CN102302424B - 抗皱剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供含有西洋菜以及款冬的提取物中的至少任意一种作为有效成分的组合物用于制备细胞外基质生成促进剂、细胞外基质生成促进剂、皮肤松弛和皮肤弹力改善剂的用途。

Description

抗皱剂

本申请是申请日为2006年4月12日，申请号为200680011784.1，发明名称为“抗皱剂”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种新型的抗皱剂。更详细地说，本发明涉及以西洋菜，杜松，白术和/或款冬来源的提取物作为有效成分的抗皱剂。另外，本发明还涉及以上述提取物作为有效成分的基底膜稳定剂、细胞外基质生成促进剂以及皮肤松弛和皮肤弹力改善剂，以及使用上述提取物的人工皮肤制造方法，减轻皱纹的方法，皮肤松弛和皮肤弹力改善的方法。

背景技术

覆盖包括人在内的各种动物全身的皮肤，承受着如下的变化：由于日光、干燥、氧化、环境因素所致的压力和精神压力等的外部因子、以及老化导致皱纹形成、硬化、色斑、晦暗、弹性降低等。这里，对皮肤进行大致划分的话，可分为表皮和真皮两层结构。在表皮与真皮之间有一种称为基底膜的薄薄的纤细膜层存在。表皮的代谢是通过这层基底膜，获取真皮细胞产生的因子或血液供给的。皮肤中表皮的增殖与分化是通过基底膜和真皮进行调节的。因此，借助于基底膜的表皮与真皮间的交流，对皮肤表皮的功能调节来说，起着至关重要的作用。

皮肤基底膜中存在有一种称为锚着复合体的特殊结构，具有稳定表皮和真皮两种组织间的粘连和交流的重要作用。锚着纤维复合体的蛋白质可以将作为角质形成细胞的细胞骨骼的角蛋白与真皮乳头层结缔组织的蛋白质这两者相互联结起来。锚着纤维复合体的重要构成成分之一就是层粘连蛋白-5(Rousselle et al.，J Cell Biol.1991 Aug；114(3)：567-76)。迄今为止的研究揭示了造成所谓Herlitz交界型大疱性表皮松解症这样的重度水疱病的先天性遗传疾病的原因是由于编码层粘连蛋白-5三条肽链的基因的遗传学变异。(Aberdam et al.，Nat Genet.1994 Mar；6(3)：299-304)。这表明层粘连蛋白-5是表皮粘连所不可或缺的物质。而且已知该粘连蛋白-5会形成锚丝(anchoring filament)，进而与已知作为层粘连蛋白-5受体的整联蛋白α6β4(半桥粒中存在的跨膜型整联蛋白)发生结合(Niessen et al.，Exp Cell Res.1994 Apr；211(2)：360-7)。

有报道指出，层粘连蛋白-5不仅直接结合形成连接真皮乳头层锚着纤维的VII型胶原蛋白，而且还同其它的层粘连蛋白-6或-7一起形成复合体，该复合体通过巢蛋白与基底膜骨架IV型胶原蛋白结合。

有报告指出，观察到构成上述复合体的IV型胶原蛋白的表达水平会随着年龄老化而降低(Vazquez F et al.，Maturitas 1996，25：209-215)，关于层粘连蛋白-5结合的VII型胶原蛋白，来源于高龄者的皮肤成纤维细胞比来源于年轻人的皮肤成纤维细胞，其蛋白质水平以及mRNA水平的生成能力都有下降(Chen et al.，J.Invest.Dermatol.，102：205-209，1994)。也有报道指出，由VII型胶原蛋白构成的锚着纤维在正常皮肤中也会伴随着生理老化和光老化而减少(辻卓夫，日皮会誌 105：963-975，1995，Tidman et al.，J.Invest Dermatol.，83：448-453，1984)。除了它们的种种的构成成分特征之外，已知基底膜本身伴随着皮肤老化也会出现多层化、分解断裂等等结构(lavker et al.，J.Invest.Dermatol.197973：59-66)，并且认为这种结构变化的结果造成了皱纹、松弛等老化特征的出现，以及伴随老化的皮肤功能低下。为此，促进构成基底膜骨架的层粘连蛋白-5、IV型以及VII型胶原蛋白的生成本身，对于保持良好的基底膜构造状态和防止皮肤老化是极其重要的。事实上有报道指出，对皮肤基底膜构造进行详细观察时，以二十岁后期到三十岁早期为对象进行观察发现基底膜损伤发生频率是较高，说明基底膜构造变化在诱导皮肤老化中具有重要的作用(IFSCC Magazine，2000 4(4)：15-23)。

为防止皮肤老化，主要问题之一就是抗皱。而且，皱纹大致分类为皮沟较浅的“表皮皱纹”(小皱纹)和皮沟较深的“真皮皱纹”(大皱纹)，然而，特别是真皮皱纹随着基底膜的变化，会发生真皮层的变性和塌陷，因此，鉴于这一原因，基底膜的维护被认为是很重要的。

进而，除上述基底膜的构成成分之外，真皮中大量存在的I型和III型胶原蛋白(大约分别为80％和15％)，由于随着年龄老化在真皮中的绝对值有所减少，所以认为它们的变化很可能同真皮弹性以及皮肤弹力的减少、皱纹、或者真皮的萎缩有很密切的关系。我们对III型胶原蛋白进行了调查，在胚胎的幼儿组织中III型胶原蛋白的比例要高于成人组织的比率，在皱纹明显的Ehlers-Danlos综合征IV型的病人组织中未发现III型胶原蛋白的存在，因此认为构成正常的柔软皮肤时III型胶原蛋白可能是一种很重要成分。

而且，真皮中的I型和III型胶原蛋白是由成纤维细胞合成的。如果在胶原蛋白中培养这种成纤维细胞，则胶原蛋白出现收缩。收缩的胶原蛋白的纤维密度与真皮中的纤维密度值很接近。这是由于成纤维细胞使得胶原蛋白纤维靠近所生成的现象。在实际的真皮中，可以认为，成纤维细胞通过使得胶原蛋白纤维充分紧密接近来保持皮肤弹力的。可以说，为维持抗皱、改善皮肤松弛和皮肤弹力等的皮肤恒常性，除基底膜外，真皮的功能维持也很重要。

至今为止，从维持皮肤恒常性的观点出发，已经提出专利申请的包括具有增强基底膜主要成分层粘连蛋白-5的生成能力的大豆来源的调制品和溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸，以及罂粟科属(Bacconia)属、四棱豆属(Psophocarpus)、决明属(Cassia)和百金花属(Erythraea)植物的提取物(特开平11-343226号、特开2000-226308号、以及特开2003-313135号公报)。同样，已知的III型、IV型、VII型胶原蛋白生成促进剂有大豆、日本山毛榉的树芽、葛根、欧洲常春藤、山毛榉科山毛榉属植物的提取物等各种植物来源的提取物(特开2001-39849号、特开2004-18471号、特开2004-75661号等)。但是，既促进基底膜重要构成成分层粘连蛋白-5、IV型、VII型胶原蛋白，又促进真皮的重要构成成分III型胶原蛋白生成的促进物质只有葛根提取物(特开2001-39849号、特开2003-137767号和特开2004-18471号)。

发明内容

本发明涉及提供一种新型的抗皱剂。

本发明人特别是为达到针对真皮抗皱的目的，对各种植物提取物进行了深入的研究，其结果发现，西洋菜、杜松、白术、款冬能显著促进基底膜的重要构成要素层粘连蛋白-5、IV型胶原蛋白、VII型胶原蛋白，以及真皮的重要构成成分III型胶原蛋白的生成，而且在应用于皮肤的情况下，发现其具有防止皮肤老化作用、特别是抗皱作用和皮肤松弛与皮肤弹力的改善作用。同时，发现上述的提取物中的杜松、白术、款冬具有抗炎作用和创伤愈合作用。迄今，尚未报道过上述植物提取物促进包括层粘连蛋白-5在内的细胞外基质生成的促进作用，以及在皮肤老化过程中的抗皱作用。

西洋菜(学名Nasturtium officinalis R.Brown)：作为一种十字花科植物的西洋菜的提取物，已知具有活血作用(特开2001-181120)，并由于促进生成血管内皮细胞生长因子而被用作育发产品(特开2003-313113)。但是并不知道其对于皮肤老化的作用。

杜松(学名Juniperus oxycedrus Linne)：作为一种柏科植物的杜松的提取物，已知具有改善皮肤干糙等的皮肤屏障功能的效果(特开2001-288066)，但是并不知道关于皮肤老化、抗皱、皮肤松弛和皮肤弹力的改善作用。另外，这里所说的改善皮肤屏障功能效果是针对角质层而言的，并不涉及对角质层以下的真皮等的效果。

白术(学名Atractylodes macrocephale)：作为一种菊科植物的白术的提取物，已知有抗皮肤干糙的作用(特开2003-194809)、抗白发作用(特开2004-161639)，但是并不知道关于皮肤老化、抗皱、皮肤松弛和皮肤弹力的改善作用。

款冬(学名Tussilago farfara Linne)：作为一种菊科植物的款冬的提取物，已知有抑制光毒性效果、可例举出防止UVA照射大气污染物质产生的产物所导致的老化的作用(特开2002-12548)，但是并不知道对于主要由UVB照射引起的皱纹的预防/改善作用以及皮肤松弛和皮肤弹力的改善作用。

因此，本发明提供，含有西洋菜、杜松、白术以及款冬提取物中的至少任意一种作为有效成分而形成的抗皱剂、基底膜稳定剂、细胞外基质生成促进剂、皮肤松弛和皮肤弹力改善剂，以及使用上述提取物的人工皮肤的制造方法、为皱纹减轻以及改善皮肤松弛和皮肤弹力的美容方法。

本发明涉及的抗皱剂，通过含有西洋菜、杜松、白术、款冬提取物，促进基底膜重要构成成分层粘连蛋白-5、IV型胶原蛋白、VII型胶原蛋白，以及作为真皮重要构成成分的III型胶原蛋白等的细胞外基质的生成。此外，通过促进细胞外基质的生成，修复基底膜和真皮，使得创伤愈合，实现减少皮肤水分蒸发量、增加皮肤粘弹性等的皮肤状态向正常转化、或者实现减少皱纹数目及其长度的抗皱作用。虽然确切的机理还不清楚，但是这些作用都可以认为是由于促进了层粘连蛋白等生成所导致的基底膜及真皮的修复与稳定的结果。因此，上述的提取物也能改善基底膜细胞的松解、基底膜从表皮的剥离、VII型胶原蛋白的异常等、由于基底膜不稳定所导致的表皮水疱病的症状改善。另外，本申请发明最独特的效果是上述所有的提取物不是单一地促进层粘连蛋白-5、III型、IV型胶原蛋白以及VII型胶原蛋白的某一种，而是促进它们所有的生成。

具体实施方式

抗皱剂

本发明的抗皱剂是以西洋菜、杜松、白术和/或款冬的提取物作为有效成分的。本说明书中使用的“抗皱”意思是指，在后述的“防止皮肤老化作用”中，防止和/或改善皮肤皱纹的作用，特别是减轻皮肤皱纹的数目和长度，但是有时与“防止皮肤老化作用”同义使用。另外，通过本发明所改善/防止的“皱纹”特指基底膜变化导致的真皮层塌陷生成的皮沟较较深的真皮皱纹。这些作用可以考虑例如，依据视觉感官判定的角质改善、皮肤水分量增加、皮肤弹性增加等的要因进行判断。本发明所实现的上述作用，虽然被认为是通过西洋菜、杜松、白术和款冬来源的提取物增加层粘连蛋白-5、III型、IV型或VII型胶原蛋白等细胞外基质的生成量，由此使基底膜和真皮稳定，并改善皮肤的恒常性的，但是明确的机理还不清楚。鉴于此，通过本发明的抗皱剂所获得的抗皱作用并不仅仅是限于细胞外基质生成量的增加所导致的结果。此外，已知款冬提取物具有预防/改善UVA辐射所产生的皮肤老化或者皱纹产生的作用(特开2002-12548)，但是并不知道对于主要由UVB引起的皱纹的预防/改善作用。

本说明书中使用的“防止皮肤老化作用”是指，防止和改善伴随年龄老化或光老化引起的基底膜构造变化的积累所导致的皮肤功能降低，具体的是皮肤的皱纹、松弛、硬化等，维持具有弹力的年轻健康的皮肤状态。

基底膜稳定剂

本发明提供以西洋菜、杜松、白术和款冬来源的提取物中至少任意一种作为有效成分的基底膜稳定剂。这里，本说明书中使用的“基底膜稳定化”的含义是指，对于存在于表皮与真皮之间的，与维持皮肤恒常性密切相关的基底膜，稳定其骨架，进而进行修复。更具体地讲，就是通过促进构成基底膜的重要成分，特别是细胞外基质的生成，对基底膜产生的全部作用。

细胞外基质生成促进剂

本发明还提供，以上述提取物中的至少任意一种作为有效成分的细胞外基质生成促进剂。这里，本说明书中使用的“细胞外基质”的含义是指，为所属行业中所公认的，特别是包含层粘连蛋白-5、IV型或VII型胶原蛋白在内的基底膜中的重要构成成分，以及III型胶原蛋白等真皮的重要构成成分。

皮肤松弛、皮肤弹力的改善剂

本发明还提供，以上述提取物中的至少任意一种作为有效成分的皮肤松弛、皮肤弹力改善剂。这里，本说明书中使用的“皮肤松弛、皮肤弹力的改善”的含义是指，通过提高皮肤弹性和收紧皮肤来改善由干燥、紫外线等外界刺激、老化导致的皮肤松弛和皮肤弹力。例如，，能够通过体外试验的胶原蛋白凝胶的收缩促进作用等进行评价，通过活体试验的皮肤粘弹性等进行评价。

此外，上述提取物除具有抗皱作用、基底膜稳定作用、细胞外基质生成促进作用、皮肤松弛和皮肤弹力改善作用以及胶原蛋白凝胶收缩促进作用之外，还具有抗炎作用和伤口愈合作用。但是，上所述所有这些的作用的确切机理尚不清楚。本说明书中使用的“抗炎作用”以及“创伤愈合促进作用”是指，将本发明的植物提取物应用于各种炎症部位以及创伤部位的情况下，同非使用部位相比较而言进行相对确定的。利用本发明所得到的创伤愈合促进作用包括促进细胞外基质生成所产生的结果，稳定以及修复基底膜所产生的结果。但是，该作用并不限于细胞外基质生成增加所引起的。此外，本发明中使用的提取物中，已经报道了西洋菜提取物有创伤愈合效果(特开2003-313134)。

除上述抗炎作用和创伤愈合作用外，本发明使用的植物提取物也具有表皮水疱病的改善作用。这里，本说明书中使用的“表皮水疱病的改善作用”的意思是指，不仅可以缓和、治疗被分类为单纯型表皮水疱病、接合型表皮水疱病以及营养失养型表皮水疱病的常见表皮水疱病，而且还可以预防该疾病的症状。该作用是通过促进基底膜的重要构成成分胶原蛋白等的生成，从而稳定基底膜构造而带来的。

本发明中使用的植物提取物来源于西洋菜、杜松、白术和款冬。从草本植物西洋菜、杜松、白术和款冬各植物的根、叶、茎、花等提取，从木本植物杜松的根、芽、树皮、果实、叶、花等部位提取。

提取方法可以采用溶剂提取法，用溶剂提取时，根据需要对植物材料进行干燥，而且根据需要将植物材料切碎或粉碎后，用水性提取剂，例如冷水、温水、或者沸水或较沸点温度稍低的热水；或者用有机溶剂，例如甲醇、乙醇、1，3-丁二醇，乙醚等在常温或者加热条件下进行提取。但是，提取方法不限于溶剂提取，所在行业内已知的常用方法都可以使用。上述提取物的形态不仅包括提取液本身，还包括采用常用方法进行适当稀释或者浓缩、或者干燥后的形态。

本发明的抗皱剂、基底膜稳定剂、细胞外基质生成促进剂或者皮肤松弛和皮肤弹力改善剂可以单独地含有各提取物，或者组合含有多种的提取物。作为其它的形式，本发明的抗皱剂、基底膜稳定剂、细胞外基质生成促进剂或者皮肤松弛和皮肤弹力改善剂，有时进一步含有丝氨酸蛋白酶抑制剂而构成。如后述实施例所记载的那样，本发明的抗皱剂、基底膜稳定剂、细胞外基质生成促进剂或者皮肤松弛和皮肤弹力改善剂，通过进一步含有丝氨酸蛋白酶抑制剂，能抑制胶原蛋白的分解，使基底膜和真皮保持更良好的状态。其结果是，利用本发明获得的抗皱作用、皮肤松弛和皮肤弹力的改善作用、创伤愈合促进作用、表皮水疱病的改善作用等都将会有良好的效果。作为该丝氨酸蛋白抑制剂，并没有限定，可以例举，欧薄荷、鹿蹄草、小连翘、鱼腥草、山金车、木瓜、山楂、旋果蚊子草、西洋玫瑰、野蔷薇、葡萄、牡丹、蛇麻、覆盆子、罗马甘菊的提取物，这些也都可以按照上述的西洋菜等的提取方法，同样采用溶剂提取等进行提取。此外，上述的丝氨酸蛋白酶抑制剂也包括抑肽酶、凝血酸、ε-氨基己酸等。

本发明使用的上述提取物，按照能够实现防止皮肤老化作用、特别是抗皱作用以及皮肤松弛和皮肤弹力改善作用所必需的量，或者按照能够实现基底膜和真皮的稳定或者层粘连蛋白-5、III型、VI型或VII型胶原蛋白等的细胞外基质生成量增加所需的量进行配合。此外，根据增加角质或者透皮水分含量增加(改善干糙)、增加皮肤弹性、改善皮肤纹理等的目的进行相应量的配合，而且该配合量也可依据配合剂型等的各种因素而有所变化。对配合量没有任何限制，但是上述提取物的配合量，相对于抗皱剂、基底膜稳定剂、细胞外基质生成促进剂或者皮肤松弛和皮肤弹力改善剂的总质量而言，为0.0001-10质量％的浓度，最优选为0.001-1质量％的浓度。

本发明的抗皱剂、基底膜稳定剂、细胞外基质生成促进剂或者皮肤松弛和皮肤弹力改善剂中，除上述提取物外，在不影响抗皱作用等的范围内，也可以根据需要适当配合一般化妆品和医药品中可以配合的成分，例如，液态油脂、固体油脂、蜡、碳水化合物、高级脂肪酸、高级醇、酯类、硅油类、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂、保湿剂、水溶性高分子化合物、增粘剂、成膜剂、紫外线吸收剂、金属离子螯合剂、低级醇、多元醇、糖类、氨基酸类、有机胺类、pH调节剂、皮肤营养剂、维生素类、防氧化剂、香料、粉末、色素材料、水等。另外，也可以适当配合L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸磷酸酯、L-抗坏血酸硫酸酯等的L-抗坏血酸的酯衍生物及其盐；L-抗坏血酸葡萄糖苷等的L-抗坏血酸的配糖体及其盐；4-甲氧基水杨酸等的烷氧基水杨酸及其盐；对苯二酚β-D-葡萄糖、对苯二酚α-D-葡萄糖等的对苯二酚配糖体及其盐；凝血酸、凝血酸甲酰胺盐酸盐等的凝血酸衍生物；4-正丁基间苯二酚等的间苯二酚衍生物；曲酸、鞣花酸、亚油酸、洋甘菊提取物、视黄酸、视黄醇、视黄醇醋酸酯、视黄醇棕榈酸酯、甘草酸及其衍生物等；溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酸、大豆调制品等的层粘连蛋白-5生成促进剂；葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等的糖类；烟酸苄酯、烟酸β-丁氧基乙酯、辣椒素、姜酮、斑蝥酊、鱼石脂、咖啡因、单宁酸、α-冰片、烟酸生育酚酯、六烟酸肌醇酯、环扁桃酯、桂利嗪、妥拉唑林、乙酰胆碱、维拉帕米、千金藤碱、γ-谷维醇等的活血剂；硫磺、噻嗯素等的抗脂溢剂；从多样的目的出发，可适当配合桧木硫醇、鸢尾提取物、儿茶钩藤提取物、尿囊素、芦荟提取物、鹿蹄草提取物、百里香提取物、姜黄提取物、黄柏提取物、黄连提取物、小连翘提取物、刺芒柄花提取物、水解酪蛋白、水解酵母提取液、葛根提取物、木糖醇、苦参提取物、大米提取物的水解液、柴胡提取物、藏红花提取物、氧化锌、四棱豆提取物、紫草提取物、芍药提取物、生姜提取物、包覆了二氧化硅的氧化锌、鼠尾草提取物、锦葵提取物、川芎提取物、当药提取物、陈皮提取物、辣椒提取物、当归提取物、桃仁提取物、硫代牛磺酸、人参提取物、大蒜提取物、射干提取物、亚牛磺酸、桦树提取物、枇杷提取物、葡萄提取物、山毛榉树芽提取物、丝瓜提取物、牛至提取物、百合提取物、薏苡仁提取物、迷迭香提取物、精氨酸及其盐酸盐、丝氨酸及其盐酸盐等氨基酸及其衍生物；泛酸钙、D-泛醇、泛醇乙醚、乙酰泛醇乙醚等的泛酸类；麦角钙化醇、胆钙化醇等的维生素D类；烟酸、烟酸酰胺、烟酸苄酯等的烟酸类；α-生育酚、生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚烟酸酯、DL-α-生育酚琥珀酸酯等的维生素E类、维生素K、维生素P、生物素等的维生素类；泛醌等的辅酶等。

本发明的抗皱剂、基底膜稳定剂、细胞外基质生成促进剂或者皮肤松弛和皮肤弹力改善剂的剂型没有特殊的限制，可以制成，溶液体系、可溶化体系、乳化体系、粉末分散体系、水-油双相体系、水-油-粉末三相体系、软膏、凝胶、气雾剂等的任何剂型。另外，使用形态也没有特殊的限制，可以使用化妆水、乳液、霜剂、精华液、啫哩、凝胶、软膏、面膜、粉底等的任何形态。

皮肤外用剂

进而，本发明提供含有上述提取物形成的皮肤外用剂。这里，本发明的皮肤外用剂是指，以抗皱作用和皮肤松弛与皮肤弹力改进作用之外的防止皮肤老化作用、抗炎作用、创伤愈合促进作用、表皮水疱病改善作用等为目的使用的外用剂。但是，本发明的皮肤外用剂并不仅限于上述目的，还包括有意利用上述提取物的细胞外基质生成促进作用试图进行皮肤的各种症状的改善。

本发明的皮肤外用剂可以配合的物质同上述的抗皱剂等一样，但是可根据本领域技术人员所希望的目的来决定适合的种类、数量、浓度等。例如，以抗炎作用和创伤愈合作用为目的的情况下，上述提取物相对于皮肤外用剂总质量的配合浓度为0.0001-10质量％，优选的配合浓度为0.001-1质量％。

抗皱剂、基底膜稳定剂、细胞外基质生成促进剂或者皮肤松弛和皮肤 弹力改善剂的制造方法。

在另一方式中，本发明提供包括添加西洋菜、杜松、白术和款冬来源的提取物到水相或者油相的工序的抗皱剂、基底膜稳定剂、细胞外基质生成促进剂或者皮肤松弛和皮肤弹力改善剂的制造方法。该方法也可以适用于上述的皮肤外用剂。

人工皮肤的制造方法

进而，本发明提供人工皮肤的制造方法，其特征在于，将西洋菜、杜松、白术和款冬的提取物中的至少任意一种添加到人工皮肤形成培养基中。

本发明中用于人工皮肤制造的基础培养基，可以使用以前用于人工皮肤制造的任意培养基，作为这些培养基可以例举出，含10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM培养基)；含10％胎牛血清、转铁蛋白5μg/ml、胰岛素5μg/ml、三碘甲状腺原氨酸2nM、霍乱毒素0.1nM、氢化可的松0.4μg/ml的DMEM-Ham’sF12(3∶1)培养基；角质形成细胞生长培养基(KGM)和含10％胎牛血清的DMEM培养基的1∶1混合培养基等。在这些培养基中添加的上述提取物，依据种类各有不同，但大约为0.001质量％-1质量％的程度。除该提取物以外，抗皱剂的形态中使用的各种物质也可以一同添加进去，特别是上述的丝氨酸蛋白酶抑制剂，为了抑制胶原蛋白的分解、稳定基底膜，被认为是优选的物质。

在本发明的人工皮肤制造中，首先将含有人成纤维细胞的收缩I型胶原蛋白放置在金属网上。含有人成纤维细胞的收缩I型胶原蛋白可以按如下进行调制。在冰上制备好成纤维细胞的胶原蛋白悬液后，皮氏培养皿上使胶原蛋白凝胶化而进行制备。然后，从皮氏培养皿上将胶原蛋白宁胶剥离，将胶原蛋白放入二氧化碳孵箱使其收缩。

接下来，在上述的胶原蛋白凝胶上培养表皮细胞，例如人正常表皮的表皮形成细胞，形成表皮。通过培养皮肤细胞来形成表皮可如下进行。将收缩的胶原蛋白凝胶放置在金属网上，接着将玻璃环状物放置在该凝胶上。在该玻璃环内加入人包皮来源的表皮形成细胞悬液并使液体不外漏。在二氧化碳孵箱中使表皮形成细胞附着，移走玻璃环。表皮层长满上述培养基表面后，将表皮层暴露于空气中，继续进行培养，以形成角质层。

按照这种方法可以获得，在含有成纤维细胞的收缩I型胶原蛋白凝胶构成的真皮层和表皮层之间有充足沉淀了基底膜成分的，与自然皮肤接近的人工皮肤。本发明使用的上述提取物不仅是在表皮细胞接种后的几天时间内，在交换培养基时被加入到新鲜培养基中，而且并不只限定于这个时期，可以根据需要适量添加。

减轻皱纹的方法和皮肤松弛与皮肤弹力的改善方法

在另一方式中，本发明提供美容方法，其特征是，通过在皮肤上使用西洋菜、杜松、白术和款冬提取物中的至少任意一种，来减轻皱纹，改善皮肤松弛和皮肤弹力。而且该方法不仅可以减轻皱纹，改善皮肤松弛与皮肤弹力，还可以用于上述的细胞外基质的生成促进，进一步用于需要基底膜以及真皮稳定的各种皮肤症状，例如在表皮水疱病的改善中使用。在该方法中，上述提取物所应用的对象通常是哺乳动物，特别是适用于人类。

实施例

以下，列举实施例来更详细地说明本发明。

[实验方法-1]

关于层粘连蛋白-5生成促进效果的试验方法

(1)表皮角质细胞的培养

表皮角质细胞由人包皮分离而来，并在低浓度钙的表皮细胞生长培养基(KGM)中培养。向该培养基中加入牛脑下垂体提取液和EGF。细胞在KGM中继代培养4代后，经胰蛋白酶-EDTA处理后悬浮附着细胞，过滤去除细胞团块，获得均一的细胞悬液。离心分离收集细胞，按照8×10⁴/ml的密度再悬浮在DMEM-F12(2∶1)-0.1％BSA培养基中。将0.5ml该细胞悬液，加入到含有2倍药物浓度的相同培养基0.5ml中。培养使用24孔细胞培养板，37℃进行24小时培养。培养结束后，将上清液移入Eppendroff管中，10000rpm、5分钟离心分离，将上清液转移至一支新管中，直到层粘连蛋白-5的测定日都保存在-20℃。此外，为溶解出细胞内部和培养塑料容器上结合的层粘连蛋白-5，向各孔中加入含有各种表面活性剂的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)，-20℃过夜保存。第二天，进行超声波处理，再度冷冻。次日，再溶解后，10000rpm、5分钟离心分离，将上清液转移至管中，直到层粘连蛋白-5的测定日都保存在-20℃。

(2)层粘连蛋白-5的夹心ELISA法测定

采用夹心ELISA法测定培养上清、细胞层中存在的层粘连蛋白-5。96孔ELISA板的固相表面包被上抗层粘连蛋白-5的层粘连蛋白α3链的单克隆抗体BM165。为使用夹心法测定层粘连蛋白-5，将另外一种抗体，即抗层粘连蛋白β3链的单克隆抗体6F12预先进行生物素标记(b-6F12)。本方法，仅能测定具有功能的异源三聚体(α3β3γ2)，不能检测异源二聚体(β3γ2)。在预先加有含b-6F12的3％明胶磷酸缓冲液的各孔中加入样品。孔内样品的最终稀释率为，培养液1/4，细胞层1/10。抗原抗体在37℃反应2小时，冲洗培养板后添加生物素HRP(辣根过氧化物酶)溶液，进一步反应30分钟到1小时。冲洗后，加入HRP底物ABTS溶液，用ELISA板读数仪读取405nm吸光度。在0～40ng/ml浓度范围内制作标准曲线。

层粘连蛋白-5的生成量按照培养基中的游离量和细胞层的残留量的总和进行计算，用相对未添加植物提取物的样品(对照)的相对比值进行表示。如表1所示，给出了各提取物的层粘连蛋白-5生成量的增长率。

表1

(结果-1)

[实验方法-2]

关于IV型胶原蛋白、VII型胶原蛋白生成促进效果的试验方法

(1)人成纤维细胞的培养

将在含10％FBS的DMEM培养基中培养的人成纤维细胞播种于24孔板，细胞附着后，用含有0.25％FBS和250μM抗坏血酸葡萄糖苷的DMEM培养基进行培养基交换，加入测试药物。培养一天后，回收上清，离心分离，测定所得上清中的IV型、VII型胶原蛋白，并测定细胞的DNA量，作为细胞数目的指标。

(2)DNA的定量

DNA量的测定采用Hoechst公司的H33342进行荧光测定法的测定。

(3)用夹心ELISA法测定IV型、VII型胶原蛋白

IV型、VII型胶原蛋白用夹心ELISA法进行测定。本实施例中使用的抗体如下所示。

·IV型胶原蛋白特异性抗体；单克隆抗体JK-199和多克隆抗体MO-S-CLIV

·VII型胶原蛋白特异性抗体；单克隆抗体NP-185和单克隆抗体NP-32

将单位未添加测试药物的样品(对照)DNA的IV型、VII型胶原蛋白量为100时，单位测试药物样品DNA的IV型、VII型胶原蛋白量作为IV型、VII型胶原蛋白量生成促进率。如表2所示，给出了对应的胶原蛋白生成促进率。

表2

(结果-2)

[实验方法-3]

III型胶原蛋白生成促进效果的试验方法

(1)人成纤维细胞的培养

将在含10％FBS的DMEM培养基中培养的人成纤维细胞播种于24孔板，细胞附着后，用含有0.25％FBS和250μM抗坏血酸磷酸镁的DMEM培养基进行培养基交换，加入测试药物。培养三天后，回收培养基上清，离心分离，测定所得上清中的III型胶原蛋白，并测定细胞的DNA量，作为细胞数目的指标。

(2)DNA的定量

DNA量的测定采用Hoechst公司的H33342进行荧光测定法的测定。

(3)III型胶原蛋白的测定

细胞中III型胶原蛋白的生物合成能力的评价方法是测定培养上清中分泌的III型胶原蛋白的末端肽(Procollagen type III-peptide：简称为PIIIP)的含量。具体地讲就是，用“RIA-gnost PIIIP(PIIIP)测定试剂盒(CIS.Diagnostic公司产品)”进行测定。III型胶原蛋白生成量表示为，相对DNA量的比值，和相对未添加植物提取物的样品(对照)的相对值(参照表3)。

表3

(结果-3)

样品   浓度(％)相对无添加对照和相对DNA比的III型胶原蛋白生成量(％)

西洋菜提取物  0.001                   117

              0.01                    124

从以上的结果看出，西洋菜提取物的III型胶原蛋白的生成促进作用具有有意差。

[实验方法-4]

用人皮肤成纤维细胞评价I型胶原蛋白凝胶收缩能力的方法

在冰上制备好成纤维细胞(5×10⁴cell/ml)的胶原蛋白悬液(使用高研株式会社生产的I型胶原蛋白)后，37℃下进行胶原蛋白的凝胶化。然后，加入待测物(对照使用DMSO)和含0.25％FBS的DMEM培养基，从玻璃皿的壁上将凝胶剥落下来，使胶原蛋白发生收缩(各组n＝3)。1、2天后，从三个方向测量胶原蛋白的直径，求平均值。收缩前的直径设为收缩率定为0％，求待测物加入后的收缩率(参照表4)。

表4

(结果-4)

从以上结果看出，西洋菜提取物对胶原蛋白凝胶收缩促进作用具有有意差。

[实验方法-5]

人工皮肤的制造方法

胶原蛋白凝胶，在冰上制备好人真皮来源的成纤维细胞(1×10⁵cells/ml)的胶原蛋白悬液后，加入到60mm皮氏培养皿中37℃下进行胶原蛋白的凝胶化。然后从玻璃皿的壁上将凝胶剥落下来，将胶原蛋白凝胶放置在金属网上，接下来在凝胶上放置一个玻璃环状物(内径12mm)。加入含人包皮来源的表皮形成细胞悬液的KGM-DMEM(1∶1)的混合培养基并使得其不会从玻璃环内漏出。过夜孵育，使表皮细胞附着，第二天拿走玻璃环。表皮层长满上述培养基表面后，将表皮层暴露于空气中，制备成显示角质形成过程的具有多层细胞表皮的皮肤模型。

从播种表皮细胞后的第4天起，交换含有(1)无测试药物添加、(2)0.3％西洋菜提取物、(3)0.3％西洋菜提取物+0.5％欧薄荷提取物、(4)0.3％杜松油、(5)0.3％杜松油+0.5％鹿蹄草提取物、(6)0.3％白术提取物、(7)0.3％白术提取物+0.5％小连翘提取物、(8)0.3％款冬提取物、(9)0.3％款冬提取物+0.5％鱼腥草提取物的培养基。之后每隔2-3天交换含有测试药物种类和浓度一样的培养基，继续培养2周。

形成的人工皮肤用苏木精-伊红染色法以及免疫染色法(抗IV型胶原蛋白抗体和抗VII型胶原蛋白抗体)进行染色。IV型以及VII型胶原蛋白的染色程度按照从低到高的顺序进行5阶段的1-5点评分。如表5所示，给出了胶原蛋白染色程度的点数。

表5

(结果-5)

如上所述，对照(1)中，IV型胶原蛋白着色较弱，而VII型胶原蛋白基本观察不到。与此相对，在人工皮肤模型中可以看到，有层粘连蛋白-5、IV型胶原蛋白和VII型胶原蛋白生成促进作用的西洋菜、杜松、白术和款冬都可以提高IV型和VII型胶原蛋白的着色性能。而且表明，作为丝氨酸蛋白酶抑制剂的欧薄荷、鹿蹄草、小连翘、鱼腥草的提取物也能进一步提高其着色性能。

[实验方法-6]

在30-45岁的健康男性3名的皮肤上，分别涂抹西洋菜、杜松、白术和款冬的提取物，测定其角质层水分含量，并与对照部位进行比较。对照使用离子交换水。对每位测试者的前臂内侧2.5cm见方的正方形区域内进行涂抹，使用CorneoMeter CM 825C(Courage+Khazaka公司产品)对涂抹前、涂抹后1小时的角质层水分含量进行测定，求出水分含量增加率。如表6所示，给出了在涂有各植物提取物的情况下的角质层水分含量的增加率。

表6

(结果-6)

待测物质涂抹1小时后的角质层水分含量的增加率

对照部位    测试药物涂抹部位

            西洋菜    杜松    白术    款冬

1％         40％      35％    38％    30％

如上所述，通过测试物质的涂抹，角质层水分含量上升，表明皮肤有改善效果。

[实验方法-7]

对40-55岁的健康女性志愿者进行了下述处方的霜剂连续使用试验。志愿者48名被分为4组，各组分别在面部的一侧涂抹霜剂(本发明产品1-4)，在另一侧涂抹比较品1，共4周，每天涂抹二次。角质层水分含量用CorneoMeter CM 825C测定，皮肤水分蒸发量用TewaMeter TM210测定，皮肤粘弹性用弹性测量仪(全部为Courage+Khazaka公司产品)进行测定，并分别作为水分含量的增加程度、皮肤干糙改善程度，皮肤弹力改善程度的指标。弹性测量仪按照常规方法负压吸引2秒，释放1秒，重复3次，将第一次和第三次的皮肤拉伸(Uf值，最大振幅)以及粘性/弹性比率(Uv/Ue值)同连续使用前进行比较。而且使用硅胶印模(Silflo，FLEXICODEVELOPMENTS公司产品)采集外眼角的印模，测定皱纹的数目和长度，对连续使用前后的数值进行比较。并且通过不干胶胶带采集角质层的脱落程度，由专业人员的视感判定评价皮肤的纹理完整程度，和角质层脱落的均一程度。

结果(同连续使用前的比较值)列于以下表7-11中。括弧中的数值表示成对学生t检验的检验值。

表7

(结果-7)

印模的分析结果

          本发明品1使用组 本发明品2使用组 本发明品3使用组 本发明品4使用组

皱纹数目   -9％(p＝0.003)    -6％(p＝0.004)  -7％(p＝0.009)  -6％(p＝0.003)

皱纹长度   -12％(p＝0.010)   -10％(p＝0.009) -11％(p＝0.015) -9％(p＝0.008)

从以上的结果可以看出本发明品的抗皱作用具有明显的统计学意义。

表8

角质水分含量

本发明品1使用组  本发明品2使用组  本发明品3使用组 本发明品4使用组

+22％(p＝0.0001) +24％(p＝0.0001) +20％(p＝0.0001) +15％(p＝0.0008)

从以上的结果可以看出本发明品的保湿效果具有明显的统计学意义。

表9

皮肤水分蒸发量

本发明品1使用组 本发明品2使用组 本发明品3使用组 本发明品4使用组

-40％(p＝0.0001) -34％(p＝0.0009) -33％(p＝0.0009) -27％(p＝0.0012)

从以上的结果可以看出本发明品的皮肤干糙改善效果具有明显的统计学意义。

表10

皮肤粘弹性

从以上的结果可以看出本发明品的皮肤弹性增加具有明显的统计学意义。

表11

皮肤纹理

从以上的结果可以看出本发明品的纹理改善效果具有明显的统计学意义。

上述发明品1-4以及比较品的组成在以下表12列出。同时，数值全部以相对于全体的重量％进行表示。

表12

[实验方法-8]

抗炎、创伤愈合促进试验

对8周龄HR-1小鼠人工形成炎症或者创伤，各组(n＝5)分别涂抹含有(1)无测试药物添加、(2)5％杜松油、(3)5％白术提取物、(4)5％款冬提取物的1，3-丁二醇0.5g，每天2次，涂抹5天，第五天观察炎症部位或者创伤部位的状态。抗炎作用、创伤愈合作用分别从低到高进行5阶段的1-5点的评分。其结果表示在表13。

表13

(结果-8)

如表13所示，对照(1)中，炎症和创伤的改善程度较低。与此相比，在活体实验中得到证实，西洋菜、杜松、白术和款冬提取物都表现出具有抗炎作用和创伤愈合促进作用。

实施例1-霜剂

(1)处方

(A相)

(B相)

(2)制造方法

A的油相部分和B的水相部分分别在70℃加热至完全溶解。将A相加入到B相，用乳化设备进行乳化。将乳化物用热交换器进行冷却。

实施例2-霜剂

(1)处方

(2)制造方法

在离子交换水中加入丙二醇、杜松的甲醇提取物和苛性钾，溶解，加热，在70℃保温(水相)。混合其它成分加热溶解，在70℃保温(油相)。将油相慢慢地加入到水相中，全部加完后在该温度放置一段时间使其进行反应。然后，用均质器进行均质乳化，充分搅拌下冷却到30℃。

实施例3-防皱霜

(1)处方

(2)制造方法

在离子交换水中加入丙二醇，加热，在70℃保温(水相)。混合其它成分，加热溶解，在70℃保温(油相)。将油相慢慢地加入到水相中，进行预备乳化反应，用均质器进行均质乳化，充分搅拌下冷却到30℃。

实施例4-抗老化霜

(1)处方

(2)制造方法

在离子交换水中加入肥皂粉末和硼砂，加热溶解，在70℃保温(水相)。混合其它成分，加热融解，在70℃保温(油相)。将油相边搅拌边慢慢地加入到水相中进行反应。反应结束后，用均质器进行均质乳化，乳化后在充分搅拌下冷却到30℃。

实施例5-乳液

(1)处方

(2)制造方法

用少量的离子交换水溶解羧乙烯基聚合物(A相)。在余下的离子交换水中加入聚乙二醇1500和三乙醇胺，加热溶解，在70℃保温(水相)。混合其它成分，加热融解，在70℃保温(油相)。将油相加入到水相中，进行预备乳化反应，加入A相，用均质器进行均质乳化，乳化后在充分搅拌下冷却到30℃。

实施例6-乳液

(1)处方

(2)制造方法

在离子交换水中加入丙二醇，加热，在70℃保温(水相)。混合其它成分，加热融解，在70℃保温(油相)。将油相边搅拌边慢慢地加入到水相中，用均质器进行均质乳化。乳化后在充分搅拌下冷却到30℃。

实施例7-乳液

(1)处方

(A相)

(B相)

(2)制造方法

将A油相部分和B水相部分分别在70℃加热，完全溶解。将A相加入到B相中，用乳化设备进行乳化。将乳化物用热交换器进行冷却。

实施例8-啫哩

(1)处方

(2)制造方法

在离子交换水中均匀溶解卡波姆940，另外，在95％乙醇中溶解款冬的乙醇提取物、聚氧乙烯(50摩尔)油醇醚，加入到水相中。随后，加入其它成分后，用苛性钠和L-精氨酸中和，进行增粘。

实施例9-美溶液

(1)处方

(A相)

(B相)

氢氧化钾                          0.1

(C相)

(2)制造方法

分别均匀溶解A相和C相，把A相加入到C相中，形成可溶化状态。再加入B相，然后进行填充。

实施例10-面膜

(1)处方

(A相)

一缩二丙二醇                    5.0   重量％

聚氧乙烯(60摩尔)氢化蓖麻油      5.0

(B相)

(C相)

(2)制造方法

分别均匀溶解A相、B相和C相，把B相加入到A相中，形成可溶化状态。再将其加入到C相，然后进行填充。

实施例11-化妆水

(1)处方

(A相)

(B相)

(2)制造方法

将A的醇相加入到B的水相中，进行可溶化得到化妆水。

实施例12-固体粉底

(1)处方

(2)制造方法

用搅拌机充分混合滑石粉-氧化铁黑粉末成分，在其中加入角鲨烷～辛酸异十六烷基酯的油性成分、款冬的乙醇提取物、防腐剂、香料，充分搅拌后，进行容器填充和成型。

实施例13-乳化型粉底(膏霜型)

(1)处方

(2)制造方法

加热水相搅拌后，添加经过充分混合粉碎的粉体部分进行均质处理。然后加入加热混合的油相进行均质处理后，边搅拌边加入香料，冷却到室温。

Claims (3)

1.含有来源于西洋菜以及款冬提取物中的至少任意一种作为有效成分的组合物用于制备细胞外基质生成促进剂的用途。

2.如权利要求1所述的组合物用于制备细胞外基质生成促进剂的用途，其特征在于，生成促进的细胞外基质的构成成分为选自层粘连蛋-5，Ⅲ型胶原蛋白，Ⅳ型胶原蛋白以及Ⅶ型胶原蛋白组成的组中的一种或二种以上。

3.如权利要求1或2所述的组合物用于制备细胞外基质生成促进剂的用途，其特征在于，生成促进所有的层粘连蛋白-5，Ⅲ型胶原蛋白，Ⅳ型胶原蛋白以及Ⅶ型胶原蛋白。