관계한다.

본 발명은 보호 재생 효과와 함께 피부 탈색 및/또는 미백 목적의 미용 또는 약학 조성물에서 탈분화된 식물 세포의 적어도 한가지 동결건조물의 용도에 관계한다. 이에 더하여, 본 발명은 이와 같은 적어도 한가지 동결건조물을 함유하는 국소-투약 미용 또는 약학 조성물에 관계한다.

피부는 외부 환경과 내부 기관 사이의 접촉면을 구성하는 보호 외피이다. 하지만, 피부는 밀폐되지 않고, 흡수 기관으로서 구멍과 모낭(hair follicle)을 통한 용해된 물질의 침투를 허용한다.

피부는 추위, 열, 방사선, 압력, 마찰, 화학물질에 의해 유발된 병소, 미생물의 침투, 수분 상실, 체온 상실로부터 보호한다.

자외선에 대한 피부의 자연적 보호 효과는 갈색 색소, 멜라닌을 발생시킨다. 멜라닌은 표피의 기저 세포층: 멜라닌세포(melanocyte)에 존재한다. 이는 아미노산 티로신으로부터 합성되고 효소 티로시나아제에 의해 변형된다. 멜라닌 합성은 UV 광에 의해 유도된다. 피부의 짙은 천연색은 일광에 대한 일차적이고 자연적인 보호인데, 이는 투명 피부에는 극히 부적합하다. 황갈색(tan)은 UV, 멜라닌 합성에서 증가된 멜라닌세포 활성, 각화세포(keratinocyte)에서 멜라닌의 축적의 효과에 기인한다.

멜라닌 양 및 멜라닌 세포 수는 피부색을 결정하는 유전적으로 예정된 인자이다.

멜라닌의 과도한 국소 생산은 반점, 주근깨(freckle), 기미(chloasma), 일광 흑자(solar lentigo), 노인성 반점(senile lentigo) 등의 외관을 유발한다. 실제로, 가장 최근의 명명법에 따라, 검버섯(aging spot)은 노인성 반점이고, 다른 반점은 일광 흑자이다.

“검버섯”은 작고 엷은 갈색이며 편평하고 전체적으로 둥근 반점이다. 이들은 얼굴, 손등, 데콜테(decollete), 팔뚝에서 가장 빈번하게 발견된다. 이들은 일광과 노화의 조합에 의해 유발된다. 이들의 개수는 나이가 들면서 증가한다. UV 광의 반복된 작용하에, 멜라닌세포는 멜라닌의 생산이 증가한다.

흑자(lentigine)는 겨울에 나타나지 않고, 아주 작고 다수이며 서로 매우 밀집하여 위치하는 갈색 “주근깨”이다. 이들은 얼굴, 어깨, 데콜테에서 가장 빈번하게 나타난다. 이들은 과선량의 자외선에 기인하고 매우 어린 나이에 형성될 수 있다.

“기미”는 균일하지 않은 윤곽을 갖는 커다란 갈색 반점으로서, 얼굴에서 가장 빈번하게 나타나고, 때때로 마스크의 형상을 취한다. 이들 반점이 임신 과정에서 나타나는 경우에 기미라고 하고, 다른 경우에 흑반(melasma)이라고 한다. 이들은 UV 광에 대한 노출과 결합된 호르몬 자극(임산, 호르몬요법)에 의해 유발된다.

이들 모든 유형의 반점은 유전 양식(genetic inheritance) 및 유전 형질(heredity)과 연관될 수 있다.

이런 과농축된 멜라닌의 부적절한 측면으로 인하여, 이런 외관을 예방하고 및/또는 억제할 수 있는 국소 제제(topical preparation)의 이용가능성이 극히 중요하다.

미용과 약학 제제의 제조업체는 멜라닌의 합성을 직간접적으로 차단하거나, 또는 멜라닌소체(melanosoma)의 각화세포로의 전달을 저해하거나 차단하면서 일광 착색(solar pigmentation)으로부터 이들 부위를 보호하는 비-공격성 활성 성분을 지속적으로 찾고 있다. 미용 제제의 제조업체는 또한, 피부 보호 산물을 제공함으로써 피부색을 미백하려는 흑인이나 황인 집단의 증대하는 욕구를 충족시키기 위하여 탈색(depigmentation)용 비-공격성 활성 성분을 찾으려 노력하고 있다.

다른 이용가능한 공격성 탈색 처리(레이저, 냉동 요법)의 단점을 극복하기 위하여, 이들 활성 성분은 동시적으로 피부를 보호하고 및/또는 피부를 구성하는 세포의 재생을 자극해야 한다.

실제로, 피부 보호 및/또는 피부 세포의 재생 자극은 이들 반점: 복수 원인 에 기인한 피부 노화를 악화시키는 인자를 동시적으로 극복할 수 있다.

피부 노화의 첫 번째 원인은 “예정된” 노화인데, 이는 스트레스, 흡연, 특정 질환에 의해 가속화될 수 있다. 시간이 흐름에 따라, 피부는 탄력을 상실하게 되는데, 그 이유는 진피가 더욱 적어진 콜라겐과 엘라스틴 섬유를 생산하기 때문이다. 따라서, 연결 조직이 점진적으로 약화되고 피부가 느슨해진다. 표피 역시 재생 능력이 감소하고, 변화된 대사로 인하여 더욱 탈수되고 얇아진다. 시간이 흐름에 따라, 피부는 또한 짙은 외관(dull complexion)을 유발하는 아시니스(ashiness)가 진행되는데, 이는 미백 치료에 의해 극복될 수 있다.

노화의 두 번째 이유는 조직, 세포, 기관 기능의 점진적 축소를 유발하는 호르몬 생산의 감소이다. 호르몬, 예를 들면, 성장 호르몬(HGH), 테스토스테론, DHEA, 멜라토닌은 20세까지 최대량으로 생산되는데, 이들은 세포 재생에 도움을 준다.

환경 효과(다양한 오염원: 배기 가스, 담배 연기, 공장 매연, 화학적 산물 등)와 공동으로 이들 상이한 노화 원인은 여러 세포 성분: 단백질, 지질, 당, DNA를 표적하고 피부 노화의 추가적인 원인이 되는 유리 라디칼의 과도한 생산을 초래한다. 일부 외부적 영향에 의해 유인된 이들 라디칼은 결합을 형성하기 위하여 다른 분자를 지속적으로 탐색한다. 이후, 이들은 피부의 콜라겐 섬유, 세포막, 지방층을 공격한다. 이들은 세포의 유전 양식을 변화시키고, 따라서 새로운 피부 세포의 질을 하락시킨다.

신체는 이들 산화 반응에 대항하는 상이한 효소 시스템(항-산화제)로 이들 공격으로부터 자신을 보호한다. 20세 이후, 자연 방어 기전은 점진적으로 약화되고 피부 단독으로는 자신을 방어할 수 없게 된다.

놀랍게도, 본 출원인은 탈분화된 식물 세포의 동결건조물이 원하는 효과: 완전히 무해한 표피의 탈색 및/또는 미백; 표피의 보호와 재생화를 동시에 달성할 수 있음을 발견하였다.

탈분화된 세포는 줄기 세포로서 모든 세포 잠재력을 유지한다. 이들은 게놈의 모든 유전자를 발현하고, 따라서 각 유형의 분화된 세포가 외부 환경으로부터 자신을 보호할 수 있도록 하는 모든 단백질을 발현한다.

이런 이유로, 본 발명의 첫 번째 측면은 미용 또는 약학 조성물의 제조를 위한 탈분화된 식물 세포의 적어도 한가지 동결건조물의 용도인데, 상기 동결건조물은 표피를 탈색 및/또는 미백하고, 표피를 보호하고 재생시킬 수 있다.

“탈분화된 식물 세포”는 분화(specialization)의 특성을 나타내지 않고, 자체로써 식물의 완전한 모종(young plant)을 재생산할 수 있는 임의의 식물 세포를 의미한다. 세포는 외식체(explant)라고 하는 전체 식물 또는 식물의 기관, 예를 들면, 잎, 줄기, 뿌리, 종자, 꽃, 꽃잎, 꽃밥, 열매 등의 임의의 샘플로부터 분리될 수 있다.

적절하게는, 잎이나 종자의 단편이 외식체로서 이용된다.

외식체의 시험관내 배양이 특히 선호된다. “시험관내 배양”은 완전하게 통제된 조건하에, 정의된 영양 배지에서 배양된 외식체로부터 기관 또는 전체 식물을 재생산할 수 있는 당업자에게 공지된 기존 문헌의 전체 기술을 의미한다. 이들 완전하게 통제된 조건은 모종의 완벽한 재생성(reproducibility)과 균일성(homogeneity)을 담보할 수 있다. 특히, 이런 배양 방법은 무한히 동일한 클론을 제공한다. 기존 문헌에 기술된 시험관내 배양 방법과 배지 중에서, "Plant Culture Media: formulations and uses, E.F. George, DJM Puttock and H.J. George (Exegetics Ltd 1987)"에 기술된 제조물인 Gamborg(1968), Murashige와 Skoog(1962), Morel(1970) 등의 배지가 예로써 언급될 수 있다.

특히, 호염성(halophile) 식물, 예를 들면, 살리코르니아 라모씨시마(Salicornia ramossisima)(Salicorne), 수에다 베라(Sueda vera), 베타 마리티마(Beta maritima), 오비원 포르툴라코이데스(Obione portulacoides), 아르메리아 마리티마(Armeria maritima), 크리트뭄 마리티뭄(Crithmum maritimum)(Criste Marine), 오피리스 스페고데스(Ophrys sphegodes), 아르테미아 불가리스(Artemia vulgaris), 무스카리스 코모섬(Muscaris comosum), 에린기움 마리티뭄(Eryngium maritimum), 산귀소르바 마이너(Sanguisorba minor), 코클레아리아 오피시날리스(Cochlearia officinalis), 푸마리아 오피시날리스(Fumaria officinalis), 빈세톡시쿰 풀로눔(Vincetoxicum fullonum), 디프사쿠스 풀로눔(Dipsacus fullonum), 헤라클레움 스폰딜리움(Heracleum spondylium), 이눌라 크리트모이데스(Inula crithmoides), 이눌라 브리타니카(Inula brittanica), 이눌라 비스코사(Inula viscosa)의 탈분화된 식물 세포, 가장 바람직하게는 크리스테 마린(Criste Marine)의 탈분화된 식물 세포의 이용이 선호된다. 염생 식물(halophyte)이라고 하는 이들 호염성 식물은 고염도 토양을 견뎌내는 식물이다. 이들 식물은 그들이 입식하는 공격성 외부 환경에 대항하는 방어 시스템을 발달시켰다. 특히, 염생 식물은 고염도 토양, 습도, 바람을 견뎌낼 수 있는 해변 식물이다. 이들 식물은 세포에서 삼투압을 유지하기 위하여 끊임없이 노력하는데, 수분은 세포막(plasmic membrane)을 통과하여 더욱 높은 나트륨 농도를 보유하는 세포외 구획으로 이동하게 된다.

염생 식물이 이용되는 경우에, 바다 오염의 위험에 처해있는 이들 종을 보호하기 위하여 무한하고 재생가능한 바이오매스(biomass)를 제공하는 시험관내 세포 배양액을 개발하는 것이 특히 중요하다.

본 발명의 특정 구체예에서, 특정 배양 조건(pH, 온도, 실온 가스 조성, 배양 배지 조성, 광도)을 조절하는 것도 가능하다. 탈분화된 세포는 특정 세포내 물질을 다소간 생산하는 경향이 있다.

본 발명의 두 번째 측면은 국소-투약 미용 또는 약학 조성물인데, 여기서 상기 조성물은 생리학적으로 허용되는 기부(base)에, 0.05 내지 2%, 바람직하게는 0.1 내지 1%, 가장 바람직하게는 0.5%의 상기한 적어도 한가지 동결건조물을 함유한다.

실제로, 이런 동결건조물은 본 발명에 따른 조성물의 유일 활성 성분으로 사용될 수 있다. 하지만, 여러 동결건조물이 본 발명의 조성물의 기부에 첨가될 수도 있다.

본 발명의 첫 번째 특정 구체예에서, 탈분화된 식물 세포의 적어도 한가지 동결건조물은 피부 외관(skin aspect)을 회복시킬 것으로 기대되는 미용 또는 약학 조성물의 제조에 사용된다.

본 발명의 두 번째 특정 구체예에서, 탈분화된 식물 세포의 적어도 한가지 동결건조물은 색소성 모반(lentigo)이라고 하는 반점을 치료할 것으로 기대되는 미용 또는 약학 조성물의 제조에 사용된다.

본 발명의 세 번째 특정 구체예에서, 탈분화된 식물 세포의 적어도 한가지 동결건조물은 흑색이나 황색 피부를 미백할 것으로 기대되는 미용 또는 약학 조성물의 제조에 사용된다.

아래의 실시예에서는 범위의 제한없이 본 발명을 예시한다.

도 1: 전반적인 형태, 단순 재구성된 표피 SKINETHIC^®(각화세포)에서 헤마톡실린/에오신(HES)으로 염색

도 2: 전반적인 형태, 멜라닌세포를 포함하는 단순 재구성된 표피 SKINETHIC^®에서 헤마톡실린/에오신(HES)으로 염색

도 3: 필라그린(filaggrine)의 라벨링(labelling)

도 4: KI-67의 라벨링(유사분열 지수(mitotic index)의 평가)

실시예 1: 식물 조직으로부터 탈분화된 크리스테 마린(Criste marine) 세포의 시험관내 배양

1 - 일차 유합 조직(callus)의 획득

선택된 구역, 줄기, 잎 등에서 조직 절편(최소 3 ㎝)은 한 쌍의 가위를 이용하여 절단한다. 본 조작 단계에서, 모든 작업은 무균 대기하에 무균 작업대(laminar flow hood)에서 수행된다.

식물 재료를 멸균하기 위하여, 조직은 에탄올에 30초간 담그고 용제를 제거하며, 이후 이들 조직은 3 x 100 ㎖의 무균 H₂O로 씻어내고 몇 방울의 Tween 20이 첨가된 아염소산나트륨(sodium hydrochlorite)에 15분간 담그고 3 x 100 ㎖의 무균 H₂O로 씻어낸다.

조직 배양을 위하여, 이들 조직 단편은 무균 페트리 접시(125 ㎜)에 집어넣고 절단하며(2 내지 3 ㎜) 아염소산나트륨으로 표백된 부분을 조심스럽게 제거한다. 이렇게 수득된 외식체는 가늘게 절개하여 아가 영양 배지에 도말하고 반쯤 묻는다(표 1).

2 - 유합 조직 재식(replanting)

본 조작 단계에서, 모든 작업은 무균 대기하에 무균 작업대에서 수행된다. 유합 조직 수준에서 압설자(spatula)로 2 내지 3개의 세포 클러스터(1 내지 2 ㎝)를 채취한다.

이들 클러스터는 새로운 배지에 도말하고 분산시킨다.

고형 배양 배지의 조성

다량원소	㎎/ℓ
KNO₃	2500
(NH₄)₂SO₄	134
CaCl₂, 2H₂O	150
NaH₂PO₄, 2H₂O	300
MgSO₄, 7H₂O	250
미량원소	㎎/ℓ
MnSO₄, H₂O	16.9
ZnSO₄, 7H₂O	8.6
H₃BO₃	6.2
Kl	0.83
Na₂MoO₄, 2H₂O	0.25
CuSO₄, 5H₂O	0.025
FeSO₄, 7H₂O	27.8
비타민	㎎/ℓ
미오-이노시톨	100
니코틴산	1
칼슘-D(+)-판토테네이트	1
(+)-비오틴	0.01
피리독살 클로하이드레이트	1
티아민 디클로라이드	1
유기 화합물	g/ℓ
사카로오스	30
식물호르몬	㎎/ℓ
나프탈렌 아세트산	1.5
2,4-디클로로페녹시아세트산	0.5
키네틴	0.5
겔화제	g/ℓ
아가	9

3 - 액체 배지에서 유합 조직 세포의 확장

- 유지 종자(maintenance seed)

이들 유합 조직 세포는 고형 아가-없는 배지와 동일한 액체 배지로 이전한다(표 1). 이들은 교반(110 rpm/min)하에 25℃, 연속 백광(3500 lux, 형광 튜브 “일광”), 250 ㎖ Erlenmeyer 플라스크에서 Erlenmeyer 플라스크당 50 ㎖의 비율로 성장시킨다.

이들은 매 10-11일마다 1:4(즉, 100 ㎖/400 ㎖)로 희석한다.

- 건식 재료(dry material)의 생산

이들 세포는 교반(110 rpm/min)하에 25℃, 연속 백광(3500 lux, 형광 튜브 “일광”), 5 ℓ의 Erlenmeyer 플라스크에서 유지 종자의 1:4 희석액으로부터 Erlenmeyer 플라스크당 2 ℓ 배양의 비율로 12-13일간 성장시킨다.

2,4-디클로로페녹시아세트산은 완전히 대사되고 최종 산물에서 발견되지 않는다.

실시예 2: 탈분화된 크리스테 마린(Criste marine) 세포의 동결건조물의 제조

현탁액에서 액체 세포 배양액은 원심분리하여 세포를 펠리트(pellet)로 만든다.

이들 세포는 150-200 ㎛의 체에 통과시키고 냉동시키며, 이후 플레이트 동결건조기(plate lyophiliser)에서 동결건조시킨다.

실시예 3: 재구성된 표피 SKINETHIC ^® 에서, 탈분화된 크리스테 마린(Criste marine) 세포의 동결건조물을 함유하는 미용 제조물의 독성 부재의 입증

재구성된 표피 SKINETHIC^®은 SkinEthic Laboratories Company(Nice, France)에 의해 개발되고 시판되는 인간 표피 모델이다.

1 - 재구성된 단순 표피 SKINETHIC^®(각화세포로만 구성됨)에서:

인간 기원의 각화세포는 한정되고(변형된 MCDB 153) 보충된 배지에서 0.63 ㎠의 폴리카보네이트 필터에 접종한다. 이들 세포는 공기/액체 접촉면에서 14일간 성장시키고, 성장 배지는 격일로 교체한다.

이렇게 형성된 표피는 배양 17일째부터 본 연구를 수행하는데 이용하였다.

재구성된 표피에 도포되는 산물의 접촉 시간(contact time)과 세포독성 비-유도량(cytotoxicity non-inducing amount)을 결정하기 위하여 예비 검사를 수행하였다.

모든 검사는 이중으로 수행하였다:

배치(batch) 1: 어떤 산물로도 처리되지 않은 대조 표피

배치 2: 크림 PXTS + 0.1% AK205로 처리된 표피

배치 3: 크림 PXTS + 0.5% AK205로 처리된 표피

배치 4: 생성된 세포 동결건조물(AK 205)로 처리된 표피

AK205 = 실시예 1과 2에서 수득되는 탈분화된 크리스테 마린(Criste marine) 세포의 동결건조물.

PXTS = 심한 건성 피부용

10% 포름알데히드 용액에 고정된 표피는 파라핀 블록에 포매시켰다. 4 마이크론의 종단 절편은 헤마톡실린/에오신으로 염색하고 광학 현미경을 통하여 촬영하였다.

배양액은 오르토케라토시스(orthokeratosis)를 보이는 기저, 가시모양, 과립형, 기본형 각질 세포층을 제공하고, 표피 층리(epidermal stratification)는 규칙적이고 정상적이다. 기저층 세포는 수직으로 양극화된다. 다수의 각질유리과립(keratohyaline granules)이 각질층(corneous layer) 바로 아래 과립층(granular layer)에서 관찰된다(보라색).

24시간동안 처리된 재구성된 표피에 ㎠당 2 ㎕의 비율로 도포된 크림 PXTS+0.1% AK205, 크림 PXTS+0.5% AK205, 생성된 크리스테 마린(Criste marine) 세포의 동결건조물(AK205)은 대조 표피와 비교하여 임의의 독성을 유발하지 않았다. 헤마톡실린/에오신으로 염색이후, 처리된 표피의 조직학적 영상은 대조 표피의 조직학적 영상과 동등하다(도 1).

2 - 멜라닌세포를 포함하는 재구성된 표피 SKINETHIC^®에서:

인간 기원의 각화세포와 멜라닌세포는 한정되고(변형된 MCDB 153) 보충된 배지에서 0.63 ㎠의 폴리카보네이트 필터에 접종한다. 이들 세포는 공기/액체 접촉면에서 10일간 성장시키고, 성장 배지는 매일 교체한다.

이렇게 형성된 IV 표피(= 니그로이드(negroid))는 배양 10일째부터 이용하였다.

모든 검사는 이중으로 수행하였다:

배치 1: 어떤 산물로도 처리되지 않은 대조 표피

배치 2: 2% 코지산(kojic acid)으로 처리된 양성 대조 표피

배치 3: 크림 PXTS + 0.1% AK205로 처리된 표피

배치 4: 크림 PXTS + 0.5% AK205로 처리된 표피

24시간동안 처리된 재구성된 표피에 ㎠당 2 ㎕의 비율로 도포된 크림 PXTS+0.1% AK205와 크림 PXTS+0.5% AK205는 대조 표피와 비교하여 임의의 독성을 유발하지 않았다. 헤마톡실린/에오신으로 염색이후, 처리된 표피의 조직학적 영상은 대조 표피의 조직학적 영상과 동등하다(도 2).

실시예 4: 재구성된 표피 SKINETHIC ^® 에서, 멜라닌세포를 포함하는 탈분화된 크리스테 마린(Criste marine) 세포의 동결건조물을 함유하는 미용 제조물의 탈색 효과의 사정

1 - 실험 프로토콜

모든 검사는 이중으로 수행하였다:

배치 1: 어떤 산물로도 처리되지 않은 대조 표피

배치 2: 2% 코지산(kojic acid)으로 처리된 양성 대조 표피

배치 3: 크림 PXTS + 0.1% AK205로 처리된 표피

배치 4: 크림 PXTS + 0.5% AK205로 처리된 표피

세포내 멜라닌 합성의 사정(정성적 연구)은 이들 세포를 부유시키고 30분간 NaOH(1N)과 디메틸설폭사이드에 용해시킨 이후 475nm에서 분광법(spectrometry)으로 수행하였다.

배양 기간의 종결 시점에서, 배양 배지는 회수하고, 표피는 PBS(인산염 완충액)으로 씻어내고 1% Triton X-100(Sigma, France)과 접촉시키며, 이후 10분간 배양하였다. PBS에 담긴 10 mM Ca² ⁺-와 Mg² ⁺-없는 L-도파민(Sigma, France)을 첨가하여 효소 반응을 유도하였다.

37℃에서 1시간동안 어둠 배양이후, 475nm에서 분광광도계에 의한 흡광도 측정으로 티로시나아제 활성을 사정하였다.

2 - 결과

a) 멜라닌 검사

획득된 결과는 아래의 표에 요약한다:

	흡광도(475 nm)	%
음성 대조	0.160± 0.02	-
양성 대조	0.09± 0.01	-44
크림 PXTS + 0.1% AK205	0.139± 0.02	-13
크림 PXTS + 0.5% AK205	0.101± 0.01	-37

이들 획득된 결과는 크림 PXTS + 0.5% AK205가 멜라닌세포를 포함하는 재구성된 표피의 수준에서 멜라닌 비율의 유의한 감소(-37%)를 유도한다는 것을 입증한다. 크림 PXTS + 0.1% AK205는 양성 대조 2% 코지산(-44%)과 비교하여 상기 비율을 근소하게 감소시켰다(-13%).

b) 티로시나아제 활성의 사정

획득된 결과는 아래의 표에 요약한다:

	흡광도(475 nm)	%
음성 대조	0.245± 0.03	-
양성 대조	0.153± 0.01	-38
크림 PXTS + 0.1% AK205	0.198± 0.02	-19
크림 PXTS + 0.5% AK205	0.167± 0.02	-32

이들 획득된 결과는 크림 PXTS + 0.5% AK205가 양성 대조(-38%)와 비교하여 멜라닌세포를 포함하는 재구성된 표피의 수준에서 티로시나아제 활성의 유의한 감소(-32%)를 유도한다는 것을 입증한다. 크림 PXTS + 0.1% AK205 처리이후 근소한(-19%) 감소가 관찰되었다.

결론적으로, 적용된 실험 조건하에, 크림 PXTS + 0.5% AK205는 멜라닌세포를 포함하는 재구성된 표피에서 알짜 탈색 활성(net depigmenting activity)을 보였다. 크림 PXTS + 0.1% AK205에서는 더욱 제한적이긴 하지만 실질적인 활성이 관찰되었다.

실시예 5: 재구성된 표피 SKINETHIC ^® 에서, 탈분화된 크리스테 마린(Criste marine) 세포의 동결건조물을 함유하는 미용 제조물의 항-라디칼 효과의 검출

- 말론디알데히드(Malondialdehyde)를 검사하는 이유

생물 체계에서, 분자 산소는 안정하고 낮은 반응성을 보인다. 이는 전자 공여자로서 행동하고, 이의 환원은 물을 생산한다. 하지만, O₂의 불완전한 환원은 유리 라디칼(free radical) 및 과산화물 음이온(superoxide anion) O₂ ^-, 퍼하이드록사이드 라디칼 HO₂ ^-(제1철(ferrous iron)의 존재에서, 이런 반응은 고도 공격성 OH^-를 발생시킬 수 있다), 또는 과산화수소(hydrogen peroxide) H₂O₂와 같은 대사물질을 발생시킨다.

슈퍼옥사이드 디스무타아제(superoxide dismutase, SOD)는 H₂O₂에서 O₂ ^-의 신속한 부동변화(dismutation)로 막을 보호한다. 상대적으로 안정한 H₂O₂는 카탈라아제(catalase)와 페록시다아제(peroxidase)에 의해 물(H₂O)로 환원된다. O₂의 불완전한 환원에 기인한 이들 유리 라디칼은 이중 결합의 수준에 민감한데, 이는 전자 이동(electronic delocalisation)으로 다른 유리 라디칼의 출현을 조장한다. 라디칼 연쇄 반응(radical chain reaction)의 시작은 다중불포화된 지방산의 수준에서 진행된다. 이후, 이런 연쇄 반응은 세포막 내에서 유인되어 분해 산물인 말론디알데히드(MDA) 및 다른 알데히드와 알칸의 방출을 유도한다. 이들은 티오바르비투르산(thiobarbituric acid, TBA)과의 반응으로 결정될 수 있다.

산화 과정과 스트레스에 기인한 필수 세포독성 마커중의 하나인 MDA의 검사는 이용가능한 특정 물질의 항-라디칼 활성에 관한 정보 지표를 제공한다.

2 - 실험 프로토콜:

인간 기원의 각화세포는 한정되고(변형된 MCDB 153) 보충된 배지에서 0.63 ㎠의 폴리카보네이트 필터에 접종한다. 이들 세포는 공기/액체 접촉면에서 14일간 성장시킨다. 배양 배지는 격일로 교체한다.

모든 검사는 산물과 표피의 24시간 접촉 시간(contact time)이후, 삼중으로 수행하였다:

배치 1: 어떤 산물로도 처리되지 않은 음성 대조 표피

배치 2: 크림 PXTS + 0.1% AK205로 처리된 표피

배치 3: 크림 PXTS + 0.5% AK205로 처리된 표피

배치 4: 생성된 세포 동결건조물(Criste marine)로 처리된 표피

검사된 이들 산물은 각 처리된 표피의 표면에 2 ㎕/㎠의 비율로 도포되었다.

⇒ 말론디알데히드 추출

산물과 표피의 24시간 접촉 시간이후, 이들을 부유시켰다:

- 0.1M NaCl; 20 mM EDTA를 함유하는 250 ㎕의 Tris 50 mM 완충액, pH 8

- 25 ㎕의 7% SDS

- 300 ㎕ HCl(0.1 N)

- 물에서 38 ㎕ 1% 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid)

- 물에서 300 ㎕ 0.67% 티오바르비투르산

50℃, 어둠에서 1시간동안 배양 및 얼음물에서 냉각이후, 300 ㎖의 n-부탄올을 각 튜브에 첨가하였다. 이들은 0℃에서 10분간 10,000 g로 원심분리하였다. 상층액은 회수하여 MDA를 검사하였다.

⇒ 말론디알데히드 검사

MDA는 HPLC(고압 액체 크로마토그래피)에 의한 복합체 MDA-TBA의 분리이후 형광을 측정함으로써 검사하였다.

- 펌프 Bischoff Model 2.200

- 자동 주입장치 Alcoot Model 788 자동시료주입기(autosampler)

- Ultrasep CIS 칼럼(30 ㎝ x 0.18 ㎝) 다공성 6 ㎜

- 형광 검출기, jasco 821-FI

형광의 검출은 515 nm의 여기 파장(excitation) 및 553 nm의 방출 파장(emission)에서 수행하였다. 이용된 용리액은 메탄올:물 40:60(v/v)인데, 이의 pH는 KOH 1M로 조정하였다.

정량은 컴퓨터 프로그램 ICS(Pic 3)(Instrumentation, Consumable, Service)를 이용하여 샘플(0.125, 0.25, 0.5, 1 mM)로서 처리된 표준과 연관하여 수행하였다.

⇒ 단백질 검사

단백질 검사는 BRADFORD 방법에 따라 수행하였다. 595 nm에서 흡광도의 증가는 분광광도계 UNI CAM 8625에 의해 측정된 단백질의 농도에 비례한다.

3 - 결과

a) 생리학적 지방과산화(lipoperoxidation)

획득된 결과는 아래의 표에 요약한다:

	MDA(μM/㎎ 단백질)	%
대조	652± 31	-
크림 PXTS + 0.1% AK205	638± 47	-2(ns)
크림 PXTS + 0.5% AK205	620± 32	-5(ns)
세포 동결건조물	594± 57	-9(ns)

ns: 유의하지 않음

이들 결과는 검사된 산물이 생리 조건하에, 처리되지 않은 대조와 비교하여 MDA 방출을 유도하지 않는다는 것을 입증한다.

b) UVB에 의해 유도된 지방과산화

획득된 결과는 아래의 표에 요약한다:

	MDA(μM/㎎ 단백질)	%
대조	652± 31	-
UVB(150 mJ/㎠)	832± 63	+28*
크림 PXTS + 0.1% AK205 + UVB(150 mJ/㎠)	660± 51	-21**
크림 PXTS + 0.5% AK205 + UVB(150 mJ/㎠)	625± 42	-25**
세포 동결건조물 + UVB(150 mJ/㎠)	602± 37	-28**

* 음성 대조와 비교됨

** UVB로 조사(照射)된 양성 대조와 비교됨

획득된 결과는 재구성된 표피 SKINETHIC^®의 표면에 도포된 크림 PXTS + 0.1% AK205, 크림 PXTS + 0.5% AK205, 세포 동결건조물(Criste marine)에 의해 제공되는, 자외선 B(150 mJ/㎠)로 유도된 지방과산화에 대한 유의한 보호를 입증한다.

MDA 생산의 감소율은 조사(照射)된 표피와 비교하여, 크림 PXTS + 0.1% AK205, 크림 PXTS + 0.5% AK205, 생성된 세포 동결건조물(Criste marine)에 대하여 각각 -21, -25, -28%이었다.

UVB 조사(양성 대조)는 MDA 생산의 +28% 증가를 유도하였고, 노출에 앞서 크림 PXTS + 0.1% AK205, 크림 PXTS + 0.5% AK205, 생성된 세포 동결건조물(Criste marine)의 도포는 생리 수준에서 MDA 생산을 유지시켰다.

실시예 6: 재구성된 표피 SKINETHIC ^® 에서, 탈분화된 크리스테 마린(Criste marine) 세포의 동결건조물을 함유하는 미용 제조물의 자극 효과의 결정

1 - 자극의 사정 기준

인간 각화세포의 세포 배양으로, 표피의 점진적인 분화의 마커에 대한 비타민 A 유도체의 특이적인 효과를 더욱 상세하게 기술하였다: 상부-기저층(supra-basal layer)에서 KI-67의 발현이 자극되고, 표피 과증식(epidermal hyperproliferation)에 전형적인 케라틴(K19, K13)의 발현이 유도되고, 기저 세포층에서 양극성(polarity)의 상실이 관찰되는 반면, 각질층에서 케라틴의 포장(packaging)을 담당하는 단백질인 필라그린의 합성이 저해된다. 과립층에 위치하고 높은 함량의 필라그린을 포함하는 각질유리과립(keratohyaline granules)은 배양 배지에서 레티논산, 0.05%(비타민 A 산)의 존재하에 24시간 이내에 소멸된다. 이런 이유로, 레티노이드는 증식의 전반적인 자극 및 표피 분화의 저해를 유도한다(Rosdy, M. et al., In Vitro Toxicology, Vol. 10 n°1, p. 39-47, 1997, "Retinoic acid inhibits epidermal differentiation when applied topically on the stratum corneum of epidermis formed in vitro by human keratinocytes grown on defined medium).

따라서, 필라그린과 단백질 KI-67은 표피 분화의 마커로서 이용될 수 있다.

2 - 표피 분화 연구:

- 프로토콜

배치 1: 어떤 산물로도 처리되지 않은 음성 대조 표피

배치 2: 크림 PXTS + 0.1% AK205로 처리된 표피

배치 3: 크림 PXTS + 0.5% AK205로 처리된 표피

배치 4: 생성된 세포 동결건조물(Criste marine)로 처리된 표피

24시간의 접촉 시간동안 어떤 산물로도 처리되지 않은 대조 표피 및 검사 산물로 처리된 표피는 -80℃에서 동결시켰다. 파라핀 블록에 포매시킨 이후, 이들 표피는 절단하고 면역조직화학으로 처리하였다.

상기 반응은 필라그린 재조합 단클론 항체로 수행하였다.

- 결과: 표피 세포의 분화 저해

재구성된 대조 표피 및 크림 PXTS + 0.1% AK205, 크림 PXTS + 0.5% AK205, 생성된 세포 동결건조물(Criste marine)로 처리된 표피의 비교 관찰에서, 과립층의 수준에서 필라그린의 라벨링 밀도(labelling density) 사이에 차이가 확인되었다(도 3).

실제로, 생리 조건하에, 표피 처리의 결과는 아래와 같다:

- 크림 PXTS + 0.1% AK205는 처리되지 않은 대조와 비교하여 필라그린의 라벨링의 알짜 감소(net reduction)에서 관찰되는 표피 분화의 알짜 축소(net diminution)를 유도하였다.

- 크림 PXTS + 0.5% AK205는 처리되지 않은 대조와 비교하여 필라그린의 라벨링의 알짜 감소에서 관찰되는 표피 분화의 알짜 축소를 유도하였다.

- 생성된 세포 동결건조물(Criste marine)은 처리되지 않은 대조와 비교하여 필라그린의 라벨링의 알짜 감소에서 관찰되는 표피 분화의 알짜 축소를 유도하였다.

3. 표피 기저 세포층 세포의 증식 활성의 연구

- 프로토콜

이들 산물의 활성은 면역조직화학적 라벨링(immunohistochemical labelling)으로 확인하였다.

배치 1: 어떤 산물로도 처리되지 않은 음성 대조 표피

배치 2: 크림 PXTS + 0.1% AK205로 처리된 표피

배치 3: 크림 PXTS + 0.5% AK205로 처리된 표피

배치 4: 생성된 세포 동결건조물(Criste marine)로 처리된 표피

24시간의 접촉 시간동안 어떤 산물로도 처리되지 않은 대조 표피 및 검사 산물로 처리된 표피는 10% 포름알데히드에 고정시켰다. 파라핀 블록에 포매시킨 이후, 이들 표피는 절단하고 면역조직화학으로 처리하였다.

상기 반응은 핵 항원(nuclear antigen) KI-67의 재조합 펩티드인 항체 MIB1(Immunotech)로 수행하였다.

확인은 열 전처리에 의한 항원 차폐 제거(antigenic demasking)이후 과산화효소-항과산화효소 방법으로 수행하였다.

색원체(chromogen) DAB 라벨링은 단계적으로 발현되는 성장 세포 분획물의 핵 부위 KI-67을 갈색으로 노출시킨다:

⇒ G1과 S = 휴면기와 세포 합성기

⇒ G2 = 세포 구성요소의 전분열기

⇒ M = 유사분열

유사분열 지수(mitotic index)는 대조 표피 슬라이드와 비교하여, 광학 현미경(확대도 x 250)을 통하여 슬라이드당 10개 필드(field)의 비율로, 착색된 핵 부위를 산정함으로써 6으로 사정되었다.

- 결과: 표피 세포 증식의 자극

결과는 아래의 표에 요약한다:

	현미경을 통한 카운트 필드(count field)당 착색된 핵의 평균값
대조	7± 2
크림 PXTS + 0.1% AK205	8± 2
크림 PXTS + 0.5% AK205	12± 2
세포 동결건조물	14± 3

면역조직화학적 처리이후, 모든 샘플의 갈색 착색된 핵 부위의 산정에서 아래의 결과가 산출되었다:

- 크림 PXTS + 0.1% AK205는 기저층 세포 증식의 근소하지만 유의한 증가를 유도하였다. 착색된 핵 부위의 개수는 처리되지 않은 대조에 필적한다(도 4).

- 크림 PXTS + 0.5% AK205는 처리되지 않은 대조와 비교하여 기저층 세포 증식의 근소하지만 유의한 증가를 유도하였다. 착색된 핵 부위의 개수는 처리되지 않은 대조에서보다 많다(도 4).

- 생성된 세포 동결건조물(Criste marine)은 처리되지 않은 대조와 비교하여 기저층 세포 증식의 유의한 증가를 유도하였다. 착색된 핵 부위의 개수는 처리되지 않은 대조에서보다 훨씬 많다(도 4).

Claims

탈분화(dedifferentiation)된 식물 세포의 적어도 한가지 동결건조물(lyophilisate)의 미용 또는 약학 조성물의 용도에 있어서, 상기 동결건조물은 표피(epidermis)를 탈색 또는 미백하고, 표피를 보호하고 재생시키는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항에 있어서, 탈분화된 식물 세포는 시험관내 배양으로 수득되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 2항에 있어서, 시험관내 배양으로 수득된 탈분화된 식물 세포는 세포주(cell line)인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 탈분화된 식물 세포는 호염성(halophile) 식물 세포인 것을 특징으로 하는 용도.
제 4항에 있어서, 호염성 식물은 크리스테 마린(Christe Marine)인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, 동결건조물은 티로시나아 제(tyrosinase) 활성을 차단함으로써 표피를 탈색 또는 미백하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, 동결건조물은 항-라디칼 효과(anti-radical effect)로 표피를 보호하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, 동결건조물은 표피 기저층(basal layer) 세포의 증식에 대한 자극 효과로 표피를 재생시키는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, 동결건조물은 표피 분화에 대한 저해 효과로 표피를 재생시키는 것을 특징으로 하는 용도.
생리학적으로 허용되는 기부(base)에 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 적어도 한가지 동결건조물을 함유하는 국소-투약 미용 또는 약학 조성물.
생리학적으로 허용되는 기부(base)에 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 0.05% 내지 2%의 적어도 한가지 동결건조물을 함유하는 국소-투약 미용 또는 약학 조성물.
생리학적으로 허용되는 기부(base)에 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 0.1% 내지 1%의 적어도 한가지 동결건조물을 함유하는 국소-투약 미용 또는 약학 조성물.
생리학적으로 허용되는 기부(base)에 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 0.5%의 적어도 한가지 동결건조물을 함유하는 국소-투약 미용 또는 약학 조성물.
제 10항 내지 13항중 어느 한 항에 있어서, 피부 외관(skin aspect)을 회복하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10항 내지 13항중 어느 한 항에 있어서, 색소반(pigment spot)을 치료하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10항 내지 13항중 어느 한 항에 있어서, 흑색이나 황색 피부를 미백하는 것을 특징으로 하는 조성물.