JP4634768B2 - 皮膚老化防止効果向上剤、その製造方法、それを用いた皮膚老化防止用組成物及びそれを含有する皮膚外用剤。 - Google Patents

Description

本発明は、皮膚老化防止効果向上剤、すなわち皮膚老化防止剤に配合して、その効果を向上させるための添加剤、その製造方法、それを用いた皮膚老化防止用組成物及びそれを含有する皮膚外用剤に関するものである。

高年齢化が進むに従って、人の皮膚は老化し、シワやタルミとなって現われ、老人や女性にとって大きな悩みとなる。このシワやタルミの発症メカニズムは、まだ明確には解明されていないが、皮膚の表皮層での乾燥化や角質層での保湿力の低下などが原因となっており、また真皮層については、長期間の紫外線照射や弾性線維の変性による弾性力の低下などに起因するものと考えられる。

このような皮膚の老化を防止するためには、レチノイン酸、α‐ヒドロキシ酸、レチノールなどが効果があるとされているが、その外に緑藻類、褐藻類、紅藻類などの海藻から抽出されたヒアルロニダーゼ阻害剤（特許文献１参照）、一般式

で表わされる酸化型化合物と、フノリ科、ヒトエグサ科、ミル科、ウシケノリ科、スギノリ科、カギノリ科、イバラノリ科、ナガマツモ科、モズク科、ダービリア科、レッソニア科及びダルス科の中から選ばれた海藻の抽出物とを含有する皮膚外用剤（特許文献２参照）、カッコン、ワレモコウ及び麦芽の抽出物より選ばれた１種と海藻の抽出物とを含有した皮膚外用剤（特許文献３参照）、加水分解シルクタンパク質及び海藻抽出物を含有する皮膚外用剤（特許文献４参照）、褐藻類、紅藻類、緑藻類から選ばれる少なくとも１種の海藻抽出物からなるエラスターゼ活性阻害剤（特許文献５参照）、ゲットウ、ワレモコウ、キナ属植物、ソーセージノキ属植物、麦芽及び海藻の抽出物より選ばれた少なくとも１種と、多糖類及びその誘導体から選ばれた少なくとも１種を含有する皮膚外用剤（特許文献６参照）、酵母、酵母抽出物の中から選ばれた少なくとも１種と、海藻又はその抽出物とを含有する皮膚外用剤（特許文献７参照）、アオサ科、オゴノリ科、テングサ科、ミリン科、コンブ科、アイヌワカメ科、ホンダワラ科又はヒバマタ科に属する海藻の抽出物からなる生体ヒアルロン酸合成促進剤（特許文献８参照）、ヒドロキシカルボン酸と、アオサ科、オゴノリ科、テングサ科、ミリン科、コンブ科、アイヌワカメ科、ホンダワラ科、ヒバマタ科、フノリ科、ヒトエグサ科、ミル科、ウシケノリ科、スギノリ科、カギノリ科、イバラノリ科、ナガマツモ科、モヅク科、ダービリア科、レッソニア科及びダルス科に属する海藻の抽出物から選ばれる少なくとも１種とを含有する皮膚外用組成物（特許文献９参照）などが提案されている。
しかしながら、これらの皮膚老化防止剤は、活性が低いため、十分な効果を奏するには、かなり高濃度にして用いることが必要であり、場合によっては、皮膚障害をひき起すおそれがあり、安全性、安定性の点で問題があった。

特開平９−６７２６６号公報（特許請求の範囲その他） 特開平９−２６８１１９号公報（特許請求の範囲その他） 特開２００２−１０４９５２号公報（特許請求の範囲その他） 特開２００２−１０４９５２号公報（特許請求の範囲その他） 特開２００１−１８１１６７号公報（特許請求の範囲その他） 特開２００３−１０４８６５号公報（特許請求の範囲その他） 特開２００３−２３８３８４号公報（特許請求の範囲その他） 特開平７−１０１８７１号公報（特許請求の範囲その他） 特開平８−２５９４４３号公報（特許請求の範囲その他）

本発明は、従来使用されている皮膚老化防止剤に配合することにより、その中の有効成分の最少有効濃度を低減させ、皮膚に対する障害の発生を抑制し、安全かつ安定した皮膚老化防止効果を奏させるための皮膚老化防止効果向上剤を提供することを目的としてなされたものである。
本発明では最少有効濃度とは、有効成分の有効な機能が充分に発揮されるのに必要な最低限の有効成分の量（濃度）のことをいう。

本発明者らは、先に植物由来、特に海洋植物由来の赤血球凝集素について、種々研究を重ねた結果、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）から、特定の条件下で抽出された赤血球凝集素が、凝集活性が高く認識糖鎖選択性が高い上に、イオン強度により凝集活性を制御し、熱処理によって糖結合性が消失せず、認識糖鎖選択性に優れ、かつ細胞性免疫能力賦活などの自己免疫増強活性を有すること、更にこの新規な自己免疫増強剤を皮膚老化防止剤に配合することにより、皮膚老化防止剤の皮膚老化防止効果を向上させることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。

すなわち、本発明は、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とした皮膚老化防止効果向上剤、オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶媒で溶解することにより細胞性免疫能力賦活活性を示す液状抽出物を分離し、捕集することを特徴とする皮膚老化防止効果向上剤の製造方法、上記の皮膚老化防止効果向上剤を用いた皮膚老化防止用組成物及びそれを含有することを特徴とする皮膚外用剤を提供するものである。

本発明における有効成分としては、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、沈殿として得た（１）「粗活性画分（沈殿）」、又は粗活性画分を沈殿として分取し、沈殿を適当な溶媒で溶解することにより得た液状の（２）「粗活性画分（液状）」、又はさらに、所望に応じ、１００℃、１〜１０分間の熱処理によって夾雑タンパク質を除去した（３）「粗活性画分（熱処理済み）」、又はさらにゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画したのち、この画分をクロマトグラフィーにより分離、精製した精製画分が用いられる。

上記の硫酸アンモニウムの飽和濃度は、「グリーン及びヒューズ（Ｇｒｅｅｎ，Ａ．Ａ．＆ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｗ．Ｌ．）著（１９５５）「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１巻、第６７〜９０ページ」に記載されている［結晶硫酸アンモニウムの添加量と濃度（％飽和）との関係に関する表］に基づいて、規定されるものである。

また、本発明方法は、例えば、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）から塩類水溶液で抽出される抽出液に、最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶液で溶解することにより得られる液状の粗活性画分、さらには、所望に応じ、１００℃、１〜１０分間の熱処理によって夾雑タンパク質を除去し、次いでゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画し、さらにクロマトグラフィーにより成分を分離し、細胞性免疫能力賦活性を示す画分を液状体として捕集することからなっている。

この際用いる塩類水溶液としては、例えば生理食塩水や、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる少なくとも一種を添加した液などがあり、特に、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれる少なくとも１種を添加した液が好ましい。

上記で得た液状体は、糖を主成分とする赤血球凝集素を含んでいる。このような糖としては、糖を構成している単糖の中のガラクトースの割合が７０〜１００質量％、特に９０〜１００質量％のものが好ましい。本発明の有効成分として上記液状体を用いる場合、糖のほかに糖の質量に対してタンパク質の質量が０.４以下であるタンパク質を含んでいてもよい。
なお、糖の定量は、標準試料としてガラクトースを用いて、フェノール硫酸法によって行い、タンパク質の定量は、標準試料としてウシ血清アルブミンを用いて、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法によって行う。

この際の原料としては、オゴノリ属紅藻類が用いられるが、特にオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）、ツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）、それらの亜種が好ましい。本発明においてオゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）には、（１）オゴノリ属海藻（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）に分類される海藻、あるいは、（２）Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．に分類される海藻、あるいは、（３）Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．に過去に分類された海藻を含む。

例えば、日本産海藻では、オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）には、「新日本海藻誌日本産海藻類総覧、吉田忠生著、内田老鶴圃発行、１９９８年」においてオゴノリ目（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｌｅｓ：グラシラリアレス）オゴノリ科（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａｃｅａｅ：グラシラリアシー）に分類されている海藻が含まれている。
これらの紅藻類は、寒海にも存在するが特に暖海に多く、わが国ではほとんどすべての海岸地帯に分布しており、寒天の増量物や刺身のつまなどに用いられている。

本発明方法を好適に行うには、上記の紅藻類原料に（イ）水溶性画分の抽出工程、（ロ）粗活性画分の分取工程、及び、必要に応じて、（ハ）凝集素の精製工程を順次施す。

前記各工程について、さらに詳細に説明すると、まず（イ）工程においては、原料の紅藻類に塩類含有水溶液、例えば、生理食塩水や、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる少なくとも一種を添加した液、好ましくは、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれる少なくとも１種を添加した液を加えてホモゲナイズしたのち、遠心分離処理し、上澄である粗抽出液を得る。

次に（ロ）工程においては、前記（イ）工程で得られた抽出液に、まず最終濃度２０〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離処理により除去する。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去される。次いで、遠心分離処理で得た上澄に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて２段目の塩析を行い、生成した沈殿を遠心分離処理により分別したのち、この沈殿画分を塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液で再溶解し、所望に応じ、塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液などの緩衝液に対する透析等により精製して粗活性画分を得る。この粗活性画分は、そのまま本発明の皮膚老化防止効果向上剤として用いることができる。

（ロ）工程においては最後に、粗活性画分を１００℃、１〜１０分間熱処理し沈殿した夾雑タンパク質を除去することにより、熱処理済みの粗活性画分を得る。この熱処理済みの粗活性画分は、そのまま本発明の皮膚老化防止効果向上剤として用いることができる。

この熱処理済みの粗活性画分については、所望に応じ、さらに（ハ）工程を行うことができる。（ハ）工程においては、前記（ロ）工程で得られた熱処理済みの粗活性画分を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１０万以上の画分を分画し、さらにクロマトグラフィーにより成分を分離し、精製赤血球凝集素を得る。この際、最終段階で使用するクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーあるいはそれらの組合せを用いるのが有利である。

ここでいう、分子量１０万以上の画分とは、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、球状タンパク質を標準分子量物質として用いて、溶出画分の分子量を算出した結果が１０万以上の分子量に相当する画分をいう。

上記の精製画分・精製標品の０．１ミリリットルをＴＳＫゲル Ｇ３０００ ＰＷＸＬカラムに添加し、ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムから０．１ミリリットルずつ溶出画分を集める。この際、標準分子量物質として、チログロブリン（分子量６６９，０００）、フェリチン（分子量４４０，０００）、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００）、オボアルブミン（分子量４３，０００）を用いる。その結果、マイトジェン能をもつ赤血球凝集素の溶出した画分（赤血球凝集活性の画分）を示す凝集活性を有するピークの頂点は分子量５．６４×１０⁵に相当することがわかった。

本発明の皮膚老化防止効果向上剤は、皮膚老化防止剤、例えば皮膚老化防止作用をもつ植物エキスに対し、１０：１ないし１：１の割合で配合すると、皮膚老化防止剤の皮膚老化防止効果が向上する。
上記配合割合は必ずしもこの範囲に限定されることはなく、必要に応じこれよりも少なくしてもよいし、また増加してもよい。

本発明の皮膚老化防止効果向上剤として用いる有効成分はさらに次に示す事項によって特徴付けられる。
（１）プロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害されること、
（２）ウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化すること、
（３）細胞性免疫能力賦活活性を有すること、
（４）１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有すること、
（５）ヒトリンパ球を幼若化する活性を有すること、
（６）トリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進させること。

本発明の皮膚老化防止効果向上剤は、海藻特に紅藻類由来の新規なものであって、イオン強度により凝集活性が制御でき、認識糖鎖選択性に優れ、細胞性免疫能力賦活など自己免疫増強活性を有し、１００℃、１０分間の熱処理後も糖結合活性を有するという利点がある。更にこのものは皮膚老化防止剤に対し配合することにより、皮膚老化防止剤の皮膚老化防止効果を向上させる。

本発明の皮膚老化防止効果向上剤を用いた皮膚老化防止用組成物は、皮膚外用剤、浴用剤に配合できるが、その配合量には特に制限はない。配合する製品の種類、性状、品質、期待する効果の程度により異なるが、効果の面からいえば乾燥固形物に換算して、皮膚老化防止効果向上剤の添加量は０．０００１〜１０．０質量％、特に０．００１〜１．０質量％が好ましい。

次に、本発明の皮膚老化防止用組成物は、上記皮膚老化防止効果向上剤及び皮膚老化防止剤を含有したものであり、（Ａ）皮膚老化防止効果向上剤、（Ｂ）エラスターゼ活性阻害剤、コラゲナーゼ活性阻害剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びコラーゲン産生促進剤からなる群より選ばれる少なくとも１種、及び（Ｃ）ＳＯＤ様活性剤及びＤＰＰＨラジカル消去剤からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有してなる。

上記（Ｂ）成分のエラスターゼ活性阻害剤としては、例えばショウキョウ、フトモモ、クジン、パシャンベ、ホホバ葉、イリス、サンヤク、ワレモコウ、アシタバ、ベニバナ、スギナ、オオバナサルスベリ、センキュウ、ヤグルマギク、エイジツ、ニンジン、トウキンセンカ、ローマカミツレ、シモツケソウ、サンキライ、チョウジ、チンピ、ソウハクヒ、サンシシ、ジオウ、アルニカ、センコツ、ショウブ根、モモ葉、キョウニン、メリロート、ユーカリ、ラベンダー、クマザサ、ホオウ、ゼニアオイ、ゲンノショウコ、ブドウ葉、トウヒ、サイシン、ハッカ、ホップ、ローズマリー、エイジツ、シソ、メリッサ、パセリ、キキョウ、紅茶、サンザシ、ハス葉、フキタンポポ、オトギリソウ、ツボクサ、センブリ、コンフリー及びカンゾウからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を、コラゲナーゼ活性阻害剤としては、例えばヨウバイヒ、シラカバ、セイヨウボダイジュ、ケイヒ、ワレモコウ、オトギリソウ、フトモモ、マロニエ、パシャンベ、ダイオウ、シモツケソウ、紅茶、ハマメリス、ユーカリ、ゴバイシ、アセンヤク、オオバナサルスベリ、ホホバ葉、ビワ葉、ゲンノショウコ、ボタン、オウレン、ハス葉、ユキノシタ、チョウトウコウ、ブドウ葉、サンザシ、ガイヨウ、ハイビスカス、トチュウ、茶、キナ、ヘンナ、イチョウ、シソ、サンキライ、タイム、セージ、オウバク、オクラ、アルニカ、ホップ及びオウゴンからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を、ヒアルロン酸産生促進剤としては、例えばブクリョウ、エイジツ、サイシン、ゲンノショウコ、キナ、フキタンポポ、アガリスク、チョウトウコウ、ベニバナ、シコン、ツボクサ、トウキンセンカ、キョウニン、セージ、シラカバ、ジオウ、ハッカ、カラスムギ、ローマカミツレ、オトギリソウ及びヤグルマギクからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を、コラーゲン産生促進剤としては、例えばコンフリー、ローマカミツレ、紅茶、サンザシ、ハス葉、クロレラ、ガイヨウ、クマザサ、ゴボウ、クジン、サイシン、ビワ葉、シソ、クワ葉、タイム、オプリア・ストレプタカンサ、トウヒ、オドリコソウ、ワレモコウ、アイブライト、チンピ、ゼニアオイ、ショウキョウ、カミツレ、セイヨウネズ、センブリ、ジオウ、ローズマリー及びセージからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物をそれぞれ挙げることができる。

また上記（Ｃ）成分のＳＯＤ様活性剤としては、例えばフトモモ、パシャンベ、ヨウバイヒ、ゴバイシ、チョウジ、ホホバ葉、ワレモコウ、マロニエ、シモツケソウ、茶、シラカバ、アセンヤク、メリッサ、オオバナサルスベリ、ケイヒ、紅茶、ゲンノショコ、タイム、ユーカリ、セイヨウボダイジュ、ダイオウ、セージ、ガイヨウ、ハマメリス、ローズマリー、ユキノシタ、ラベンダー、オトギリソウソ、トチュウ、ビワ葉、チョウトウコウ、シソ、ボタンピ、カワラヨモギ、サンショウ、セイヨウノコギリソウ、キナ、アルニカ、ハス葉、オウゴン及びビデンスピローサからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を、ＤＰＰＨラジカル消去剤としては、例えばゴバイシ、パシャンベ、シモツケソウ、ヨウバイヒ、ワレモコウ、茶、フトモモ、チョウジ、メリッサ、シラカバ、バナバ、ユーカリ、ローズマリー、ダイオウ、ケイヒ、ハマメリス、ゲンノショウコ、アセンヤク、紅茶、オトギリソウ、セージ、マロニエ、セイヨウボダイジュ、タイム、ボタンピ、シソ、ガイヨウ、ユキノシタ、チョウトウコウ、ヘンナ、サンショウ、ブドウ葉、センコツ、ハス葉、ラベンダー、キナ、トチュウ、セイヨウノコギリソウ、アイブライト、アルニカ、ハッカ及びビワ葉からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物をそれぞれ挙げることができる。

本発明の皮膚老化防止効果向上剤を配合してなる皮膚外用剤には、必要に応じて、本発明の効果を損なわない範囲で、医薬品、医薬部外品、化粧品などに使用される成分や添加剤を併用することができる。これらの添加成分の具体例を示すと次のとおりである。

界面活性剤としては、例えばセッケン用素地、脂肪酸セッケン、高級アルキル硫酸エステル、アルキルエーテル硫酸エステル塩、Ｎ−アシルサルコシン酸、高級脂肪酸アミドスルホン酸塩、リン酸エステル塩、スルホコハク酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｎ−アシルグルタミン酸塩、高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩、硫酸化油、ＰＯＥアルキルエーテルカルボン酸塩、ＰＯＥアルキルアリルエーテルカルボン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、高級脂肪酸エステルスルホン酸塩、二級アルコール硫酸エステル塩、高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩、ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸塩、Ｎ−パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン、カゼインナトリウム等のアニオン界面活性剤、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジウム塩、アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルイソキノニウム塩、ジアルキルモルホニウム塩、ＰＯＥアルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等のカチオン界面活性剤、イミダゾリン系界面活性剤、ベタイン系界面活性剤等の両性界面活性剤、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体等の親油性非イオン界面活性剤、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル、テトラＰＯＥ・テトラＰＯＰエチレンジアミン縮合物、ＰＯＥ硬化ヒマシ油誘導体、ＰＯＥミツロウ・ラノリン誘導体、アルカノールアミド、ＰＯＥプロピレングリコール脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸アミド、ショ糖脂肪酸エステル等の親水性非イオン界面活性剤などを挙げることができる。

また、油類としては、例えばアボカド油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、キリ油、ホホバ油、カカオ脂、ヤシ油、馬油、パーム油、パーム核油、牛脂、羊脂、豚脂、ラノリン、鯨ロウ、ミツロウ、カルナウバロウ、モクロウ、キャンデリラロウ、スクワラン等の動植物油及びその硬化油。流動パラフィン、ワセリン等の鉱物油、トリパルミチン酸グリセリン等の合成トリグリセリンを挙げることができる。

高級脂肪酸としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、イソステアリン酸、ウンデシン酸、トール酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などがある。高級アルコールとしては、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、セトステアリルアルコール、ホホバアルコール、ラノリンアルコール、バチルアルコール、２−デシルテトラテセシノール、コレステロール、フィトステロール、イソステアリルアルコール等がある。合成エステルとしては、例えば、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、オレンイ酸デシル、ジメチルオクタン酸、乳酸セチル、乳酸ミリスチル等がある。シリコーンとしては、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、デカメチルシクロポリシロキサン等の環状ポリシロキサン、シリコーン樹脂等の三次元網目構造のものを挙げることができる。

保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ムコイチン硫酸、アテロコラーゲン、尿素、乳酸ナトリウム、胆汁酸塩、ｄｌピロリドンカルボン酸塩、可溶性コラーゲン、等のほか、各種動植物抽出物、酵母抽出物などを挙げることができる。

紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸誘導体等の安息香酸系紫外線吸収剤、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート等のアントラニル酸系紫外線吸収剤、アミルサシリレート等のサリチル酸系紫外線吸収剤、オクチルシンナメート等の桂皮酸系紫外線吸収剤、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン等のベンゾフェノン系紫外線吸収剤、４−メチルベンジリデンカンファー、３−ベンジリデンカンファー、２−フェニル−５−メチルベンゾキサゾールなどを挙げることができる。

ビタミン類としては、例えば、ビタミン油、レチノール等のビタミンＡ類、リボフラビン等のビタミンＢ２類、ピリドキシン塩酸塩等のビタミンＢ６類、Ｌ−アスコルビン酸等のビタミンＣ類、パントテン酸カルシウム等のパントテン酸類、エルゴカルシフェノール等のビタミンＤ類、ニコチン酸アミド等のニコチン酸類、酢酸トコフェノール等のビタミンＥ類、ビタミンＰ、ビオチンなどを挙げることができる。

天然水溶性高分子としては、例えば、アラビアガム、トラガントガム、ガラクタン、グアガム、キャロブガム、カラヤガム、カラギーナン、ペクチン、カンテン、クインスシード、アルゲコロイド、デンプン、キサンタンガム、デキストラン、サクシノグルカン、プルラン、コラーゲン、カゼイン、ヒアルロン酸、アルブミン、ゼラチンなどがある。半合成水溶性高分子としては、例えば、メチルセルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース系高分子、カルボキシメチルデンプン等のデンプン系高分子、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸系高分子等がある。合成水溶性高分子としては、例えば、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー等のビニル系高分子、ポリエチレングリコール２０００等のポリオキシエチレン系高分子、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体等の共重合高分子系、ポリアクリルアミド等のアクリル系高分子、ポリエチレンイミン、カチオンポリマーなどを挙げることができる。

粉末成分としては、例えば、タルク、カオリン、雲母、セリサイト、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、シリカ、硫酸バリウム、焼セッコウ、フッ素アパタイト、セラミックパウダー等の無機粉末、ナイロン粉末、ポリエチレン粉末、ポリスチレン粉末、セルロース粉末等の有機粉末などがある。色素剤としては、二酸化チタン、酸化鉄、カーボンブラック、コバルトバイオレツト等の無機顔料、赤色２０１号、赤色３号、黄色２０５号、黄色４号等の有機顔料、クロロフィル、リボフラビン、β−カロチン等の天然色素、ベニバナ、ウコン等の植物抽出物色素等がある。防腐剤としては、安息香酸塩、サリチル酸塩、ソルビン酸塩、デヒドロ酢酸塩、パラオキシ安息香酸エステル、塩化ベンザルコニウム、ヒノキチオール、レゾルシン、エタノール等がある。酸化防止剤としては、トコフェノール、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸エステル等がある。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、クエン酸などを挙げることができる。

さらに、抗菌、細胞賦活、保湿、皮脂分泌調整、消炎、収斂、抗酸化、美白、活性酸素抑制、抗アレルギー等の生理活性作用を有する植物抽出物及びこれらの抽出分画、精製物を併用することもできる。また、上記以外にも、香料、アルコール、水等を適宜配合することができる。

本発明の皮膚老化防止用組成物を配合してなる皮膚外用剤は、一般皮膚化粧料に限定されるものだけではなく、医薬品、医薬部外品、薬用化粧料等を包含する。本発明の皮膚外用剤の剤型は、可溶化系、乳化系、粉末分散系等何れでもよく、用途も、化粧水、乳液、クリーム、パック等の基礎化粧料、ファンデーション等のメークアップ化粧料、シャンプー、リンス、セッケン、ボディーシャンプーなどのトイレタリー製品、浴用剤等いずれでもよい。

本発明の皮膚老化防止効果向上剤を用いると、併用する皮膚老化防止剤の有効使用量を著しく低減することができ、多量の皮膚老化防止剤を用いる場合にもたらされるトラブルを避けることができる。

次に、参考例及び実施例により本発明を実施するための最良の形態を説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。

参考例１
（イ）水溶性画分の抽出工程
ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）を０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、天日乾燥して乾燥物を得た。この乾燥物１００ｇに０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）７００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。

（ロ）粗活性画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度が３５％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、４℃で１時間放置、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度が７０％飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し、添加終了後、４℃で一晩放置した。生成した沈殿を遠心分離して分別した。得られた沈殿画分を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に再溶解し、粗活性画分を得た。得られた粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は２５６単位であり、比活性は３３７２．９単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は６２．４％であった。ここで、凝集活性の単位は、凝集活性が検出できる試料の最大希釈率の逆数と定義した。

（ハ）凝集素の精製工程
次に、このようにして得られた粗活性画分に１００℃、１０分間の熱処理を行い、遠心分離し不溶性の夾雑タンパク質を除去後、ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量１０万以上の画分を分画し、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５ＰＷを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、精製標品を得た。得られた精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は０．８７６３μｇ／ｍｌであった。以上の結果から、本発明の皮膚老化防止効果向上剤を用いると、紅藻類由来の赤血球凝集素が、その活性を保持したまま効果的に得られることが分かる。

精製標品について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン強度依存性を試験したところ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は２０４８単位であり、一方０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は８単位であった。

精製標品に１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は２０４８単位であり、熱処理による凝集活性の消失は認められなかった。赤血球凝集素の凝集活性は、赤血球凝集素の糖結合活性の指標の一つであるので、以上の結果から本発明の皮膚老化防止効果向上剤の赤血球凝集素への糖結合活性は熱に対して安定なことが分かる。

精製標品についてマイトジェン活性を調べるために、ヒトリンパ球幼若化試験を行った。リンパ球幼若化試験は、患者や健常人の末梢血リンパ球のＤＮＡ合成能を測定、比較するのによく用いられる。この反応は一般的な細胞性免疫反応能力を示すと考えられている。測定方法としては、固定染色標本で染色体の出現した細胞数を数える方法、形態学的に観察する方法等もあるが、本例では、³Ｈ−チミジンの細胞核への取り込みを測定する方法を行った。健常人３名分の検体からのリンパ球を用いて実験した。

培養液として、純水１００ｍｌに対してＲＰＭＩ １６４０ １．０５ｇ、ＮａＨＣＯ₃ ０．２ｇ、ペニシリン１００００Ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン１０ｍｇ、ウシ胎児血清１０ｍｌの割合で溶解した水溶液を準備し、フィルターで濾過滅菌後、使用量に合わせて小びんにつめ、密栓して−２０℃で保存した。

比較用マイトジェンとしてインゲンマメレクチンを培養液に溶解して濃度１０〜５０μｇ／ｍｌに調製した。滅菌小試験管に分注、密栓して−２０℃で保存した。

リンパ球の分離は次のように行った。すなわち、ヘパリン添加血液よりフィコール・コンレイ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ）法にてリンパ球を分離し、ＣＭＦ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。分離したリンパ球を培養液１ｍｌに懸濁し、リンパ球数を算定した。次いで培養液で５×１０⁵個／ｍｌに調整したリンパ球浮遊液を得た。

リンパ球の培養は次のように行った。すなわち、マイクロプレートの各ウェルに、リンパ球浮遊液を２００μｌずつ分注した。次いでマイトジェン溶液として、精製標品、陽性コントロールとしての比較用マイトジェン、陰性コントロールとしてのリン酸緩衝液（ＰＥＳ）を各ウェルに２０μｌずつ分注した。次いでＣＯ₂濃度５％、３７℃の空気中、湿潤状態で、３日間培養した。培養終了８時間前に³Ｈ−チミジンを培養液中の最終濃度が１μＣｉ／ｍｌになるように各ウェルに分注した。

活性の測定は次のように行った。すなわち、Ｌａｂｏ−ＭＡＳＨを用いて食塩水でウェル内をハーベストしつつ、細胞をグラスファイバーフィルター上に集め、これを連続吸引してフィルター上の細胞を洗浄した（約２０秒間、生理食塩水約１．５ｍｌ）。次いでグラスフィルター上の細胞固着部を剥離し、カウンティングバイアルに入れた。十分に乾燥させた後、液体シンチレーターとしてトルエンシンチレーター（ＰＯＰＯ ０．１ｇ＋ＰＰＯ ５ｇ／リットル トルエン）５ｍｌをディスペンサーを用いて各バイアルに分注し、シンチレーションカウンターにて計測した。結果を１検体あたり３回の測定の平均値として表１に示す。

この表から、本発明の皮膚老化防止効果向上剤は、従来知られている陸上植物由来の赤血球凝集素よりも高いマイトジェン活性を示すことが分かる。

参考例２
（イ）水溶性画分の抽出工程
ツルシラモ（徳島県吉野川河口域産）湿質量５００ｇを０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、−３０℃で凍結した。３０ｍＭ塩化カリウムと３μＭ硫酸亜鉛、５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含んだ０．５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を抽出用緩衝液として使用し、細かく粉砕した凍結海藻（ツルシラモ湿質量５００ｇ相当）に対し、抽出用緩衝液８００ｍｌを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を４℃で６時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。

（ロ）粗活性画分の分別工程
次いで、この粗抽出液に、最終濃度３５質量％飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて１段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、４℃で１時間放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度７０％飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し添加終了後、４℃で一晩放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）で再溶解し、次いで０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に対して透析し、粗活性画分を得た。得られた粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は２５６単位であった。

（ハ）凝集素の精製工程
次に、このようにして得られた粗活性画分を１００℃１分間で熱処理、遠心分離し不溶性の夾雑タンパク質を除去後、ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量１０万以上の画分を分画し、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５ＰＷを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、精製標品を得た。このようにして得た精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は２０４８単位であった。以上の結果から、本発明の皮膚老化防止効果向上剤が、その活性を保持したまま得られることが分かる。

精製標品について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン強度依存性を検討したところ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は２０４８単位であるのに対し、０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性は８単位であった。

また、精製標品を１００℃１０分間の熱処理を行った後での凝集活性を測定したところ２０４８単位であり、熱処理による凝集活性の低下は認められなかった。

粗活性画分及び精製標品についてマイトジェン活性を測定した。ヒトリンパ球幼若化試験を行った。

次に、³Ｈ−チミジンの取り込みによる、ヒトリンパ球幼若化試験を行って、粗活性画分と精製標品についてのマイトジェン活性を測定した。この場合、すべての細胞培養に要する材料、例えば、マイクロプレート、セルハーベスター、グラスファイバーフィルター、カウンティングバイアル、³Ｈ−チミジン、トルエンシンチレーター（ＰＯＰＯ ０．１ｇ＋ＰＰＯ ５ｇ／リットル トルエン）、液体シンチレーションカウンターの準備及びこれらを用いて行う操作はいずれも無菌的に行った。

次に、培養液として、純水１００ｍｌに対してＲＰＭＩ １６４０ １．０５ｇ、ＮａＨＣＯ₃ ０．２ｇ、ペニシリン１００００Ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン１０ｍｇ、ウシ胎児血清１０ｍｌの割合で溶解した水溶液を準備し、フィルターで濾過滅菌後、使用量にあわせて小びんにつめ、密栓して−２０℃で保存した。この状態で２か月は保存使用可能であった。使用時には使い切るようにし、凍結融解は繰り返さないようにした。

リンパ球は、ヘパリン添加血液からフィコール・コンレイ法により分離した。次いでＣＭＦ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で３回洗浄したのち、培養液１ｍｌに懸濁し、リンパ球数を算定した。次いで培養液で５×１０⁵個／ｍｌに調整した。

リンパ球の培養は、マイクロプレートの各ウェルに、リンパ球浮遊液を２００μｌずつ分注して行った。

次いで、リンパ球の入ったマイクロプレートをクリーンブース内に置いた。３つの実験区により実験を行った。紫外線照射を行わず、３０分間クリーンブース内に放置した対照実験区を実験区Ａとした。マイクロプレート内のリンパ球に対して上方から紫外線照射を３０分間行った実験区を実験区Ｂとした。マイクロプレート内のリンパ球に対して上方から紫外線照射を１６時間行った実験区を実験区Ｃとした。紫外線照射は次のように行った。マイクロプレートをクロマトビューポータブル暗箱（フナコシ株式会社製）に入れ、暗箱上部取り付けた６ワット・ハンディ型ＵＶランプＵＶＬ−５６型ブラックレイランプ（フナコシ株式会社製）より、長波長（３６５ｎｍ）の紫外線を照射した。この際の３６５ｎｍの紫外線強度は、デジタル式ＵＶＸ ＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ紫外線強度計（フナコシ株式会社製）にＭＯＤＥＬ ＵＶＸ−３６センサー（フナコシ株式会社製）を接続して測定した。マイクロプレートの位置での紫外線強度は、０．６３ｍＷ／ｃｍ²であった。

次いで、それぞれの実験区に対して、マイトジェン溶液として、粗活性画分、精製標品、リン酸緩衝液（ＰＥＳ）を各ウェルに２０μｌずつ分注した。粗活性画分は、緩衝液で希釈した希釈液（１０倍希釈から３２０倍希釈）を調製し、実験に供した。粗活性画分での³Ｈ−チミジンの取り込み量（ｃｐｍ）は、希釈液での測定値に希釈倍率を乗じて原液に換算した値を算出することにより求めた。精製標品は、緩衝液で希釈した希釈液（１０倍希釈から３２０倍希釈）を調製し、希釈液を実験に供した。精製標品での³Ｈ−チミジンの取り込み量（ｃｐｍ）は、希釈液での測定値に希釈倍率を乗じて原液に換算した値を算出することにより求めた。
次いで５％ＣＯ₂含有空気中３７℃の湿潤状態で、３日間培養した。培養終了８時間前に³Ｈ−チミジンを培養液当りの最終濃度が１μＣｉ／ｍｌになるように各ウェルに分注した。

活性の測定は次のように行った。Ｌａｂｏ−ＭＡＳＨ等を用いて食塩水でウェル内をハーベストしつつ、細胞をグラスファイバーフィルター上に集め、これを連続吸引してフィルター上の細胞を洗浄した（約２０秒間、生理食塩水約１．５ｍｌ）。次いでグラスフィルター上の細胞固着部を剥離し、カウンティングバイアルに入れた。次いで充分乾燥させた後、液体シンチレーター ５ｍｌをディスペンサーを用いて各バイアルに分注し、シンチレーションカウンターにて計測した。実施例１で用いた３人とは別の３人の検体（以下、検体ａ、ｂ及びｃという）からのリンパ球を用いて実験した。ある実験条件での実験数を３回（表には１、２、３と記載）とし、平均は３回の測定の平均値を示す。その検体ａについての結果を表２、検体ｂについての結果を表３、検体ｃについての結果を表４にそれぞれ示す。

表２ないし４の実験区Ａから明らかなように、参考例２で得られた粗活性画分及び精製標品からなる本発明の皮膚老化防止効果向上剤は、陰性コントロールと比べて、³Ｈ−チミジンの取り込み量がそれぞれ６００倍以上及び３４００倍以上と著しく多いので、優れたマイトジェン活性を示すことが分かる。
また、表２ないし４の陰性コントロールの平均値から明らかなように、紫外線を照射すると、³Ｈ−チミジンの取り込み量、すなわち免疫力が低下することが分かるが、実験区Ｂ及びＣの結果から明らかなように、本発明の皮膚老化防止効果向上剤を添加することにより、紫外線を照射しても³Ｈ−チミジンの取り込みが促進されることが分かる。
以上の結果から、自己免疫増強成分の粗活性画分・精製標品を紫外線照射処理によりＤＮＡ合成能力（³Ｈ−チミジンの取り込みなど）など免疫力が低下したヒトリンパ球に対して添加することにより、当該リンパ球のＤＮＡ合成能力など免疫力を増強させることができる。また、紫外線照射時間が３０分以内であれば、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に自己免疫増強成分を添加した場合と同等のＤＮＡ合成能力まで上昇させることができる。紫外線を１６時間照射しても、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に自己免疫増強成分を添加した場合の５０％以上のＤＮＡ合成能力まで上昇させることができるし、紫外線を照射しなかった陰性コントロールと比較すると、³Ｈ−チミジンの取り込み量がはるかに多いことが分かる。

参考例３
参考例１−（ロ）の粗活性画分の分別工程において、硫酸アンモニウム添加による２段階の塩析による分別処理の代わりに、５０質量％エタノールによる分別処理［「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第２７巻、第２０６３〜２０６７ページ（１９８８年）参照］を行った以外は、参考例１と同様にして粗活性画分を得た。この粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は４単位、比活性は５３．４単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は５．０％であった。これらの結果を表５に示す。比較のために参考例１の結果も併記した。

参考例４
常用の方法［「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｉｓｉｏｌ．）」第１０２Ｂ巻、第４４５〜４４９ページ（１９９２年）に記載されている方法］に従って、紅藻類由来の赤血球凝集素を得た。得られた粗活性画分の赤血球凝集活性は１６単位、比活性は１４９．５単位／ｍｇプロテイン、活性回収率は１９．５％であった。これらの結果を表５に示す。また、精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は３２．６μｇ／ｍｌであり、参考例１の約１／４０の比活性に相当した。これらの結果を表５に示す。

参考例５
紅藻類から常用の方法［「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｉｓｉｏｌ．）」第１０２Ｂ巻、第４４５〜４４９ページ（１９９２年）に記載されている方法］に従って精製した分子量５０，０００の凝集素について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度及び０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに１０２４単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は認められなかった。これらの結果を表６に示す。

参考例６
Ｃｏｎ Ａ［和光純薬（株）製］２５ｍｇをリン酸緩衝液１００ｍｌに溶解し、ウサギ赤血球凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。０．１５Ｍ塩化ナトリウム濃度及び０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに６４単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は認められなかった。これらの結果を表６に示す。比較のために参考例１の結果も併記した。

Ｃｏｎ Ａを１００℃、１０分間の熱処理を行った後での凝集活性は検出されず、熱処理により凝集活性の消失が認められた。

表５から明らかなように、本発明の皮膚老化防止効果向上剤は、凝集活性、比活性、活性回収率がいずれも高く、活性回収率は参考例３の約１２倍、参考例４の約３倍、比活性は参考例３の約６３倍、参考例４の約２３倍である。また、表６から参考例１の精製凝集素は参考例５及び６のものと異なり、ウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により制御されることが分かる。

参考例７
皮膚老化防止用組成物に用いられる植物エキスのエステラーゼ活性阻害について試験した。
（エラスターゼ活性阻害の評価）
ヒト線維芽細胞由来エラスターゼ及び合成基質としてＳｕｃ−（Ａｌａ）₃−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて評価した。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。また、反応緩衝液として、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を用いた。

（試験方法）
合成基質をＤＭＳＯにて溶解し、１００μｌずつマイクロチューブに分注し凍結保存した。使用時に反応緩衝液を用いて希釈し６ｍＭとした。エラスターゼは、ヒト正常線維芽細胞を１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭにて１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間培養後、ＰＢＳ（−）で一回洗浄し、０．５％ ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００／ＰＢＳ（−）を２５μｌ添加、溶解した細胞液を用いた。
９６穴プレートに、それぞれ試験試料２５μＬ、６ｍＭの合成基質５０μｌを加え、直ちに３７℃にて２時間インキュベーションした。その後、プレートリーダーで４０５ｎｍにて吸光度を測定した。

測定結果より次式によりエラスターゼ阻害率を算出し、各固形物濃度より、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度を算出した。本発明ではＩＣ５０とは、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度のことをいう。
エラスターゼ阻害率（％）＝〔１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）〕×１００
Ａ：試料溶液添加、エラスターゼ添加時の吸光度
Ｂ：試料溶液添加、エラスターゼ無添加時の吸光度
Ｃ：試料無添加、エラスターゼ添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加、エラスターゼ無添加時の吸光度
ただし、各無添加のときには、それぞれ精製水、緩衝液を代わりに用いた。試験結果活性の高かったものを表７に示す。

参考例８
皮膚老化防止用組成物に用いられる各種植物エキスについてのコラゲナーゼ阻害活性を試験した。
（コラゲナーゼ阻害活性の評価）
Ｗｕｎｓｃｈ−Ｈｅｉｄｒｉｃｈ法を一部変更した方法（薬学雑誌１１８，４２３−４２９，１９９８）により測定した。コラゲナーゼは、Ｓｉｇｍａ社製ＴｙｐｅＩＶを５ｍｇ／ｍｌとし１００μｌずつ分注し凍結保存する。使用時に５０倍希釈し０．１ｍｇ／ｍｌとして使用した。コラゲナーゼ合成基質は、ＰＺ−ペプチド（Ｐｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ，Ｂａｃｈｅｍ社製）０．５ｍｇに調製した。希釈液は、ともに０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．１，２０ｍＭＣａＣｌ₂を含有）を使用した。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。

（試験方法）
合成基質４００μｌ、コラゲナーゼ５０μｌ、試験試料５０μｌを加え、３７℃にて３０分間反応させた後、２５ｍＭクエン酸溶液１ｍｌを加えて反応を停止させた。酢酸エチル５ｍｌを加えて激しく振とうさせた後、２５００ｒｐｍにて遠心分離した。酢酸エチル層をとり、３２０ｎｍで吸光度を測定した。
測定結果より次式によりコラゲナーゼ阻害率を算出し、各固形物濃度より、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度を算出した。本発明ではＩＣ５０とは、５０％阻害率を示すエキスの固形物濃度のことをいう。
コラゲナーゼ阻害率（％）＝〔１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）〕×１００
Ａ：試料溶液添加、コラゲナーゼ添加時の吸光度
Ｂ：試料溶液添加、コラゲナーゼ無添加時の吸光度
Ｃ：試料無添加、コラゲナーゼ添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加、コラゲナーゼ無添加時の吸光度
ただし、各無添加のときには、それぞれの水を代わりに用いた。試験結果活性の高かったものを表８に示す。

参考例９
皮膚老化防止用組成物に用いられる各種植物エキスのヒアルロン酸産生促進作用について試験した。
（ヒアルロン酸産生促進作用の評価）
正常ヒト皮膚線維芽細胞を０．５％ＦＢＳ含有ＭＥＭを用いて、９６穴プレートに２．０×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種し、２４時間培養後、試験試料含有ＭＥＭに交換し、５日間培養した。培養上清のヒアルロン酸量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。同時にＭＴＴ還元法にて線維芽細胞数を測定し、細胞当たりのヒアルロン酸産生量を算出した。試料を含有しない対照の細胞当たりヒアルロン酸産生量を１００とし、相対値で示した。試験試料は、各植物１０ｇに精製水１００ｇを加え、７０℃にて３時間抽出した後、ろ過し、固形分濃度１％に調製したものを０．５％添加した。試験の結果を表９に示す。

参考例１０
皮膚老化防止用組成物に用いられる各種植物エキスのコラーゲン産生促進作用について試験した。
（コラーゲン産生促進作用の評価）
正常ヒト皮膚線維芽細胞を０．５％ＦＢＳ含有ＭＥＭを用いて、９６穴プレートに２．０×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種し、２４時間培養後、ＰＢＳ（−）にて洗浄後、試料を添加した無血清培地に交換し、４８時間培養する。培養後、培養上清中に含まれるＩ型コラーゲンをＥＬＩＳＡ法にて定量した。１００μｌの培養上清をＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、１８時間室温に保管した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、１％スキムミルク／ＰＢＳ−Ｔで２時間ブロッキングした。抗ヒトＩ型コラーゲン抗体、ペルオキシダーゼ標準抗ラットＩｇＧ抗体で処理し、ペルオキシダーゼ用発色キットを用いて発色させた。４５０ｎｍの吸光度から培養上清中に含まれるＩ型コラーゲン量を求め、単位蛋白当たりとして算出した。蛋白定量は、Ｌｏｗｒｙ法を用いた。コントロールのＩ型コラーゲン量を１００とした相対値として評価した。試験試料は、各植物１０ｇに精製水１００ｇを加え、７０℃にて３時間抽出した後、ろ過し、固形分濃度１％に調製したものを０．５％添加した。試験の結果を表１０に示す。

参考例１１
皮膚老化防止用組成物に用いられる抗酸化剤のＳＯＤ様活性酸素消去作用について試験した。
（活性酸素消去作用ＳＯＤ様活性作用の測定）
ＳＯＤ様活性は、ＮＢＴ法（ＸＯＤ系と組み合わせたＢｅａｕｃｈａｍｐｓらの方法Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ．，４４、２７９〜２８７、１９７１）に従った。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。その結果を表１１に記す。

参考例１２
皮膚老化防止用組成物に用いられる抗酸化剤のＤＰＰＨラジカル消去能の測定を行った。
ＤＰＰＨ（ジフェニルピクリルヒドラジルラジカル）ラジカル（Ｓｉｇｍａ社）をエタノールに溶解し０．１ｍＭ溶液とした。０．１ｍＭＤＰＰＨラジカル溶液３ｍｌを試験管にとり、試験溶液０．５ｍｌを加え、室温で１０分間放置後、波長５１７ｎｍで吸光度を測定した。コントロールには、試験試料の代わりに精製水を用いた。消去能は、ＢＨＡ４２．３μｇ／ｍｌでの反応に対応する試験試料の抽出物固形量で比較した。試験試料は、各植物１０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液１００ｇを加え、５０℃にて５時間抽出した後、ろ過し、濃縮後凍結乾燥したものを精製水にて溶解し、各抽出物固形分濃度を設定した。その結果を表１２に記す。

皮膚の老化防止向上試験
皮膚の抗老化効果を調べるために、下記実施例に示す組成の化粧料を用いて、以下の方法により、しわに対する改善効果と、肌のはり、たるみに対する改善効果について評価試験を行った。

無作為に抽出した年齢３０〜５０歳の健常な女性９０名を３グループに分け被験者とし、試験物質を含むクリーム及び試験物質の代わりに精製水を含む比較例クリームをそれぞれ顔面皮膚に連日２か月使用した後、しわに対する改善効果と肌のはり、たるみに対する改善効果について調べた。試験物質の組成は表１３に示す。使用した植物エキスは、市販のもの（香栄興業製）を用いた。また、試験の結果を表１４に示す。

下記成分（１）〜（１０）、別に下記成分（１１）〜（１６）を７５℃に加温溶解しそれぞれＡ液及びＢ液とする。Ａ液にＢ液を加えて乳化し、クリームを調製した。
成 分 質 量％
（１）ホホバ油 ３．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）メチルポリシロキサン ０．５％
（４）ステアリルアルコール ０．５％
（５）セチルアルコール ０．５％
（６）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル １２．５％
（７）モノステアリン酸グリセリル ５．０％
（８）モノステアリン酸ジグリセリル １．５％
（９）モノステアリン酸デカグリセリル ３．０％
（10）パラオキシ安息香酸プロピル ０．１％
（11）キサンタンガム ０．１％
（12）表１３に示す試験物質
（13）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（14）グリチルリチン酸ジカリウム ０．０５％
（15）パラオキシ安息香酸メチル ０．２％
（16）精製水 残余

「しわに対する改善効果」
目尻のしわの状態を視覚評価した。
（判定基準）
著効 ：しわがほとんどめだたなくなった
有効 ：しわがかなり目立たなくなった
やや有効：しわが以前より目立たなくなった
効果なし：変化なし
「肌のはり、たるみに対する改善効果」
肌のはり、たるみを視覚評価した。
（判定基準）
著効 ：使用前に比べ肌に非常にはりがあり、たるみがない
有効 ：使用前に比べ肌にややはりがあり、たるみがない
やや有効：使用前に比べ肌にややはりがあり、たるみが減少した
効果なし：変化なし

表１４から明らかなように、実施例のクリームを用いた場合には、比較例のクリームを用いた場合よりも、目尻のしわ及び肌のはり、たるみの点で改善されていることが認められた。また、皮膚老化防止剤に皮膚老化防止効果向上剤を加えることにより、皮膚老化防止剤の効果が増進することが明らかとなり、これらを含有する化粧料は、皮膚の老化防止に有効な化粧料であることが確認された。

以下にさらに、本発明の化粧品処方例を示す。

下記成分（７）〜（１０）を混合溶解させＡ液とし、これとは別に下記成分（１）〜（６）及び（１１）を混合溶解させてＢ液とし、Ａ液とＢ液を均等に混合し、化粧水を調製した。
成 分 質 量％
（１）クインスシードエキス ８．０％
（２）グリセリン ３．０％
（３）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（４）オゴノリ粗活性画分 ２．０％
（５）パシャンベ抽出液 １．０％
（６）ブクリョウ抽出液 １．０％
（７）ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル １．２％
（８）エチルアルコール ５．０％
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．２％
（10）香料 ０．１％
（11）精製水 残余

下記成分（１）〜（１０）、別に（１１）〜（１５）及び（１７）を７５℃で加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１６）を加え、乳液を調製した。
成 分 質 量％
（１）ホホバ油 １．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）ベヘニルアルコール １．０％
（４）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル ２．０％
（５）テトラグリセリン縮合シリノレイン酸 ０．１％
（６）モノオレイン酸プロピレングリコール ０．５％
（７）モノステアリン酸グリセリン １．０％
（８）モノミレスチン酸ヘキサグリセリル １．０％
（９）モノミリスチン酸デカグリセリル ０．５％
（10）パラオキシ安息香酸プロピル ０．１％
（11）クインスシードエキス ５．０％
（12）オゴノリ粗活性画分 ２．０％
（13）フトモモ抽出物 ２．０％
（14）シモツケソウ抽出液 １．０％
（15）１，３−ブチレングリコール ３．０％
（16）香料 ０．１％
（17）精製水 残余

セッケン製造の定法により下記成分を混合しセッケンを調製した。
成 分 質 量％
（１）セッケン素地 ５３．２％
（２）スクロール １９．４％
（３）ホホバ油 ０．２５％
（４）ツルシラモ粗活性画分 ２．５％
（５）ショウキョウ抽出液 ２．０％
（６）ワレモコウ抽出液 １．０％
（７）濃グリセリン ６．５％
（８）ヒドロキシエタンジホスホン酸 ０．１５％
（９）常水 残余

下記成分（１）〜（３）、別に（４）〜（８）及び（１０）を７０℃に加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて均一になるまで攪拌する。攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（９）を加えてクレンジングジェルを調製した。
成 分 質 量％
（１）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル ２０．０％
（２）流動パラフィン ５８．８％
（３）パラオキシ安息香酸エステル ０．３％
（４）ツルシラモ粗活性画分 １．０％
（５）ホホバ葉抽出液 ０．５％
（６）パシャンベ抽出液 ０．５％
（７）濃グリセリン ５．９％
（８）ソルビトール ５．０％
（９）香料 ０．１％
（10）精製水 残余

Ａ相、Ｂ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ａ相にＢ相を加えて可溶化し、次いでＣ相を加えて均一に溶解し、パック剤を調製した。
成 分 質 量％
（Ａ相）ジプロピレングリコール ５．０％
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ５．０％
（Ｂ相）オリーブ油 ５．０％
酢酸トコフェノール ０．２％
パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（Ｃ相）亜硫酸水素ナトリウム ０．０３％
ポリビニルアルコール １３．０％
オゴノリ粗活性画分 １．０％
ブクリョウ抽出液 ０．５％
フトモモ抽出液 ０．５％
エタノール ７．０％
精製水 残余

下記成分（１）〜（６）を充分に混合粉砕した粉末部をＡとし、（７）（８）をＢ液、（９）〜（１４）及び（１６）をＣ液とする。Ｃ液を加熱攪拌後、Ａを添加しホモミキサー処理し、さらに加熱混合したＢ液を加えてホモミキサー処理する。攪拌しながら５０℃まで冷却し、（１５）を加え、さらに室温まで冷却して乳化ファンデーションを調製した。
成 分 質 量％
（１）二酸化チタン １０．３％
（２）セリサイト ５．４％
（３）カオリン ３．０％
（４）黄色酸化鉄 ０．７％
（５）ベンガラ ０．４％
（６）黒色酸化鉄 ０．２％
（７）デカメチルシクロペンタシロキサン １１．５％
（８）流動パラフィン ８．５％
（９）セスキオレイン酸ソルビタン ３．０％
（10）ツルシラモ粗活性画分 １．５％
（11）クジン抽出液 １．５％
（12）チョウジ抽出液 １．５％
（13）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（14）パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（15）香料 ０．２％
（16）精製水 残余

下記成分（１）〜（７）をブレンダーで均一に混合し、これに（８）〜（１６）を加え、よく混練して固形ファンデーションを調製した。
成 分 質 量％
（１）タルク ４２．４％
（２）カオリン １５．５％
（３）セリサイト １０．０％
（４）亜鉛華 ７．０％
（５）二酸化チタン ３．８％
（６）黄色酸化鉄 ２．９％
（７）黒色酸化鉄 ０．２％
（８）スクワラン ７．５％
（９）イソステアリン酸 ４．０％
（１０）モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン ３．０％
（１１）オクタン酸イソセチル ２．０％
（１２）オゴノリ粗活性画分 ０．５％
（１３）ローマカミツレ抽出液 ０．５％
（１４）サイシン抽出液 ０．５％
（１５）パラオキシ安息香酸エステル ０．１％
（１６）香料 ０．１％

上記実施例１〜８の皮膚外用剤は、いずれも優れた皮膚老化防止効果を示した。

本発明の皮膚老化防止効果向上剤は、皮膚老化防止用組成物の成分として有用である。

Claims (13)

1. オゴノリ属紅藻類（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｓｐ．）からの塩類水溶液による液状抽出物を有効成分とし、かつ、
   ショウキョウ抽出液、シラカバ抽出液、ブクリョウ抽出液、ローマカミツレ抽出液及びオプティア・ストレプタカンサ抽出液を含む皮膚老化防止用組成物。
2. さらに、パシャンベ抽出液及びフトモモ抽出液を含む請求項１記載の皮膚老化防止用組成物。
3. オゴノリ属紅藻類がオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）又はツルシラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ ｃｈｏｒｄａ）あるいはそれらの亜種である請求項１または２記載の皮膚老化防止用組成物。
4. 液状抽出物がプロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害されることで特徴付けられる請求項１ないし３のいずれかに記載の皮膚老化防止用組成物。
5. 液状抽出物がウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化することで特徴付けられる請求項１ないし４のいずれかに記載の皮膚老化防止用組成物。
6. 液状抽出物が球状タンパク質を標準分子量物質として使用するゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分子量１００，０００以上に相当する画分に溶出することで特徴付けられる請求項１ないし５のいずれかに記載の皮膚老化防止用組成物。
7. 液状抽出物が細胞性免疫能力賦活活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし６のいずれかに記載の皮膚老化防止用組成物。
8. 液状抽出物が１００℃、１０分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有することで特徴付けられる抽出物である請求項１ないし７のいずれかに記載の皮膚老化防止用組成物。
9. 液状抽出物がヒトリンパ球を幼若化する活性を有することで特徴付けられる請求項１ないし８のいずれかに記載の皮膚老化防止用組成物。
10. オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度３５〜４０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第１段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度６０〜８０％飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第２段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶媒で溶解することにより細胞性免疫能力賦活活性を示す液状抽出物を分離し、捕集したものを、ショウキョウ抽出液、シラカバ抽出液、ブクリョウ抽出液、ローマカミツレ抽出液及びオプティア・ストレプタカンサ抽出液を含む皮膚老化防止用組成物に配合することを特徴とする皮膚老化防止用組成物の製造方法。
11. 液状抽出物をさらに１００℃において１〜１０分間熱処理して夾雑タンパク質を除去し、次いでゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量１００，０００以上の画分を分画したのち、この画分をクロマトグラフィーにより分離、精製する請求項１０記載の皮膚老化防止用組成物の製造方法。
12. 塩類水溶液が塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液である請求項１０又は１１記載の皮膚老化防止用組成物の製造方法。
13. 塩類水溶液が塩化カリウム、硫酸亜鉛及び２−メルカプトエタノールから選ばれた少なくとも１種を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液である請求項１０又は１１記載の皮膚老化防止用組成物の製造方法。