CN107541486A - 一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其包括胎盘亚全能干细胞的分离、培养以及活性因子的制备，活性因子的制备为：取P3代胎盘亚全能干细胞，接种，消化，冰上超声破碎细胞，收集上清液；然后滴入三氯乙酸，冰浴，低温离心，弃上清；加预冷的丙酮洗涤沉淀，低温离心，弃丙酮后，重悬沉淀，0.1μM的滤膜过滤，所得的SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF浓度均大于20000pg/ml。本发明采用无异源性动物血清的培养体系，减少引入异源性动物病毒的风险；同时培养体系中不含任何激素，避免激素可能引起的皮肤过敏反应；并使用低温沉淀的方法制备活性因子，保证了活性因子的活性。

Description

一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子及其制备与 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子及其制备与应用。

背景技术

干细胞由于具有可以分化为其他组织类型的细胞而被称为万能细胞，已经成为再生医学领域的研究热点。近年来的研究提示，在成体组织中存在一种和造血干细胞、神经干细胞等只能分化为特定胚层的多能干细胞不同的原始干细胞群，这类原始干细胞群可分化为不同胚层的组织细胞。此外，它们也区别于胚胎干细胞，在生长发育中逐渐失去部分分化潜能，并且表现出一些特殊表型或者分子标志，这类原始干细胞群被称为亚全能干细胞。

亚全能干细胞的分化潜能仅次于全能干细胞，处于干细胞等级的最上层，它们在胚胎期存在于一些或全部的组织和器官中，可分化为不同类型的多能干细胞，在体外具有分化成三胚层来源的组织细胞的能力，且无致瘤性。可以参与机体自我修复和更新，不仅能分化为所在器官的组织特异性细胞，参与器官重塑，也可以在炎症因子或者生长因子的趋化作用下，远处转移修复受损组织。

胎盘亚全能干细胞除了通过分化为特定的细胞来参与机体自我修复和更新外，还可以通过分泌活性因子来发挥作用。其分泌的因子主要包括：干细胞因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)、神经细胞生长因子(NGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)转化生长因子β1(TGF-β1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、集落形成刺激因子(CSF)、内皮生长因子(VEGF)、各类白介素(IL1-19)和胶原蛋白等，这些活性因子在皮肤抗衰、美白、祛皱中发挥了重要的作用。

目前市面上的美容护肤产品多为精细化工产品，有效改善皮肤生理状态的效果并不理想，且长期使用的副作用大。本发明公开了一种美容护肤用胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，包括：胎盘亚全能干细胞的分离和培养方法以及活性因子的制备方法。本发明采用无异源性动物血清的培养体系，减少引入异源性动物病毒的风险；同时培养体系中不含激素，避免激素可能引起的皮肤过敏。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子及其制备与应用，以解决了现有技术中的不足。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其包括胎盘亚全能干细胞的分离、培养以及活性因子的制备，所述制备方法包括以下步骤；

S1：分离：分离胎盘表面的羊膜组织，将羊膜组织置于含有抗生素的PBS的培养皿；

S2：将羊膜组织清洗干净，剪成小块后转移至离心管中，并向离心管中加入0.25％的胰蛋白酶，然后置于摇床内振荡消化10～20min；振荡消化完毕后，去除消化上清液；

S3：去掉上清消化液后向剩余组织中加入含有Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶的消化液，然后振荡消化；

S4：将消化所得的细胞悬液过滤，离心后收集细胞；

S5：取步骤S4中所收集的细胞，弃上清，加入2mL完全培养基，混合均匀，则整体呈细胞悬浮液状态；

S6：将步骤S5中的细胞悬浮液接种至培养瓶中，37℃、5％CO₂培养；第2天换液，以后每2天换液1次，直至可以进行传代；

S7：进行细胞传代时，弃细胞培养液，洗涤，消化，离心，然后按(0.7～1.5)x10⁵/ml的密度传代培养，传代至P1和P3代时细胞，即得到P3代的胎盘亚全能干细胞的；

S8：取步骤S7中所得的P3代胎盘亚全能干细胞，以(1～3)x10⁶/瓶的密度接种在培养瓶中，然后进行消化，洗涤；将洗涤后的细胞重悬，冰上超声破碎细胞，然后收集上清液并将转移至新的离心管中；

S9：将三氯乙酸缓慢滴入步骤S8所得的上清液中，轻轻混匀，冰浴40～80min，低温离心10～30min，弃上清；加入0.3～0.7ml预冷的丙酮洗涤沉淀，低温离心10～30min，按此方法用丙酮重复洗涤至少3次；最后一步离心并吸弃丙酮后，室温放置，加入0.7～1.5mlddH₂O重悬沉淀，并用0.1μM的滤膜过滤，-80℃冻存备用，即得高度浓缩的胎盘亚全能干细胞活性因子；

所得的高度浓缩的胎盘亚全能干细胞活性因子中包括SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF，且其浓度均大于20000pg/ml。

进一步地，步骤S8中，以2x10⁶/瓶的密度接种在培养瓶中，48h后收集培养液至离心管中，然后加0.25％胰酶消化细胞，并用PBS洗涤细胞2次；将洗涤后的细胞用所收集的培养液重悬，以2000rpm/10min冰上超声破碎细胞10min。

进一步地，步骤S9中，所述三氯乙酸与上清液的体积比为三氯乙酸:上清＝1:9，二者混匀后，冰浴55～65min，12000rpm/min 4℃低温离心20min，弃上清，加入0.5ml预冷的丙酮洗涤沉淀，12000rpm/min 4℃低温离心20min，按此方法用丙酮重复洗涤5次，最后一步离心吸弃丙酮后，室温放置10min，加入ddH₂O 1ml重悬沉淀，并用0.1μM的滤膜过滤。

进一步地，所述预冷的丙酮为丙酮事先放入-20℃冰箱冷冻至少1h以上。

进一步地，步骤S1中，所述抗生素包括1％青霉素和1％链霉素；

步骤S2中，加入胰蛋白酶后将离心管置于摇床内37℃、250rpm/min振荡消化15min，振荡消化完毕后，去除消化上清液，并用此方法重复消化3次，弃上清消化液；

步骤S3中，向剩余组织中加入含有0.2％Ⅰ型胶原酶和0.1％中性蛋白酶的消化液，然后在37℃、80rpm/min振荡消化60min；

步骤S4中，细胞悬液用100目滤网过滤，1200rpm/min离心10min收集细胞；

步骤S6中，按照2×10⁶个细胞/瓶的接种量接种至多个T175培养瓶；

步骤S7中，细胞汇合度达80％-90％时即可进行细胞传代，然后弃细胞培养液、洗涤，加0.5ml 0.25％的胰酶消化3min，吹打收集细胞后1200rpm/min离心3min，按1x10⁵/ml的密度传代培养。

进一步地，步骤S2中，所述羊膜组织与胰蛋白酶的体积比为：羊膜组织:胰蛋白酶＝1:2；

步骤S3中，所述消化液的加量为：xx，该消化液中0.2％Ⅰ型胶原酶和0.1％中性蛋白酶的含量为xx；

步骤S5中，所述完全培养基包括58％DMEM、40％MCDB、2％脐血血浆、2mmol/L谷氨酰胺、10ng/ml EGF、10ng/ml bFGF、5ng/ml LA-BSA、0.1mmol/L亚硒酸钠、0.1mmol/LVitamin C。

进一步地，所述脐血血浆的制备方法为：将脐血转到离心管中，2000rpm/min离心15min，取上层黄色血浆至新的50ml离心管中，56℃灭活30min。

一种根据上述方法所制备的胎盘亚全能干细胞活性因子，所述胎盘亚全能干细胞活性因子中包括SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF，且其浓度均大于20000pg/ml。

一种胎盘亚全能干细胞活性因子在美容护肤中的应用。

一种面膜液，其包括制作面膜的面膜水和胎盘亚全能干细胞活性因子，所述胎盘亚全能干细胞活性因子与面膜水的体积比为：1:20。

本发明至少具有以下有益效果：

本发明给出了一种容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子及其制备与应用，通过对胎盘亚全能干细胞的分离、培养以及对活性因子的制备等具体过程，从而得到了包括SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF等在内的胎盘亚全能干细胞活性因子，且其浓度均大于20000pg/ml；该胎盘亚全能干细胞活性因子具有重要的美容护肤功效。

本发明中的完全培养基的成分采用了脐血血浆以及亚硒酸钠、Vitamin C等，未添加现有技术中使用的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸等成分，使得成分更简单，定量定性非常容易，而现有技术成分复杂，难以定量定性，导致结果受到较大影响。

此外，目前市面上的美容护肤产品多为精细化工产品，有效改善皮肤生理状态的效果并不理想，且长期使用的副作用大。本发明用胎盘亚全能干细胞活性因子作为美容护肤的活性因子，能有效改善皮肤生理状态，且无副作用。本发明采用无异源性动物血清的培养体系，减少引入异源性动物病毒的风险；同时培养体系中不含激素，避免激素可能引起的皮肤过敏；并使用低温沉淀的方法制备活性因子，最大限度的保证了活性因子的活性，该方法至少可保证98％以上的活性因子依然具有活性。

附图说明

图1是本发明实施例中所制备的P0代的胎盘亚全能干细胞的示意图；

图2是本发明实施例所制备的P1代的胎盘亚全能干细胞的示意图；

图3是本发明实施例所制备的P3代的胎盘亚全能干细胞的示意图；

图4是本发明实施例所述的胎盘亚全能干细胞表达CD45的示意图；

图5是本发明实施例所述的胎盘亚全能干细胞表达CD31的示意图；

图6是本发明实施例所述的胎盘亚全能干细胞表达CD34的示意图；

图7是本发明实施例所述的胎盘亚全能干细胞表达HLA-DR的示意图；

图8是本发明实施例所述的胎盘亚全能干细胞表达Flk1的示意图；

图9是本发明实施例所述的对比组的脂分化的能力的示意图；

图10是本发明实施例所述的胎盘亚全能干细胞的脂分化的能力的示意图；

图11是本发明实施例所述的对比组的成骨诱导分化的能力的示意图；

图12是本发明实施例所述的胎盘亚全能干细胞的成骨诱导分化的能力的示意图；

图13是本发明实施例所述的胎盘亚全能干细胞的向肝细胞和心肌细胞分化的能力的示意图；

图14是本发明实施例所述的胎盘亚全能干细胞活性因子中各种成分的浓度示意图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通方法人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：胎盘亚全能干细胞的分离和培养

取来胎盘和脐血，机械分离胎盘表面的羊膜组织，以生理盐水漂洗去除血细胞，具体步骤如下：

(1)将羊膜置于装有10ml含有抗生素的(1％青霉素和1％链霉素)PBS的培养皿中；

(2)用手术镊夹持羊膜进行漂洗，重复漂洗3遍，尽量去除干净血细胞；

(3)将羊膜组织剪成小块后转移羊膜组织至50mL离心管中；

(4)向离心管中加入0.25％的胰蛋白酶，然后置于摇床内37℃、250rpm/min振荡消化15min；其中，羊膜组织与胰蛋白酶的体积比为：羊膜组织:胰蛋白酶＝1:2，

(5)振荡消化完毕后，去除消化上清液，并用此方法重复消化3次，弃上清消化液；

(6)去掉上清消化液后向剩余组织中加入20ml含有0.2％Ⅰ型胶原酶和0.1％中性蛋白酶的消化液，然后在37℃、80rpm/min振荡消化60min；该消化液的加量为：

(7)将消化所得的细胞悬液用100目滤网过滤，1200rpm/min离心10min收集细胞；

(8)制备脐血血浆：将脐血转到离心管中，2000rpm/min离心15min，取上层黄色血浆至新的50ml离心管中，56℃灭活30min；

(9)取步骤(7)中所收集的细胞，弃上清，加入2mL完全培养基，混合均匀，则整体呈细胞悬浮液状态，取10μL该细胞悬液状态的加了完全培养基的细胞用于细胞计数；所述完全培养基包括58％DMEM、40％MCDB、2％脐血血浆、2mmol/L谷氨酰胺、10ng/ml EGF、10ng/mlbFGF、5ng/ml LA-BSA、0.1mmol/L亚硒酸钠、0.1mmol/L Vitamin C；

(10)将步骤(9)中的细胞悬浮液按照2×10⁶/瓶接种多个T175培养瓶，37℃、5％CO₂培养；

(11)第2天换液，以后每2天换液1次，直至可以进行传代。

(12)细胞汇合度达80％-90％时即可进行细胞传代，弃细胞培养液，PBS洗涤2次，加0.5ml 0.25％的胰酶消化3min，吹打收集细胞后1200rpm/min离心3min，按1x105/ml的密度传代培养。胎盘亚全能干细胞原代培养4天后，细胞贴壁，成三角形和卵圆形状，为P0代，如图1所示；胎盘亚全能干细胞传代至P1和P3代时细胞呈梭型，如图2和3所示。

实施例2

取P3代胎盘亚全能干细胞，用间接免疫荧光法检测细胞的免疫表型；针对胎盘亚全能干细胞表面抗原，细胞经胰酶消化后，用洗液(含0.5％BSA的PBS)冲洗，加入一抗4℃孵育30min，用洗液洗两次。一抗为小鼠抗人的单克隆抗体CD31、CD34、CD45、HLA-DR、Flk1。为检测细胞内抗原，细胞与一抗孵育之前，用2％多聚甲醛4℃固定15min，并在室温下用0.1％的皂角素透膜lh。

此外，选用同种同型非相关IgG抗体作为阴性对照用洗液洗过后，加入FITC标记的羊抗鼠二抗4℃孵育30min，细胞洗三次，并悬浮在300ml的PBS中，置于冰上待流式细胞仪检测。

结果发现，胎盘亚全能干细胞不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR，而Flk1呈阳性，符合亚全能干细胞的细胞表型，如图4～8所示。

实施例3

1、脂肪诱导分化

取实施例1中所得到的P3代胎盘亚全能干细胞，以2x10⁴/孔的密度接种在6孔板中，12h后将培养基换成脂肪诱导培养液，每3天半量换液，第21天油红O染色鉴定。以没有添加成脂诱导培养液的正常培养的P3代胎盘亚全能干细胞作为阴性对照组。所述诱导培养液包括10％FCS、10^-6M地塞米松、100μg/ml 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤和50μg/ml抗坏血酸。

实验组和对比组的结果如图9～10所示，由此可知，本发明的胎盘亚全能干细胞具有成脂分化的能力。

2、成骨诱导分化

取实施例1中所得到的P3代胎盘亚全能干细胞，以2x10⁴/孔的密度接种在6孔板中，12h后将培养基换成骨诱导培养液(DMEM 10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100nM地塞米松、0.2mM抗坏血酸、10mMβ-磷酸甘油)，每3天半量换液，25天后茜红素染色鉴定。以没有添加成骨诱导培养液的以正常培养的P3代胎盘亚全能干细胞作为阴性对照组。

实验组和对比组的结果如图11～12所示，由此可知，本发明的胎盘亚全能干细胞具有成骨诱导分化的能力。

3、肝细胞诱导分化

取实施例1中所得到的P3代胎盘亚全能干细胞，以2x10⁴/孔的密度接种在6孔板中，12h后将培养基换成肝脏细胞诱导培养液(含20ng/ml HGF的DMEM/F12培养液)。每3天半量换液一次，到两周后更换培养基(含10ng/ml OSM的DMEM/F12培养液)，第三周时半定量PCR检测肝脏特异基因ALB和CK18的基因表达，引物序列见表1。以没有添加肝脏细胞诱导培养液的以正常培养的P3代胎盘亚全能干细胞作为阴性对照组。

实验组和对比组的结果如图13所示，由此可知，本发明的胎盘亚全能干细胞具有向肝细胞分化的能力。

表1 引物序列表

4、心肌细胞诱导分化

取实施例1中所得到的P3代胎盘亚全能干细胞，以2x10⁴/孔的密度接种在6孔板中，48h后将培养基换成心肌细胞诱导培养液(含6μM 5-脱氧杂氮胞苷的DMEM-HG培养液)，24h换成DMEM-HG培养液培养，每3天半量换液一次，第14天时半定量PCR检测心肌特异基因β2M、MyoD1的表达，引物序列见表1。以没有添加心肌细胞诱导培养液的正常培养的P3代胎盘亚全能干细胞作为阴性对照组。实验组和对比组的结果如图13所示，由此可知，本发明的胎盘亚全能干细胞具有向心肌细胞分化的能力。

实施例4

取实施例1中所得的P3代胎盘亚全能干细胞，以2x10⁶/瓶的密度接种在T175培养瓶中，48h后收集培养液至50ml离心管中，在培养瓶中加0.25％胰酶消化细胞，并用PBS洗涤细胞2次。将洗涤后的细胞用所收集的培养液重悬，冰上超声破碎细胞，2000rpm/10min，然后将上清转移至新的50ml离心管中。

按三氯乙酸(TCA):上清＝1:9的比例，将TCA缓慢滴入上述新的离心管中的上清液中，轻轻混匀，冰浴60min，12000rpm/min 4℃离心20min，弃上清。加入0.5ml预冷的丙酮洗涤沉淀，12000rpm/min 4℃离心20min，按此方法用丙酮重复洗涤5次。最后一步离心吸弃丙酮后，室温放置10min，加入ddH2O 1ml重悬沉淀，并用0.1μM的滤膜过滤，-80℃冻存备用，即得高度浓缩的胎盘亚全能干细胞活性因子。

上述预冷的丙酮为将丙酮预先放入-20℃冰箱冷冻至少1h以上。

实施例5

取10μl实施例4所制得的高度浓缩的胎盘亚全能干细胞活性因子，稀释50倍。用ELISA试剂盒检测部分细胞活性因子的浓度，操作步骤如下：

取酶标板室温平衡30min，采用1/50-1/400的稀释度将样本加入酶标孔，每孔20ul，做3个复孔；置于37摄氏度放置60min后，用洗涤液满孔洗涤3遍；每孔50ul/孔加入酶标抗体，37摄氏度避光孵育60min；洗涤3次后，加入底物100ul/孔，37℃避光放置3-5min，加入50ul/孔终止液终止反应，并在20min内用酶标仪检测实验结果。

结果如图14所示，浓缩液中SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF浓度均大于20000pg/ml。

本实施例中所得到的活性因子中的SCF是一种重要的造血生长因子，具有促进细胞再生，促进组织修复的作用。αFGF具有促进成纤维细胞、表皮细胞代谢、增殖和分化；激活老化细胞，加速皮肤细胞的新陈代谢，修复断裂的浅表皮成纤维细胞，对皮肤创面有突出的快速修复功能。VEGF可有效提高局部血管通透性，从而为成纤维细胞的增殖及胶原的合成提供充足的营养物质和其他生长因子，进一步促进细胞的分裂、增殖，改善皮肤微循环，使蜡黄、无光泽、不健康的皮肤变得红润有光泽。EGF能促进机体表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞的生长、分裂和新陈代谢，促进微血管的生长，改善细胞生长的微环境。因此它对受损皮肤、敏感皮肤、创伤皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用。KGF是一种多功能生长因子，其生物学功能有促进上皮细胞增殖与分化，辐射防护，维持细胞骨架稳定。

实施例6

基于本发明所制备的胎盘亚全能干细胞活性因子中包含众多对美容护肤有效的护肤因子。本发明将所制备的胎盘亚全能干细胞活性因子可用于各种美容护肤品，如面膜、面霜、水光针制剂等等。

实施例7

本实施例以面膜水为例，说明本发明的活性因子具有美容护肤的功效。

试验对象：将100名年龄为30-60岁的女性受试者分为2组，每组50人，每组平均年龄为40.5±5.6。

实验组：使用本发明的面膜液，即将实施例4中所制备的胎盘亚全能干细胞活性因子与面膜水按1:20的比例混匀，制得含胎盘亚全能干细胞活性因子的面膜液。所述面膜水中含有水以及面膜中含有的最常规的保湿成分等，如维他命C等。

对比组：仅使用实验组中的面膜水，不含有胎盘亚全能干细胞活性因子。

试验方法：将充分浸湿的面膜纸敷于2组受试者脸部，每次敷脸25min，4天一次，持续15次。连续观察60天，对受试者进行评定。评定方法为客观评定和主观评定。

客观评定方法：采用VISIA皮肤测试仪，VISIA皮肤测定仪运用多重光谱影像科技从毛孔情况、面部皱纹、肤色均匀度、色斑、紫外线斑、日光损伤等6个能影响面容、皮肤健康的指标进行综合分析。其中，治疗前绝对值-治疗后绝对值>0表示有效。

主观评定方法：使用后后对患者的皮肤改善情况按照以下标准进行综合评价：1分，面部皱纹、毛孔等均无明显变化；2分，皱纹、毛孔有少许减少、皮肤略有改善(1％-25％)；3分，毛孔有所缩小，皱纹有所淡化，斑点有所减小(26％-50％)；4分，毛孔缩小、面部皱纹淡化、斑点减少，皮肤光滑(51％-75％)；5分，毛孔明显缩小、面部皱纹明显淡化、肤色均匀度明显增加、色斑明显减少、皮肤光滑(76％-100％)。

然后，客观与主观评定的指标用spss软件进行统计学处理。

结果如表2所示，由客观评价可知：实验组在治疗后，在毛孔情况、面部皱纹、肤色均匀度、色斑、紫外线斑、日光损伤6个指标的综合分析中得到明显改善，且改善程度要远远优于对比组。由主观评价结果可知，实验组中，32％的试验者认为效果非常显著，改善率76％-100％，具有5分的效果；48％的试验者认为效果显著，改善率51％-75％，具有4分的效果；4分以上效果的试验者达80％，仅有1个试验者认为无明显变化。对比组中，具有4分以上效果的试验者只有36％，远低于实验组。

含有本发明所制备活性因子的面膜液护肤效果均要好于不含活性因子的面膜水。

表2 第60天治疗前后效果评价

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其包括胎盘亚全能干细胞的分离、培养以及活性因子的制备，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤；

S1：分离：取胎盘表面的羊膜组织，将羊膜组织置于含有抗生素的PBS的培养皿；

S2：将羊膜组织清洗干净，剪成小块后转移至离心管中，并向离心管中加入0.25％的胰蛋白酶，然后置于摇床内振荡消化10～20min；振荡消化完毕后，去除消化上清液；

S3：去掉上清消化液后向剩余组织中加入含有Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶的消化液，然后振荡消化；

S4：将消化所得的细胞悬液过滤，离心后收集细胞；

S5：取步骤S4中所收集的细胞，弃上清，加入2mL完全培养基，混合均匀，则整体呈细胞悬浮液状态；

S6：将步骤S5中的细胞悬浮液接种至培养瓶中，37℃、5％CO₂培养；第2天换液，以后每2天换液1次，直至可以进行传代；

S7：进行细胞传代时，弃细胞培养液，洗涤，消化，离心，然后按(0.7～1.5)x10⁵/ml的密度传代培养，传代至P1和P3代时细胞，即得到P3代的胎盘亚全能干细胞的；

S8：取步骤S7中所得的P3代胎盘亚全能干细胞，以(1～3)x10⁶/瓶的密度接种在培养瓶中，然后进行消化，洗涤；将洗涤后的细胞重悬，冰上超声破碎细胞，然后收集上清液并将转移至新的离心管中；

S9：将三氯乙酸缓慢滴入步骤S8所得的上清液中，轻轻混匀，冰浴40～80min，低温离心10～30min，弃上清；加入0.3～0.7ml预冷的丙酮洗涤沉淀，低温离心10～30min，按此方法用丙酮重复洗涤至少3次；最后一步离心并吸弃丙酮后，室温放置，加入0.7～1.5ml ddH₂O重悬沉淀，并用0.1μM的滤膜过滤，-80℃冻存备用，即得高度浓缩的胎盘亚全能干细胞活性因子；

所得的高度浓缩的胎盘亚全能干细胞活性因子中包括SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF，且其浓度均大于20000pg/ml。

2.根据权利要求1所述的美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其特征在于：步骤S8中，以2x10⁶/瓶的密度接种在培养瓶中，48h后收集培养液至离心管中，然后加0.25％胰酶消化细胞，并用PBS洗涤细胞2次；将洗涤后的细胞用所收集的培养液重悬，以2000rpm/10min冰上超声破碎细胞10min。

3.根据权利要求2所述的美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其特征在于：步骤S9中，所述三氯乙酸与上清液的体积比为三氯乙酸:上清＝1:9，二者混匀后，冰浴55～65min，12000rpm/min 4℃低温离心20min，弃上清，加入0.5ml预冷的丙酮洗涤沉淀，12000rpm/min 4℃低温离心20min，按此方法用丙酮重复洗涤5次，最后一步离心吸弃丙酮后，室温放置10min，加入ddH₂O 1ml重悬沉淀，并用0.1μM的滤膜过滤。

4.根据权利要求3所述的美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其特征在于：所述预冷的丙酮为丙酮事先放入-20℃冰箱冷冻至少1h以上。

5.根据权利要求4所述的美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述抗生素包括1％青霉素和1％链霉素；

步骤S2中，加入胰蛋白酶后将离心管置于摇床内37℃、250rpm/min振荡消化15min，振荡消化完毕后，去除消化上清液，并用此方法重复消化3次，弃上清消化液；

步骤S3中，向剩余组织中加入含有0.2％Ⅰ型胶原酶和0.1％中性蛋白酶的消化液，然后在37℃、80rpm/min振荡消化60min；

步骤S4中，细胞悬液用100目滤网过滤，1200rpm/min离心10min收集细胞；

步骤S6中，按照2×10⁶个细胞/瓶的接种量接种至多个T175培养瓶；

步骤S7中，细胞汇合度达80％-90％时即可进行细胞传代，然后弃细胞培养液、洗涤，加0.5ml 0.25％的胰酶消化3min，吹打收集细胞后1200rpm/min离心3min，按1x10⁵/ml的密度传代培养。

6.根据权利要求5所述的美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述羊膜组织与胰蛋白酶的体积比为：羊膜组织:胰蛋白酶＝1:2；

步骤S3中，所述消化液的加量为：xx，该消化液中0.2％Ⅰ型胶原酶和0.1％中性蛋白酶的含量为xx；

步骤S5中，所述完全培养基包括58％DMEM、40％MCDB、2％脐血血浆、2mmol/L谷氨酰胺、10ng/ml EGF、10ng/ml bFGF、5ng/ml LA-BSA、0.1mmol/L亚硒酸钠、0.1mmol/L Vitamin C。

7.根据权利要求6所述的美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其特征在于：所述脐血血浆的制备方法为：将脐血转到离心管中，2000rpm/min离心15min，取上层黄色血浆至新的50ml离心管中，56℃灭活30min。

8.一种根据权利要求1～7中任一项所制备的胎盘亚全能干细胞活性因子，其特征在于：所述胎盘亚全能干细胞活性因子中包括SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF，且其浓度均大于20000pg/ml。

9.一种胎盘亚全能干细胞活性因子在美容护肤中的应用。

10.一种面膜液，其包括制作面膜的面膜水，其特征在于：还包括胎盘亚全能干细胞活性因子，所述胎盘亚全能干细胞活性因子与面膜水的体积比为：1:20。