PT3085418T - Composições cosméticas compreendendo oligómeros de ácido hialurónico e células vegetais de buganvília desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES COSMÉTICAS COMPREENDENDO OLIGÓMEROS DE ÁCIDO HIALURÓNICO E CÉLULAS VEGETAIS DE BUGANVÍLIA DESDIFERENCIADAS E INDUZIDAS ENCAPSULANDO UM EXTRATO DE AÇAFRÃO" A presente invenção relaciona-se com domínio técnico geral dos produtos cosméticos para utilização tópica, utilizados, nomeadamente, na pele.

Mais precisamente, a presente invenção refere-se a composições cosméticas para aplicação tópica, que compreendem oligómeros de ácido hialurónico e células vegetais desdiferenciadas e induzidas de Buganvília encapsulando um extrato de açafrão. Refere-se também a um processo cosmético não terapêutico para o cuidado da pele usando a referida composição, bem como à utilização não terapêutica da referida composição cosmética para cuidados da pele e, nomeadamente, para melhorar a firmeza da pele, promovendo em particular a regeneração da derme e a redução das rugas cutâneas. A pele é um verdadeiro órgão que compreende várias camadas integradas, que vão desde a camada superficial, a epiderme, às camadas mais profundas, a derme e a hipoderme, possuindo cada uma dessas camadas, propriedades específicas que permitem ao conjunto reagir e adaptar-se às condições do seu ambiente, conferindo à pele a sua flexibilidade e resistência. A epiderme, composta sobretudo por queratinócitos, melanócitos e células de Langerhans, desempenha um papel fundamental no assegurar da proteção e na manutenção de uma boa troficidade. Os queratinócitos são células extremamente dinâmicas que apresentam proliferação e diferenciação permanentes, transformando-se depois em células mortas (corneócitos), as quais são regularmente eliminadas por descamação. A derme consiste principalmente de colagénio, elastina e proteoglicanos, moléculas sintetizadas pelos fibroblastos dérmicos. As fibras de colagénio conferem força mecânica e textura à pele, a elastina é responsável pela elasticidade e os proteoglicanos, combinando proteínas e glicosaminoglicanos, desempenham um papel importante na estrutura e na humidade da pele. Glicosaminoglicanos, como o ácido hialurónico, são moléculas altamente higroscópicas que são capazes de reter grandes quantidades de água. Outras células, como os macrófagos e os leucócitos, estão também presentes na camada da derme. A hipoderme, que é a camada mais profunda da pele, contém adipócitos que produzem lípidos, de modo a que o tecido subcutâneo produza uma camada de gordura que proteja músculos, ossos os órgãos internos, contra choques. 0 colagénio é a principal proteína estrutural representando mais do que 70% da quantidade de proteína na pele. Na pele humana, estão descritos 14 tipos de colagénio. O colagénio 1 é o principal e representa 90% do colagénio total na pele.

Com a passagem do tempo, ocorrem profundas alterações na derme. A população de fibroblastos, células especializadas na síntese de fibras de elastina e colagénio, reduzir-se-á a metade entre os 20 e os 80 anos. Estes fibroblastos asseguram o equilíbrio entre a síntese, a maturação e a degradação das fibras de elastina e de colagénio. Ao longo do tempo, o equilíbrio irá evoluir para uma degradação dessas fibras, resultando em perda de elasticidade e de tonicidade da derme e uma flacidez que deixará de se opor aos efeitos de contração dos músculos subjacentes, conduzindo ao aparecimento de rugas. Assim, com o envelhecimento, a derme torna-se mais fina e rígida: a pele fica menos flexível, menos firme com a idade, e as rugas aparecem. Além disso, a pele tem de enfrentar continuamente várias agressões externas, as quais podem acelerar o processo natural de envelhecimento.

Assim, procuram-se constantemente novos agentes ativos cosméticos, a fim de combater os sinais do envelhecimento cutâneo e, em particular, a atrofia da derme e o aparecimento de rugas.

As células vegetais de cultura de Buganvília induzidas e desdiferenciadas estão descritas no pedido de patente FR 14 53647. Essas células permitem transportar qualquer tipo de ingrediente ativo, libertando-o progressivamente no seio das várias camadas da epiderme, independentemente de esses ingredientes ativos serem hidrossolúveis ou lipossolúveis. De fato, as células de Buganvília desdiferenciadas e induzidas apresentam-se sob a forma de vesículas que compreendem uma membrana vegetal constituída por uma bicamada lipídica que delimita um volume interno contendo uma fase encapsulada. Os constituintes da membrana são idênticos aos lipídios intercorneocíticos da camada superior da epiderme e aos lipídios intercelulares (ácidos gordos, ceramidas, colesterol). Assim, após a aplicação de células desdiferenciadas e induzidas, o conteúdo celular difunde-se pelo simples corte da pele; 0(s) ingrediente (s) ativo(s) beneficiam de um encapsulamento natural e de liberação por biomimetismo. Assim, após aplicação sobre a pele, a ação das células ocorre em 3 etapas, sendo 1) fragmentação das membranas lipídicas das células inteiras, 2) inserção nos lípidos intercorneocíticos e 3) libertação progressiva do ou dos ingredientes ativos por biomimetismo, na própria epiderme. Demonstrou-se assim que o encapsulamento de um extrato de açafrão, enquanto ingrediente ativo, pelas células de Buganvília desdiferenciadas e induzidas tem um efeito positivo na proliferação das células da derme e da epiderme da pele, promovendo assim a sua regeneração.

No entanto, sendo certo que esta composição tem um efeito favorável sobre a quantidade de colagénio I e sobre a regeneração dérmica, mantem-se a necessidade de propor novos ingredientes ativos que tornem possível lutar mais eficazmente contra os sinais de envelhecimento da pele e, em particular, contra a perda de firmeza da pele e o aparecimento de rugas. 0 ácido hialurónico é um glicosaminoglicano presente em todos os vertebrados, principalmente no tecido conjuntivo, epitelial e nos tecidos nervosos. É um dos principais componentes da matriz extracelular. 0 ácido hialurónico é um componente natural da derme desempenhando um papel importante na hidratação, na tonicidade e na elasticidade da pele. Encontra-se em maior quantidade em organismos jovens. De facto, com o tempo, a sua presença diminui, especialmente porque é destruído pelos radicais livres a que estamos expostos (sol, poluição ...).

Em cosmética, os oligómeros de ácido hialurónico de baixo peso molecular (isto é, geralmente inferior a 10 kDa) desempenham um papel importante na migração e proliferação de células, dois processos que ocorrem em qualquer regeneração, reconstrução ou cicatrização de feridas. As capacidades regenerantes dos oligómeros de baixo peso molecular podem, portanto, ser eficazmente utilizadas para tratar o envelhecimento da pele.

Os estudos realizados pelo requerente mostraram que os oligómeros de ácido hialurónico de baixo peso molecular, isto é, inferior a 10 kDa, potenciam o efeito das células desdiferenciadas e induzidas de Buganvília que encapsulam um extrato de açafrão, na proliferação de células da derme, mais particularmente na síntese de colagénio I, promovendo assim sua regeneração; A combinação de oligómeros de ácido hialurónico de baixo peso molecular, ou seja, inferior a 10 kDa, com células de Buganvília desdiferenciadas e induzidas que encapsulam um extrato de açafrão podem ser vantajosamente utilizadas para os cuidados da pele e, em particular, para promover a regeneração da derme. Além disso, nas doses utilizadas, os testes realizados demonstraram que as composições cosméticas à base de células desdiferenciadas de Buganvília utilizadas na presente invenção, não apresentam citotoxicidade. A presente invenção tem pois por objeto principal, uma composição cosmética que compreende células vegetais desdiferenciadas e eliciados de Buganvília, que se apresentam sob a forma de vesículas, as referidas vesículas compreendendo uma membrana vegetal constituída por uma dupla camada lipídica que delimita um volume interno contendo uma fase encapsulada, caraterizando-se a referida composição por compreender ainda pelo menos um oligómero de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa e pelo facto de existir um extrato de açafrão na fase encapsulada da s ve s i cu 1 a s .

De acordo com a invenção, a composição cosmética é de preferência uma composição cosmética para aplicação tópica. A invenção tem ainda por objeto um processo cosmético não terapêutico para o cuidado da pele, em particular para melhorar a firmeza da pele, promovendo a regeneração da derme, e para reduzir as rugas cutâneas, caracterizado por consistir na aplicação nas áreas da pele em causa, de pelo menos uma composição cosmética como definida acima, isto é, uma composição cosmética compreendendo pelo menos um oligómero de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa e células vegetais desdiferenciadas e induzidas de Buganvília que se apresentam sob a forma de vesículas, cuja fase encapsulada compreende pelo menos um extrato de açafrão. Por fim, a invenção tem por objeto a utilização não terapêutica de uma composição cosmética para aplicação tópica compreendendo pelo menos um oligómero de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa e células de vegetais desdiferenciadas e induzidas de Buganvília encapsulando um extrato de açafrão, para o cuidado da pele, em particular para melhorar a firmeza da pele, em particular promovendo a regeneração da derme e reduzindo as rugas da pele.

De acordo com a presente invenção, podem ser utilizadas todas as espécies de Buganvília, mas mais especificamente podem mencionar-se, as Bougainvillea glabra, Bougainvillea alba,

Bougainvillea spectabilis, Bougainvillea infesta, e Bougainvillea buttiana.

Por células vegetais desdiferenciadas de Buganvília entende-se qualquer célula vegetal derivada de uma cultura in vitro de células de Buganvília, não exibindo as referidas células qualquer das características de uma especialização específica, e sendo capazes de viver por si mesmas e não em dependência de outras células.

As células desdiferenciadas e induzidas de Buganvília que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção podem ser obtidas através de técnicas conhecidas de crescimento ou multiplicação celular, em meio líquido ou sólido, de células de Buganvília cultivadas in vitro, num ambiente controlado, sob condições assépticas na ausência de microrganismos. A técnica de cultura vegetal tem a vantagem de produzir células cultivadas sob condições ambientais bem definidas e reprodutíveis, nomeadamente no que se refere à temperatura, à luz e ao meio de cultura, e de produzir células desdiferenciadas que se encontram, num determinado momento, na mesma fase fisiológica (indiferenciadas). Outra vantagem consiste na formação de metabólitos secundários num período de tempo mais curto, da ordem de uma a três semanas, sendo que, na planta, esse período é de vários meses.

Por exemplo, podem preparar-se células desdiferenciadas e induzidas de Buganvília a partir de explantes de folhas, flores, caule ou raiz.

As células desdiferenciadas e induzidas utilizáveis de acordo com a invenção podem ser obtidas por qualquer método conhecido na especialidade, como, por exemplo, pelos métodos descritos por E.F. George e P.D. Sherrington em Plant Propagation by tissue culture, Handbook and Directory of Commercial Laboratories (Exegetics Ltd, 1984).

Os meios de cultura que podem ser utilizados de acordo com a invenção são geralmente conhecidos pelos especialistas. Podem citar-se, a titulo de exemplo, os meios de Gamborg, de Murashige Skoog, de Heller e de White, cujas descrições completas podem encontrar-se em "Plant Culture Media: formulations and uses", E.F. George, DJM Puttock et H. J. George (Exegetics Ltd 1987, Volumes 1 & 2).

Por "indução" entende-se a aplicação de stress ou de agressão (biológica, química ou física) em células vegetais no seu meio de cultura, para provocar um ou mais mecanismos de defesa que se concretizam, nomeadamente, mas não apenas, através da síntese de metabolitos secundários de interesse, como as fitoalexinas.

De acordo com a invenção, a indução das células desdiferenciadas de Buganvília em meio de cultura pode ser efetuada por aplicação de agentes químicos ou várias situações de stress, tais como pressão, depressão, vácuo, variação da pressão, presença de um gás, atmosfera variável, calor, frio, luz, ciclos luminosos, radiação, toxinas, agitação, contaminação por microrganismos (bactérias, leveduras, vírus), ultrassom, radiação infravermelha ou ultravioleta, asfixia. De acordo com a presente invenção, podem utilizar-se especificamente células de Buganvília desdiferenciadas, induzidas e liofilizadas. A liofilização das células permite melhorar a sua preservação e, consequentemente, facilitar a sua incorporação em composições cosméticas.

Os elementos doseados nas células liofilizadas são os seguintes (por 100 g de células liofilizadas):

Proteínas (determinadas de acordo com o método descrito na Portaria de 8 de setembro de 1977, relativo aos métodos oficiais para a análise de produtos dietéticos e de regime): 13,56 g O aminograma do extrato proteico revelou os seguintes aminoácidos principais. Os teores dos aminoácidos são indicados em gramas por 100 g de células liofilizadas.

Lipidos (determinadas de acordo com o método descrito na Portaria de 8 de setembro de 1977, relativo aos métodos oficiais para a análise de produtos dietéticos e de regime): 1,08 g, consistindo, nomeadamente, em cerca de 73% em peso de ácidos gordos saturados e não saturados em Cis e em cerca de 21% em peso de ácidos gordos Ci6 saturados. Açúcares (determinados por cromatografia iónica - deteção amperométrica pulsada (PAD)):

As células induzidas e desdiferenciadas de Buganvília de acordo com a presente invenção encapsulam, como substância ativa, um extrato de flores de açafrão (Crocus sativus). O extrato de açafrão pode ser obtido a partir de flores de açafrão, após remoção de estigmas e pistilos. As flores sem estigmas e pistilos são então secas, reduzidas a pó, sendo então extraídas por maceração com água.

Assim, as células desdiferenciadas e induzidas de Buganvília encapsulando um extrato de açafrão são de preferência obtidos pelo processo que compreende os seguintes passos: 1) A preparação in vitro de células desdiferenciadas por cultura em meio de cultura de explante de Buganvília, 2) A indução, no meio de cultura, das células desdiferenciadas obtidas no passo anterior, 3) A extração das células desdiferenciadas e induzidas obtidas acima no passo anterior, 4) A incubação das células desdiferenciadas e induzidas obtidas no passo 3) com uma solução ou dispersão contendo o extrato de açafrão no meio líquido. 0 passo de incubação de 4) é realizado, de preferência, a uma temperatura inferior ou igual a 30°C, preferencialmente a uma temperatura variando entre 20 e 30°C, durante um período entre 12 e 48 Horas. O meio líquido que pode ser utilizado para incubar as células desdiferenciadas e induzidas com o ingrediente ativo (s) pode, por exemplo, ser escolhido a partir dos meios utilizados na etapa 1) do processo para a cultura in vitro das células, isto é, para a multiplicação celular das células de Buganvília.

No final da incubação, as células de Buganvília desdiferenciadas e induzidas encapsulando o extrato de açafrão podem ser recuperadas no meio líquido, por exemplo, por filtração. A quantidade de extrato de açafrão presente na fase encapsulada varia geralmente entre cerca de 0,01 e 5% em peso em relação à massa total das células de Buganvília desdiferenciadas e induzidas, e ainda mais preferencialmente entre cerca de 0,1 e 3% em peso. Mais preferencialmente, a quantidade de extrato de açafrão presente na fase encapsulada é de cerca de 1% em peso.

De acordo com a invenção, a fase encapsulada é de preferência uma fase aquosa escolhida entre água e os meios de cultura utilizados para a cultura in vitro das referidas células.

De acordo com uma forma particularmente vantajosa da invenção, as células de Buganvília desdiferenciadas e induzidas encapsulando o extrato de açafrão são dispersas em glicerina para obter uma suspensão de células, antes de serem incorporados numa composição cosmética. Assim, de acordo com uma forma de realização preferida da invenção, as células desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão estão presentes sob a forma de uma suspensão das referidas células em glicerina. De preferência, a quantidade de células desdiferenciadas e induzidas que encapsulam um extrato de açafrão na referida suspensão varia entre cerca de 15 e 30% em peso, sendo ainda mais preferivelmente de cerca de 20% em peso em relação à massa da referida suspensão.

Assim, de acordo com esta forma de realização específica da invenção, a composição cosmética pode, então, compreender entre cerca de 0,01 e 10% em peso de uma suspensão de células vegetais de Buganvília desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão em glicerina, como descrito acima, em relação à massa total da composição cosmética, de preferência entre cerca de 0,05% e 5% em peso, e ainda mais preferencialmente entre cerca de 0,1% e 3% em peso.

De acordo com a invenção, o oligómero ou oligómeros de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa corresponde de preferência à fórmula (C14H21NO11) n, em que n é um número inteiro inferior a 25, designando o grau de polimerização.

De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, n está compreendido entre 5 e 25.

Vantajosamente, a concentração de oligómeros de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa na composição cosmética da invenção pode variar entre cerca de 0,01% e 1%, preferencialmente entre 0,05% e 0,5%%, e ainda mais preferencialmente entre 0,1 e 0,3% em peso em relação à massa total da composição cosmética.

Os oligómeros de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa, que podem ser utilizados no contexto da presente invenção podem ser obtidos graças à produção produção de ácido hialurónico de acordo com processos biotecnológicos bem conhecidos dos especialistas, como os descritos, por exemplo, em Schiraldi, C. et ai. ("Biotechnological Production and Application of Hyaluronan", em Biopolymers, M. Elnashar, Ed., pp. 387-412, InTech, Rijeka, Croatia, 2010) e, em seguida, hidrólise do ácido hialurónico para obter oligómeros de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa.

Os métodos utilizados para avaliar o peso molecular dos oligómeros de ácido hialurónico, que podem ser utilizados de acordo com a invenção são geralmente conhecidos dos especialistas, como os descritos, por exemplo, por Mahnoey D.J. et ai em («Novel methods for the preparation and characterization of hyaluronan oligosaccharides of defined lengh», Glycobiology. 2001, 11(12), 1025-1033).

Podem citar-se, a titulo de exemplo, a combinação da difusão luminosa em vários ângulos associada a uma cromatografia de exclusão sérica (MALLS-SEC), que separa as proteínas de acordo com o seu volume hidrodinâmico permitindo ter acesso à massa molecular das espécies e à homogeneidade de um pico na saída da cromatografia de exclusão sérica. O peso molecular dos oligómeros do ácido hialurónico de fórmula (C14H21NO11) n, em que n é um número inteiro inferior a 25, de acordo com a presente invenção varia, assim, entre 2 kDa inclusive e 10 kDalton exclusive.

Os oligómeros de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa estão também comercialmente disponíveis. A título de exemplo, podem mencionar-se em particular os produtos vendidos sob as designações comerciais Signal-10® (Número CAS 90004-61-9) pela empresa Principium S.A. (Viganello, CH) , ou PrimaHyal 10® pela empresa Soliance (Pomade, FR) .

As composições de acordo com a presente invenção compreendem, em combinação, pelo menos um oligómero de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa e as células vegetais de Bougainvillia desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão, se necessário, com os meios e os excipientes usualmente utilizados em composições cosméticas e dermatológicas. Cosmeticamente e dermatologicamente aceitáveis.

Para os fins da presente invenção, "veículo cosmeticamente e dermatologicamente aceitável" representa os meios que compreendem água, uma mistura de água com um ou mais solventes orgânicos ou um solvente ou uma mistura de solventes orgânicos cosmeticamente ou dermatologicamente aceitáveis.

De acordo com uma forma de realização vantajosa, as composições cosméticas de acordo com a presente invenção podem conter, para alem das células vegetais de Bougainvillia desdiferenciadas e induzidos encapsulando um extrato de açafrão e oligómeros de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa, um ou mais agentes ativos suplementares que vantajosamente aprimorem ou completem a sua atividade e sejam compatíveis, ou seja, que não sejam capazes de reagir uns aos outros ou de mascarar ou limitar os seus efeitos. Tais ingredientes ativos podem, por exemplo, ser escolhidos de entre qualquer tipo de compostos usualmente utilizados em composições cosméticas. A título de exemplo, podem mencionar-se os extratos de plâncton, extratos de origem vegetal, como um extrato de maca (que atua na prevenção de distúrbios associados a deficiências da microcirculação cutânea e ao stress oxidativo que daí pode resultar), um extrato de pétalas de papoula que atua ao nível da nutrição celular, uma combinação de extratos de ancusa, papoula e maracujá que, em combinação, atuam na prevenção dos sinais de envelhecimento da pele, um extrato de sementes de mimosa, um extrato de pétalas de malmequer, um extrato de barbatimão, um extrato de kigelia africana, um extrato de aveia. As composições cosméticas de acordo com a presente invenção podem apresentar-se nas formas galénicas convencionalmente utilizadas para aplicação tópica, isto é, sob a forma de gel, emulsão (nomeadamente creme ou leite), emulsão bifásica óleo-em-água ou água- -em-óleo, óleo corporal, máscara, pomada, unguento, loção, solução concentrada, podendo as referidas formas galénicas conter também excipientes e meios usuais e aceitáveis em cosmética. Utilizam-se preferencialmente sob a forma de cremes, soro, de loção ou de gel.

Estas formas de administração tópicas são preparadas pelas técnicas usuais e, por exemplo, no caso de um creme, por dispersão de uma fase gorda numa fase aquosa, a fim de obter uma emulsão de óleo-em-água, ou de modo inverso, para preparar uma emulsão de água em óleo no caso de cremes, podem ser utilizadas emulsões com estrutura lamelar obtidas com lecitinas hidrogenadas ou ésteres de sacarose, contendo poucos ou nenhuns produtos etoxilados.

As composições tópicas de acordo com a invenção podem compreender excipientes adequados para aplicação tópica externa, em particular excipientes cosmeticamente aceitáveis. Estes excipientes adequados para a formulação são bem conhecidos dos especialistas e incluem, em particular, agentes penetrantes tais como fitantriol, octil dodecanol e escina; espessantes como gomas naturais e polímeros sintéticos; surfatantes; emolientes tais como octanoato de cetearilo, miristato de isopropilo, isononanoato de cetearilo, dimeticona, ciclometicona, 3-diisoestearato de poliglicerilo, poliisobuteno hidrogenado, álcool cetílico, palmitato de cetilo, fosfato de cetilo; emulsionantes tais como derivados de poliglicerol; conservantes tais como fenoxietanol e ácido desidroacético; corantes; fragâncias. Outros ingredientes que podem ser utilizados nas composições da invenção incluem agentes hidratantes tais como glicerina, butilenoglicol, sal sódico do ácido carboxílico da pirrolidona (sódio PCA) e combinações de derivados glucosicos com efeito hidratante e reestruturante, tais como Aquaxyl® (Xilitilglucosido e anidroxiltol e xilitol), e também vitaminas antioxidantes.

Também é possível adicionar glúcidos à composição, escolhidos principalmente a partir de glicose, glicogénio e trealose, ou ainda um palmitoil pentapeptídeo-3, como o Matrixyl® ou derivados, como o palmitoil GHK (possuindo a cadeia Glicil-Histidil-Lisina) e o palmitoil GQPR (Glicil-Glutamil-Prolil-Arginina) ou o palmitoil VGVAPG (Valil-Glicil-Valil-Alanil-Prolil-Glicina) associado a uma ceramida-2, bem como. De um modo geral, qualquer associação com uma ceramida.

Podem também adicionar-se à composição, agentes de proteção contra os raios ultravioletas, como por exemplo, protetores solares UV-A e UV-B hidrófilos ou lipófilos, ou pigmentos que formem um écran anti ultravioleta.

Os filtros solares podem ser escolhidos, por exemplo, a partir de benzofenona ou de um derivado de benzofenona, como 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona (Eusolex® 4360), ou um éster do ácido cinâmico e mais particularmente metoxicinamato de octilo, (Eusolex® 2292), metoxicinamato de 2-etilhexil (Parsol MCX®) ou ainda ciano-β,β-difenilacrilato como o octocrileno (Eusolex® OCR), a 4-metilbenzilideno-cânfora (Eusolex 6300®), e derivados de dibenzoilmetano como 4-isopropil dibenzoilmetano (Eusolex 8020), t-butil-metoxidibenzoilmetano (Parsol 1789®) e 4-metoxi-dibenzoilmetano.

Os pigmentos podem ser escolhidos, por exemplo, a partir de dióxido de titânio, óxido de zinco e óxido de zircónio. A associação, de acordo com a presente invenção, de células Buganvília desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão e oligómeros de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa revelou uma excelente atividade sobre a síntese de colagénio I. Assim, nas concentrações testadas, observou-se um aumento muito significativo (+ 106%) da quantidade de colagénio I. Estes resultados confirmam que a combinação de acordo com a invenção promove a regeneração da derme e permite melhorar a firmeza da pele e reduzir o aparecimento de rugas. A utilização não terapêutica da composição cosmética de acordo com a invenção compreende todos os cuidados do corpo e da pele, incluindo produtos solares, protetores e bronzeadores, os produtos antienvelhecimento, antiseborreicos, tónicos, os produtos que melhoram a aparência da pele, incluindo o tratamento do acne e de erupções cutâneas.

Os resultados são explicitados nos exemplos seguintes e demonstram a sinergia dos efeitos de cada um dos componentes, uma vez que, em doses equivalentes, os resultados obtidos com a combinação superiores à soma dos efeitos que produzem individualmente.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção não limitando o seu âmbito.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Preparação de uma suspensão de células vegetais de Bougainvillia desdiferenciadas e induzidas que encapsulam vim extrato de açafrão 1. Recolha e cultura de células desdiferenciadas de Buganvília A partir de folhas frescas de Bougainvillia (Bougainvillea glabra) recolheram-se pedaços de folhas com cerca de 5 a 10 mm.

Os pedaços de folhas foram então esterilizados, e, sendo depois cultivadas em caixas esterilizadas à temperatura ambiente num meio nutritivo sintético (meio de Murashige e Skoog com gelose), até à formação, ao nível dos explantes, de aglomerados de células desdiferenciadas, denominados calos ou células-mães.

Após 30 dias removeram-se as células-mãe, as quais foram depois transplantadas para um novo meio nutritivo sob as mesmas condições de cultura que precederam a formação dos calos friáveis.

Obteve-se um grupo de linhagens estáveis desdiferenciadas possuindo características de crescimento e de produção de metabolitos. 2. Indução das células obtidas no passo anterior A indução celular foi efetuada por irradiação com luz UV a 180 nm, durante 2 horas, utilizando uma lâmpada T-30C Wilbert-Lourmat (600 mW/m2) colocada a uma distância de 1 m na luz direta sobre as células. 3. Preparação da suspensão celular

Após a indução, colheu-se um pedaço de calo que foi seguidamente colocado em suspensão num meio nutritivo liquido (meio de Murashige e Skoog sem gelose).

No final da cultura (15 dias), as células foram filtradas para remover o meio de cultura sendo depois enxaguadas com água fria (4°C) . Obteve-se assim uma biomassa fresca de cerca de 250 g de células por litro de cultura. 4. Obtenção de extrato de açafrão O extrato de açafrão foi obtido a partir de flores de açafrão, após a remoção dos estigmas, e pistilos. As flores sem estigmas e pistilos foram secas, reduzidas a pó sendo depois extraídas por maceração com água. 5. Encapsulamento do extrato de açafrão nas células desdiferenciadas e induzidas de Buganvília

As células desdiferenciadas e induzidas de Buganvília como preparadas acima foram suspensas num meio nutriente líquido (meio de Murashige e Skoog sem gelose) contendo 1% em massa de extrato de açafrão. A incubação das células de Buganvília foi realizada durante 48 horas a uma temperatura de 25°C para encapsular o extrato de açafrão na fase aquosa das células.

No final do período de incubação, as células de Buganvília foram recuperadas por filtração sendo depois suspensas em glicerina, numa proporção de 20% em massa, para 80% em massa de glicerina.

Obteve-se assim uma suspensão que compreende 80% em massa de glicerina, 20% em massa de células Buganvília desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão. EXEMPLO 2 Demonstração da ausência de citotoxicidade da associação das células vegetais de Buganvília que encapsulam vim extrato de açafrão e oligómeros de ácido hialurónico com vim peso molecular inferior a 10 kDa

Neste exemplo testou-se a eventual citotoxicidade das células de Buganvília desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão obtidas no Exemplo 1, para oligómeros de ácido hialurónico de fórmula (C14H21NO11) n, onde n é um número inteiro inferior a 25, vendidos sob a designação comercial de Signal-10 pela empresa Principium SA, bem como da sua combinação. O estudo foi realizado em fibroblastos de derme humana NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts; origem: prepúcio) a cerca de 40% do seu potencial proliferativo e cultivadas em monocamada em meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) contendo soro FBS (Fetal Bovine Serum) e antibióticos (penicilina/estreptomicina).

Os vários tratamentos com os ingredientes ativos e a sua combinação foram realizados em meio de cultura que não continha soro.

As células foram mantidas a 37°C sob atmosfera húmida contendo 5% de CO2.

As células foram semeadas numa placa de 24 poços, 24 horas antes do tratamento com respetivamente 0,3% de oligómeros de ácido hialurónico de fórmula (C14H21NO11) n, onde n é um número inteiro inferior a 25, e 3% de células de Buganvília desdiferenciadas e induzidas que encapsulam um extrato de açafrão, e a combinação destes dois agentes ativos nessas duas concentrações.

Tratamento dos fibroblastos NHDFs pelos dois agentes ativos e pela sua combinação, aplicados a estas concentrações e cultivados em triplicado (n=3), foi feito no meio de cultura DMEM contendo antibióticos e na ausência de soro.

Após 48 horas de tratamento, analisou-se a viabilidade das células através do teste MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-3 (3-carboxi-metoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio) . A densidade celular e a cinética experimental correspondem às condições que foram utilizadas posteriormente para a análise do efeito dos agentes ativos na quantidade de colagénio I.

Para validar o ensaio de citotoxicidade utilizou-se como controlo positivo uma solução aquosa de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,08% por peso. O limiar de citotoxicidade foi arbitrariamente definido em 80% de viabilidade em comparação com o controlo não tratado e a SDS foi utilizada como controlo positivo para validar a citotoxicidade da experiência.

Relativamente à percentagem de viabilidade de fibroblastos NHDF após 48 horas de tratamento, não se verificou diferença significativa entre as células tratadas com os dois ingredientes ativos ou a sua combinação e as células de controlo que não receberam qualquer tratamento (resultados não apresentados).

Estes resultados indicam ausência de citotoxicidade. EXEMPLO 3 Avaliação do efeito na regeneração da derme, da combinação de células de Buganvília desdiferenciadas e induzidas encapsulando vim extrato de açafrão e oligómeros de ácido hialurónico com vim peso molecular inferior a 10 kDa 0 teste baseia-se na avaliação do colagénio I marcado por imunofluorescência a fim de avaliar o efeito das células desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão, de um oligómero com um peso molecular inferior a 10 kDa, e da sua associação, na sintese de colagénio I.

Para avaliar os efeitos sobre a sintese de colagénio I, os fibroblastos NHDFs foram semeadas em lâminas de vidro (poços de 0,7 cm2), 24 horas antes do inicio do tratamento com os ingredientes ativos e a sua combinação. Criaram-se cinco lotes:

Lote 1: Controlo não recebendo qualquer produto.

Lote 2: Controlo positivo. Como molécula de referência utilizou-se uma solução de TGF-βΙ a 20 ng/mL permitindo aumentar a sintese de colagénio I nos fibroblastos NHDFs.

Lote 3: Os fibroblastos foram tratados com oligómeros de ácido hialurónico de fórmula (C14H21NO11) n, onde n é um número inteiro inferior a 25, a 0,3%, vendido sob o nome comercial de Signal-10 pela empresa Principium S .A.

Lote 4: os fibroblastos foram tratados com 3% de células vegetais de Buganvília desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão.

Lote 5: Os fibroblastos foram tratados pela associação de 3% de células vegetais de Buganvília desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão e 0,3% de oligómeros de ácido hialurónico de fórmula (C14H21NO11) n, onde n é um número inteiro inferior a 25, vendido sob o nome comercial Signal-10 pela empresa Principium S.A.

Os ingredientes ativos foram solubilizados no meio de cultura que não continha soro e foram postos em contacto com os fibroblastos durante 48 horas. Cada condição foi realizada em triplicado (n=3).

No final dos tratamentos, os fibroblastos foram fixados com formalina sendo depois lavados com PBS. As lâminas foram então armazenadas a 4°C até ao dia da marcação. A imunomarcação do colagénio I por fluorescência foi realizada através da incubação das lâminas com um anticorpo primário específico e um anticorpo secundário conjugado com fluoresceína. Utilizou-se DAPI (4',6'-diamidino-2-fenilindole), uma molécula fluorescente capaz de se ligar ao ADN, para marcar os núcleos. As lâminas foram finalmente montadas com álcool polivinílico (produto vendido sob a marca registada MOWIOL® pela empresa Aldrich) e armazenadas a 4°C. A quantificação foi efetuada com base em réplicas de 3 imagens tiradas utilizando um microscópio Leica® (DM 2000, lente de 40x) e uma câmara Leica® (DFC420C).

O colagénio I marcado por imunofluorescência foi quantificado utilizando o software QWin 3® (Leica), utilizando o pixel como uma unidade de superfície (1 pixel = 1μπΐ2) . Cada imagem consiste de 4 751 460 pixels. A intensidade média da marcação foi determinada para cada imagem. Os núcleos foram contados graças ao programa imageJ a fim de revelar a superfície marcada e a intensidade média da marcação para o número de núcleos presentes em cada imagem. Esta relação, que permite determinar a intensidade da marcação, é comparada com o valor correspondente à condição de controlo, não tratado. Realizou-se um teste estatístico t de Student a fim de comparar o efeito de cada substância ativa ou associação.

Os resultados são apresentados na Tabela 1: TABELA 1

Os valores de 0,001<p<0,01 são considerados muito significativos (*) e os de p<0,001 como muitíssimo significativos (**) (teste t de Student em relação à condição de CTL não tratado)

Estes resultados mostram que o tratamento de fibroblastos NHDFs pela associação de células vegetais de Buganvília desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão e oligómeros de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa, induz um aumento altamente significativo da síntese de colagénio I (+106 % de colagénio I marcado por imunofluorescência em comparação com o controlo). Estes resultados são surpreendentes na medida em que os oligómeros de ácido hialurónico com peso molecular inferior a 10 kDa não têm influência sobre a síntese de colagénio I (a marcação do colagénio I por imunofluorescência diminuiu 11% em comparação com o controlo). Assim, estes resultados demonstram que os oligómeros de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa potenciam os efeitos de células vegetais de Buganvília desdiferenciadas e induzidos encapsulando um extrato de açafrão (aumento de 106% da marcação por imunofluorescência após tratamento com a associação, em comparação com o controle vs um aumento de 75% em comparação com o controlo, após o tratamento com células vegetais de Bougainvillia desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão).

Assim, a associação de células vegetais desdiferenciadas e induzidas de Buganvília encapsulando um extrato de açafrão e oligómeros de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa, tem um efeito superior na síntese de colagénio I. EXEMPLO 4: Creme para os cuidados da pele

Pelas técnicas habituais, preparou-se um creme para os cuidados da pele, com a seguinte composição, em peso: - Gluconato de sódio 0,2 g - Copolímero de 1,65 G hidroxietilacrilato/ acriloildimetil taurato de sódio vendido pela Seppic sob a denominação de Sepinov® EMT10 - Glicerina pura a 99,8% 2,0 g - Hidróxido de sódio 0,25 g - Ácido cítrico 0,3 g monohidratado - Filtros solares 15,5 g - Benzoato de alquilo C12- 11,0 g C15 vendido sob a

denominação de Cetiol® AB pela BASF - Mistura de álcool 3,0 g araquidílico, álcool behenilico e araquidil glicosídeo comercializado sob a designação de Montanov® 202 por Seppic - Dimeticona vendida sob a 2,0 g designação de Abil® 350 por Evonik Industries - Óleo virgem de amêndoas 3,0 g doces - DL α-tocoferol 0,5 g - Hidroxietilureia sob a 3,0 g designação de Hydrovance® pela AkzoNobel - Células de Bougainvillia 1,0 g encapsulando um extrato de açafrão, como preparado no Exemplo 1 - Agente tensor 1,0 g - Extrato hidroglicólico 0,3 g de Açafrão descorado

Vendido por GREENTECH - Células de cacau moldas 0,01 g vendidas sob a designação

de células Ground Cacao por DIANA PLANT - Oligómeros de ácido 0,1 g hialurónico com peso

molecular inferior a 10 kDa, vendidos sob a designação de Sinal-10® por Principium BSI - Conservantes q.b. - Fragrâncias q.b - Água desmineralizada 1 q.s.p. 100,0 g

Este creme antienvelhecimento pode ser utilizado uma ou duas vezes por dia por aplicação nas áreas da pele a tratar.

Exemplo 5: Soro para o cuidado da pele

Utilizando as técnicas habituais, preparou-se um soro de cuidados da pele tendo a composição em peso abaixo indicada. - Gluconato de sódio 0,2 g - Goma xantana vendida sob a denominação - Glicerina pura a 99,8% 1,0 g - Acrilatos/Cio-3o Alquilacrilato crosspolimero vendido sob a designação de PEMULEN®TR-1 por Lubrizol 0,3 g - Mistura de álcoois C14-C20 e de alquilglicósidos em C14-C20 vendido sob a designação de Montanov® L por Seppic 1,5 g - Estearoil glutamato de sódio vendido sob a designação de Eumulgin® SG pela BASF 0,2 g - Triglicéridos dos ácidos cáprico e caprilico vendidos sob a designação de MYRITOL® 318 pela BASF 4,0 g - Óleo virgem de amêndoa doce 3,0 g - DL a-tocoferol 0,5 g - Oligómeros de ácido hialurónico com um peso molecular inferior a 10 kDa, vendido sob a designação de Signal-10® por Principium BSI 0,1 g

- Células de cacau moldas vendidas sob a designação de células Ground Cacao por DIANA PLANT 0,01 g - Hidroxietilureia vendida sob a designação de Hydrovance® pela AkzoNobel 3,0 g - Extrato hidroglicólico de Açafrão descorado

Vendido por GREENTECH 0,3 g - Células de Bougainvillia encapsulando um extrato de açafrão, como preparado no Exemplo 1 1, 0 g - Hidróxido de sódio 0,07 g - Conservantes q.b. - Fragrâncias q.b. q. s . p - Água desmineralizada 100,0 g

Este soro destina-se a refirmar e regenerar a pele e pode ser utilizado uma vou duas vezes por dia. EXEMPLO 6: Emulsão para o cuidado da pele

Pelas técnicas usuais, preparou-se uma emulsão para o cuidado de peles normais ou mistas tendo a composição em peso abaixo indicada. - Gluconato de sódio 0,2 g

Copolimero de hidroxietilacrilato/ acriloildimetil taurato de sódio vendido pela

Seppic sob a denominação de Sepinov® EMT10 1,2 g - Glicerina pura a 99,8% 1,0 g - Hidróxido de sódio 0,3 g - Mistura de álcool araquidílico, álcool behenilico e araquidil glicosideo comercializado sob a designação de Montanov® 202 por Seppic 1,5 g - Estearoil glutamato de sódio vendido sob a designação de Eumulgin® SG pela BASF 0,25 g - Palmitato de Glicol vendido sob a designação de Lanol® P por Seppic 1,0 g - Triglicéridos de ácidos cáprico e caprílico vendidos sob a designação de MYRITOL® 318 pela BASF 3,0 g - Polifenilmetilsiloxano vendido sob a designação de Dow Corning®556 pela Dow

Corning 1,0 g - Óleo virgem de amêndoas doces 2,0 g - Óleo de Limnanthe 2,0 g - DL a-tocoferol 0,7 g - Hidroxietilureia vendida sob a designação de Hydrovance® pela AkzoNobel 3,0 g - Extrato aquoso de pétalas de papoula 0,5 g - Mistura de butilenoglicol, extrato de casca de Enantia Chlorantha e ácido oleanólico vendido sob a designação comercial de Evermat® por Croda 1,0 g - Células de Bougainvillia encapsulando um extrato de açafrão, como preparado no Exemplo 1 1, 0 g

- Células de cacau moldas vendidas sob a designação de células Ground Cacao por DIANA PLANT 0,01 g - Oligómeros de ácido hialurónico com peso molecular inferior a 10 kDa, vendidos sob a designação de Sinal-10® por Principium BSI 0,1 g - Conservantes q.s. - Fragrâncias q.s. q. s .p - Água desmineralizada 100,0 g

Esta emulsão pode ser utilizada uma ou duas vezes por dia por aplicação a áreas da pele a tratar.

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição cosmética compreendendo células vegetais desdiferenciadas e induzidas de Bougainvillia sob a forma de vesículas, as referidas vesículas compreendendo uma membrana vegetal constituída por uma bicamada lipídica que delimita um volume interior que envolve uma fase encapsulada, a referida composição caracterizando-se por compreender ainda, pelo menos, um oligómero de ácido hialurónico de peso molecular inferior a 10 kDa, e em que um extrato de açafrão está presente na fase encapsulada das vesículas.
2. 2. A composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser uma composição cosmética para aplicação tópica.
3. 3. A composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por a quantidade de extrato de açafrão contido na fase encapsulada variar de 0,01 a 5% em peso em relação ao peso total das células de Bougainvillia desdiferenciadas e induzidas.
4. 4. A composição de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracteriza por compreender entre 0,01% e 10% em peso de uma suspensão de células vegetais de Bougainvillia desdiferenciadas e induzidas encapsulando um extrato de açafrão em glicerina, em relação ao peso total da referida composição.
5. 5. A composição de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o ou os oligómero (s) de ácido hialurónico de peso molecular inferior a 10 kDa corresponderem à fórmula (C14H21NO11) n, onde n é um número inteiro menor do que 25, que designa o grau de polimerização.
6. 6. A composição de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada por a concentração de oligómero de ácido hialurónico de peso molecular inferior a 10 kDa variar entre 0,01% e 1% em peso, em relação ao peso total da referida composição.
7. 7. A composição de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender ainda um ou mais ingredientes ativos selecionados de entre os extratos de plâncton, um extrato de maca, um extrato de pétalas papoila, uma combinação de extratos de ancusa, papoila e passiflora, um extrato de sementes de mimosa, um extrato de pétalas de malmequer, extrato de barbatimão, extrato de Kigelia africana e extrato de aveia.
8. 8. A composição de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada por estar sob a forma de um gel, de emulsão bifásica óleo-em-água ou água-em-óleo, de óleo corporal, de máscara, de pomada, de unguento ou de solução concentrada.
9. 9. Método cosmético não terapêutico para o cuidado da pele, caracterizado por consistir na aplicação às regiões da pele em causa de, pelo menos, uma composição cosmética como definida em qualquer das reivindicações 1 a 8.
10. 10. Utilização não terapêutica de uma composição cosmética tal como definida em qualquer das reivindicações 1 a 8 para o cuidado da pele.
11. 11. Utilização não terapêutica de uma composição cosmética tal como definida em qualquer das reivindicações 1 a 8, para melhorar a firmeza da pele e reduzir rugas da pele.