CN105219696A - 一种新型的人表皮培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型的人表皮培养方法，其包括以下步骤：(1)皮肤样本处理和细胞分离；(2)表皮细胞的培养；(3)表皮细胞的传代和组织工程皮肤的剥离：(4)组织工程皮肤质检。所述KMSFM培养基的配置方法是：以Gibco的DKSFM为基础，使用低钙离子浓度，同时添加牛脑垂体提取物(BPE)、牛胰岛素、牛转铁蛋白、bFGF、皮质醇、肝素和内皮素配置得到。本发明提供的新型的人表皮培养方法，去除了牛血清，可以大大减少非人源成分的混入，降低成本和不安全因素；使用I型胶原包被的培养体系提高了由于去除滋养层细胞带来的细胞生长缓慢，可以用来治疗皮肤色素疾病，比如白癜风、巨大色素痣等疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的人表皮培养方法及其制备的组织工程皮肤。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，它由三部分即表皮层、真皮层和皮下层构成。表皮层位于皮肤的最外层，厚度介于0.06-0.8mm之间，其微结构由基底层、棘细胞层、颗粒细胞层和角质层构成。表皮培养技术的“Green法”，是由哈佛医学院HawardGreen教授在1975年确立的皮肤表皮细胞的多层培养法。
“Green法”法指的是数层细胞的培养，最终形成表皮状。这个方法成功地制造出了类似于皮肤的表皮组织。这个类似于正常表皮的构造是角质细胞集合体，是依靠粘着斑等来加强细胞间的联系而形成的，有能被剥离的强度，可用于移植。“Green法”的技术的特点，是用丝裂霉素处理过的不能增殖的滋养层细胞和分离到的患者自身的表皮细胞共同培养。
经过几十年的发展，表皮培养技术也在不断发展，主要是通过使用成分确定的培养基和真皮类似物替代血清和滋养层细胞来大大提高表皮培养的简便性以及降低成本。因为血清和来自动物的滋养层细胞的使用不利于培养表皮的临床使用，增加感染和免疫反应的风险，也不利于质量控制。
同时，临床上自体表皮移植治疗疾病往往需要含有一定功能的表皮组织，比如含有黑素细胞，免疫细胞等等，发展多种细胞混合培养形成具备多种功能的自体表皮已经成为一种趋势。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种成本较低，更为安全的人表皮培养方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种新型的人表皮培养方法，其包括以下步骤：
(1)皮肤样本处理和细胞分离：
取患者皮肤3cm2保存于DMEM中；将患者皮肤经乙醇消毒，去除患者皮肤表面的微生物污染；使用磷酸缓冲液清将患者皮肤冲洗数次，去除患者皮肤上的残余乙醇，用手术刀将患者皮肤切割成直径为2mm的微小颗粒；
将切割后的患者皮肤微小颗粒入装有40ml浓度为100-200U/ml的胶原蛋白酶的PE瓶中，4℃过夜处理后使用细胞滤器收集表皮组织；
将收集到的表皮组织放入80mL胰酶-EDTA中，37℃下搅拌1-3小时，使表皮角质细胞充分消化分离，然后使用细胞滤器去除残留的表皮组织后收集细胞悬液；
将收集到的细胞悬液在1800rpm离心5分钟，收集得到的细胞沉淀即为分离得到的皮肤表皮细胞；
(2)表皮细胞的培养:
使用磷酸缓冲液将I型胶原配置为浓度为25mg/ml，以5-15mg/cm2的量制备I型胶原包被的培养皿，然后4℃保存，2周内使用；
使用DMEM培养基重悬步骤(1)中制备得到的皮肤表皮细胞的细胞沉淀，洗涤细胞沉淀3次，去除残留的蛋白酶；
向洗涤后细胞沉淀中加入KMSFM5ml，将细胞沉淀重新配置为均匀分散的细胞悬液，然后取出100ul的细胞悬液，加入25ul台盼蓝染液，活细胞计数，将细胞密度调整为1.0～3*106/ml；
将上述调整好的细胞悬液接种在预先包被上I型胶原酶的10cm培养皿中，放置在CO2培养箱中37℃培养；
每两天更换一次培养基，并采用倒置显微镜观察细胞贴壁生长状态，当出现细胞克隆时每天更换培养基，当克隆逐渐扩增并达到60-90％汇合率时，进行传代培养；
(3)表皮细胞的传代和组织工程皮肤的剥离：
用PBS洗涤细胞表面，去除残留培养基；
然后向细胞中加入3ml的TrypLE，37℃下静置5-10分钟，直至所有细胞分解离；
吸弃TrypLE，加入10mlKMSFM，轻轻吹打使细胞完全解离成细胞悬液，将细胞悬液收集至50ml离心管中，同时取出100ul的细胞悬液采用台盼蓝染液进行活细胞计数；
根据计数结果加入适当KMSFM重悬细胞沉淀，接种至I型胶原包被的10cm培养皿中，CO2培养箱中37℃培养；
每天更换一次培养基并采用倒置显微镜观察细胞贴壁生长状态，当细胞达到100％汇合后，继续培养3-7天；
当表皮形成后，弃去培养基，PBS洗涤3次；
用40-80u/ml分散酶在37℃下处理1-3小时，使表皮从培养皿表面解离；
弃去分散酶液，加入10mlPBS，置于体式显微镜下，采用显微镊沿培养皿四周逐渐剥离表皮，使其完全脱离培养皿表面，悬浮于液体中，即可见完整培养表皮，此表皮可用于临床移植；
(4)组织工程皮肤质检
使用质量分数为0.1％L_DOPA溶液将组织工程细胞进行染色，黑素细胞将被染成深棕色或者黑色，同时使用哈氏苏木素溶液对所有细胞核进行染色；
当黑素细胞的比例为5-15％，即为合格的、可以用于移植的组织工程皮肤。
进一步地，所述KMSF培养基的配置方法是：以Gibco的DKSMF为基础，使用低钙离子浓度，同时添加牛脑垂体提取物(BPE)、牛胰岛素、牛转铁蛋白、bFGF、皮质醇、肝素和内皮素配置得到。
本发明采用的KMSFM(keratinocyteandMelanocytes-SFM)为自主研发优化培养基，其主要特点为无血清、无需滋养层细胞，混合培养角质细胞和黑素细胞。以Gibco的DKSFM为基础，使用低钙离子浓度，同时添加适合黑素细胞生长的添加物和因子，包括牛脑垂体提取物(BPE)、牛胰岛素、牛转铁蛋白、bFGF、皮质醇、肝素和内皮素。
本发明所达到的有益效果是：
(1)培养基的改进，去除牛血清可以大大减少非人源成分的混入，降低成本和不安全因素；
(2)无滋养层细胞，而改用胶原酶包被的平板，可以提高由于去除滋养层细胞带来的细胞生长缓慢，不利于形成多层细胞的缺点，同时无动物细胞的混入带来临床应用的可能；
(3)角质细胞和黑素细胞的混合培养形成的组织工程皮肤可以改进单纯角质细胞皮片带来的无法和病人自体皮肤颜色相符的问题，同时可以用来治疗皮肤色素疾病，比如白癜风、巨大色素痣等疾病。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
一种新型的人表皮培养方法，其包括以下步骤：
(1)皮肤样本处理和细胞分离：
取患者皮肤3cm2保存于DMEM(Gibco)中；将患者皮肤经乙醇消毒，去除患者皮肤表面的微生物污染；使用磷酸缓冲液清将患者皮肤冲洗数次，去除患者皮肤上的残余乙醇，用手术刀将患者皮肤切割成直径为2mm的微小颗粒；
将切割后的患者皮肤微小颗粒入装有40ml浓度为100-200U/ml的胶原蛋白酶的PE瓶中，4℃下过夜处理后使用细胞滤器收集表皮组织；
将收集到的表皮组织放入80mL胰酶-EDTA中，37℃下搅拌1-3小时，使表皮角质细胞充分消化分离，然后使用细胞滤器去除残留的表皮组织后收集细胞悬液；
然后将收集到的细胞悬液在1800rpm离心5分钟，收集得到的细胞沉淀即得到分离的皮肤表皮细胞；
(2)表皮细胞的培养:
使用磷酸缓冲液将I型胶原配置为浓度为25mg/ml，以5-15mg/cm2的量制备I型胶原包被的培养皿，然后4℃保存，2周内使用；
使用DMEM培养基重悬步骤(1)中制备得到的皮肤表皮细胞的细胞沉淀，洗涤细胞沉淀3次，去除残留的蛋白酶；
向洗涤后细胞沉淀中加入KMSFM(DefinedkeratinocyteandMelanocytes-SFM)5ml，将细胞沉淀重新配置为均匀分散的细胞悬液，然后取出100ul的细胞悬液，加入25ul台盼蓝染液，活细胞计数，将细胞密度调整为1.0～3*106/ml；
将上述调整好的细胞悬液接种在预先包被上I型胶原酶的10cm培养皿中，放置在CO2培养箱中37℃培养；
每两天更换一次培养基，并采用倒置显微镜观察细胞贴壁生长状态，当出现细胞克隆时每天更换培养基，当克隆逐渐扩增并达到60-90％汇合率时，进行传代培养；
(3)表皮细胞的传代和组织工程皮肤的剥离：
用PBS洗涤细胞表面，去除残留培养基；
然后向细胞中加入3ml的TrypLE，37℃下静置5-10分钟，直至所有细胞分解离；
吸弃TrypLE，加入10mlKMSFM，轻轻吹打使细胞完全解离成细胞悬液，将细胞悬液收集至50ml离心管中，同时取出100ul的细胞悬液采用台盼蓝染液进行活细胞计数根据计数结果加入适当KMSFM重悬细胞沉淀，接种至I型胶原包被的10cm培养皿中，CO2培养箱中37℃培养；
每天更换一次培养基并采用倒置显微镜观察细胞贴壁生长状态，当细胞达到100％汇合后，继续培养3-7天；
当表皮形成后，弃去培养基，PBS洗涤3次；
用40-80u/ml分散酶在37℃下处理1-3小时，使表皮从培养皿表面解离；
弃去分散酶液，加入10mlPBS，置于体式显微镜下，采用显微镊沿培养皿四周逐渐剥离表皮，使其完全脱离培养皿表面，悬浮于液体中，即可见完整培养表皮，此表皮可用于临床移植；
(4)组织工程皮肤质检
使用质量分数为0.1％L_DOPA溶液(sigma，D9628-5g)将组织工程细胞进行染色，黑素细胞将被染成深棕色或者黑色，同时使用哈氏苏木素溶液对所有细胞核进行染色；
当黑素细胞的比例为5-15％，即为合格的、可以用于移植的组织工程皮肤。
所述KMSFM培养基的配置方法是：以Gibco的DKSFM为基础，使用低钙离子浓度，同时添加牛脑垂体提取物(BPE)、牛胰岛素、牛转铁蛋白、bFGF、皮质醇、肝素和内皮素配置得到。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种新型的人表皮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)皮肤样本处理和细胞分离：
取患者皮肤3cm2保存于DMEM中；将患者皮肤经乙醇消毒，去除患者皮肤表面的微生物污染；使用磷酸缓冲液清将患者皮肤冲洗数次，去除患者皮肤上的残余乙醇，用手术刀将患者皮肤切割成直径为2mm的微小颗粒；
将切割后的患者皮肤微小颗粒入装有40ml浓度为100-200U/ml的胶原蛋白酶的PE瓶中，4℃过夜处理后使用细胞滤器收集表皮组织；
将收集到的表皮组织放入80mL胰酶-EDTA中，37℃下搅拌1-3小时，使表皮角质细胞充分消化分离，然后使用细胞滤器去除残留的表皮组织后收集细胞悬液；
将收集到的细胞悬液在1800rpm离心5分钟，收集得到的细胞沉淀即为分离得到的皮肤表皮细胞；
(2)表皮细胞的培养：
使用磷酸缓冲液将I型胶原配置为浓度为25mg/ml，以5-15mg/cm2的量制备I型胶原包被的培养皿，然后4℃保存，2周内使用；
使用DMEM培养基重悬步骤(1)中制备得到的皮肤表皮细胞的细胞沉淀，洗涤细胞沉淀3次，去除残留的蛋白酶；
向洗涤后细胞沉淀中加入KMSFM5ml，将细胞沉淀重新配置为均匀分散的细胞悬液，然后取出100ul的细胞悬液，加入25ul台盼蓝染液，活细胞计数，将细胞密度调整为1.0～3*106/ml；
将上述调整好的细胞悬液接种在预先包被上I型胶原的10cm培养皿中，放置在CO2培养箱中37℃培养；
每两天更换一次培养基，并采用倒置显微镜观察细胞贴壁生长状态，当出现细胞克隆时每天更换培养基，当克隆逐渐扩增并达到60-90％汇合率时，进行传代培养；
(3)表皮细胞的传代和组织工程皮肤的剥离：
用PBS洗涤细胞表面，去除残留培养基；
然后向细胞中加入3ml的TrypLE，37℃下静置5-10分钟，直至所有细胞分离；
吸弃TrypLE，加入10mlKMSFM，轻轻吹打使细胞完全解离成细胞悬液，将细胞悬液收集至50ml离心管中，同时取出100ul的细胞悬液采用台盼蓝染液进行活细胞计数；
根据计数结果加入适当KMSFM重悬细胞沉淀，接种至I型胶原包被的10cm培养皿中，CO2培养箱中37℃培养；
每天更换一次培养基并采用倒置显微镜观察细胞贴壁生长状态，当细胞达到100％汇合后，继续培养3-7天；
当表皮形成后，弃去培养基，PBS洗涤3次；
用40-80u/ml分散酶在37℃下处理1-3小时，使表皮从培养皿表面解离；
弃去分散酶液，加入10mlPBS，置于体式显微镜下，采用显微镊沿培养皿四周逐渐剥离表皮，使其完全脱离培养皿表面，悬浮于液体中，即可见完整培养表皮，此表皮可用于临床移植；
(4)组织工程皮肤质检
使用质量分数为0.1％L_DOPA溶液将组织工程细胞进行染色，黑素细胞将被染成深棕色或者黑色，同时使用哈氏苏木素溶液对所有细胞核进行染色；
当黑素细胞的比例为5－15％，即为合格的、可以用于移植的组织工程皮肤。
2.一种如权利要求1所述的新型的人表皮培养方法，其特征在于，所述KMSFM培养基的配置方法是：以Gibco的DKSFM为基础，使用低钙离子浓度，同时添加牛脑垂体提取物(BPE)、牛胰岛素、牛转铁蛋白、bFGF、皮质醇、肝素和内皮素配置得到。
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