FR2767690A1 - Utilisations d'extraits de la plante rhoeo discolor dans le domaine de la cosmetique et de la pharmacie, notamment de la dermatologie - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des utilisations d'extraits de Rhoeo discolor dans le domaine de la cosmétique et de la pharmacie, notamment de la dermatologie.Elle concerne plus particulièrement dans ces deux domaines les utilisations où l'on cherche à améliorer la différenciation des kératinocytes et/ ou à lutter contre les méfaits des radicaux libres et/ ou à améliorer la synthèse des glycosaminoglycanes.Dans ce cadre, les extraits de Rhoeo discolor sont généralement incorporés dans des compositions destinées en particulier à améliorer l'hydratation de la peau, sa souplesse et sa fermeté, à lutter contre les effets du vieillissement cutané ou à traiter les peaux sèches, ichtyosiques ou psoriasiques.L'invention concerne également les utilisations de ces mêmes extraits pour préparer des milieux de culture de cellules, en particulier de kératinocytes pour accélérer et améliorer leurs différenciations.

Description

L'invention concerne de nouvelles utilisations d'extraits de la plante
Rhoeo discolor dans le domaine de la cosmétique et de la pharmacie, notamment de la dermatologie. Elle concerne également l'utilisation des mêmes extraits pour la préparation de milieux de culture de cellules de peau.

La plante Rhoeo discolor est une plante de la famille des
Commeliaceae connue également sous les noms Rhoeo discolor Hance ou Rhoeo spathacea Stearn ou Tradescantia spathacea.

Cette plante est connue pour être native d'Amérique Centrale et cultivée au Brésil. Elle est également présente en Nouvelle Calédonie.

Des usages traditionnels de cette plante sont mentionnés dans Atlas of medicinal plants of middle America, Julia F. Morton, Charles C. Thomas, éditeur, 1981, pp. 71-72, pour le traitement des saignements de la bouche, pour la toux, les problèmes pulmonaires et les hémorragies utérines. Cette plante est également connue pour permettre la cicatrisation des blessures.

Des usages voisins sont également rapportés dans Chinese medicinal herbs ofHongkong, Hong kong, 1985, pp. 188.

D'après B. Weniger, J. Ethnopharmacol, 1982, 6, 67-84, les extraits de la plante Rhoeo, proposés comme abortifs en Haiti, ne présenteraient aucune activité anti-oestrogénique et auraient un effet stimulant sur l'utérus de rat.

La plante est également citée comme source potentielle d'anthocyanines acylées, en particulier pour la préparation de colorants alimentaires, pharmaceutiques ou cosmétiques dans le brevet US 4,999,423.

Une activité insecticide d'un extrait aqueux de feuilles et de tiges est également citée dans Lloydia, 1950, 13, 89-162).

Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert de façon tout à fait surprenante que des extraits de cette plante présentaient un certain nombre d'activités permettant d'envisager leur utilisation aussi bien dans le domaine de la cosmétique que de la pharmacie, notamment de la dermatologie.

Les activités de ces extraits de plante, mises en évidence par les inventeurs de la présente invention, sont plus particulièrement une activité sur la différenciation des kératinocytes, une activité en tant qu'inhibiteur de radicaux libres ainsi qu'une activité très nette sur la synthèse des glycosaminoglycanes, désignés ci-après par "GAG ".

Ainsi, l'invention résulte de ce qu'on a pu observer que les extraits de
Rhoeo discolor sont particulièrement actifs pour favoriser la différenciation des kératinocytes et peuvent être ainsi utilisés pour traiter les désordres cutanés s accompagnant de dérèglement de la différenciation des kératinocytes. Cette différenciation se traduit en particulier, au niveau de l'épiderme, par une plus grande cohésion cellulaire, par une régulation de la transformation des kératinocytes en cornéocytes par perte du noyau et augmentation de la cornéification cellulaire, par une augmentation du nombre de couches de cornéocytes formant la couche cornée, l'ensemble de ces phénomènes contribuant au renforcement de la fonction protectrice de la peau vis-à-vis du milieu extérieur et au renforcement de la barrière hydrique empêchant la perte excessive d'eau par l'épiderme. Par ailleurs, elle se traduit également au niveau du follicule pileux par une régulation des processus de synthèse des kératines par les kératinocytes, ces protéines étant le constituant principal de la tige pilaire du cheveu dont la qualité est essentielle pour un cheveu en bon état. En outre, les inventeurs ont pu observer que ces extraits permettaient de favoriser, d'accélérer et d'améliorer la différenciation des cellules de peau, en particulier des kératinocytes, lors de leur culture dans un milieu de culture.

Par ailleurs, les inventeurs de la présente invention ont clairement mis en évidence l'activité des extraits de Rhoeo discolor en tant que piégeurs de radicaux libres et ont mis en évidence l'intérêt d'utiliser de tels extraits pour la préparation de produits cosmétiques ou dermatologiques à activité anti-radicalaire, en particulier pour la préparation de produits destinés à lutter contre le vieillissement cutané et les phénomènes oxydatifs conduisant à la production d'espèces radicalaires réactives. En particulier, ces produits permettent de lutter efficacement contre les radicaux toxiques OH.

Les inventeurs ont également mis en évidence que les extraits de la plante Rhoeo discolor présentent un intérêt précieux en cosmétique et en pharmacie notamment en dermatologie du fait de leur propriété de stimulation de la production de GAG par les fibroblastes du derme, notamment du derme humain.

Or, l'homme de l'art sait que les protéoglycanes, constitués pour partie de GAG, sont des macromolécules complexes formées d'une partie protéique sur laquelle sont greffées par des liaisons covalentes des polymères de disaccharides dénommés glycosaminoglycanes (GAG). Ceci est en particulier décrit dans l'ouvrage de E.D. HAY ayant pour titre "Cell Biology of Extracellular Matrix", paru chez Plenum Press, New York en 1991 et dans la publication de J. E.

SILBERT, ayant pour titre "Structure and Metabolism of Proteoglycans and
Glycosaminoglycans", parue dans J. Invest. Dermatol.,1982, 79, pages 31s-37s.

Ainsi, les GAG sont présents au niveau dermique et participent à la composition de la matrice extracellulaire. Ils ont été trouvés liés à certains sites des fibres de collagène, comme décrit par J. E. SCOTT dans Int. J. Biol.

Macromol., 1991, 13, pages 157-161. Ils ont également été identifiés entre les kératinocytes au niveau de l'épiderme comme décrit par J. G. HAGGERTY et al. dans la revue J. Invest. Dermatol., 1992, 99, pages 374-380, 99 pages 374-380.

Des GAG ont été trouvés également dans la matrice extracellulaire de la papille dermique du follicule pileux. Leur quantité varie en fonction du cycle pilaire. Elle atteint un maximum durant la phase anagène correspondant à la croissance du cheveu. En ce qui concerne les protéoglycanes et les GAG des follicules pileux, on pourra se reporter en particulier à la publication de J.R. COUCHMAN citée plus haut, et à celle de M. TAYLOR et al., "Glycosaminoglycan synthesis by cultured human hair follicle dermal papilla cells : comparison with non-follicular dermal fibroblasts", Brit. J. Dermatol. 1992 (May) 126 (5) 479-84. On notera qu'il a été démontré que le minoxidil, substance bien connue présentant une certaine activité sur la croissance et la repousse des cheveux, stimulait la biosynthèse des glycosaminoglycanes (Y. MORI et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1991 (Dec. 26) 642 473-5). Les observations des auteurs précédemment cités, combinées à d'autres preuves cliniques, suggèrent que les glycosaminoglycanes participent à la régulation de la croissance des cheveux.

On sait également que l'unité dîsaccharidîque des GAG est formée d'une hexosamine (D-glucosamine ou D-galactosamine) assez souvent sulfatée alternant avec un acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique). Les chaînes de GAG les plus fréquemment rencontrées au niveau de la peau sont l'acide hyaluronique, les chondroïtines-4 et -6 sulfate, le dermatane sulfate et, en faible quantité, l'héparine et l'héparane sulfate. L'acide hyaluronique, en particulier, est connu comme étant un élément indispensable pour une peau en bonne santé et en bon état. Seul cet acide n'est pas synthétisé en liaison à une protéine centrale.

Les GAG, par leur propriété première de s'associer fortement à des molécules d'eau et de former des gels, assurent l'hydratation du derme et de l'épiderme. Une peau bien hydratée est gage d'une bonne apparence, d'un état physiologique et fonctionnel satisfaisant, avec notamment de bonnes propriétés mécaniques. La diminution des GAG au cours du vieillissement cutané a été montrée par de nombreux auteurs (comme par exemple : SMITH et al. dans J.

Invest. Dermatol., 1962, 39, pages 347-350 ; ou FLEISCHMAJER et ai. dans
Biochim Biophys. Acta, 1972, 279, pages 265-275 ; ou encore par LONGAS et al. dans Carbohydr. Res., 1987, 159, pages 127-136).

La stimulation de la synthèse des GAG permet donc notamment de rendre à une peau présentant une déficience au niveau de ses propriétés mécaniques ou de sa barrière hydrique, telle qu'une peau déshydratée ou âgée, les qualités et les propriétés d'une peau normale et jeune, ou de prévenir ou traiter les troubles de la croissance des cheveux, ou encore de restaurer ou renforcer l'éclat et la souplesse d'une chevelure.

La présente invention a pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une nouvelle formulation de compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques, ayant la propriété de favoriser la différenciation des kératinocytes et destinée en particulier à traiter les désordres cutanés s'accompagnant d'une insuffisance ou d'un dérèglement de la différenciation des kératinocytes, tel que le psoriasis, à restaurer, préserver et/ou renforcer la fonction protectrice de la peau, notamment la fonction de barrière hydrique, conduisant ainsi à un effet hydratant, en particulier en empêchant la perte excessive d'eau par l'épiderme. Une application avantageuse de ce dernier phénomène est le traitement des peaux ichtyosiques, ainsi que le traitement des peaux psoriasiques. Ces compositions permettent également d'améliorer la qualité des cheveux, embellissant ainsi l'aspect de la chevelure.

La présente invention a encore pour autre but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solution permettant de favoriser, d'accélérer et d'améliorer la différenciation de cellules de peau, notamment de kératinocytes, en culture.

La présente invention a également pour autre but principal de fournir des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dennatologiques, présentant une activité antiradicalaire.

L'invention a également pour autre but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture de compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques, permettant de stimuler la synthèse des GAG. De ce fait, l'invention concerne également l'utilisation des extraits de Rhoeo discolor pour préparer des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques, permettant de stimuler la synthèse des GAG. Ces compositions permettent d'améliorer la fermeté et la souplesse de la peau, de lutter contre la formation des rides ou d'en atténuer la profondeur ou d'obtenir un lissage de la surface de la peau grâce, en particulier, à un effet tenseur physiologique ou pour améliorer l'hydratation de la peau.

La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solution permettant de traiter des cellules, en particulier des fibroblastes, en culture, pour obtenir une stimulation de la synthèse des GAG.

Plus précisément, selon l'une de ses caractéristiques essentielles, I'invention concerne l'utilisation d'un extrait de la plante Rhoeo discolor comme principe actif d'une composition cosmétique.

Selon une variante avantageuse de ce premier aspect, I'extrait de la plante Rhoeo discolor est utilisé comme agent cosmétique destiné à hydrater ou à améliorer l'hydratation de la peau, à lutter contre les effets du vieillissement de la peau, à prévenir ou traiter les rides, à améliorer la fermeté et la souplesse de la peau.

Les inventeurs de la présente invention ont pu relier ces différentes activités à l'activité des extraits de la plante Rhoeo discolor sur la différenciation des kératinocytes, le piégeage des radicaux libres ainsi que sur la synthèse des
GAG.

Plus précisément, les compositions cosmétiques de l'invention permettent d'améliorer la différenciation des kératinocytes, ce qui contribue à renforcer la barrière cutanée au niveau de la couche cornée, permettant ainsi de diminuer la perte en eau de la peau, de conserver son hydratation, d'améliorer son aspect et son éclat, de renforcer la barrière cutanée vis-à-vis de la pénétration d'agents extérieurs irritants ou toxiques, de protéger la peau et, plus généralement,
I'organisme.

L'activité anti-radicalaire des compositions selon l'invention se manifeste par l'efficacité de ces compositions dans la lutte contre le vieillissement de la peau.

L'effet des compositions cosmétiques de l'invention pour stimuler la synthèse des GAG se traduit par l'effet de ces compositions pour améliorer l'hydratation du derme et de l'épiderme, lutter contre la formation des rides ou en atténuer la profondeur, et améliorer la fermeté et la souplesse de la peau. Ce dernier effet permet d'obtenir un lissage de la surface de la peau grâce à un effet tenseur physiologique.

Selon un autre de ses aspects, I'invention concerne également les utilisations d'extraits de la plante Rhoeo discolor pour préparer des compositions à usage pharmaceutique, notamment dermatologique.

Ainsi selon une autre de ses caractéristiques essentielles, l'invention concerne l'utilisation d'un extrait de la plante Rhoeo discolor, pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment dermatologique, destinée:
- a la prévention ou au traitement des désordres liés à un dysfonctionnement de la différenciation des kératinocytes, afin de lutter notamment contre une desquamation irrégulière ou exagérée, de traiter les peaux sèches ichtyosiques ou psoriasiques, ou d'améliorer la fonction protectrice de l'épiderme, ou de traiter toutes les insuffisances de la fonction barrière de l'épiderme,
- et/ou au traitement ou à la prévention des effets du vieillissement sur la peau, en particulier du vieillissement lié aux effets néfastes des radicaux libres,
- et/ou au traitement des sujets souffrant d'une insuffisance de la synthèse des GAG, pour corriger les effets négatifs de ladite insuffisance, en particulier pour améliorer la fermeté et la souplesse cutanée, pour lutter contre la formation des rides ou pour en atténuer la profondeur.

Ainsi donc, les compositions pharmaceutiques, notamment dermatologiques de l'invention, s'avèrent particulièrement intéressantes du fait que, par leurs effets sur la différenciation des kératinocytes, les compositions pharmaceutiques, notamment dermatologiques de l'invention, permettent d'améliorer l'effet de barrière de la peau et par conséquent de limiter les pertes en eau mais également cette activité permet de lutter contre les phénomènes desquamation irrégulière ou exagérée. L'invention permet donc de fournir des compositions qui permettent de restaurer l'état physiologique normal de la peau.

L'effet des compositions pharmaceutiques, notamment dermatologiques de l'invention sur les radicaux libres, permet d'apporter une solution à tous les phénomènes de vieillissement de la peau, notamment aux phénomènes oxydatifs.

L'effet des compositions pharmaceutiques, notamment dermatologiques, de l'invention sur la synthèse des GAG s'avère particulièrment intéressant dans tous les traitements de la peau où l'on cherche à obtenir en particulier un lissage de la surface de la peau, en particulier grâce à un effet tenseur ou à améliorer l'hydratation de la peau.

Pour ces deux aspects aussi bien cosmétique que pharmaceutique, notamment dermatologique, on pourra utiliser des extraits de la plante entière.

On utilisera également avantageusement des extraits des feuilles de la plante.

Selon un mode avantageux de réalisation, I'extrait de la plante Rhoeo discolor est un extrait obtenu par extraction au moyen d'un solvant ou d'un mélange de solvants dont le paramètre de polarité p' est compris entre 4 et 8. Pour la définition de ce paramètre de polarité p' on se reportera à la publication dans
Practical High Performance Liquid Chromatography (Véronika R. Meyer)
Université de Berne, traduit de l'édition originale allemande par Valérie Cottrell, 1988, John Wiley and Sonc éditeur.

L'extrait sera avantageusement obtenu par macération de la plante ou partie de plante dans un solvant ou un mélange de solvants tel que défini cidessus, suivie d'une filtration et, au besoin, d'une évaporation dudit solvant ou mélange de solvants.

A titre d'exemple de solvants ou mélange de solvants particulièrement avantageux pour préparer les extraits utiles selon l'invention, on citera
- les alcools en C1 à C4, en particulier l'éthanol, le méthanol,
I'isopropanol ou les mélanges hydroalcooliques de ces alcools,
- les esters, en particulier l'acétate d'éthyle ou l'acétate d'isopropylique,
- les cétones en C2 à C6, en particulier l'acétone ou
- les glycols en C2 à C6, en particulier l'éthylèneglycol,
- et les mélanges des solvants précités.

Diverses formes de compositions peuvent être réalisées. Les formes préférées sont les formes topiques adaptées pour être appliquées sur le tissu cutané, incluant la peau et les muqueuses. Les formulations topiques appropriées incluent, sans limitation, des émulsions, des crèmes, des laits, des baumes, des gels, des lotions, des ovules ainsi que des compositions de maquillage traitantes, ces différents types de formulations étant bien connus de l'homme de l'art.

Les compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques, de l'invention contiennent avantageusement des concentrations d'extraits de la plante Rhoeo discolor comprises entre 0,001 et 5 % en poids, de préférence entre 0,01 et 2 % exprimées en extrait sec par rapport au poids de ladite composition.

Selon une variante particulièrement avantageuse, les deux aspects de l'invention cosmétique ou pharmaceutique, les compositions contiennent également au moins un produit choisi dans la famille constituée par:
- les acides aminés, en particulier la lysine, la proline, la thréonine, la sérine, l'arginine et leurs dérivés,
- les agents kératolytiques, en particulier les acides hydroxylés en alpha tels que l'acide lactique, I'acide malique, I'acide glycolique, I'acide citrique,
I'acide tartrique, l'acide salicylique, et les extraits naturels en contenant,
- les agents hydratants tels que le glycérol, le lactate de glycérol, l'urée, la tréhalose, le dextran,
- les vitamines, en particulier les vitamines A, B, C, D, E et F et leurs dérivés en particulier leurs esters ou leurs phosphates,
- les céramides, en particulier les céramides d'origine végétale ou synthétique,
- les effecteurs de la synthèse naturelle des céramides,
- les oligomères procyanidoliques ainsi que les tannins catéchiques et galliques et leurs dérivés, en particulier leurs esters,
- les substances connues pour stimuler la synthèse du collagène, en particulier les triterpènes et leurs dérivés, en particulier les dérivés glycosylés de l'acide asiatique ou madécassique, tel que l'asiaticoside, le madécassoside, et leurs esters ou les extraits de Centella asiatica,
- les extraits d'algues, en particulier de micro-algues telles que Euglena ou Chlorella,
- les agents à action antiradicalaire tels que les curcuminoïdes, les dérivés de la vitamine E et de la vitamine C, I'acide nordihydrogariarétique.

Enfin, selon un dernier aspect, la présente invention concerne également un milieu de culture de cellules ou de tissus, notamment pour la culture de cellules de peau, en particulier de kératinocytes, permettant de favoriser, d'accélérer et d'améliorer leur différenciation, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'un extrait de la plante Rhoeo discolor, pour obtenir une telle différenciation.

Ce milieu de culture comprend avantageusement de 0,0001 à 1 % en poids d'extrait de Rhoeo discolor par rapport au poids total dudit milieu de culture.

L'invention concerne également un procédé de culture en masse de cellules de peau, en particulier de kératinocytes et/ou de fibroblastes, pour la production de peau artificielle ou pour la préparation de modèles de peau reconstituée.

Ce procédé permet de favoriser, d'accélérer ou d'améliorer la différenciation des cellules de peau, en particulier des kératinocytes et/ou de stimuler la synthèse des GAG, en particulier à partir des fibroblastes, notamment dans le cadre d'une culture en masse de cellules de peau et permet ainsi la production de peau artificielle ou la préparation de modèles de peau reconstituée, comprenant un derme et un épiderme.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent clairement à l'homme du métier, également à partir de la description explicative qui va suivre en référence à plusieurs exemples de réalisation donnés à titre d'illustration de l'invention. Dans ces exemples, sauf indications contraires, les pourcentages sont donnés en poids.

EXEMPLES
Exemple 1
Préparation d'un extrait méthanolique de la plante entière
On met en contact après broyage pendant 24 h, 1 kg de la plante entière avec 10 1 de méthanol à froid. On réalise ensuite l'extraction pendant 30 min au reflux. On filtre ensuite sur papier, puis on évapore le solvant. On obtient un extrait sec dénommé MD 44/94.

Suivant une variante de ce procédé, le broyat de la plante, préalablement à sa macération dans le méthanol, est traité par de l'hexane, selon une méthode bien connue de l'homme de l'art, pour le dégraisser.

Un deuxième essai d'extraction méthanolique, selon le procédé décrit au premier paragraphe ci-dessus, est réalisé avec un autre lot de la plante entière broyée. On obtient un extrait sec dénommé MD 82/95.

Exemple 2
Préparation d'un extrait hvdroglvcolique de Rhoeo discolor
On prépare un extrait par un mélange hydroglycolique de 1,3butylèneglycol et d'eau dans le rapport 1/1 en utilisant un rapport en poids de 1/20 de la plante par rapport au solvant. Cet extrait est préparé par chauffage à chaud pendant 20 min à 80"C du mélange.

On récupère un extrait de couleur jaune. Cet extrait présente l'avantage d'être incorporable aisément dans des formulations cosmétiques.

Exemple 3
Mise en évidence de l'effet d'un extrait de Rhoeo discolor sur la différenciation des kératinocvtes
Pour la présente étude, on utilise un prélèvement de peau effectué lors d'une opération de plastie mammaire d'une femme de vingt deux ans. Le protocole suivi est voisin de celui décrit par Detmar et al., dans la publication Eur. J.

Dermatol. 1994 4 558-562.

Au jour J = -2, on ensemence 12 puits d'une plaque de culture multipuits avec 300 000 cellules par puits de kératinocytes isolés à partir de ce prélèvement dans un milieu de culture classique pour la culture des kératinocytes, bien connu de l'homme de l'art. Avantageusement, ce milieu de culture peut être constitué par un milieu M199 additionné de 2 mM de L-glutamine, de 10% de sérum de veau foetal, de toxine cholérique, d'hydrocortisone, ainsi que du facteur de croissance épidermique EGF.

Aux jours J=1, J=5, J = 8 et J=11, le milieu de culture est renouvelé par un milieu identique dans 6 des 12 puits qui constituent des puits témoins non traités, et, dans les 6 puits restants constituant les puits traités, on renouvelle avec un milieu identique, mais dans lequel on a dissous 2,5 ug/ml d'extrait de Rhoeo discolor tel qu'obtenu à l'exemple 1, et sur lesquels on a réalisé préalablement une filtration stérilisante sur filtre à 0,22 pm.

Au jour J = 12, on réalise une numération cellulaire ainsi qu'une inclusion des cellules en résine époxy après fixation des structures cellulaires au glutaraldéhyde et tétroxyde d'osmium.

On réalise des coupes de chacun des blocs de résine ainsi obtenus sous forme de coupes ultrafines, par exemple à l'aide d'un dispositif connu sous le nom de microtome.

On observe ensuite au microscope électronique à transmission les coupes des six cultures témoin, d'une part, et les coupes des six cultures traitées par l'extrait de Rhoeo discolor, d'autre part.

Les mêmes essais sont réalisés en utilisant une solution d'extrait de la plante Rhoeo discolor à la concentration de 10 tlg/ml à la place de la solution à 2,5 llg/ml.

On a pu observer que les cellules traitées avec l'extrait de Rhoeo discolor selon l'invention, obtenu à l'exemple 1, présentent une différenciation cellulaire nettement supérieure au témoin.

Dans le cas du traitement avec 2,5,uUml, on observe une épaisseur totale et un nombre plus important de couches de cellules. L'homogénéité d'épaisseur des cellules en cours de différenciation montre une bonne stratification.

Les couches supérieures présentent une bonne cornéification des kératinocytes, alors qu'il est connu que le stade final de la différenciation n'est jamais complètement atteint dans le cas de cultures immergées.

On retrouve les caractéristiques essentielles d'une bonne différenciation:
- aplatissement des cellules supérieures
- épaississement de l'enveloppe cornée (couches supérieures)
- présence de desmosomes
- présence de grains de kératohyaline (couches moyenne)
- présence de filaments de kératine orientés
- existence de l'exocytose lipidique.

Ainsi, les cultures de kératinocytes humains normaux cultivés en présence d'un extrait de Rhoeo discolor à la dose de 2,5 à 10 Fg/l présentent une amélioration très nette de leur différenciation.

Exemple 4
Mise en évidence de l'effet inhibiteur des radicaux libres d'un extrait de Rhoeo discolor a) Principe du test
Une micro-émulsion est préparée en dissolvant de l'acide linoléique dans un détergent zwittérionique, le CHAPS (Sigma), et en additionnant progressivement un tampon phosphate 0,06 M, pH 7,4.

La micro-émulsion d'acide linoléique préparée comme décrit ci-dessus (avec ou sans produit à tester) est exposée au rayonnement y d'une source de 2Ci de 137 Cs pendant 18 h (soit dans les conditions de l'essai, 20.000 rads). Les radicaux libres OH0 sont alors formés par radiolyse de l'eau.

Ensuite, la décomposition de l'acide linoléique par les radicaux OH0 conduit à la formation de pentane qui s'échappe dans l'atmosphère d'un flacon scellé. Le pentane libéré peut alors être dosé par chromatographie en phase gazeuse.

Ainsi, il est possible de déterminer en comparaison avec les essais réalisés avec la micro-émulsion témoin, le taux d'inhibition de la formation des radicaux libres due à la présence des extraits de la plante Rhoeo discolor. b) Résultats
Les résultats figurent au tableau I ci-dessous pour différentes concentrations en extraits, obtenus selon l'exemple 1, dans les micro-émulsions testées.

TABLEAU I

<tb> CONCENTRA- <SEP> % <SEP> INHIBITION <SEP> (/ <SEP> TEMOIN) <SEP>
<tb> EN <SEP> EXTRAITS
<tb> <SEP> 500 <SEP> ml <SEP> 62,7
<tb> <SEP> 250 <SEP> g/ml <SEP> 51,7
<tb> <SEP> 125 <SEP> g/ml <SEP> 45,7
<tb> <SEP> 62,5 <SEP> *g/ml <SEP> 44,0
<tb>
Ainsi, ces résultats montrent clairement l'action inhibitrice des extraits selon l'invention sur la formation des radicaux libres, en particulier des radicaux OH". Sachant que l'acide linoléique est présent dans la couche cornée de l'épiderme, ainsi que dans les membranes cellulaires, la présente invention s'avère particulièrement intéressante pour protéger de l'action néfaste des radicaux libres, en particulier des radicaux OH", les différents éléments biologiques exposés, notamment le ciment lipidique cutané et les membranes cellulaires. La mise en oeuvre de l'invention assure ainsi l'intégrité et la fonctionnalité de ces éléments.

ExemPle 5
Mise en évidence de l'effet d'un extrait de Rhoeo discolor sur la stimulation de la synthèse des GAG a) Principe du test
Sur cellules humaines, on étudie l'incorporation de glucosamine radiomarquée dans la formation et la sécrétion de GAG, avec et sans produit objet de l'invention.

On part de cultures de fibroblastes de derme humain que l'on incube avec de la 3H-glucosamine avec ou sans le produit à tester. Puis, sur les surnageants, on sépare par hydrolyse, au moyen de la pronase, la partie protéique des protéoglycannes formés. On précipite les GAG formés et secrétés (ayant incorporé plus ou moins la glucosamine radiomarquée) par du chlorure de cétylpyridinium (CPC). On procède ensuite au comptage de la radioactivité des cultures traitées et témoin, cette radioactivité étant proportionnelle à la quantité des GAG synthétisés.

Afin de contrôler la réponse des cellules utilisées, on a testé en parallèle sur ces cellules du PDGF à 25 ng/ml final. Le PDGF (Platelet Derived
Growth Factor), facteur de croissance dérivé des plaquettes sanguines, (PDGF
BB, Sigma, réf. 4306) est un agent connu pour stimuler la synthèse des GAG par les fibroblastes cutanés. b) Protocole du test
Les cultures de fibroblastes humains normaux (FHN) sont initiées en trois semaines à partir d'explants de peau saine obtenue en chirurgie plastique. Les cellules sont cultivées en présence de milieu E199, complémenté en L-glutamine 2mM (noté E199c) et contenant 10 % v/v de sérum de veau foetal (SVF, Gibco).

Les boites de culture sont placées dans un incubateu de 3H-glucosamine (réf. TRK 398 Amersham). On laisse incuber 48 h à 37"C.

Puis, on prélève les surnageants, on les regroupe par 2 et on les transfère dans des tubes Eppendorf à vis. Dans chacun des tubes, on ajoute 200 pl d'une solution à 0,2 mg/ml de pronase (Sigma P5147) dans une solution tampon de PBS contenant 0,02 % d'azoture de sodium. On laisse agir une nuit à 370C. La pronase est alors inactivée en plongeant les tubes 5 min dans de l'eau bouillante.

Après refroidissement à température ambiante, on coprécipite les
GAG radiomarqués avec une solution aqueuse d'un mélange d'acide hyaluronique, de dermatan sulfate, de chondroitine sulfate 1/1/1, 8 mg/ml par 40 ,ul d'une solution à 100 mg/ml de CPC (Sigma C 9002). On agite et on laisse incuber 30 min à température ambiante. On centrifuge le précipité, on aspire le surnageant et on récupère le culot avec 400 ul d'une solution de CPC à 10 mg/ml. On agite 5 min et on reprend le culot dans 500 u1 de méthanol. On agite et on transfère dans des fioles à scintillation puis on ajoute 10 ml de liquide scintillant et on compte la radioactivité.

Parallèlement, la cytotoxicité du produit à tester est évaluée par un test au XTT (sel de tétrazolium) tel que décrit par Roehm N.W. et al. dans Journal of
Immunological Methods 1991, 142, 257-265. Ce test mesure la viabilité cellulaire. c- ExPression des résultats et test statistique
L'activité A du produit est exprimée en % selon la formule suivante
A = (GAG synthétisés par les FHN traités - GAG synthétisés par les FHN témoins) x 100
GAG synthétisés par les FHN témoin
Les quantités de GAG synthétisées sont exprimées en cpm par rapport à la quantité de protéines cellulaires exprimées en llg.

Les résultats obtenus sur les FHN traités (n=6) et témoins (n=6) sont comparés par le test t de Student non apparié. p=0,05 est fixé comme seuil de significativité. Les essais significatifs (p Z 0,05) sont notés S, ceux non significatifs NS. d-Résultats
d- 1) Cytotoxicité
Le test XTT cité ci-dessus a permis de démontrer que les extraits selon l'invention, testés aux concentrations de 1,7 à 17,4 llg/ml, ne sont pas cytoxiques.
d-2) Première expérience
Cette étude est réalisée sur la souche de fibroblastes FHN679 (femme, 68 ans, lifting), à la deuxième sous-culture P2.

Les tableaux 2 et 3 donnent les résultants obtenus avec l'extrait de l'exemple 2 d'une part et avec le PDGF comme témoin positif d'autre part.

TABLEAU 2

<tb> <SEP> [MD82/95] <SEP> GAG <SEP> encpm/ g <SEP> protéines/48 <SEP> Activité <SEP> Significativite
<tb> <SEP> h <SEP> p
<tb> <SEP> Témoin <SEP> DMSO <SEP> 0,1% <SEP> 880 <SEP> # <SEP> 55
<tb> v/v
<tb> <SEP> 1,7 <SEP> g/ml <SEP> 1 <SEP> 085 <SEP> # <SEP> 76 <SEP> +23 <SEP> % <SEP> S
<tb> <SEP> p <SEP> = <SEP> 0,0004
<tb> <SEP> 6,9 <SEP> Zg/ml <SEP> 1 <SEP> 222 <SEP> + <SEP> 87 <SEP> +39 <SEP> % <SEP> S
<tb> <SEP> p <SEP> = <SEP> 0,0000
<tb> <SEP> 17,4 <SEP> g/ml <SEP> 1 <SEP> 347#114 <SEP> +53 <SEP> % <SEP> S <SEP>
<tb> <SEP> p <SEP> = <SEP> 0,0000
<tb>
TABLEAU 3

<tb> [PDGF] <SEP> GAG <SEP> en <SEP> cmp/g <SEP> protéines/48 <SEP> Activité <SEP> Significativité
<tb> <SEP> h
<tb> Témoin <SEP> 943 <SEP> + <SEP> 85
<tb> 25 <SEP> ng/ml <SEP> 1 <SEP> 876#196 <SEP> <SEP> +99 <SEP> % <SEP> S
<tb> <SEP> p <SEP> = <SEP> 0,0015
<tb>
d- 3) Deuxième expérience
Cette expérience a éé réalisée pour confirmer l'effet stimulant du
MD82/95 sur la synthèse des GAG. Comme dans la 1ère expérience, la souche
FHN679 a été utilisée (femme, 68 ans, lifting) mais à la 3ème sous-culture (P3).

Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4. Ceux obtenus avec le
PDGF figurent dans le tableau 5.

TABLEAU 4

<tb> <SEP> [MD82/95] <SEP> GAG <SEP> en <SEP> cpm/g <SEP> Activité <SEP> Significativité
<tb> <SEP> protéines/48 <SEP> h
<tb> Témoin <SEP> DMSO <SEP> 0,1% <SEP> 692+46 <SEP>
<tb> <SEP> v/v
<tb> <SEP> 1,7 <SEP> lg/ml <SEP> 806#64 <SEP> <SEP> +16 <SEP> % <SEP> S
<tb> <SEP> p <SEP> = <SEP> 0,0064
<tb> <SEP> 6,9 <SEP> g/ml <SEP> 923 <SEP> + <SEP> 98 <SEP> +33 <SEP> % <SEP> S
<tb> <SEP> p <SEP> = <SEP> 0,0011
<tb> <SEP> 17,4 <SEP> g/ml <SEP> 986#61 <SEP> <SEP> +42 <SEP> % <SEP> S
<tb> <SEP> p <SEP> = <SEP> 0,0000
<tb>
TABLEAU 5

<tb> [PDGF] <SEP> GAG <SEP> en <SEP> cmp/g <SEP> protéines/48 <SEP> h <SEP> Activité <SEP> Significavité
<tb> Témoin <SEP> 692 <SEP> # <SEP> <SEP> 46
<tb> 25 <SEP> ng/ml <SEP> 1 <SEP> 545 <SEP> i <SEP> 44 <SEP> +123 <SEP> % <SEP> S
<tb> <SEP> p <SEP> = <SEP> 0,0000
<tb>
d-4) Conclusion
Le témoin positif de référence, le PDGF (à 25 ng/ml), stimule de manière significative la synthèse des GAG, dans les deux expériences (+99 % et +123 % respectivement).

Le MD82/95 stimule significativement, dans les deux expériences réalisées, la synthèse des GAG et ce dès 1,7 g/ml (+23 % et +16 %), le maximum d'effet étant obtenu à 17,3 g/ml (+53 % et +42 %), cette concentration ne présentant par ailleurs aucune cytotoxicité.

En conséquence, I'extrait méthanolique de Rhoeo discolor testé est un activateur de la synthèse des glycosaminoglycanes par des fibroblastes humains normaux de derme, en particulier dans la gamme de concentration de 1,7 à 17,4 ,ug/ml avec un effet stimulant maximal observé à la concentration de 17,4 ssg/ml.
ll apparaît donc que les extraits de Rhoeo discolor, incorporés dans les compositions selon l'invention appliquées sur la peau, auront pour effet de stimuler la synthèse des GAG et ainsi de contribuer à la formation d'une matrice extracellulaire dermique optimale. La peau sera alors réhydratée, raffermie, et les cellules communiqueront mieux entre elles.

Exemple 6
Crème hvdratante
Extrait butylèneglycol de Rhoeo discolor selon l'exemple 2: . . . .... 2 g
Palmitate de vitamine A: .... 0,05 g
Glycérol ....3g
Acide lactique: . ........... .... 3 g
Céramides végétaux: . . 0,2 g
Excipient parfumé .................................... qsp 100 g
Cette crème hydrate la peau, affine le grain et illumine le teint dès le 3ème jour d'applications.

Exemple 7
Crème raffermissante anti-âge
Extrait méthanolique de Rhoeo discolor MD 82/95 selon l'exemple 1: .. . . ......0,2 g
Phosphate d'ascorbyle, sel de Mg .... 2 g
Acide malique .. .... 3 g Extrait de Centella asiatica . ... 0,5 g
Excipient ... .... qsp 100 g
En application sur le visage, cette crème raffermit la peau et élimine rides et ridules.

Exemple 8
Fond de teint traitant
Extrait méthanolique de Rhoeo discolor MD 44/94 selon l'exemple 1... . . . .... 0,1 g
Acétate de vitamine E... .... 0,1 g
Extrait de curcuma longa.... 0,2 g Particules de nylon. . . 2 g
Excipient fluide avec pigments... . .. qsp 100 g
Ce fond de teint permet de lutter contre les signes du vieillissement tout en renforçant l'éclat de la peau.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'un extrait de la plante Rhoeo discolor, comme principe actif d'une composition cosmétique.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit extrait est utilisé comme agent cosmétique destiné à hydrater ou améliorer l'hydratation de la peau, à lutter contre les effets du vieillissement de la peau, à prévenir ou traiter les rides, à améliorer la fermeté et la souplesse de la peau.

3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit extrait est utilisé comme agent cosmétique destiné à:

- améliorer la différenciation des kératinocytes, ce qui contribue à renforcer la barrière cutanée au niveau de la couche cornée permettant ainsi de diminuer la perte en eau de la peau, de conserver son hydratation, d'améliorer son aspect et son éclat, de renforcer la barrière cutanée vis-à-vis de la pénétration d'agents extérieurs irritants ou toxiques, de protéger la peau et, plus généralement,

I'organisme,

- et/ou à lutter contre les méfaits des radicaux libres, permettant ainsi de lutter contre le vieillissement de la peau,

-et/ou à améliorer la synthèse des glycoaminoglycanes (GAG), permettant ainsi d'améliorer l'hydratation du derme et de l'épiderme, de lutter contre la formation des rides ou d'en atténuer la profondeur, d'améliorer la fermeté et la souplesse de la peau et d'obtenir un lissage de la peau grâce à un effet tenseur physiologique.

4. Utilisation d'un extrait de la plante Rhoeo discolor, pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment dermatologique, destinée

- a la prévention ou au traitement des désordres liés à un dysfonctionnement de la différenciation des kératinocytes, afin de lutter notamment contre une desquamation irrégulière ou exagérée, de traiter les peaux sèches, ichtyosiques ou psoriasiques, d'améliorer la fonction protectrice de l'épiderme, ou de traiter les insuffisances de la fonction barrière de l'épiderme,

- et/ou au traitement ou à la prévention des effets du vieillissement sur la peau, en particulier du vieillissement lié aux effets néfastes des radicaux libres,

-et/ou au traitement des sujets souffrant d'une insuffisance de la synthèse des glycosaminoglycanes (GAG), pour corriger les effets négatifs de ladite insuffisance, en particulier pour améliorer la fermeté et la souplesse cutanée, pour lutter contre la formation des rides ou pour en atténuer la profondeur.

5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit extrait est un extrait de la plante entière.

6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit extrait est un extrait de feuilles de ladite plante.

7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu par macération de la plante ou partie de plante dans un solvant ou un mélange de solvants dont le paramètre p' de polarité est compris entre 4 et 8, suivie d'une filtration et, au besoin, d'une évaporation dudit solvant ou mélange de solvants.

8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit solvant ou mélange de solvants est choisi dans le groupe constitué par:

- les alcools en C1 à C4, en particulier l'éthanol, le méthanol,

I'isopropanol ou les mélanges hydroalcooliques de ces alcools,

- les esters, en particulier l'acétate d'éthyle ou l'acétate d'isopropylique,

- les cétones en C2 à C6, en particulier l'acétone ou

- les glycols en C2 à C6, en particulier l'éthylèneglycol,

- et les mélanges des solvants précités.

9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit extrait est présent dans la composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, à des concentrations exprimées en extrait sec par rapport au poids de ladite composition.comprise entre 0,001 et 5 % en poids, et de préférence entre 0,01 et 2 %.

10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, comprend en outre au moins un produit choisi dans la famille constituée par

- les acides aminés, en particulier la lysine, la proline, la thréonine, la sérine, l'arginine et leurs dérivés,

- les agents kératolytiques, en particulier les acides hydroxylés en alpha tels que l'acide lactique, I'acide malique, I'acide glycolique, I'acide citrique,

I'acide tartrique, l'acide salicylique et les extraits naturels en contenant,

- les agents hydratants tels que le glycérol, le lactate de glycérol, l'urée, la tréhalose, le dextran,

- les vitamines, en particulier les vitamines A, B, C, D, E et F et leurs dérivés en particulier leurs esters ou leurs phosphates,

- les céramides, en particulier les céramides d'origine végétale ou synthétique,

- les effecteurs de la synthèse naturelle des céramides,

- les oligomères procyanidoliques ainsi que les tannins catéchiques et galliques et leurs dérivés, en particulier leurs esters,

- les substances connues pour stimuler la synthèse du collagène, en particulier les triterpènes et leurs dérivés, en particulier les dérivés glycosylés de l'acide asiatique ou madécassique, tel que l'asiaticoside, le madécassoside, et leurs esters ou les extraits de Centella asiatica,

- les extraits d'algues, en particulier de micro-algues telles que Euglena ou Chlorella,

- les agents à action antiradicalaire tels que les curcuminoïdes, les dérivés de la vitamine E et de la vitamine C, I'acide nordihydrogariarétique.

11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, est formulée pour une application topique.