PT1699423E

PT1699423E - Utilização de um liofilizado de celulas vegetais desdiferenciadas a fim de despigmentar e/ou tornar clara a pele

Info

Publication number: PT1699423E
Application number: PT04805628T
Authority: PT
Inventors: Nicole Mekideche
Original assignee: Biotech Marine
Priority date: 2003-12-29
Filing date: 2004-12-03
Publication date: 2008-02-14
Also published as: CA2551414C; FR2864446B1; FR2864446A1; KR20060118571A; DE602004009964T2; AU2004314922B2; TNSN06205A1; DE602004009964D1; HK1103964A1; US20070098668A1; JP2012102136A; JP4974679B2; US7604806B2; CA2551414A1; PL1699423T3; MA28398B1; CN1921827A; EP1699423A1; BRPI0418291A; WO2005072697A1

Description

1

DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE UM LIOFILIZADO DE CÉLULAS VEGETAIS DESDIFERENCIADAS A FIM DE DESPIGMENTAR E/OU TORNAR CLARA A PELE" A presente invenção diz respeito à utilização em uma composição cosmética ou farmacêutica de pelo menos um liofilizado de células vegetais desdiferenciadas, as quais são células de plantas halófilas, de modo a despigmentar e/ou tornar clara, proteger e regenerar a epiderme. A invenção diz respeito à utilização de pelo menos um liofilizado de células vegetais desdiferenciadas, as quais são células de plantas halôfilas, numa composição cosmética ou farmacêutica para fins de despigmentação e/ou tornar clara a epiderme acompanhada por um efeito protector e regenerador. A invenção tem, além disso, por objecto uma composição cosmética ou farmacêutica para uso tópico que compreende pelo menos um tal liofilizado. A pele é um invólucro protector que representa a interface entre o meio exterior e os outros órgãos internos. Ela não ê, no entanto, hermética e, na qualidade de órgão de absorção, permite âs substâncias dissolvidas penetrar por intermédio dos poros e dos folículos pilosos. A pele protege contra o frio, o calor, a radiação; contra a pressão, o atrito; contra as lesões químicas; contra a penetração de microrganismos; contra a perda de água e de calor.

A protecção natural da pele contra a radiação ultravioleta passa por um pigmento castanho, a melanina. A 2 melanina encontra-se presente em células das camadas basais da epiderme: os melanócitos. Ela é sintetizada a partir de um aminoácido, a tirosina, modificado por uma enzima, a tirosinase. A síntese da melanina é induzida pelos raios UV. A coloração escura da pele constitui uma primeira protecção natural contra o sol, que é claramente insuficiente para as peles mais claras. O bronzeamento é a consequência, sob a acção das radiações UV, do aumento da actividade melanocitária de síntese da melanina e do armazenamento da melanina nos queratinócitos. A quantidade de melanina e o número de melanócitos constitui factores programados geneticamente que proporcionam a sua cor à pele.

Uma produção excessiva e localizada de melanina provoca o aparecimento de manchas: sardas, pano de gravidez, lentigens ou sardas solares ou senis, etc.,... Com efeito, de acordo com as últimas nomenclaturas, as manchas de velhice são as lentigens senis e as lentigens solares constituem as. outras manchas.

As "manchas de velhice" são pequenas manchas de cor castanha clara, planas e de uma maneira geral redondas, na maior parte dos casos no rosto, nas costas das mãos, no decote, nos antebraços. Elas são provocadas pela combinação do sol e do envelhecimento. 0 seu número aumenta com a idade. Sobre a acção repetida dos raios UV, os melanócitos acabam por produzir demasiada melanina.

As lentigens ou sardas são "sardas" que não desaparecem no inverno, castanhas, minúsculas e numerosas, muito próximas umas das outras. Encontram-se na maior parte dos casos no rosto, nos ombros e no decote. Elas são 3 provocadas por uma sobredosagem de ultravioletas e podem-se formar logo na idade mais jovem. O "pano de gravidez" manifesta-se por grandes manchas castanhas de contorno irregular, na maior parte dos casos no rosto, que tomam, por vezes, o aspecto de uma máscara. Quando essas manchas aparecem no decurso da gravidez, fala--se de cloasma, caso contrário fala-se de melasma. Elas são provocadas por uma estimulação hormonal (gravidez, hormonoterapia) combinada com a exposição aos raios UV.

Todos estes tipos de manchas podem encontrar-se igualmente ligados ao património genético e, por consequência, à hereditariedade.

Tendo em conta o aspecto desagradável destas sobreconcentrações de melanina, é de um interesse particularmente importante ter acesso a preparações para uso tópico que permitiriam prevenir o seu aparecimento e/ou atenuá-las.

Os fabricantes de preparações cosméticas e farmacêuticas encontram-se constantemente a investigar princípios activos não agressivos que permitem inibir ou bloquear a síntese da melanina, directamente ou indirectamente, ou inibir ou bloquear a transferência dos melanossomas para os queratinócitos e, por consequência, tornar claras estas manchas ao mesmo tempo que se protege essas zonas de uma pigmentação solar. De igual, modo, os fabricantes de preparações cosméticas procuram princípios activos de despigmentação não agressivos tendo em conta o desejo crescente das populações negras e asiáticas de tornar clara a sua pele, ao ser-lhes proposto o produto protector da pele. 4

Para remediar os desagrados dos outros tratamentos disponíveis fastidiosos e/ou agressivos (laser, crioterapia) de despigmentação, esses princípios activos devem simultaneamente proteger a pele e/ou estimular a regeneração das células que a constituem.

Com efeito, a protecção da pele e/ou a estimulação das regeneração das células da pele permitem lutar ao mesmo tempo contra um factor que agrava as manchas: o envelhecimento cutâneo devido a causas múltiplas. A primeira causa do envelhecimento cutâneo é o envelhecimento "programado" que pode ser acelerado pelo stress, o tabagismo e determinadas doenças. Com os anos, a pele perde a sua elasticidade uma vez que a derme produz cada vez menos fibras de colagénio e de elastina. Daí o enfraquecimento progressivo do tecido conjuntivo e o relaxamento ou abrandamento da pele. A capacidade de renovação da epiderme tende igualmente a diminuir, tornando-se esta última mais seca e mais fina visto que o seu metabolismo é alterado. A pele toma igualmente com o tempo um aspecto acinzentado que proporciona uma cor baça contra a qual um cuidado de aclaramento pode também lutar. A segunda causa do envelhecimento é a diminuição da produção hormonal que leva â diminuição progressiva das funções tecidulares, celulares e orgânicas. As hormonas tais como a hormona do crescimento (HGH), a testosterona, a DHEA e a melatonina são produzidas em grandes quantidades até à idade dos 20 anos e favorecem a renovação celular. A consequência destas diferentes causas do envelhecimento conjugadas com os efeitos do ambiente (poluições diversas: gases de escape, fumos de cigarros, 5 fumos de fábricas, produto químicos,,,.) conduzem à sobreprodução de radicais livres que têm por alvos diferentes componentes da célula: proteínas, lípidos, açúcares e o ADN e que constituem assim uma outra causa do envelhecimento cutâneo. Determinadas influências exteriores impelem-nos a entrar em reacçao uma vez que eles procuram constantemente outras moléculas com as quais se podem ligar. Eles atacam, então, as fibras de colagénio, as membranas celulares e a camada de gordura da pele. Eles alteram o património genético das células, de modo que a qualidade das novas células da pele diminui. O corpo protege-se contra esses agressores através de sistemas enzimãticos que se opõem a essas reacções de oxidação (antioxidantes) . Mas logo a partir da idade de vinte anos, os mecanismos de defesa naturais enfraquecem progressivamente, de modo que a pele deixa de poder defender-se por si só. A Requerente verificou, de maneira surpreendente e inesperada, que um liofilizado de células vegetais desdiferenciadas, as quais são células de plantas halófilas, permite atingir essa combinação de efeitos procurada: ele despigmenta e/ou torna clara a epiderme com uma perfeita inocuidade ao mesmo tempo que a protege e a regenera.

As células desdiferenciadas conservam todas as potencialidades celulares tais como as células estirpes. Elas exprimem todos os genes do seu genoma, portanto, todas as proteínas que permitem a cada tipo de célula especializada proteger-se do meio exterior. A invenção tem, portanto, por objecto, em primeiro lugar, a utilização em ou para a fabricação de uma 6 composição cosmética ou farmacêutica de pelo menos um liofilizado de células vegetais desdiferenciadas, as quais são células de plantas halõfilas, permitindo o referido liofilizado despigmentar e/ou tornar clara, proteger e regenerar a epiderme.

Entende-se por "célula vegetal desdiferenciada" qualquer célula vegetal que não apresente nenhum carácter de especialização e que pode regenerar por si só uma planta completa de vegetal donde é proveniente. Ela pode ser isolada a partir de qualquer amostra de planta completa ou de órgão como as folhas, as hastes, as raízes, as sementes, as flores, as pétalas, as anteras, os frutos, etc.,... denominado transplante.

De maneira preferida, utiliza-se um pedaço de folha ou uma semente como transplante.

Prefere-se, muito particularmente, cultivar o transplante in vitro. Entende-se por "cultura in vitro" ou conjunto de técnicas da técnica anterior conhecidas do perito na especialidade que permitem em condições perfeitamente controladas regenerar um órgão ou uma planta completa a partir de um transplante cultivado em ou sobre um meio nutritivo definido. Essas condições perfeitamente controladas permitem uma perfeita reprodutibilidade e homogeneidade das plantas. Em particular, este método de cultura fornece clones idênticos ao infinito. De entre os métodos e meios de cultura in vitro descritos na técnica anterior, pode-se citar a título de exemplos os meios de Gamborg (1968), de Murashige e Skoog (1962), de Morei (1970), etc. cuja formulação se encontra descrita em "Plant Culture Media : formulations and uses" de E.F. George, DJM Puttock e H.J. George (Exegetics Ltd 1987). 7

Em particular, prefere-se utilizar células vegetais desdiferenciadas de vegetal halófilo tal como as espécies Salicornia ramossisima (Salicorne), Sueda vera, Beta maritima, Obione portucaloides, Armeria marítima, Crithum maritimum (Criste Marine), Ophrys sphegodes, Artemia vulgeris, Muscaris comosum, Eryngium maritimum, Sanguisorba minor, Cochlearia officinalis, Fumaria officinalis, Vincetoxicum fullonum, Dipsacus fullonum, Heracleum spondylium, Inula crtithmoides, Inula brittanica, Inula viscosa, mais particularmente células vegetais halõfilas desdiferenciadas de Criste Marine (Crithmum maritimum). Os vegetais halófilos, igualmente denominados halófitos, são vegetais que toleram solos ricos em sal. Eles desenvolveram sistemas de defesa contra o meio exterior agressivo que colonizam. Em particular, as halôfitas são vegetais da beira-mar susceptíveis de suportar um solo rico em sal, a humidade e o vento. Eles lutam, em permanência, para manter a pressão osmõtíca nas suas células, tendo a água tendência para atravessar a membrana plásmica para o compartimento extracelular mais sodado.

No caso da utilização de vegetal halófilo, é particularmente importante desenvolver uma cultura in vitro de células que fornecem uma biomassa infinita e susceptível de ser . reproduzida para proteger estas espécies, encontrando-se as halôfitas em perigo face à poluição dos mares.

Numa forma de realização particular da presente invenção, é igualmente possível modificar determinadas condições de cultura (pH, temperatura, composição gasosa ambiente, composição do meio de cultura, luminosidade). As células desdiferenciadas tenderão então a produzir mais ou menos certas substâncias intracelulares. 8 0 segundo objecto da presente invenção é uma composição cosmética ou farmacêutica para utilização tópica caracterizada pelo facto de compreender, numa base fisiologicamente aceitável, entre 0,05 e 2%, de preferência entre 0,1 e 1%, de maneira particularmente preferida 0,5% de pelo menos um liofilizado tal como descrito anteriormente.

Com efeito, um tal liofilizado pode ser utilizado como único princípio activo da composição de acordo com a presente invenção. No entanto, podem adicionar-se diversos liofilizados a base da composição de acordo com a presente invenção.

De acordo com um primeiro modo de realização particular da presente invenção, utiliza-se pelo menos um liofilizado de células vegetais desdiferenciadas, as quais são células de plantas halófilas, para a fabricação de uma composição cosmética ou farmacêutica, destinada a rejuvenescer o aspecto da pele.

De acordo com um segundo modo de realização particular da presente invenção, utiliza-se pelo menos um liofilizado de células vegetais desdiferenciadas, as quais são células de plantas halófilas, para a fabricação de uma composição cosmética ou farmacêutica destinada ao tratamento de manchas denominadas lentigens ou sardas.

De acordo com um terceiro modo de realização particular da presente invenção, utiliza-se pelo menos um liofilizado de células vegetais desdiferenciadas, as quais são células de plantas halófilas, para a fabricação de uma composição cosmética ou farmacêutica, destinada a tornar claras as células negras ou asiáticas. 9

Os exemplos seguintes ilustram a invenção sem no entanto lhe limitar o âmbito.

Legenda das Figuras

Figura 1: morfologia geral, coloração pela hematoxilina/eosina (HES) sobre epiderme reconstituída SKINETHIC® simples (queratinócitos)

Figura 2: morfologia geral, coloração pela hematoxilina/eosina (HES) sobre epiderme reconstituída SKIWETHIC® que integra melanócitos

Figura 3: marcação da filagrina

Figura 4: marcação de Kl-67 (avaliação do índice mitótico)

Exemplo 1: Cultura in vitro de células desdiferenciadas de Criste Marine (Funcho Marítimo) a partir de tecido vegetal 1 - Obtenção de calos primários

Colhem-se por meio de tesouras pedaços de tecidos na zona escolhida (3 cm mínimos) haste, folhas,.. . . A partir deste estado da manipulação, tudo se deve desenrolar em atmosfera estéril sob uma hote com fluxo laminar.

Para esterilizar o material vegetal, mergulham-se os tecidos durante 30 segundos em etanol, depois elimina-se o solvente, lavam-se com 3 x 100 ml de H20 estéril, mergulham-se durante 15 minutos em hipoclorito de sódio a que se adicionaram algumas gotas de TWeen 20 e lavam-se com 3 x 100 ml de H20 estéril. 10

Para colocar os tecidos em cultura, deposita-se os fragmentos de tecidos em uma caixa de Petri estéril {125 mm) , cortam-se fragmentos de tecidos (2 a 3 mm) tendo o cuidado de eliminar as partes branqueadas por Água de Javel. Os transplantes assim obtidos são ligeiramente cortados e depositados em semi-escuros em um meio nutritivo gelosado (Quadro 1). 2- Repicagem dos calos

Neste estádio da manipulação, tudo se deve desenrolar em atmosfera estéril sob uma hote de fluxo laminar. Recolhe-se ao nível do calo 2 a 3 cachos celulares (1 a 2 cm) por meio de uma espátula.

Depositam-se e repartem-se estes cachos sobre o meio novo.

Composição do meio de cultura solido: Quadro 1

Macroelementos mg/1 kno3 (nh4)2so4 CaCl2, 2H20 NaH2P04/ 2H20 MgS04, 7H20 MICROELEMENTOS mg/1 MnS04, H20 ZnS04, VH2O h2bo3 Kl NaMo04, 2H20 CuS04, 5H20 FeS04, 7H20 Vitaminas mg/1 mio-inositol ácido nicotínico D{+)-pantotenato de cálcio (+)-biotina cloridrato de piridoxal dicloreto de tiamina Compostos orgânicos g/i sacarose. 30 11

Fito-hormonas mg/1 ácido naftaleno acético 1,5 ácido 2,4 dicloro-fenoxiacético 0,5 quinetina 0,5 Agente gelificante g/i agar 9 3- Expansão de células do calo em meio líquido • Inoculo de manutenção:

Transferiram-se as células do calo para um meio liquido idêntico ao meio sólido sem ãgar (Quadro 1). Cultivaram-se sob agitação (110 rotações/minuto), à temperatura de 25 °C sob luz branca contínua (3500 lux, tubos fluorescentes "luz do dia") em erlenmeyers de 250 ml, à razão de 50 ml por erlenmeyer.

Elas são diluídas todos os 10 a 11 dias até 1/4 ou seja 100 ml em 400 ml. • Produção de matéria seca:

Cultivaram-se as células a partir de uma diluição a 1/4 do inóculo de manutenção em erlenmeyers de 51, à razão de 21 de cultura por erlenmeyer, sob agitação (110 rotações/minuto) , à temperatura de 25 °C sob luz branca contínua (3500 lux, tubos fluorescentes "luz do dia") e isto durante 12 a 13 dias. É preciso salientar que o ácido 2,4-dicloro--fenoxiacético é inteiramente metabolizado e que ele já não será encontrado no produto final.

Exemplo 2: Preparação de um liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marine : 12 A cultura celular líquida em suspensão é centrifugada para reunir ou coagular as células.

Fizeram-se passar as células através de um peneiro com 150 a 200 μτη, congelaram-se e depois liofilizaram-se em um liofilizador de placas.

Exemplo 3: Colocação em evidência sobre a epiderme reconstituída SKINETHIC® da ausência de toxicidade de uma preparação cosmética que contém um liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marine ; A epiderme reconstituída SKINETHIC® é um modelo de epiderme humana desenvolvido e comercializado pela Sociedade SkinEthic Laboratories (Nice, França). 1- Sobre a epiderme reconstituída SKINETHIC® simples (constituída unicamente por queratinócitos):

Semeara-se queratinócitos de origem humana em filtros de policarbonato de 0,63 cm2 num meio definido (MCDB 153 modificado) e suplementado. Cultivaram-se as células durante 14 dias na interface ar/líquido, mudando-se o meio de cultura de dois em dois dias.

Utilizaram-se as epidermes assim formadas para a realização do estudo a partir do 17.° dia de cultura.

Realizou-se um ensaio preliminar a fim de determinar o tempo de contacto e a quantidade do produto aplicada sobre a epiderme reconstituída que não leva à citotoxicidade.

Conduzíram-se todos os testes em duplicado com:

Lote 1: epidermes testemunhas que não recebem produto 13

Lote 2: epidermes tratadas que recebem creme PXTS + 0,1% de AK2 05

Lote 3: epidermes tratadas que recebem creme PXTS + 0,5% de AK2 05

Lote 4: epidermes tratadas que recebem o produto liofilizado de células (AK 205) AK205 = liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marine obtido de acordo com os Exemplos 1 e 2. PXTS = para peles muito secas.

Incluíram-se as epidermes fixadas numa solução de formaldeído a 10% em blocos de parafina. Coraram-se os cortes verticais de 4 micrómetros com hematoxilina/eosina e fotografaram-se num microscópio óptico.

As culturas devem apresentar camadas celulares de base, espinhosas, granulosas e cõrneas intactas, ortoqueratósicas, e a estratificação epidérmica deve ser regular e normal. As células da camada de base devem ser polarizadas verticalmente. Numerosos grãos de querato--hialina devem ser visíveis (ao violeta) na camada granulosa imediatamente por baixo da camada cómea.

Os produtos, creme PXTS + 0,1% de AK205, creme PXTS + 0,5% de AK205 e o produto liofilizado de células de Criste Marine (AK 205) depositadas à razão de 2 μΐ por cm2, sobre epidermes reconstituídas tratadas durante 24 horas, comparativamente com epidermes testemunhas, não induziram qualquer toxicidade. As imagens histológicas, após coloração com hematoxilina/eosina, de epidermes tratadas são comparáveis com as de epidermes testemunhas (conforme a Figura 1) . 14 2- Sobre a epiderme reconstituída SKINETHIC® que integra melanócitos:

Semearam-se queratinócitos de origem humana e melanócitos em filtros de policarbonato com 0,63 cm3 num meio definido (MCDB 153 modificado) e suplementado. Cultivaram-se as células durante 10 dias na interface ar/líquido, mudando-se o meio de cultura todos os dias.

Utilizaram-se as epidermes de tipo VI (= negróide) assim formadas a partir do 10.° dia de cultura.

Realizou-se um ensaio preliminar a fim de determinar o tempo de contacto e quantidade de produto aplicada sobre a epiderme reconstituída que não leva a citotoxicidade.

Conduziu-se o ensaio em duplicado com:

Lote 1: epidermes testemunhas que não recebem produto Lote 2: epidermes testemunhas positivas que recebem o ácido cójico, 2%

Lote 3: epidermes tratadas que recebem creme PXTS + 0,1% de AK2 05

Lote 4: epidermes tratadas que recebem creme PXTS + 0,5% de AK205 AK205 = liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marine obtido de acordo com os Exemplos 1 e 2.

Incluíram-se as epidermes fixadas numa solução de formaldeído a 10% em blocos de parafina. Coraram-se os cortes verticais de 4 micrómetros com hematoxilina/eosina e fotografaram-se ao microscópio óptico.

As culturas devem apresentar camadas celulares basais, espinhosas, granulosas e córneas intactas, 15 ortoqueratósicas, e a estratificação epidérmica deve ser regular e normal. As células da camada basal devem ser polarizadas verticalmente. Numerosos grãos de querato-hialina devem ser visíveis (no violeta) na camada granulosa imediatamente por baixo da camada córnea.

Os produtos, creme PXTS + 0,1% de AK205 e creme PXTS + 0,5% de AK205 depositados à razão de 2 μΐ por cm2, em epidermes reconstituídas tratadas durante 24 horas, comparativamente com epidermes testemunhas, não induziram qualquer toxicidade. As imagens histológicas, após coloração com hematoxilina/eosina, de epidermes tratadas são comparáveis à de epidermes testemunhas (conforme a Figura 2).

Exemplo 4: Avaliação do efeito de despigmentação de uma preparação cosmética que contém um liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marine sobre as epidermes reconstituídas SKINETHIC®, que integram melanócitos: 1- Protocolo experimental

Semearam-se queratinócitos de origem humana e melanócitos em filtros de policarbonato com 0,63 cm2 num meio definido (MCDB 153 modificado) e suplementado. Cultivaram-se as células durante 10 dias na interface ar/líquido, mudando-se o meio de cultura todos os dias.

Conduziram-se todos os ensaios em duplicado com:

Lote 1: epidermes testemunhas que não recebem produto 16

Lote 2: epidermes testemunhas positivas que recebem o ácido côjico, 2%

Lote 3: epidermes tratadas que recebem creme PXTS + 0,1% de AK2 05

Lote 4; epidermes tratadas que recebem creme PXTS + 0,5% de AK2 05 AK2Q5 = liofilizado de células diferenciadas de Criste Marine obtido de acordo com os Exemplos 1 e 2.

Realizou-se a avaliação da síntese da melanina (estudo qualitativo) intracelular mediante espectrometria a 475 nm após o que se colocaram as células em suspensão e depois se dissolveram em NaOH (IN) e sulfóxido de dimetilo durante 30 minutos.

No final do período de incubação, recolheu-se o meio de cultura, depois lavaram-se as epidermes com PBS (Phosphate Buffer Saline) e fizeram-se contactar com Triton X-100 (Sigm, França) a 1% e depois incubaram-se durante 10 minutos. Iniciou-se a reacção enzimãtica mediante adição da L-Dopamina (Sigma, França) a 10 mM em PBS desprovido de Ca2+ e de Mg2+.

Decorria 1 hora de incubação à temperatura de 37 °C ao abrigo da luz, avaliou-se a actividade da tirosinase mediante adição da absorção a 475 nm por intermédio de um espectrofotómetro. 2- Resultados a) Doseamento da melanina

Os resultados obtidos são apresentados sob a forma de quadro:

Absorvância (475 nm) 17

Testemunha negativa 0,160 ± 0,02 - Testemunha positiva H O O +1 σι o o -44 CREME PXTS+0,1% de AK205 0,139 + 0,02 -13 CREME PXTS+0,5% de AK205 0,101 ±0,01 -37

Os resultados obtidos revelaram que o creme PXTS+0,5% de AK205 levou a uma diminuição significativa da taxa de melanina ao nível das epidermes reconstituídas que integram melanócitos (-37%). 0 creme PXTS+0,1% de AK205 reduziu ligeiramente a taxa (-13%) em comparação com a testemunha positiva ácido cójico a 2% (-44%). b) Avaliação da actividade tirosinãsica

Os resultados obtidos são apresentados sob a forma de quadro:

Absorvância (475 nm) % Testemunha negativa 0,245 + 0,03 - . Testemunha positiva 0,153 ± 0,01 -38 CREME PXTS+0,1% de AK205 0,198 ± 0,02 -19 CREME PXTS+0,5% de AK205 0,167 ± 0,02 -32

Os resultados obtidos revelaram que o produto creme PXTS+0,5% de AK205 levou a uma diminuição significativa da actividade da tirosinase ao nível das epidermes reconstituídas que integram melanócitos (-32%) em comparação com a testemunha positiva (-38%). Observou-se uma ligeira diminuição (-19%) após tratamento com o produto creme PXTS+0,1% de AK205.

Em conclusão, nas condições experimentais retidas o produto creme PXTS+0,5% de AK205 apresentou uma actividade despigmentante nítida em relação às epidermes reconstituintes que integram melanócitos. Observou-se uma actividade mais limitada mas real com o creme PXTS+0,1% de AK205. 18

Exemplo 5: Colocação em evidência sobre a epiderme reconstituída SKINETHIC® do efeito anti-radicalar de uma preparação cosmética que contém um liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marine: 1 — Porquê dosear o malondialdeído?

Nos sistemas biológicos, o oxigénio molecular ê estável e pouco reactivo. Ele comporta-se como um aceitador de electrões e a sua redução conduziu à produção de água. Mas a reacção incompleta do 02 conduziu à produção de radicais livres e de metabolitos tais como o anião superõxido 02“, o radical perhidróxido H02_ tóxico (na presença de ferro ferroso, a reacção pode conduzir a OH-, muito agressivo) ou o perõxido de hidrogénio H202. A superóxido dismutase (SOD) protege as membranas ao dismutar muito rapidamente 02“ em H202. O H202, relatívamente estável, ê reduzido em água (H20) pela catalase e a peroxidase. Estes radicais livres resultantes da redução incompleta do 02 são sensíveis ao nível das ligações duplas, o que favorece o aparecimento de outros radicais livres por deslocalização electrónica. 0 início da reacção em cadeia radicalar produz-se ao nível dos ácidos gordos poli-insaturados. A reacção em cadeia desencadeia-se então, no interior da membrana celular, o que conduz à libertação do malondialdeído (MDA) assim como a outros aldeídos e alcanos que são produtos de degradação. Estes últimos podem ser postos em evidência mediante reacção com o ácido tiobarbitúrico (TBA).

Ao dosear o MDA, que é um dos marcadores essenciais da citotoxicidade pelos processos oxidativos e o stress, 19 dispÕe-se então de um índice que elucida sobre a acfcividade anti-radicalar de uma substância dada. 2- Protocolo experimental:

Semearam-se queratinócitos de origem humana em filtros de policarbonato com 0,63 cm2 num meio definido (MCDB 153 modificado) e suplementado. Cultivaram-se as células durante 14 dias na interface ar/líquido, mudando-se o meio de cultua de dois em dois dias.

Conduziu-se o ensaio em triplicado após 24 horas de contacto do produto com as epidermes: -Lote 1: epidermes testemunhas negativas que não recebem produto -Lote 2: epidermes tratadas que recebem o creme PXTS + 0,1% de AK205 -Lote 3; epidermes tratadas que recebem o creme PXTS + 0,5% de AK205 -Lote 4: epidermes tratadas que recebem o produto liofilizado de células (Criste Marine)

Aplicaram-se os produtos a estudar na superfície de cada epiderme tratada, à razão de 2 μΐ/cm2. => Extracção do malondialdeído

Decorridas 24 horas de contacto do produto com as epidermes, suspenderam-se estas últimas em: -250 μΐ de tampão Tris 50 mM, pH 8 que contém NaCl 0,1 M ; EDTA 20 mM. 20 -25 μΐ de SDS a 7% -300 μΐ de HCl (0,1 N) -38 μΐ de ácido fosfotúngstico a 1% em água -300 μΐ de ácido tiobarbitúrico a 0,67% em água

Decorrida 1 hora de incubação na obscuridade à temperatura de 50 °C e um arrefecimento com água gelada, adicionaram-se 300 ml de n-butanol a cada tubo.

Centrifugaram-se estes últimos a 10 000 g à temperatura de 0 °C durante 10 minutos. Recuperou-se a fase superior pelo doseamento do MDA. => Doseamento do malondialdeído

Doseou-se o MDA mediante medição da fluorescência apôs separação do complexo MDA-TBA por HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Pressão). - Bomba Bischoff Modelo 2.200 - Injector automático de amostras Alcoot Modelo 788 - Coluna Ultrasep C18 (30 cm x 0,18 cm) 6 mm de porosidade

- Detector de fluorescência, jasco 821-FI

Realizou-se a detecção da fluorescência com uma excitação a 515 nm e uma emissão a 553 nm. 0 eluente utilizado é composto por metanol:água, 40:60 (v/v) cujo pH foi ajustado com KOH 1 M.

Realizou-se a quantificação em relação a padrões tratados como as amostras (0,125 ; 0,25 ; 0,5 e 1 mM) por intermédio de um programa informático ICS (Pic 3) (Instrumentation, Consommable Service). => Doseamento das proteínas 21

Realizou-se o doseamento das proteínas de acordo com o método de BRADFORD. O aumento da absorvância a 595 nm é proporcional à concentração das proteínas determinadas por intermédio de um espectrofotómetro UNI CAM 8625. 3- Resultados a) Lipoperoxidação fisiológica

Os resultados obtidos são apresentados sob a forma de quadro .- MDA μΜ/mg proteínas) % Te st eirumha 652 ± 31 - CREME PXTS+0,1% AK205 638 ± 47 -2 (ns) CREME PXTS+0,5% AK205 620 ± 32 -5 (ns) LIOFILIZADO DE CÉLULAS 594 ± 57 -9 (ns) ns : não significativo

Os resultados mostram que os produtos estudados não induzem qualquer libertação do MDA nas condições fisiológicas, em relação à testemunha não tratada.

b) Lipoperoxidação provocada por UVB

Os resultados obtidos são apresentados sob a forma de quadro: MDA μΜ/tng proteínas) % Testemunha 652 + 31 UVB (150 mJ/cm^) 832 + 63 +28* CREME PXTS+0,1% AK205 + UVB (150 mJ/cm'') 638 ± 47 -21** CREME PXTS+0,5% AK205 + UVB (150 mJ/cm3) 620 ± 32 -25** LIOFILIZADO DE CÉLULAS + UVB (150 mj/cm3) 594 ± 57 -28** * ; em relação à testemunha negativa

** : em relação à testemunha positiva irradiada com UVB

Os resultados obtidos revelaram uma protecção significativa dos produtos, creme PXTS+0,1% de AK205, creme PXTS+0,5% de AK205 e liofilizado de células (Criste Marine), aplicadas na superfície da epiderme reconstituída 22 SKINETHIC®, em relação à lipoperoxidação provocada pelos raios ultravioletas B (150 mJ/cm1 2) . A percentagem de redução da produção de MDA é de -21, -25 e -28%, respectivamente, para creme PXTS+0,1% de AK205, creme PXTS+0,5% de AK205 e o produto liofilizado de células (Criste Marine) em comparação com as epidermes irradiadas.

Tendo a irradiação UVB (testemunha positiva) provocado +28% de aumento da produção de MDA, a aplicação dos produtos creme PXTS+0,1% de AK205, creme PXTS+0,5% de AK205 e do produto liofilizado de células (Criste Marine) antes da irradiação permitiu manter a produção de MDA no seu nível fisiológico.

Exemplo 6 ; Colocação em evidência sobre a epiderme reconstituída SKINETHIC® do efeito estimulante de uma preparação cosmética que contém um liofilizado de células desdiferenciadas de Criste Marine: 1

Critérios de avaliação da estimulação 2 A cultura celular dos queratinócitos humanos permitiu descrever mais em pormenor os efeitos específicos dos derivados da vitamina A sobre os marcadores da diferenciação graduada da epiderme : a expressão de Kl-67 na curva supra-basal é estimulada, a expressão de queratinas típicas da hiperproliferação epidérmica (K19, K13) é induzida, hã. perda da polaridade das células da camada basal, enquanto que a síntese da filagrina, proteína responsável pela embalagem das queratinas na camada córnea, ê inibida. Os grãos de querato-hialina, situados na camada granulosa e ricos em filagrina, desaparecem no decurso de 24 horas na presença de ácido retinóico, a 0,05% (ácido da 23 vitamina A) no meio de cultura. Os retinóides induzem, por consequência, globalmente uma estimulação da proliferação e uma inibição da diferenciação epidérmicas. (Rosdy, M. et al., In Vitro Toxicology, Vol. 10 η.β 1, p. 39-47, 1997, "Retinoic acid inhibits epidermal differentiation when applied topically on the stratum corneum of epidermis formed in vitro by human keratinocytes grown on defined médium"). A filagrina e a proteína KI-67 podem, por consequência, ser utilizadas como marcadores da diferenciação epidérmica. 2- Estudo da diferenciação epidérmica: • Protocolo

Semearam-se queratinócitos de origem humana em filtros de policarbonato com 0,63 cm2 num meio definido (MCDB 153 modificado) e suplementado. Cultivaram-se as células durante 14 dias na interface ar/líquido, sendo o meio de cultura mudado de dois em dois dias.

Conduziu-se o ensaio em triplicado após 24 horas de contacto dos produtos com as epidermes: -Lote 1: epidermes testemunhas negativas que não receberam qualquer produto. -Lote 2: epidermes tratadas que receberam o produto creme PXTS+0,1% de AK205 -Lote 3: epidermes tratadas que receberam o produto creme PXTS+0,5% de AK205 24 -Lote 4: epidermes tratadas que receberam o produto liofilizado de células (Criste Marine)

Congelaram-se à temperatura de -80 °C as epidermes testemunhas que não receberam qualquer produto e as epidermes tratadas que receberam os produtos em estudo durante 24 horas de contacto. Apôs inclusão em blocos de parafina, cortaram-se estas epidermes e depois trataram-se em imuno-histoquímica.

Realizou-se esta reacção com um anticorpo monoclonal recombinante da filagrina. • Resultados : inibição da diferenciação das células epidérmicas A observação comparativa das epidermes reconstituídas testemunhas e tratadas com os produtos, creme PXTS+0,1% de AK205, creme PXTS+0,5% de AK205 e liofilizado de células (Criste Marine), revelou uma diferença de densidade de marcação da filagrina ao nível da camada granulosa (conforme a Figura 3).

Com efeito, nas condições fisiológicas, o tratamento das epidermes com: - creme PXTS+0,1% de AK205: induziu uma nítida diminuição da diferenciação epidérmica que se traduz pela nítida diminuição da marcação da filagrina em comparação com as testemunhas não tratadas, - creme PXTS+0,5% de AK205: induziu uma nítida diminuição da diferenciação epidérmica que se traduz pela nítida diminuição da marcação da filagrina em comparação com as testemunhas não tratadas, 25 liofilizado de células (Criste Marine): induziu uma diminuição significativa da diferenciação epidérmica que se traduz pela nitida diminuição da marcação da filagrina em comparação com a testemunha não tratada. 3" Estudo da actividade proliferadora das células da camada basal das epidermes • Protocolo

Semearam-se queratínócítos de origem humana em filtros de policarbonato com 0,63 cm2 num meio definido (MCDB 153 modificado) e suplementado. Cultivaram-se as células durante 14 dias na interface ar/liquido, sendo o meio de cultura mudado de dois em dois dias.

Utilizaram-se as epidermes assim formadas para a realização do estudo a partir do 17.° dia de cultura. A actividade dos produtos foi revelada por uma marcação imuno-histoquimica.

Conduziu-se o ensaio em triplicado após 24 horas de contacto do produto com as epidermes: -Lote 1: epidermes testemunhas negativas que não recebem qualquer produto -Lote 2: epidermes tratadas que recebem o produto creme PXTS+0,1%- de AK205 -Lote 3: epidermes tratadas que recebem o produto creme PXTS+0,5% de AK205 -Lote 4: epidermes tratadas que recebem o produto liofilizado de células (Criste Marine) 26

Fixaram-se as epidermes testemunhas que não recebem qualquer produto e as epidermes tratadas que recebem os produtos em estudo durante 24 horas de contacto, em formaldeído a 10%. Após inclusão em blocos de parafina, cortaram-se estas epidermes e depois trataram-se em imuno--histoquimica.

Realizou-se esta reacção com o anticorpo MIB1 (Immunotech), péptido recombinante do antigénio nuclear Kl-67.

Realizou-se a revelação pelo método de peroxidase--antiperoxidase após desmascaramento antigénico mediante pré-tratamento pelo calor. A marcação pelo cromogénio DAB revela em castanho os sítios nucleares KI-67 da fracção das células em crescimento expresso em fases: => G1 e S = fases de latência e de síntese da célula => G2 = fase de desdobramento dos constituintes celulares => M = mitose.

Avaliou-se o índice mitótico mediante contagem dos sítios nucleares coloridos, à razão de 10 campos por lâmina ao microscópio óptico, com um aumento de x 250, em comparação com os cortes de epiderme testemunhas. • Resultados : estimulação da proliferação das células epidérmicas

Os resultados obtidos são apresentados sob a forma de quadro: — Média do número de núcleos coloridos por campo de __contagem ao microscópio_ 27

Testemunha Cl -H I> CREME PXTS+0,1% de AK205 8 + 2 CREME PXTS+0,5% de AK205 12 ± 2 LIOFILIZADO DE CÉLULAS 14 ± 3 A contagem dos sítios nucleares coloridos com castanho de todas as amostras, após tratamento imuno-histoquímico, revelou que o produto: - creme PXTS+0,1% de AK205 : levou a um pequeno aumento mas significativo da multiplicação das células da camada basal. O número de sítios nucleares coloridos é comparável com o das testemunhas não tratadas (cf. a Figura 4). - creme PXTS+0,5% de AK205 : levou a um pequeno aumento mas significativo da multiplicação das células da camada basal em comparação com a testemunha não tratada. O número de sítios nucleares coloridos é superior ao das testemunhas não tratadas (cf. a Figura 4). liofilizado de células (Criste Marine}: levou a um aumento significativo da multiplicação das células da camada basal em comparação com a testemunha não tratada. O número de sítios nucleares coloridos é largamente superior ao das testemunhas não tratadas (cf. a Figura 4).

Lisboa, 4 de Fevereiro de 2008

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização em uma composição cosmética de pelo menos um liofilizado de células vegetais desdiferenciadas, as quais são células de plantas halófilas, para despigmentar e/ou tornar clara e proteger a epiderme.

2. utilização de pelo menos um liofilizado de células vegetais desdiferenciadas, as quais são células de plantas halófilas, para a preparação de uma composição farmacêutica destinada a uma utilização para despigmentar e/ou tornar clara, proteger e regenerar a epiderme.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1. ou 2., caracterizada pelo facto de se obterem as células vegetais desdiferenciadas mediante cultura in vitro.

4. Utilização de acordo com a reivindicação 3., caracterizada pelo facto de as células vegetais desdiferenciadas obtidas mediante cultura in vitro serem estirpes.

5. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 4., caracterizada pelo facto de a planta halófila ser a Criste Marine.

6. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 2. a 5., caracterizada pelo facto de o liofilizado despigmentar e/ou tornar clara a epiderme mediante bloqueio da actividade da tirosinase.

7. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 6., caracterizada pelo facto de o 2 liofilizado proteger a epiderme através de um efeito anti--radicalar.

8. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 2. a 5., caracterizada pelo facto de o liofilizado regenerar a epiderme através de um efeito que estimula a proliferação das células da camada basal da epiderme.

9. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 2. a 5., caracterizada pelo facto de o liofilizado regenerar a epiderme através de um efeito que inibe a diferenciação epidérmica.

10. Composição cosmética ou farmacêutica para utilização tópica, caracterizada pelo facto de compreender, em uma base aceitável sob o ponto de vista fisiológico, pelo menos um liofilizado tal como descrito de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 9..

11. Composição cosmética ou farmacêutica para utilização tópica, caracterizada pelo facto de compreender, em uma base aceitável sob o ponto de vista fisiológico, entre 0,05% e 2% de pelo menos um liofilizado tal como descrito de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 9..

12. Composição cosmética ou farmacêutica para utilização tópica, caracterizada pelo facto de compreender, em uma base aceitável sob o ponto de vista fisiológico, entre 0,1% e 1% de pelo menos um liofilizado tal como descrito de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 9..

13. Composição cosmética ou farmacêutica para utilização tópica, caracterizada pelo facto de compreender, em uma 3 base aceitável sob o ponto de vista fisiológico, entre 0,5% de pelo menos um liofilizado tal como descrito de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 9..

14. Composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 10. a 13., destinada a rejuvenescer o aspecto da pele.

15. Composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 10. a 13., destinada ao tratamento de manchas de pigmentação.

16. Composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 10. a 13., destinada a tornar claras as peles negras ou asiáticas. Lisboa, 4 de Fevereiro de 2008