CN105950543A - 一种表皮细胞的扩增制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表皮细胞的扩增制备方法，按照如下步骤进行：无菌条件下将包皮环切手术切下的包皮洗涤并剪碎，去除皮下组织后，将表皮和真皮分离，之后加入胰蛋白酶‑EDTA溶液中消化一定时间后，离心并弃上清液，并将得到的表皮细胞群接种于培养瓶内，置于培养箱中培养；接种3d后第一次换液，以后每隔2d换液一次，12‑14d后终止培养。通过在基础培养液中加入胰岛素，转铁蛋白，生长激素与视黄酸，其中，胰岛素可以促进表皮组织中DNA的合成，转铁蛋白可以控制体液中自由铁的平衡，视黄酸有控制表皮细胞正常生长分化的能力，并可抑制多种致癌因素诱发的体外培养细胞的恶性转化，所配置的培养液对表皮细胞的体外培养具有促进作用。

Description

一种表皮细胞的扩增制备方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，特别是涉及一种表皮细胞的扩增制备方法。
背景技术
皮肤由表皮、真皮和皮下组织组成,是人体最大最复杂的器官,具有保护、分泌、感知和代谢功能。皮肤缺损是一种常见的组织损伤性疾病。对于大面积深度烧伤的治疗一直以自体皮移植为首选方案,然而自体供皮不足是临床遇到的主要问题。虽可应用异体皮、异种皮移植物,但只能作为一种临时性创面覆盖物。因此人们一直在寻找一种永久性皮肤替代物,而永久性皮肤替代物仍依赖于有活性的种子细胞(表皮细胞和成纤维细胞)。至今，成纤维细胞的培养技术已经日臻完善,但表皮细胞的培养仍然是一个难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表皮细胞的扩增制备方法，通过在基础培养液中加入胰岛素，转铁蛋白，生长激素与视黄酸，确定了一种无血清培养表皮细胞的培养方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种表皮细胞的扩增制备方法，按照如下步骤进行：
步骤(1)、配置表皮细胞培养液；
步骤(2)、无菌条件下将包皮环切手术切下的包皮洗涤并剪碎；
步骤(3)、将所述步骤(2)中剪碎的包皮组织块修剪去除皮下组织后，剪碎并将表皮和真皮分离；将分离后的表皮组织加入胰蛋白酶-EDTA溶液中消化20-30min后，加入步骤(1)中配置的表皮细胞培养液终止消化；
步骤(4)、将所述步骤(3)中的得到的表皮组织悬液离心，弃上清液，得到表皮组织细胞群；
步骤(5)、于培养瓶中加入2mL所述步骤(1)中配置的表皮细胞培养液，将所述步骤(4)中得到的表皮组织细胞群以1×105个/mL接种于培养瓶内，静置30-60min后置于37℃、5％CO2培养箱中培养；接种3d后第一次换液，以后每隔2d换液一次，12-14d后终止培养。
进一步地，所述步骤(1)中表皮细胞培养液包括基础培养液以及胰岛素8-12μg/mL，转铁蛋白0.5-1μg/mL，生长激素5μg/mL，抗生素50-100μg/mL，视黄酸5×10-7mol/L。
进一步地，所述基础培养液为无血清培养液D-KSFM或KSFM中的一种。
进一步地，所述抗生素为氯霉素、新霉素中的一种或两种混合。
进一步地，所述步骤(2)中将包皮环切手术切下的包皮用0.1mol/L磷酸缓冲溶液洗涤3-5次后剪碎至体积为0.5-1cm3。
进一步地，所述步骤(3)中将包皮组织剪碎成体积为2-3mm3的皮片。
进一步地，步骤(3)中所述胰蛋白酶-EDTA溶液中胰蛋白酶浓度为2.5g/L，EDTA体积分数为0.02％。
进一步地，所述步骤(4)中离心速率为800-1500r/min，离心时间为30min。
本发明具有以下有益效果：
本发明中提出的一种表皮细胞的扩增制备方法，在基础培养液中加入胰岛素，转铁蛋白，生长激素与视黄酸，其中，胰岛素可以提高体外培养的核分裂率，还能促进表皮组织中DNA的合成，转铁蛋白可以结合、运输三价铁离子，从而控制体液中自由铁的平衡，视黄酸是维生素A中活性最强的衍生物，有控制表皮细胞正常生长分化的能力，并可抑制多种致癌因素诱发的体外培养细胞的恶性转化，所配置的培养液对表皮细胞的体外培养具有促进作用。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种表皮细胞的扩增制备方法，该方法具体步骤如下：
实施例1
步骤(1)、在D-KSFM培养液中加入胰岛素8μg/mL，转铁蛋白0.5μg/mL，生长激素5μg/mL，氯霉素50μg/mL，视黄酸5×10-7mol/L，配置成表皮细胞培养液；
步骤(2)、无菌条件下将包皮环切手术切下的包皮经0.1mol/L磷酸缓冲溶液洗涤3次，将洗涤后的包皮组织剪碎至体积为0.5cm3；
步骤(3)、用无菌镊和剪刀将步骤(2)中剪碎的包皮组织块修剪去除皮下组织后，剪碎成体积为2mm3的皮片；
用无菌镊和剪刀将皮片中的表皮和真皮分离，37℃条件下将分离后的表皮组织加入到胰蛋白酶-EDTA溶液中消化20min，其中，胰蛋白酶浓度为2.5g/L，EDTA体积分数为0.02％；
在表皮组织悬液中加入步骤(1)中配置的表皮细胞培养液终止消化；
步骤(4)、将步骤(3)中的得到的表皮组织悬液以800r/min离心30min，弃上清液，得到表皮组织细胞群；
步骤(5)、于培养瓶中加入2mL步骤(1)中配置的表皮细胞培养液，将步骤(4)中得到的表皮组织细胞群以1×105个/mL接种于培养瓶内，静置30min后置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
接种3d后第一次换液，以后每隔2d换液一次，12d后终止培养。
实施例2
步骤(1)、在KSFM培养液中加入胰岛素12μg/mL，转铁蛋白1μg/mL，生长激素5μg/mL，新霉素100μg/mL，视黄酸5×10-7mol/L，配置成表皮细胞培养液；
步骤(2)、无菌条件下将包皮环切手术切下的包皮经0.1mol/L磷酸缓冲溶液洗涤5次，将洗涤后的包皮组织剪碎至体积为1cm3；
步骤(3)、用无菌镊和剪刀将步骤(2)中剪碎的包皮组织块修剪去除皮下组织后，剪碎成体积为3mm3的皮片；
用无菌镊和剪刀将皮片中的表皮和真皮分离，37℃条件下将分离后的表皮组织加入到胰蛋白酶-EDTA溶液中消化30min，其中，胰蛋白酶浓度为2.5g/L，EDTA体积分数为0.02％；
在表皮组织悬液中加入步骤(1)中配置的表皮细胞培养液终止消化；
步骤(4)、将步骤(3)中的得到的表皮组织悬液以1500r/min离心30min，弃上清液，得到表皮组织细胞群；
步骤(5)、于培养瓶中加入2mL步骤(1)中配置的表皮细胞培养液，将步骤(4)中得到的表皮组织细胞群以1×105个/mL接种于培养瓶内，静置60min后置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
接种3d后第一次换液，以后每隔2d换液一次，14d后终止培养。
实施例3
步骤(1)、在KSFM培养液中加入胰岛素10μg/mL，转铁蛋白0.7μg/mL，生长激素5μg/mL，链霉素50μg/mL，新霉素50μg/mL，视黄酸5×10-7mol/L，配置成表皮细胞培养液；
步骤(2)、无菌条件下将包皮环切手术切下的包皮经0.1mol/L磷酸缓冲溶液洗涤4次，将洗涤后的包皮组织剪碎至体积为0.7cm3；
步骤(3)、用无菌镊和剪刀将步骤(2)中剪碎的包皮组织块修剪去除皮下组织后，剪碎成体积为2.5mm3的皮片；
用无菌镊和剪刀将皮片中的表皮和真皮分离，37℃条件下将分离后的表皮组织加入到胰蛋白酶-EDTA溶液中消化25min，其中，胰蛋白酶浓度为2.5g/L，EDTA体积分数为0.02％；
在表皮组织悬液中加入步骤(1)中配置的表皮细胞培养液终止消化；
步骤(4)、将步骤(3)中的得到的表皮组织悬液以1200r/min离心30min，弃上清液，得到表皮组织细胞群；
步骤(5)、于培养瓶中加入2mL步骤(1)中配置的表皮细胞培养液，将步骤(4)中得到的表皮组织细胞群以1×105个/mL接种于培养瓶内，静置30-60min后置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
接种3d后第一次换液，以后每隔2d换液一次，13d后终止培养。
本发明中提出的一种表皮细胞的扩增制备方法，在基础培养液中加入胰岛素，转铁蛋白，生长激素与视黄酸，胰岛素可以提高体外培养的核分裂率，还能促进表皮组织中DNA的合成，转铁蛋白可以结合、运输三价铁离子，从而控制体液中自由铁的平衡，视黄酸是维生素A中活性最强的衍生物，有控制表皮细胞正常生长分化的能力，并可抑制多种致癌因素诱发的体外培养细胞的恶性转化，所配置的培养液对表皮细胞的体外培养具有促进作用。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种表皮细胞的扩增制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：
步骤(1)、配置表皮细胞培养液；
步骤(2)、无菌条件下将包皮环切手术切下的包皮洗涤并剪碎；
步骤(3)、将所述步骤(2)中剪碎的包皮组织块修剪去除皮下组织后，剪碎并将表皮和真皮分离；将分离后的表皮组织加入胰蛋白酶-EDTA溶液中消化20-30min后，加入步骤(1)中配置的表皮细胞培养液终止消化；
步骤(4)、将所述步骤(3)中的得到的表皮组织悬液离心，弃上清液，得到表皮组织细胞群；
步骤(5)、于培养瓶中加入2mL所述步骤(1)中配置的表皮细胞培养液，将所述步骤(4)中得到的表皮组织细胞群以1×105个/mL接种于培养瓶内，静置30-60min后置于37℃、5％CO2培养箱中培养；接种3d后第一次换液，以后每隔2d换液一次，12-14d后终止培养。
2.根据权利要求1所述的一种表皮细胞的扩增制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中表皮细胞培养液包括基础培养液以及胰岛素8-12μg/mL，转铁蛋白0.5-1μg/mL，生长激素5μg/mL，抗生素50-100μg/mL，视黄酸5×10-7mol/L。
3.根据权利要求2所述的一种表皮细胞的扩增制备方法，其特征在于：所述基础培养液为无血清培养液D-KSFM或KSFM中的一种。
4.根据权利要求2所述的一种表皮细胞的扩增制备方法，其特征在于：所述抗生素为氯霉素、新霉素中的一种或两种混合。
5.根据权利要求1所述的一种表皮细胞的扩增制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中将包皮环切手术切下的包皮用0.1mol/L磷酸缓冲溶液洗涤3-5次后剪碎至体积为0.5-1cm3。
6.根据权利要求1所述的一种表皮细胞的扩增制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中将包皮组织剪碎成体积为2-3mm3的皮片。
7.根据权利要求1所述的一种表皮细胞的扩增制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述胰蛋白酶-EDTA溶液中胰蛋白酶浓度为2.5g/L，EDTA体积分数为0.02％。
8.根据权利要求1所述的一种表皮细胞的扩增制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中离心速率为800-1500r/min，离心时间为30min。
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